專利名稱：：抗原肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及病原體肽抗原及其用途領(lǐng)域，所述用途例如用于制備一種針對所述病原體的疫苗。更具體地，本發(fā)明涉及一種源自于瘧原蟲物種序列的抗原肽，并且本發(fā)明還包括其抗體和其生產(chǎn)和使用方法。
背景技術(shù)：
：人惡性癡原蟲(Plasmodiumfalciparum)CftO是一個(gè)公共衛(wèi)生問題。如今大約40%的世界人口(特別是那些居住在最貧窮國家的人)處于患癡疾的危險(xiǎn)中。每年有超過3億例急性疾病和至少一百萬例死亡由癡疾引起。由癡疾引起的死亡有90%都發(fā)生在撒哈拉以南非洲國家，大部分是幼兒和孕婦(http://rbm.who.int)。不幸地，如果保護(hù)性抗原不具有^T可以對它們進(jìn)行鑒定的結(jié)構(gòu)特征、物理化學(xué)特M者序列相關(guān)特征，那么疫苗的發(fā)現(xiàn)就仍然是一個(gè)需要憑借經(jīng)驗(yàn)的過程。對于其保護(hù)能力是由抗體介導(dǎo)的抗原而言，唯一的限制是它們接近抗體M的能力。最初疫苗開^A^^完整的M物或者蛋白進(jìn)行的，這些微生物或者蛋白可以通過經(jīng)典的純化方法容易地獲得。雖然引入分子生物學(xué)技術(shù)a地改善了所述抗原分離步驟，但是仍然難以產(chǎn)生毫克量的高度純化的重組蛋白；這使得該方法非常昂貴并且不適合于高通量的篩選方法。另夕卜，在許多情況下正確的蛋白折疊也是一個(gè)問題。因此，突破作為保護(hù)把標(biāo)的蛋白的生產(chǎn)和鑒定瓶頸是該科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。在過去的20年中，在癡疾疫苗的開發(fā)上已進(jìn)行了大量的工作，進(jìn)行了超過40項(xiàng)I期和n期"^^(Ballouefa/，2004，VandePerreandDedet，2004)。#有大約70種不同的候選疫苗JME被開發(fā)，并且至少有10種處于臨床，階段。所使用的抗原來自于寄生蟲生命周期的^h階段(GentonandCorradin，2002，Ballouetal，2004),采用了各種免疫方案(DunachieandHill，2003)并且結(jié)合了各種送遞系統(tǒng)中配制的不同佐劑(GentonWa/，2002;Taylor-Robinson，2003;BallouWa/,2004)。從地方疫情中進(jìn)行的臨床試驗(yàn)獲得的結(jié)果是令^t舞的并且顯示出一定水平的保護(hù)(Bojangefa/，1998，Bojang"a/，2001，Gentonet"a/，2002)，而其他的"i^^殳有顯示出保護(hù)作用(Nostene"/，1996，Valeroe"/，1996,UrdanetaWa/，1998，GravesandGelband，2004)。il今為止，最先進(jìn)的癡疾疫苗是RTS，S/AS02A。該疫苗包含環(huán)子孢子蛋白的免疫顯性MNP重復(fù)序列的大部分和含T細(xì)jf^^位的C-末端區(qū)域的一部分，所述疫苗與乙型肝炎表面抗原融合(GordonWa/，1995),在釀酒酵母Cfecc力ar0邁7c"cerew、/ae)中共表達(dá)并與強(qiáng)佐劑AS02A配伍(Stoutea/，1997)。RTS，S/AS02A耙向紅細(xì)胞前期肝階段并且對幼兒的臨床瘧疾和寄生蟲血癥(StouteWa/，1997)以狄年男性的癡疾(BojangWa/，2001)都有保護(hù)，但保護(hù)有效時(shí)間較短。另夕卜，最近在莫桑比克完成的學(xué)步期兒童的*中獲得了對臨^^癡疾更高水平的保護(hù)(Alonsoe,a/，2004)。在受該疾病感染最為嚴(yán)重的兒童中有長達(dá)6個(gè)月的持續(xù)保護(hù)。迄今為止使用的候選疫苗都不是根據(jù)它們的保護(hù)能力進(jìn)行系統(tǒng)篩選得到的；大部分的寄生蟲W是根據(jù)它們M現(xiàn)的時(shí)間的先后順序進(jìn)行以經(jīng)驗(yàn)為主的優(yōu)先次序的區(qū)分。雖然這樣的方法^^功地應(yīng)用于M的病原體，但是還未能^^一種有效的瘧疾疫苗。例如，EP03150185Bl(申ffr人Behringwerkeaktiengesellschaft)描述了通過利用抗41kDa蛋白的^ir清篩選兩個(gè)不同的惡性癡原蟲cDM基因庫并通過與以該方法獲得的一個(gè)克隆的插入DM相互雜交，來分離一個(gè)編碼富含組氨酸/丙氨酸的蛋白的基因。該分離的蛋白保護(hù)夜M受惡性疾原蟲的感染。不幸地是，可能由于這些猴子并不是衞以人對惡性瘧原蟲免疫應(yīng)答的合適模型，這個(gè)方法并沒有導(dǎo)致開發(fā)出一種對人有效的疫苗。在嘗試進(jìn)行針對另一種病原體肺炎^^菌(streptococcuspneumoniae)的疫苗開發(fā)中，^^I了針對肺炎球菌表面蛋白A(PspA)所產(chǎn)生的單克隆抗體的作圖研究表明，主要的交3UJI表絲在于巻曲螺差結(jié)構(gòu)域的^100個(gè)絲酸中，所*曲螺旋結(jié)構(gòu)域是一種存在于多組蛋白中的具有重要結(jié)構(gòu)和較高生物學(xué)豐度的結(jié)構(gòu)域(ChenandParry,1986and1990)。才艮據(jù)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，國際專利申請WO00/37105(申^fr人Medimmune，Inc.)7^開了用于預(yù)防肺炎M菌所致感染的方法和疫苗組^，所述疫苗組^包4^含三^ia氨酸^^者巻曲螺i區(qū)域的多#多肽片段。最近，國際專利申請冊01/96368(申請人CytovaxBiotechnologies,Inc.)公開了一種巻曲螺旋結(jié)構(gòu)骨架用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異性肽(包括合成肽)的用途。這些合成肽可以用作疫苗，或者用于刺激針對天然存在的肺炎球菌表面蛋白A和C的抗體產(chǎn)生或者細(xì)胞^h導(dǎo)的免疫。雖然在瘧疾的治療中已有一些ii^，但是對于生活在瘧疾流行區(qū)域的廣大4來說，^而有效的癡疾疫苗的開發(fā)仍然是緊迫的、未滿足的醫(yī)學(xué)需求。本發(fā)明通過提^-種源自于瘧原蟲物種的、包含至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的新抗原肽已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了這個(gè)目標(biāo)?；谝环N鑒定病原體基因組中是否存在編碼至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的序列的新方法，##產(chǎn)生一種用于制名-抗所述病原體疫苗的抗原肽的方法，已經(jīng)制備了該肽。
發(fā)明內(nèi)容從上文顯而易見的上述目的或其他目的已通過提供一種新抗原肽實(shí)現(xiàn)，所述抗原肽源自于瘧原蟲物種，包含至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域，其特征在于所述抗原lii^自SEQIDNo.1-132、SEQIDNo.134-SEQIDNo.153和SEQIDNo.159-SEQIDNo.163的M酸序列、所述M酸序列的生物學(xué)活性片段、分子嵌合體、結(jié)合物和/或變體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種源自于癡原蟲物種的混合抗原組合物。本發(fā)明還考慮了源自于瘧原蟲物種的所述抗原肽或者所述混合抗原組合物在制備一種用于刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的應(yīng)用，以及所述疫苗組合物在制備治療和/或預(yù)防癡疾的藥劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供一種識(shí)別源自于癡原蟲物種的所述抗原肽或者所述混合抗原組合物的抗體。本發(fā)明還涉及包含編碼源自于癡原蟲物種的所述抗原肽的序列的純化的和分離的核^列，包含所述純化的和分離的核#列的至少一個(gè)拷貝的表達(dá)栽體，以及包含所述純化的和分離的核酸序列或所"達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)一種用于制備抗病原體的疫苗組合物的抗原肽的方法。本發(fā)明還考慮了用于確定所述抗原肽或者針對所述抗原肽的抗體是否存在的診斷工具。通過閱讀下文的具體描述并參照下面和隨附的權(quán)利要求，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)也應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。圖1表示使用抗SEQIDNo.34(P1577)、SEQIDNo.4(P1574)、SEQIDNo.133(MR198)和SEQIDNo.1(MR194)的親和純化的人抗體在感染的人紅細(xì)胞上獲得的免疫熒光數(shù)據(jù)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種源自于瘧原蟲物種的、包含來自于癡原蟲物種序列的至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的抗原肽。所述術(shù)語"包含"通常用于表示包括的意思，就是說允許存在一個(gè)或多個(gè)特征或組分。本文使用的術(shù)語"蛋白"、"多肽"、"多肽的"、"肽"和"肽的"在本文中可以互換使用，用于表示通it^目鄰戎基的ot-氨基和g之間的肽鍵連接的一系列氨基酸戎基。術(shù)語"抗原肽"是指一種被抗體識(shí)別的肽。通常，免疫應(yīng)答會(huì)產(chǎn)生識(shí)別抗原肽或者其至少一部分的抗體。在本文中，術(shù)語"源自于"^:指所述抗原肽^_>^存在于所述癡原蟲物種病原體序列的#^*列中選出。"巻曲螺旋區(qū)域"、"巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域，，或"區(qū)域"通常由具有七氨基酸"&&/^)重復(fù)的g酸序列構(gòu)成，其中在所述a和b位置為非極性殘基而其他g通常為極性殘基。通過不同折疊中的a和d位置之間的疏水相互作用可以穩(wěn)、定這些區(qū)域的結(jié)構(gòu)(Hodgesetal，1981;Hodges,1996)。本文使用的"癡原蟲物種"可以選自于如下的癡原蟲林Plasmodiumagamae、Plasmodiumatheruri、Plasmodiumazurophil咖、柏格鼠癡原蟲(Plasmodiumberghei)、巴西癡原蟲(Plasmodiumbrasilianum)、金絲雀癡原、蟲(Plasmodiumcathemerium)、夏氏鼠疫癡原、蟲(Plasmodiumchabaudi)、Plasmodiumchiricahuae、柯式疾原蟲(Plasmodiumcoatneyi)、Plasmodiumcuculus、食蟹猴癡原蟲(Plasmodiumcynomolgi)、長角癡原蟲(Plasmodiumelongaturn)、Plasmodiumfairchildi、惡'性癡原、蟲(例如惡小生癡原蟲(分離株311)、惡性癡原蟲(分離抹7G8)、惡性癡原蟲(分離林C層/馬來西亞)、惡性癡原蟲(分離林CDC/洪;lfp4i斯)、惡性癡原蟲(分離林DD2)、惡性癡原蟲(分離林FC27/巴布亞新幾內(nèi)亞)、惡性癡原蟲(分離林FcBl/哥倫比亞)、惡性疾原蟲(分離林FCBR/哥倫比亞)、惡性癡原蟲(分離林FCH-5)、惡性癡原蟲(分離林FCM17/塞內(nèi)加爾)、惡性癡原蟲(分離林FCR-3/岡比亞)、惡性癡原蟲(分離林fid3/印度)、惡性瘧原蟲(分離林hb3)、惡性瘧原蟲(分離林IMR143)、惡性癡原蟲(分離林Kl/泰國)、惡性癡原蟲(分離林KF1916)、惡性癡原蟲(分離林LE5)、惡性癡原蟲(分離林咖d20/巴布亞新幾內(nèi)亞)、惡性癡原蟲(分離林mad71/巴布亞新幾內(nèi)亞)、惡性癡原蟲(分離林NF54)、惡性疾原蟲(分離林NF7/加納)、惡性癡原蟲(分離林nig32/尼日利亞)、惡性癡原蟲(分離林帕洛阿爾托/烏干達(dá))、惡性癡原蟲(分離林RO-33/加納)、惡性癡原蟲(分離林T4/泰國)、惡性癡原蟲(分離林TAK9)、惡性癡原蟲(分離株thtn/泰國)、惡性癡原蟲(分離林VI)、惡性癡原蟲(分離林WELLCOME)、惡性癡原蟲3D7)、費(fèi)氏猴瘧原蟲(Plasmodiumfieldi)、佛羅里達(dá)瘧原蟲(Plasmodiumfloridense)、脆弱癡原、蟲(Plasmodiumfragile)、？鳥癡原、蟲(Plasmodiumgallinaceum)、Plasmodiumgigante咖、崗氏癡原蟲(Plasmodiumgonderi)、廣東癡原蟲(Plasmodiumguanggong)、異核癡原蟲(Plasmodiumheteronucleare)、長臂猿癡原、蟲(Plasmodiumhylobati)、豬尾猴疾原、蟲(Plasmodiuminui)、^!核癥原蟲(Plasmodiumjuxtanucleare)、i若爾斯癡原蟲(Plasmodiumknowlesi)、鷴癡原蟲(Plasmodiumlophurae)、三日癡原蟲(Plasmodiummalariae)、三日癡原蟲cf.(Plasmodiumcf.malariae)、墨西哥癡原、蟲(Plasmodiummexicanum)、Plasmodiumnucleophilum、卵形癡原、蟲(Plasmodiumovale)、(癡原蟲卵形癡原蟲(malariaparasiteP.ovale))、里氏癡原、蟲(Plasmodiumreichenowi)、鳥癡原、蟲(Plasmodiumrelieturn)、勞氏癡原蟲(Plasmodiumrouxi)、4以卵形疾原、蟲(Plasmodiumsimiovale)、礙U^癡原蟲(Plasmodiumsimium)、文氏鼠癡原蟲(Plasmodiumvinckei)、間日癡原蟲(Plasmodiumvivax)(例如間日癡原蟲(Belem^K)間日癡原蟲(SalvadorI林))、約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)、未分類瘧原蟲種例如瘧原蟲種909413、癡原蟲種909414、癡原蟲種909415、癡原蟲種909416、疾原蟲種AP61、癡原蟲種AP62、癡原蟲種AP63、癡原蟲種AP64、瘧原蟲種AP65、癡原蟲AP66、癡原蟲AP67、癡原蟲種AP68、癡原蟲種AP69、癡原蟲種AP70、癡原蟲種AP71、癡原蟲種AP72、癡原蟲種AP73、癡原蟲種AP74、癡原蟲種AP75、癡原蟲種AP76、癡原蟲種AP77、癡原蟲種AP78、癡原蟲種C1、癡原蟲種C2、癡原蟲種C3、癡原蟲種C0LL1、癡原蟲種D1、癡原蟲種DAJ-2004、癡原蟲種E1、癡原蟲種E2、癡原蟲種exAplonisatrifusca、癡原蟲種exAplonistabuensis、癡原蟲種exFoulehaiocarunculata、癡原蟲種exHalcyonchloris、癡原蟲種exMyzomelacardinalis、癡原蟲種exPtilinopusporphyraceus、癡原蟲種F1、癡原蟲種l、癡原蟲種GRWll、癡原蟲種GRW2、癡原蟲種GRW4、癡原蟲種H1、癡原蟲種0RW1、疾原蟲種PA、癡原蟲種PARUS2、癡原蟲種PB、瘧原蟲種pBT6、癡原蟲種pBT7、癡原蟲種pBT8、癡原蟲種pBT9、瘧原蟲種PC、癡原蟲種pGRW9、癡原蟲種PH、癡原蟲種PI、癡原蟲種PU1、疾原蟲種SGS1、癡原蟲種林KZ02、癡原蟲種林LA09、癡原蟲種林LA15、癡原蟲種林OZ01A、癡原蟲種林0Z04、癡原蟲種林OZ08、癡原蟲種林0Z14、癡原蟲種株0Z25、癡原蟲種林0Z35、癡原蟲種抹OZ35A、癡原蟲種林OZ35B、癡原蟲種林OZ36A、疾原蟲種抹0Z42、癡原蟲種株OZ45、癡原蟲種林OZ46、癡原蟲種林PROl、癡原蟲種SYAT24、類間日癡原蟲種(Plasmodiumvivax-likesp))。優(yōu)選地，所述抗原肽可源自于惡性癡原蟲、間日癡原蟲、卵形癡原蟲和三日癡原蟲。通常，源自于瘧原蟲物種的包含至少一個(gè)巻曲螺旋的抗原肽可選自SEQIDNo.1-132、SEQIDNo.134-SEQIDNo.153和SEQIDNo.159-SEQIDNo.163的M酸序列、所述a酸序列的生物學(xué)活性片段、所述JL^酸序列的分子嵌合體、所述M酸序列的結(jié)合物和/或所述M酸序列的變體。根據(jù)下文中描述的產(chǎn)生抗原肽的方法，申請人篩選出了SEQIDNo.1-132、SEQIDNo.134-SEQIDNo.153和SEQIDNo.159-SEQIDNo.163,并示于表1中。所有這些肽序列都包含至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域。_^_Sanger一l3.030303pos.497-559Pfa3D7|pfal—chrliPFA0170c|注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白，consVNNLDSTVNYMNSTGNNINNIVNNLDSTVNYMNSTGNNINNIVNNLDSTVNYMNSTGNNINNI(SEQIDNo.1)Sanger3.250325pos.437-473Pfa3D71pfal—chrl|PFA0635c|注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置NHDTRINDYNKRLTEYNKRLTEYMRLTEYTKRLNE(SEQIDNo.39)TIGR-13.320332pos.140-166Pfa3D7lpfal—chr2lPFB0145cl注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置TISSLSNKIVNYESKIEELEKELKEVK(SEQIDNo.2)TIGR-23.090309pos.249-273Pfa3D71pfal—chr21PFB0145c|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置IIDIKKHLEKLKIEIKEKKEDLENL(SEQIDNo.5)TIGR—33.640364pos.575-601Pfa3D7|pfal—chr21PFB0145c|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置NIKTMNTQISTLKNDVHLLNEQIDKLN(SEQIDNo.3)TIGR—42.930293pos.537-561Pfa3D71pfal—chr2|PFB0145c|注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置INNLNEKLEETNKEYTNLQNNYTNE(SEQIDNo.6)TIGR-62.710271pos.597-621Pfa3D71pfal—chr2|PFB0145c|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置IDKLNNEKGTLNSKISELNVQIMDL(SEQIDNo.7)TIGR-73.000300pos.999-1023Pfa3D7Ipfa1—chr2iPFB0145c|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置LLSKDKEIEEKNKKIKELNNDIKKL(SEQIDNo.9)TIGR_82.800280pos.1154-1178Pfa3D7|pfal—chr21PFB0145c|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置ICSLTTEVMELNNKKNEL1EENML(SEQIDNo.11)TIGR—92.690269pos.1126-1150Pfa3D7Ipfal—chr21PFB0145c|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置VDKIEEHILDYDEEINKSRSNLFQLKNE(SEQIDNo.12)TIGR—104.050405pos.1198-1224Pfa3D7|pfal—chr2iPFB0145c|注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置EIEKLNKQLTKCNKQIDELNEEVEKLN(SEQIDNo.4)TIGR—112.670267pos.1178-1202Pfa3D7Ipfal—chr2|PFB0145c|注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置LNLVDQGKKKLKKDVEKQKKEIEKL(SEQIDNo.10)TIGR-122.600260pos.1252-1276Pfa3D7Ipfal—chr2iPFB0145c|注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置LDENEDNIKKMKSKIDDMEKEIKYR(SEQIDNo,13)TIGR3.170317pos.1603-1627Pfa3D71pfal—chr21PFB0315wl注釋ITIGR(蛋白編碼)41kDa抗原位置=281907.MEQMDMKMEKIDVNMDQMDVKMEQM(SEQIDNo.40)TIGR3.020302pos.616-645Pfa3D7lpfal—chr2lPFB0460cl注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置^0顆VIRSKMYNIKKRISKINDELHELSNFFL(SEQIDNo.41)TIGR-13.160316pos.516-540Pfa3D7lpfal—chr2lPFB0765wl注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置LEEMKQKNKELINNLNDISDELKNC(SEQIDNo.42)TIGR-23.470347pos.605-633Pfa3D7lpfal—chr2lPFB0765wl注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置EKLNDMQKKLNDVNEKYOUVECLNNYKT(SEQIDNo.43)TIGR—33.370337pos.1074-1098Pfa3D7|pfal—chr2lPFB0765wl注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置UCEKDKnNDLMKDMEKKKEEINKL(SE(JIDNo.44)Sanger3.340334pos,798-837Pfa3D7|pfal—chr31PFC0235wl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置MEIKELNMTLNKYKEEMNNYKEEIIVINEKYKLLEIELCK(SEQIDNo.45)Sanger—14.000400pos.2215-2255Pfa3D7lpfaLchr3lPFC0245cl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置GMNN,GDINNINGDINNMNGDINNMNGDINNMNGDINNMN(SEQIDNo.14)Sanger—13.220322pos.285-309Pfa3D7|pfal—chr31PFC0345wl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置Sanger—23.140314pos.306-330Pfa3D7Ipfal—chr31PFC0345wl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置MNIMEKDMNIIKNDMNIIO顧NII(SEQIDNo.47)Sanger—13.020302pos.2208-2236Pfa3D7|pfal—chr3lPFC0760cl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置EEIYKLNNDIDMLSNNCKKLKESI,EK(SEQIDNo.48)Sanger—23.430343pos.2401-2429Pfa3D71pfal_chr31PFC0760cI注釋lSanger(蛋白編碼)4,定的蛋白位置KEIQMLKNQILSLEESIKSLNEFINNLKN(SEQIDNo,49)Sanger3.640364pos.180-210Pfa3D7Ipfal—chr31PFC0810c|注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置KNVIEUCEYLEDLKKRMFDMQKRLNDIIITK(SEQIDNo.50)Sanger—13.010301pos.1256-1280Pfa3D71pfal_chr31PFC0960cI注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置IETLE,LKIGKEKINKFDNEIQKL(SEQIDNo.51)Sanger—43.160316pos.1707-1731Pfa3D7Ipfal_chr3|PFC0960cI注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置INNMtCEQIEDVNHKIASINKEKEEL(SEQIDNo.52)Sanger—12.620262pos.758-782Pfa3D71pfal—chr41PFDOllOwl注釋ISanger(蛋白編碼)網(wǎng)狀細(xì)胞結(jié)合蛋白DEKINDYLEEIKNEQNKIDKTIDDI(SEQIDNo.19)Sanger—23.270327pos.813-839Pfa3D7Ipfal—chr4IPF叫110wl注釋ISanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白L1KYMNERYQNMQQGYNNLTNYINQYE(SEQIDNo.15)Sanger—32.670267pos.1396-1420Pfa3D7lpfa1—chr4lPFD0110wl注釋ISanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白MDVV1NQLRDIDRQMLDLYKELDEK(SEQIDNo.20)Sanger—43.090309pos.1814-1840Pfa3D7lpfa1—chr4lPFD0110wl注釋ISanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白DINSTNNNLDNMLSEINSIQNNIHTYI(SEQIDNo.16)Sanger—53.180318pos.1904-1925Pfa3D7lpfa1—chr4lPFD0110wl注釋ISanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白EKKLDILKVNISNI,SLDKLK(SEQIDNo.17)Sanger—62.620262pos.1933-1957Pfa3D7lpfa1—chr4IPFD0110wl注釋ISanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白FQKVKEKAEIQKENIEKIKQEINTL(SEQIDNo.23)Sanger—73.250325pos.2070-2096Pfa3D7lpfal—chr4lPFD0110wl注釋ISanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白DVHNIKEDYNLLQQYLNYMKNEMEQLK(SEQIDNo.18)Sanger—82.930293pos.2208-2232Pfa3D7Ipfal—chr41PFDOllOwl注釋lSanger(蛋白編碼)網(wǎng)狀細(xì)月包結(jié)合蛋白ISNIFKDIQNIKKQSQDIITNMNDM(SEQIDNo.21)Sanger—92.950295pos.2359-2383Pfa3D71pfal—chr41PFDOllOwl注釋lSanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白LEEIIKNLDILDEQIMTYHNSIDEL(SEQIDNo.22)Sanger3.170317pos.35-59Pfa3D71pfal—chr41PFD0330wl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置LKELEKKNDILSNDKNQLQKNLTQL(SEQIDNo.53)Sanger3.490349pos.68-92Pfa3D71pfal—chr41PFD0520cI注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置LSEGNKELEKLEKNIKELEETNNTL(SEQIDNo.54)Sanger3.160316pos.1201-1225Pfa3D7lpfal—chr4lPFD0545wl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置LNHLTNNLSHHNNHMNHHTSNLNHI(SEQIDNo.55)13<image>imageseeoriginaldocumentpage14</image>IPLNQKVLEISKKLNNMNNNINEYKNYLSNFIHMLKE(SEQIDNo.63)Sanger4.600460pos.1734-1760Pfa3D7|chr6|MAL6Pl.80l注釋ISanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置=37Sanger3.110311pos.1436-1460Pfa3D7|chr6|MAL6Pl.307l注釋ISanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置Sanger3.220322pos.525-549Pfa3D71chr6IMAL6P1.2721注釋lSanger(蛋白編碼)核糖核酸酶,推定位置UKKDEEIKHLNESIYILQQNMNNL(SEQIDNo.66)Sanger3.320332pos.14-38Pfa3D7|chr6IMAL6P1.2541注釋lSanger(蛋白編碼)4fr定的蛋白位置FDAYNEKLGSISQSIDEIKKKIDNL(SEQIDNo.67)Sanger3.080308pos.7581-7613Pfa3D7|chr6|MAL6Pl.147l注釋ISanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置^DSMNNHKDDM匪YNDNINNYVESMNNYDDIMM(SEQIDNo.68)Sanger3.570357pos.3412-3441Pfa3D7Ichr6IMAL6P1.1311注釋lSanger(蛋白編碼)SET-結(jié)構(gòu)域蛋白，推定的Sanger—13.300330pos.48-72Pfa3D71chr7IMAL7P1.131注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置IDVIKNKHMLNEKINSLEEKLIEM(SEQIDNo.70)Sanger—23.620362pos.76-106Pfa3D7Ichr7IMAL7P1.131注釋ISanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置SNKTFEKLNEKLNDIRNDVTNYKNELEEFKN(SEQIDNo.71)Sanger3.240324pos.129-167Pfa3D7Ichr7IPF07—0014I注釋lSanger(蛋白編碼)4侏定的蛋白位置=12NSLDYYKKVIIKLKNNINNMEEYT冊ITNDINVLKAHID(SEQIDNo.72)Sanger3.340334pos.67-91Pfa3D7Ichr7IPF07—00211注釋ISanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置=22MDTVYKNII腿S麗MTQMYNSMNNM(SEQIDNo.73)Sanger_l4.670467pos.785-809Pfa3D71chr7IPF07—00861注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置VNKM躍V翻NEEV翻NEEV腳卿IDNo.74)Sanger一24.470447pos.806-830Pfa3D71chr7IPF07—00861注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置VNKMNKEVNKMDEEVNKMNKEVMM(SEQIDNo.75)Sanger3.580358pos.122-146Pfa3D7|chr7|PF07—Ollll注釋ISanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置-coLKSVDNYLEKINN(CIKDLDDNINDR(SEQIDNo.76)Sanger3.060306pos.1677-1703Pfa3D7Ichr7IMAL7P1.162|注釋lSanger(蛋白編碼)動(dòng)力蛋白重鏈，推定的QMEGFQKQLDRLSDSLSKIQKALGEYL(SEQIDNo.29)Sanger3.330333pos.874-898Pfa3D71chr8IMAL8P1.12|注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置INNLETNINDYNKKIKEGDSQLNNI(SEQIDNo.77)Sanger3.080308pos.35-62Pfa3D71chr8IPF08—0048|注釋lSanger(蛋白編碼)ATP依賴性螺旋酶，推定的EKLKKYNNEISSLKKELDILNEKMGKCT(SEQIDNo.78)Sanger3.020302pos.351-375Pfa3D7Ichr8IPF08—00601注釋lSanger(蛋白編碼)富含天冬酰胺抗原位置FDNVNENFESINEPYDSINEPYDNI(SEQIDNo.79)Sanger3.000300pos.310-334Pfa3D7Ipfal—chr91PFI1430wl注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置ioFNRLNKELNELRERYDHIIKHKKQM(SEQIDNo.80)TIGR—13.000300pos,482-506Pfa3D7|chr101PF10—0195I注釋IT1GR(蛋白編碼)推定的蛋白位置^omLQDLKKKKNLLQEEITNYKEEIKTL(SEQIDNo.81)TIGR—23.120312pos.608-632Pfa3D71chrlOIPF10—0195|注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置-comLIILDNKEKQNQQNINHLKEEINSM(SEQIDNo.82)TIGR3.030303pos.1755-1779Pfa3D7|chr101PF10—0212|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置^omplINEEENSLNEMKEDINEYVEMENKL(SEQIDNo.83)TIGR3.200320pos.160-184Pfa3D71chrilIPF11—05251注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置^omplMNKLKDEEKKIQEEEKKLNEELENI(SEQIDNo.84)TIGR3.080308pos.244-268Pfa3D7IchrllIPF11—0108|注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白，4呆守位置LSGLQNSLSGUTPLSGLQNSLSGL(SEQIDNo.85)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>MCELNVMENNM麗IHSNNNNISTHMDDVIE(SEQIDNo,96)Stanford-13.170317pos.1463-1487Pfa3D7lchrl2lPFL0350cl注釋lStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置LKEYSSKLQEREKKLKEKKNELQKV(SEQIDNo.97)Stanford—24.110411pos.2030-2054Pfa3D71chrl21PFL0350c|注釋ISUnford(蛋白編碼)推定的蛋白位置IDNINKNINCINNDVDNINSNINNI(SEQIDNo.98)Stanford3.130313pos.239-272Pfa3D7|chrl2|PFL0770wl注釋lStanford(蛋白編碼)絲氨酸-tRNA合成酶,推定的KIQIEEIKKETNQINKDIDHIEMNIINLKKKIEF(SEQIDNo.99)Stanford4.360436pos.329-355Pfa3D71chrl21PFL1135c|注釋lStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置N1NSVNNNINSVDNN1NNVDNN1NSVN(SEQIDNo,31)Stanford3.220322pos.297-321Pfa3D7lchrl2lPFL0125cl注釋lStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置IEIEREKINQLQEEIKKLQNEKNDL(SEQIDNo.100)Stanford3.670367pos.604-633Pfa3D7|chrl2|PFL1235cI注釋IStanford(蛋白編碼)4fr定的蛋白位置TYTLSKLNNQINELTKKINILRGNLDKARK(SEQIDNo,101)Stanford3.440344pos.506-540Pfa3D7lchrl2lPFL1605wl注釋ISUnford(蛋白編碼)推定的蛋白位置KNDINVQLDDINVQLDDINVQLDDINIQLDEINLN(SEQIDNo.102)Stanford-13.380338pos.190-214Pfa3D71chrl21PFL1930wl注釋lStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置KEEINEKLQLL顯DLDKJCNEELNL(SEQIDNo.103)Stanford—23-190319pos.3629-3653Pfa3D71chrl21PFL1930wl注釋lStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置IKNL麗EINTLNDMLKDSEEEIRML(SEQIDNo.104)Stanford—33.350335pos.3963-3987Pfa3D71chrl2|PFL1930wl注釋lStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置LNHIINELEIKREEINQMNNKLNEL(SEQIDNo.105)Stanford-43.540354pos.4776-4800Pfa3D71chrl2|PFL1930wl注釋IStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置VKILKKRLNSISNDLEKRTEEIEHL(SEQIDNo.106)Stanford-53.380338pos.5456-5480Pfa3D7lchrl2lPFL1930wl注釋IStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置INVLNDEITKLKNEINTYKNDLKNI(SEQIDNo,107)Stanford—63.480348pos.5613-5637Pfa3D71chrl21PFL1930wl注釋lStanford(蛋白編碼)推定的蛋白位置INKLNQQINYLQDDINSKSDNIISL(SEQIDNo.108)Stanford3.260326pos.117-146Pfa3D7lchrl2lPFL2310wl注釋IStanford(蛋白編碼)推定的蛋白,保守的NFFLEQMENDMSSTYDKMNRINMDLSKLKR(SEQIDNo.109)Stanford-13.180318pos.515-543Pfa3D7lchrl2(PFL2520wl注釋lStanford(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白EKLYILEKSINKLKKLLNDINNKYQTIKK(SEQIDNo.110)Stanford—23.430343pos.723-747Pfa3D7|chrl2|PFL2520wl注釋lStanford(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白LNQVLEKYEELKKNINEYSKEENKL(SEQIDNo.Ill)Sanger3.160316pos.446—478Pfa3D71chrl3—lIPF13—00651注釋lSanger(蛋白編碼)空泡ATP合酶catalytTSFSKYVRQLEQYFDNFDQDFLSLRQKISDILQ(SEQIDNo.112)Sanger3.070307pos.16—45Pfa3D7|chrl3—11PF13—0088|注釋lSanger(蛋白編碼)Mybl蛋白位置-complemEKLVKHLDVIDKUENIYDMNNLNEYIM(SEQIDNo.113)Sanger3.360336pos.956-980Pfa3D71chrl3—lIPF13—0097|注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置Sanger_l3.570357pos.864-888Pfa3D71chrl3—1IMAL13P1.96|注釋lSanger(蛋白編碼)染色體分離蛋白INEIEKKIEDIEKNINITKENLKEL(SEQIDNo.115)Sanger—23.350335pos.885-909Pfa3D7Ichrl3_lIMAL13P1.961注釋ISanger(蛋白編碼)染色體分離蛋白LKELENKITELQSSFSSYENEMKHV(SEQIDNo.116)Sanger3.080308pos.102-126Pfa3D71chrl3—11PF13—0107|注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置IDDIDRNA印INKNYEHVNKNYEHV(SEQIDNo.117)Sanger3.210321pos.14-38Pfa3D7lchr13—11PF13—0120l注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置IDRQRDKINELEKKLEELRSSSEEL(SEQIDNo.118)Sanger3.060306pos.247-270Pfa3D7Ichrl3—1IMAL13P1.147|注釋|Sanger(蛋白編碼)4偉定的蛋白位置NIIQIKNDIEQCQKSIKKIEDNLNTYE(SEQIDNo.32)Sanger3.260326pos.2069-2105Pfa3D71chrl3—1|MAL13P1.1761注釋lSanger(蛋白編碼)惡性癡原蟲retTIVQNSYNSFSDINKNINDIDKEMKTLIPMLDELLNE(SEQIDNo.119)Sanger—13.200320pos.912-936Pfa3D7lchr13—1IPF13—0198i注釋lSanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白ISELEQEFNNNNQKLDNILQDINAM(SEQIDNo.120)Sanger—23.260326pos.2139-2171Pfa3D71chrl3—11PF13—0198|注釋lSanger(蛋白編碼)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白MEIKTIVQNSYNSFSDINKNINDIDKEMKTLI(SEQIDNo.121)Sanger3.380338pos.618-642Pfa3D7Ichrl3_1|MAL13P1.2021注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置MLSLQ匪IDKLKKSN麗LNEDLRKK(SEQIDNo.122)Sanger3.130313pos.1135-1159Pfa3D71chrl3—lIPF13—02391注釋lSanger(蛋白編碼)4,定的蛋白位置MNLLREILKLMTDNIDTLKDKINEI(SEQIDNo.123)Sanger1130313pos,1040-1066Pfa3D71chrl3—lIPF13—02771注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置YIDDVDRDVENYDKGIANVDHHLNDVH(SEQIDNo.33)Sanger3.400340pos.284-312Pfa3D7Ichrl3_1IMAL13P1.3041注釋lSanger(蛋白編碼)疸疾抗原位置—oGGLKNSNHNL麗IEMKYNTL麗NMNSINK(SEQIDNo.124)Sanger4.170417pos.388-414Pfa3D71chrl3JIMAL13P1.3361注釋lSanger(蛋白編碼)推定的蛋白位置TIGR3.080308pos.408-440Pfa3D7|chrl41PF14—00131注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置^omplPYLRRAKHNL麗LQGGI麗LYSSVNVVYDNLFN(SEQIDNo.125)TIGR3.410341pos.397-423Pfa3D7|chrl41PF14—00451注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置^complARDDIQKDINKMESELINVSNEINRLD(SEQIDNo.35)TIGR3.000300pos.97-123Pfa3D7|chrl4|PF14—0089l注釋lTIGR(蛋白編碼)4扭定的蛋白位置-co即lNITNIMKNlEfaODMSNLNMMMDSNQ(SEQIDNo.38)TIGR3.240324pos.231-257Pfa3D71chrl4IPF14—00931注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置=joinSSNNLSDQ1N1LNNNIQHINSTF卵LR卿IDNo.36)TIGR3.010301pos,3419-3445Pfa3D71chrl41PF14—0175|注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置womTIGR3.240324pos.125-149Pfa3D7lchrl4lPF14—0385l注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置-joinLNSLERTVASLKNNEKQLHNN1QKI(SEQIDNo.126)TIGR3.370337pos.7-38Pfa3D7|chrl4|PF14—0397|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白，保守位置SLLDTLEKSVKGIDENIEKYNKELNV1KQKIE(SEQIDNo.127)TIGR3.710371pos.70-100Pfa3D7|chrl4IPF14—0444|注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置-complNNEMDETINKLKKDINKLNEKIEKYDNFMKM(SEQIDNo.128)TIGR3.130313pos,294-318Pfa3D7khrl4lPF14—0504l注釋lTIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置-co即lIDELENKIEKLKNELSKNSHNNNNI(SEQIDNo.129)TIGR-l3.870387pos.550-574Pfa3D71chrl41PF14_05351注釋|TJGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置=230INNIDDHI,IDDHINNIDDHI,I(SEQIDNo也130)TIGR-23.470347pos.522-546Pfa3D7|chrl41PF14—0535|注釋|TIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置=230INNIDDNK匪IDDHI麗IDDHINNI(SEQIDNo.131)T工GR3.070307pos.166-190Pfa3D7|chrl41PF14—05741注釋ITIGR(蛋白編碼)推定的蛋白位置=24538LKSLNEKIKNYDSIIEEQKNQLENL(SEQIDNo.132)PFB0765wlKLEEMKQKNKELINNLNDISDELKNCIEQVNSVSRNMANVEK(SEQIDNo,134)PF07—0021IKNMDTVYKNIINMS麗MTQMYNSMNNMSHNIINASHDMMDASGNINSH(SEQIDNo.135)PFB0315wlEKMNMKMEQMDMKMEKIDVNMDQMDVKMEQMDVKMEQMDVKMKRMNK(SEQIDNo.136)MAL8P1.12IKNKLNKKWEQINDHINNLETNINDYNKKIKEGDSQL冊IQLQCENIEQKINKIKE(SEQIDNo.137)PF07—0086INEMNKEVNKMNEEVNKMNEEVNKMNEEVNKMNKEVNKMDEEVNKMNKEVNKMNK(SEQIDNo.138)MAL13P1.96IEIINEIEKKIEDIEKNINIT!CENLKELENKITELQSSFSSYENEMKHVVKKIEDLEK(SEQIDNo.139)PFC0345wlQNKMENDMNIIKNDMNIMENDMNIMENDMNIIKNDMNIMEKDMNIIKNDMNIIK麗MNIIKNEMNIIKNV(SEQIDNo.140)PFL0115wlDFLDVIYYKLNIKEINKSLTEVKNELTELQKNQEEAKNILAFK(SEQIDNo.141)PFL0350clASIDNINOINCINNDVDMNSNINNINDNIHKINSNVYGN(SEQIDNo.142)PFL1930wlNF1KELELQIKNLNNEINTLNDMLKDSEEEIRMLNHTLEEK(SEQIDNo.143)PFL1930wlnnEINVLNDEITKLKNEINTYKNDUNINATLDFYKST(SEQIDNo.144)PF13—0120INVLEYAELIIDRQRDKINELEKKLEELRSSSEELQKNVIK(SEQIDNo.145)PF13—02391G1FIYNMNLLREIULMTDN1DTLKDKINEIKCSYAFLK(SEQIDNo.146)PFD0520clTKKLNKELSEGNKELEKLEKNIKELEETNNTLENDIKV(SEQIDNo.147)PF07—0111INFV麗YINENILNLKSVDNYLEKINNKIKDLDDNINDR(SEQIDNo.148)MAL6P1.2541PDFDAYNEKLGSISQSIDEIKKKIDNLQKEIKVANK(SEQIDNo,149)PFll—04241QLEEKTKQYNDLQNNMKTIKEQNEHLKNKFQSMGK(SEQIDNo.150)PFD0970clEN1NNMDEK1NNVDEQNNNMDEKINNVDEKK(SEQIDNo,151)PF14—05741EKGLKSLNEKIKNYDSIIEEQfCNQLENLKM(SEQIDNo.152)PF13—01981TISELEQEFNNNNQKLDNILQDINAMNLNINILQT(SEQIDNo.153)MAL6P1.37(PEG)PFB0145c(PEG)PF14—00891KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT(PEG)TISSLSNKIVNYESKIEELEKELKEVK(PEG、)NITNINKNIENIKNDMSNLNNMNDSNQ(SEQIDNo.154)PFA0170c(PEG)MAL6PL37(PEG)PFB0145c(PEG)PF14—00891NITNINKNIENIKNDMSNLNNMNDSNQ(SEQIDNo.155)MAL13P1.304(PEG)PF08—0048IMUKyNNEISSLKKELDILNEKMGKCT(PEG)GGLKNSNHNLNNIEMKYNTLNNNMNSINK(SEQIDNo.156)PFB0145c(PEG)MALI3P1.304(PEG)PF08—0048INo.157)PFD0520c(PEG)PF08—0048(PEG)MAL6P1.37ITKKLNKELSEGNKELEKLEKNIKELEETNNTLENDIKV(PEG)EKLKKY麗EISSLKKELDILNEKMGKCT(PEG)KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT(SEQIDNo.158)PFD0520cl(AcNH)KDKMHQEMEKFKKDRKNLQLNLKNTRKNHEFLKNKMQNLVLTMKKSTADDKRFQY(SEQIDNo.159)PFD0520clEIIDKDIIYMKSRINIMRENADKNNQKYDKIVSQKDKMHQEMEK(SEQIDNo.160)PFD0520clIKELEET麗TLENDIKVEMNKGNLYKSRLALLKKNKVRISKAQEnDKDIIYMK(SEQIDNo，161)PFD0520clFm。c-SIQRIKHLEGLTKKLNKELSEGNKELEKLEKNIKELEETNNTLENDIKVEMNKGNLYKSRLALLKKNKVRISKAQEIIDKDIIYMK(SEQIDNo.162)PFD0520clMRHKISENEIINKIDSINLKEVKDASACM麗YTNFISIKLKKNREGIIHSIQRIKHLEGL(SEQIDNo.163)在這163條Jltf列中，隨M取95個(gè)巻曲螺旋片斷(30-70個(gè)M酸長并且具有最高的巻曲螺旋分值)并且它們或者存在于相同蛋白中或者存在于不同蛋白中。這95個(gè)選取的抗原肽中的大部分可被一組生活在病區(qū)的M的血清不同程度地識(shí)別(5-93%)(表2)。表2使用來自布基納法索的37份成人血清、來自坦桑尼亞的42份成Ajk清和來自哥倫比亞的39份成人血清對95個(gè)合成肽進(jìn)行的抗體反應(yīng)。結(jié)a示為°/。(值〉平均陰性對照+3SD)、比率(實(shí)驗(yàn)OD/平均OD陰性對照)和未測定(nd)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>因此，識(shí)別了長度為200-10，000個(gè)M酸的71個(gè)新蛋白。將這些蛋白中的兩個(gè)包含抗原肽(SEQIDNo.38;147)的蛋白(蛋白PF14—0089;PFD0520c)經(jīng)化學(xué)合成為單個(gè)多肽或者重疊多肽，并且用ELISA試i^i行識(shí)別測試(j^2)。這些新的蛋白片段可被15-100%的來自布基納法索、坦桑尼亞和來自哥倫比亞的成人血清識(shí)別。親和純化的抗體可識(shí)別感染寄生蟲的紅血細(xì)胞。另外，來自蛋白PF14-0089的片段還與坦桑尼亞兒童中的保護(hù)作用相關(guān)(數(shù)據(jù)未顯示)。"生物學(xué)活性片段"是指包含的M酸長度比本發(fā)明的肽序列長^S的序列的-"^P分。只要該序列表現(xiàn)出與其所來源的天然序列相同的性質(zhì)，就可以使用該序列。優(yōu)選地，該序列包含的氨基酸長度為本發(fā)明的相應(yīng)肽序列的不到30%，優(yōu)選地不到60%，特別地不到90%。另夕卜優(yōu)逸地，那些序列包^:度為至少20、最優(yōu)選25、更優(yōu)選40、再更優(yōu)選50個(gè)與本發(fā)明的肽序列相同的連續(xù)絲酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法和技術(shù)制備這些生物學(xué)活性片段，所述方法和技術(shù)例如化學(xué)合成(例如使用多通道肽合成儀)。200680038012.7說明書第24/45頁另外，由于天然肽(L-型)本身存在被天然蛋白酶降解的問題，可以制備的本發(fā)明的肽以使其包括D-型的所述肽和/或所述肽的"iJL^異構(gòu)體"。優(yōu)選地，制備本發(fā)明的肽的截短部分、變體或者結(jié)合的i^異構(gòu)體。"i^異構(gòu)體"的意思是與一個(gè)線性肽的序列方向相反并且每個(gè)氨基酸殘基手'一目反的異構(gòu)體；因此，可以不存在末端基團(tuán)的互補(bǔ)。因此，防止所述肽的天然蛋白水解可以提高所述特定的雜二價(jià)或者雜多價(jià)化合物的效力。因?yàn)槊馐芴烊坏鞍酌傅慕到?，可以預(yù)測逸l向的肽比非逆反向的類似物具有更高的生物活性。而且逆良向的肽已經(jīng)顯示出更高的穩(wěn)定性和更低的免疫原性[SelaMandZis咖nE.,(1997)DifferentrolesofD-aminoacidsinimmunephenomena—FASEBJ.11，449]。依照例如SelaandZis咖n,(1997)中所述制備已知序列肽的狄肽。本發(fā)明還包括所述抗原肽的修飾(所述修飾通常不改變一級序列)，包括肽的體內(nèi)或者體外化學(xué)衍生化，如乙?；蛘唪然?。還包括糖基化修飾，例如通過在肽的合成和處理中或者在進(jìn)一步的處理步驟中對所述肽進(jìn)行糖基影響i基化的酶相接觸)來實(shí)現(xiàn)的;些糖基化修飾:^包括i有磷i化M酸殘基的序列，所述磷酸化氨基酸^J^例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或者磷酸蘇氨酸。本發(fā)明還包括本發(fā)明的抗原肽的分子嵌合體。"分子嵌合體"意欲指可以包含所述抗原肽的一個(gè)功能部分并且可以通過例如本領(lǐng)域4支術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)獲得的多核苷酸或者多l(xiāng);Uf列。本發(fā)明還考慮了所述抗原肽序列或者其片段或亞部分的特定結(jié)合。優(yōu)選地，如實(shí)施例4中所乂>開的，所述結(jié)合抗原狀選自肽LR162(SEQIDNo.154)、LR162A(SEQIDNo.155)、LR179(SEQIDNo.156)、LR179A(SEQIDNo.157)和LR181(SEQIDNo.158)。本發(fā)明還包括所述抗原肽的變體。術(shù)語"變體"指具有在某種程度上與天然序列多肽不同的^J^/^列的多肽，即由一個(gè)或者多個(gè)M酸被其^f&^酸置換引起的不同于所述天然3D序列的tt酸序列。所述變體可以是天然存在的(例如多態(tài)現(xiàn)象)也可以是合成的。變體具有在天然tt酸序列的M酸序列中特定位置的置換、缺失和/或插入。^J^酸的置換在本文凈iL^義為以下五組^L一中的交換I.小脂肪族的、非極性或微極性戎基Ala，Ser，Thr,Pro,GlyII.極性的、正電荷戎基His,Arg，LysIH.極性的、負(fù)電荷絲和它們的酰胺Asp，Asn，Glu，GlnIV.較大的、芳香族絲Phe，Tyr，TrpV.較大的、脂肪族的、非極性絲Met,Leu，Ile，Val，Cys。非天然#^酸也可以通過化學(xué)合成引入。本發(fā)明還涉及一種癡原蟲物種的混合抗原組合物，所述組合物包含至少2種本發(fā)明的抗原肽或者其混合物。本申請人已經(jīng)證明，由于對多種抗原(所述抗原可以參與相同或者不同的致病機(jī)制)同時(shí)發(fā)生免疫應(yīng)答出人意料地會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)且持久的保護(hù)，利用本發(fā)明的混合抗原組合物可以提高疫苗的性能。所述抗原肽可以是游離的或者連接在一起。若所述抗原肽連接在一起，它們優(yōu)i^fc通過一種例如PEG(聚乙二醇)的連接物連接起來。優(yōu)選地，所述混合抗原組合物選自SEQIDNo.1、2和3的結(jié)合，或者SEQIDNo.16、33、38和2的結(jié)合,或者SEQIDNo.35、27、4、34、24和37的結(jié)合。本發(fā)明還包^^^發(fā)明的抗原M者混合抗原組合物用于制備刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的疫苗組合物的用途。所述"哺乳動(dòng)物"指4壬何歸于哺乳動(dòng)物類別的動(dòng)物，包4^人、家養(yǎng)和農(nóng)場動(dòng)物和動(dòng)物園動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗、馬、貓、牛、猴等等。優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物為人。為了M刺激的免疫應(yīng)答，優(yōu)i^^將肽SEQIDNO:1-163或者所述4給抗原組*與^(可的栽體^^或者載體蛋白偶聯(lián)?？梢証J1各種蛋白、糖蛋白、碳水^^物或者亞#栽體，包括但不限于破傷風(fēng)類毒素/毒素、白喉類毒素/毒素、^f^單胞菌突變栽體、細(xì)菌外^^白、水晶狀細(xì)菌細(xì)^4ji:、各種內(nèi)毒素或外毒素、血清白蛋白、Y-球蛋白或鑰孑U1^藍(lán)蛋白、重組體、外毒素A、LT毒素、霍亂B毒素、克雷白WMt菌OmpA、細(xì)菌鞭毛、^^^狀芽J!W菌重組毒素A、肽樹枝狀4化物(多重抗原肽)、泛DR表位(PADRE)、來自破傷風(fēng)毒素的通用T細(xì)J^4位、共生細(xì)菌、噬菌體(在其表面展示肽和細(xì)菌噬菌體)、與IgGl重組體連接的#/或^^適的組分。另外，由于佐劑可以增加免疫保護(hù)抗體滴度或者增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，所述SEQIDN0:1-163的肽或者所述混合抗原組合物或者它們與載體蛋白的綴^/可以進(jìn)一步地與佐劑》'a^以引ilitCS答。這種佐劑可包括但不限于MPL+TDM+CWS(SIGMA)、MF59(—種包括5%角豈烯、0.5%失水山梨醇單油酸酯和0.5%失水山梨醇三油酸酯水包油乳劑Chiron)、不耐熱毒素(HLT)、CRMig(白喉毒素的無毒遺傳突變體)角鯊烯(IDECPHARMACEUTICALSCORP.)、卵清蛋白(SIGMA)、Qui1A(SARGEANT，INC.)、磷酸鋁艦(SUPERFOSBI0SECT0R)、霍亂全毒素(CTLISTBIOLOGICALLAB.)、霍亂毒素B亞基(CTB)、霍亂毒素A亞基-蛋白AD-片斷融M白、胞壁Sfe^肽(MDP)、Adjumera(聚磷腈，VIRUSRESEARCHINSTITUTE),SPT(—種在pH7.4磷酸鹽緩沖鹽水中含5%角蓳烯、0.2%吐溫80、1.25%普盧蘭尼克L121的乳劑)、阿夫立定(M6PHARMACEUTICALS),BayR1005(BAYER)、Calcitrol(SIGMA)、磷酸釣?zāi)z(SARGEANTINC.)、CRL1005(嵌段共聚物P1205,VAXCELCORP.)、DHEA(MERCK)、DMPC(GENZYMEPHARMACEUTICALSandFINECHEMICALS)。DMPG(GENZYMEPHARMACEUTICALSandFINECHEMICALS)、y菊粉、Gerbu佐劑(CCBIOTECHCORP.)、GM-CSF、(IMMUNECORP.)、GMDP(PEPTECHLIMITED)、口米全末特(3MPHARMACEUTICALS)、I咖Ther(ENDOREXCORPORATION)、ISCOMTM(ISCOTECAB)、Iscopr印7.0.3TM(ISCOTECAB)、洛索立賓、LT-口服佐劑(不穩(wěn)定的大腸桿菌腸毒素、原毒素，BERNAPRODUCTSCORP.)、MTP-PE(CIBA-GEIGYLTD)、Murametide，(VACSYNS.A.)、Murapalmitine(VACSYNS.A.)、普盧蘭尼克L121(IDECPHARMACEUTICALSCORP.)、PMMA(INSTITUTFURPHARMAZEUTISCHETECHNOLOGIE)、SAF-1(SYNTEXADJUVANTFORMULATIONCHIRON)、石B旨酰酪氨酸(BIOCHEMTHERAPEUTICINC.)、Theramidea(I隨NOTHERAPEUTICSINC.)、蘇氨it^-MDP(CHIRON)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁、溴化二甲基雙十八烷基銨、Adjuvax(ALPHA-BETATECHNOLOGY),注射明諷(PIERCE)、單磷酸類脂A(RIBII薩NOCHEMRESEARCH)、MPL+TDM(RIBII畫NOCHEMRESEARCH)、Titermax(CYTRX)、QS21、tRibi佐劑系統(tǒng)、TiterMaxGold、QS21、Adjumer、Calcitrol、CTB、LT(大腸桿菌毒素)、LPS(脂多糖)、阿夫立定、CpG序列(Singhetal.、1999Singh,M.andHagum，D.，NatureBiotechnology199917:1075—81)毒素、類毒素、糖蛋白、脂質(zhì)、糖脂、細(xì)菌細(xì)胞壁、亞基(細(xì)菌的或病毒的)、,分(單糖、二糖、三糖、四糖、##和多糖)、各種脂質(zhì)體制劑或者皂戒。各種佐劑的組合可以與所述抗原""^使用以制備免疫原制劑。也可以使用胃腸外給藥或者誘導(dǎo)粘a疫的佐劑。本發(fā)明還考慮了一種用于刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其特*于所^i且，包t種抗原M者一種》U^抗原組，。所述疫苗組^可有各種不同的給藥方式，所*藥方式包括血管內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、鼻部或者^A^給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所iti且合物可以進(jìn)一步地包^""種可藥用的賦形劑和/或栽體。本發(fā)明中使用的"被給予"或者"給予"是指使一種藥物、治療劑、診斷劑或者藥物組合物、治療組合物、診斷組合物與所述受"^接觸，所述受^r優(yōu)選為人。載體綴*以;^藥途徑。當(dāng)使用多于一種的抗原肽(例如兩種或者更多種)或者混合抗原組合物的時(shí)候，它們佳月形式可以是可形成一種結(jié)合物的物理混合物形式，或者是兩種或多種抗原肽的融合物形式。所^合物的產(chǎn)生可以通過例如重組#^支術(shù)、使用合適的連接物融合預(yù)先制備的抗原肽，或者在存在或不存在例如PEG(聚乙二醇)等的連接物的糾下共線性合成所i^絲來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還包括一種抗體，其特征在于它可以識(shí)別本發(fā)明的抗原肽或者本發(fā)明的^^抗原多且^。本文使用的"抗體"是一種與特異性抗原反應(yīng)的蛋白分子，并且根據(jù)結(jié)構(gòu)特征屬于如下五種不同類型的一種IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。所述i^可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體。本發(fā)明的抗體也可以被制備用于被動(dòng)免疫治療，用作診斷試劑，以及用作例如親和色譜等其他方法中的試劑。當(dāng)本發(fā)明的抗4^皮應(yīng)用于被動(dòng)免疫治療中的時(shí)候，可以將它包括在一種藥物組合物中并給予哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組*包括一種可藥用的載體并且^it^可以包括可藥用的賦形劑。所述藥物組^可以通itii管內(nèi)、Jtt內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、鼻部或者氣霧pA7v給藥。優(yōu)i^i也，所述藥物組^^通itik管內(nèi)、肌內(nèi)、口服、鼻部或者氣霧^IA給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種針對本發(fā)明的抗原肽或者混合抗原組合物的抗體，特別是一種單克隆抗體。M而言，可根據(jù)已知的遺傳工程方法(WinterG.，andMilsteinC.，Nature,1991,349293-299),4^I肽SEQIDNO:1-163產(chǎn)生雜交瘤，使用這些雜交瘤可以制備重組體f;f生抗體。優(yōu)選地，如實(shí)施例2和表3所公開的，所述抗體選自ot-8、oc-9、oc-ll/12、ot-13、ot-14、a—27、a-86、a-102、a-99、a—68、a—41、a—110、a-78、a-135、a-136、a-138、oc-146和a-151或者其》'^^。法。這些方法可以包括但不局限于ABGENIXINC.開發(fā)的xenomouse技術(shù)CC美國專利No.6，075,181和6，150，584)和BI0VATI0N、BIOINVENTINTERNATIONALAB、PROTEINDESIGNLABS、APPLIEDMOLECULAREVOLUTIONINC.、IMMGENICSPHARMACEUTICALSINC.、MEDAREXINC.、CAMBRIDGEANTIBODYTECHNOLOGY,ELAN、EOSBIOTECHNOLOGY,MEDI畫NE、MORPHOSYS、UROGENSYSINC.、AVANIRPHARMACEUTICAL/XENEREXBIOSCIENCES,AFFIBODYAB、ALLEXIONANTIBODYTECHNOLOGIES,ARIUSRESEARCHINC.、CELLTECH、XOMA、IDECPHARMACEUTICALS,NEUGENESIS、EPICYTE、SEMBIOSYSGENETICSINC.、BIOPROTEIN、GENZYMETHERAPEUTICS,KIRIN、GEMINISCIENCES,HEMATECH開發(fā)的方法。類似地，也可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的其他方法篩選針對SEQIDNO:1-163的人抗體分泌細(xì)胞。本文^fU的術(shù)語"人源化M"或者，類似術(shù)語是指一種至少其一部分包含人蛋白序列的抗體。人蛋白序列的量可能根據(jù)所述抗體的制備方法而不同。本文用術(shù)語"完全人源化的抗體"或者"人抗體"或者類似術(shù)語表示的抗體的制備可以通過例如上述xenomouse沖支術(shù)或者用EB病毒(EpsteinBarrvirus)轉(zhuǎn)4認(rèn)B細(xì)胞(Traggiaietal，Nat.Med.2004,10(8):871-5)實(shí)現(xiàn)。也可以通過例如噬菌體展示技術(shù)等其他方法來制備(BradburyAR，MarksJD，J.i咖unol.Methods,2004，290(1-2):29-49)。術(shù)語"識(shí)別"是指本發(fā)明的抗體可針對本發(fā)明的抗原M者混合抗原組合物并且與^合的。當(dāng)應(yīng)用重組4支術(shù)制^^本發(fā)明的抗原肽的時(shí)候，優(yōu)i^fe/f^1編碼所述多肽的核酸M或者其片段。因此，本發(fā)明還涉及純化的和分離的核^列，所#列包括i)編碼本發(fā)明的一種抗原肽的核苷酸序列，ii)與i)互補(bǔ)的核酸序列，iii)i)或者ii)的簡并核^f列，iv)在嚴(yán)旨降下能與i)、ii)或者iii)雜交的核酸序列，v)編碼本發(fā)明的抗原肽的截短物或者類似物的核酸序列，vi)和/或編碼本發(fā)明的所述抗原肽的生物活性片段的i)、ii)、iii)、iv)或者v)的片段。根據(jù)本發(fā)明，"純化的和分離的核酸序列"是一指為編碼^^發(fā)明的抗原肽的核酸分子或者編碼該抗原肽的核酸的狀態(tài)。核酸應(yīng)游離于或^^上游離于與之天然相關(guān)的物質(zhì)之外，所述物質(zhì)例如為與所i^核酸共存于天然環(huán)境或其制^^環(huán)境(例如細(xì)皿養(yǎng))中的多肽或核酸，所述制備環(huán)境為通過重組核酸技#體外或體內(nèi)進(jìn)行制備時(shí)的環(huán)境。術(shù)語"核酸"意^t指DNA或者RM。若核酸為DNA，則本發(fā)明中可以使用的DNA可以是任何的多脫氧核苷^列，包括例如雙鏈DNA、單鏈DNA、其中一條或兩條隨由兩個(gè)或多個(gè)片段構(gòu)成的雙鏈DNA、其中一條或兩^^具有連續(xù)的磷酸二酯主鏈的雙鏈DNA、包t個(gè)或多個(gè)單^^部分和一個(gè)或多個(gè)雙^^部分的DNA、DNA鏈完全互補(bǔ)的雙鏈DNA、DNA鏈僅部分互補(bǔ)的雙鏈DNA、環(huán)狀DNA、共價(jià)閉合DNA、線狀DNA、共價(jià)交聯(lián)DNA、cDNA、化學(xué)合成DNA、半^^成DNA、生物^^成DNA、天然分離的DNA、酶消化的DNA、剪切的DNA、標(biāo)記的DM(例如it射性標(biāo)記的DNA和熒光標(biāo)記的DNA)、包^-種或多種非天然存在的核酸種類的DNA?？梢酝ㄟ^例如磷酸三酯法等的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)^支術(shù)或者通過自動(dòng)合成方法和PCR方法合成編碼本發(fā)明的抗原Wl其片段的DNA序列。也可以通過S^支術(shù)制^^編碼4^發(fā)明的抗原肽的純化的和分離的DNA序列。因此，可以用P艮制酶(可在設(shè)定的識(shí)別序列處切割核酸M)將核酸序列從包含該核^列的較大核酸^中分離出來，所述核^列例如編碼本發(fā)明的抗原肽或者其片段的DNA(或RNA)。本發(fā)明還涵蓋多核糖核苷酸(RNA)形式的核酸，包括例如單鏈RNA、雙鏈RNA、其中一條或兩條隨由兩個(gè)或多個(gè)片段構(gòu)成的雙鏈RNA、一條或兩a具有連續(xù)的磷酸二酯主鏈的雙鏈RNA、包t個(gè)或多個(gè)單鏈部#一個(gè)或多個(gè)雙鏈部分的RNA、RNA鏈完全互補(bǔ)的雙鏈RNA、RNA鏈僅部分互補(bǔ)的雙鏈RNA、共價(jià)交聯(lián)RNA、酶消化的RM、剪切的RNA、mRNA、化學(xué)合成的RNA、半合成的RNA、生物^^成的RNA、天然分離的RNA、標(biāo)記的RNA(例如ii射性標(biāo)記的RNA和熒光標(biāo)記的RNA)、包^-"種或多種非天然存在的核酸種類的RNA。所述純化的和分離的核酸序列(DM或者RNA)也包括與編碼本發(fā)明的抗原肽的核酸序列具有基本的序列同一性或同源性的純化的和分離的核酸序列。優(yōu)選地，所述核^本的序列同一性例如具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或者85%的核酸序列同一性；更優(yōu)選90%的核酸序列同一性；最優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%或者99%的核酸序列同一性。如本領(lǐng)域已知的那樣，且為本文所^^的"同一性"是兩個(gè)或多個(gè)^J^酸序列或者兩個(gè)或多個(gè)核酸序列之間的關(guān)系，這可以通過比較所述序列來確定。"同一性"也指在M齡列或者核^列之間序列相關(guān)的程度，視情況可以通itil些序列的字符串之間的匹配程度確定。同一性和相似性是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的術(shù)語并且可以通過常規(guī)的方法進(jìn)4ti十算(例如參見ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.ed.，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.ed.，AcademicPress,NewYork,1993jComputerAnalysisofSequenceData,PartI，Griffin,A.M.andGriffin，H.G.eds.，HumanaPress,NewJersey,1994jSequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje，G.AcadmeicPress,1987;andSequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.andDevereux，J.eds.M.StocktonPress,NewYork,1991，Carillo，H.andLipman,D.，SIAMJ.AppliedMath.48:1073,1988)。通常優(yōu)選那些被設(shè)計(jì)成可以產(chǎn)生所述序列之間最大匹配的方法。確定一致性和相似性的方法可以用可公開獲得的計(jì)算4^呈序編碼，所述計(jì)算;bl^包括GCG程序包(DevereuxJ.etal.，NucleicAcidsResearch12(1):387，1984);BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.etal.J.Molec.Biol.215:403-410，1990)。BLASTX程序可以從NCBI和其他來源公開地獲得(BLASTManual,Altschul，S.etal.NCBINLMNIHBethesda，Md.20894;Altschul，S.etal.J.Mol.Biol.215:403—410,1990)。本發(fā)明還涵蓋與本發(fā)明的抗原肽互補(bǔ)的核酸序列。由于存在遺傳密碼的簡并性，序列不同于編碼本發(fā)明的抗原肽的核酸序列或者其互補(bǔ)序列的簡并核*列#本發(fā)明的范圍以內(nèi)。由于存在遺傳密碼的簡并性,這種核酸編碼本發(fā)明的抗原肽的功能等價(jià)物,但是其序列卻有所不同。這可能產(chǎn)生不影響所述U酸序列的沉JR突變。伶f可的和所有的這類核酸變體都在;^發(fā)明的范圍以內(nèi)。另外，本發(fā)明還考慮了能夠在嚴(yán)4NHf下一一優(yōu)選高JL^4MHt下一一與序列。合適的皿DNA雜交的嚴(yán)^H^是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以參見CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，可以使用大約45"C的6.OX的氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后用50X:的2.oxssc洗滌一次?？梢愿鶕?jù)清洗步驟中的使用的M選捧嚴(yán)格程度。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以選擇一種50。C的大約0.2XSSC的高嚴(yán)4^度。另外，洗滌步驟中的溫度可以處于高^旨降，在大約651C下。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的抗原肽的純化的和分離的核酸，所述核酸包括編碼所述抗原肽的截短物或者類似物的核酸序列。4^發(fā)明還包括所7>開的純>(匕的和分離的核1^列的等^:基因變體；即，所述分離的和純化的核^A然存在的M形式，所述，形式也編碼與所述純化的和分離的核酸序列所編碼的抗原及bt目同、同源或者相關(guān)的抗原肽。另夕卜，可以通過誘變技術(shù)或者通過直^^成產(chǎn)生非天然存在的變體。本發(fā)明還考慮了所公開的純化的和分離的核^列的片段，所述片^!指所含核苷酸的長度比編碼所述抗原肽的核酸序列短的序列、其互補(bǔ)核酸序列或者其簡并核酸序列。只要該序列表現(xiàn)出與衍生它的天然序列相同的性質(zhì)，就可以佳月該序列。優(yōu)逸地，該序列包含的氨基酸的長度為所述抗原肽的相應(yīng)的純化的和分離的核酸序列的少于90%，優(yōu)^少于60%，特別地少于30%。本發(fā)明的另一考慮為提供一種包含上述編碼本發(fā)明抗原肽的純化的和分離的核酸序列的表達(dá)載體。為本領(lǐng)域所熟知，表達(dá)載體的選擇直接取決于希望獲得的功能棒性，例如抗原^Ji^待轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。另夕卜，所^達(dá)栽體可以進(jìn)一步包^"種可,;4i^接有本發(fā)明的純化的和分離的核酸序列的啟動(dòng)子。這^1指所連接的、編碼本發(fā)明的抗原肽的所述分離的和純化的核酸序列受到合適的調(diào)控序列的調(diào)控，所述調(diào)控序列使得所插入的分離的和純化的核酸序列可以表達(dá)即轉(zhuǎn)錄并翻譯。本文使用的術(shù)語"啟動(dòng)子"表示本領(lǐng)域已知的^^T其他調(diào)控序列，例如通常用于多#達(dá)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子、多腺苷酸化位點(diǎn)和剪接點(diǎn)，或者還可包括一個(gè)或多個(gè)分離的靶向序列，可^i^編碼可篩選標(biāo)記。只要啟動(dòng)子與宿主細(xì)l&^目容就可以使用，可用的啟動(dòng)子例如有從例如多瘤病毒、腺病毒(例如2型腺病毒)、乳頭狀瘤病毒(例如牛乳頭狀瘤病毒)、鳥類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒(例如鼠或人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(例如SV40早期和晚期啟動(dòng)子)等病毒基因組獲得的啟動(dòng)子或者從異種哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子^得的啟動(dòng)子，例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或者免疫^l蛋白啟動(dòng)子和熱^^克啟動(dòng)子?？梢允褂玫脑鰪?qiáng)子例如有已知來自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的增強(qiáng)子序列，或者例如SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤和腺病毒增強(qiáng)子等的來自JMt細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。許多的宿主/表達(dá)載體的組合都可用于表ii^發(fā)明的核酸序列。例如，有用的表達(dá)載體可以包含染色體DNA序列區(qū)段、非染色體DNA序列區(qū)段和合成DNA序列區(qū)段。合適的載體包括SV40和已知的細(xì)菌質(zhì)粒的衍生物，例如;U^桿菌質(zhì)粒colEl、pCRl、pBR322、pMB9以及它們的矛汴生物、例如RP4的質(zhì)粒；噬菌體DNA例如喧菌體X的衍生物(如NM989)和^fe喧菌體DNA(如Ml3)和絲狀單鏈嗟菌體DNA;例如2jt質(zhì)粒等的酵母質(zhì)?；蛘?，生物；在真核細(xì)胞中有用的載體，例如在昆蟲或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有用的載體；由質(zhì)粒和噬菌體DM組合產(chǎn)生的載體，例如為利用噬菌體DNA或者^4達(dá)調(diào)控序利而修飾的質(zhì)粒；等等。本發(fā)明的另一考慮為提供一種包含本發(fā)明的純化的和分離的核酸序列或者上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(真核的或者原核的)。通常，這種宿主細(xì)胞3皮轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染有本發(fā)明的純化的和分離的核酸序列或者本文描述的表達(dá)載體。術(shù)語"轉(zhuǎn)染的細(xì)胞"或者"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"或者"轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"的意思是被引入細(xì)l^卜DNA并且因此含有所述細(xì)胞夕卜DNA的細(xì)胞?？蓪⑺鯠NA$1入所述細(xì)胞中以使核酸可作為一種染色體整合部分復(fù)制或者作為染色體外部的元件復(fù)制。通過本領(lǐng)域所熟知方法，可完成用包括本發(fā)明的純化的和分離的DNA序利的表達(dá)栽體對合適的真核或者原核宿主細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染，所述熟知方法通常依據(jù)^JI的載體類型而定。關(guān)于這些方法可參見例如胞/7/a";yWa丄1982，MolecularCloning,AlaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory和可以通過商業(yè)it徑H得的方法。許多單細(xì)胞宿主細(xì)胞可用于本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)。這些宿主可以包括本領(lǐng)域熟知的真核和原核宿主，例如;U^桿菌、假單胞菌、芽胞桿菌、鏈霉菌、真菌(如酵母)的菌林和動(dòng)物細(xì)胞例如CH0、YB/20、NS0、SP2/0、Rl.1、B_W和L-M細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(如COS1、COS7、BSCl、BSC40和BMT10)、昆蟲細(xì)胞(如Sf9)和組織培養(yǎng)的人細(xì)^植物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，更優(yōu)選地為;U^桿菌細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種用于治療和/或預(yù)防瘧疾的疫苗組合物，所述i且合物至少包含本發(fā)明的抗原JIUI者本發(fā)明的混合^^組*。另一方面，4^發(fā)明還涉^^一種用于治療和/或預(yù)防癡疾的核酸疫苗組合物，所述組合物至少包含本發(fā)明的純化的和分離的核酸序列，或者一種表達(dá)栽體，所ii4達(dá)載體包含本發(fā)明的純化的和分離的核^列的至少一個(gè)拷貝、所述純化的和分離的核酸的片段、所述純化的和分離的核酸的M嵌合體、所述純化的和分離的核酸的結(jié)合物和/或所述純化的和分離的核酸的變體。本發(fā)明的又另一方面是一種產(chǎn)生用于制備抗癡原蟲物種的疫苗組合物的抗原肽的方法，其特征在于其包含以下步驟a)識(shí)別在所述癡原蟲物種基因組中是否存在編碼至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的序列，b)選擇所述編碼至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的序列，c)合成一種與步驟b)中選出的包含至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的序列相對應(yīng)的抗原肽，d)使合成的抗原肽與生活在病原體病區(qū)的至少一個(gè)儉本的血清樣品相接觸^和e)確定所itjk清樣品是否有至少一種抗體與所述合成的抗原肽結(jié)合?？赏ㄟ^例如基于算法的計(jì)算4^呈序的生物信息學(xué)工具，識(shí)別是否存在編碼所述疾原蟲物種基因組中的至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的序列。例如，惡性癡原蟲3D7基因組録用于生物信息學(xué)分析(Gardner,2002)?！絕I包含用于敏感的廣5U^歹'J謙(sensitivegeneralizedsequenceprofile)的禾呈序的名為/7/Yo0"的軟件(Bucheretal.，1996)來尋找短a-螺旋巻曲螺旋區(qū)域。通過將M酸序列與相應(yīng)的已知巻曲螺旋結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對，#建巻曲螺旋鐠。使用兩個(gè)包含四個(gè)和五個(gè)七重復(fù)的謙進(jìn)行分析。利用這種方法選擇的巻曲螺旋區(qū)域也經(jīng)過COILS程序的檢測。使用以下程序?qū)x定的包含oc-螺i巻曲螺凌的蛋白進(jìn)一步檢測它們可能的表面定位和GPI錨定鑒定潛在的信號肽(PSORThttp:〃www.psort.org/psortb/、SignalP，http://www.cbs-dtu.dk/services/SignalP/)、跨膜區(qū)域(TMPREDhttp:〃麗.ch.embnet.org/software/TMPRED—form.html和TMHMMhttp:Vwww.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和GPI-錨定蛋白hup:〃mendelimp.univie.ac.at/sat/gpi/gpi—server,html。然后，應(yīng)用相同的計(jì)算才;L^序或者其^^1^將選定的序列與所述病原體的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以例如鑒定無性紅內(nèi)期中的蛋白(www.PlasmoDB.org)。如果該序列的巻曲螺氣復(fù)高并且如果它在所述轉(zhuǎn)^i且和所述蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫中都存在，則選擇它以應(yīng)用于后面的肽^^成。根據(jù)例如Fmoc固相合成法等本領(lǐng)域所熟知的技^ii行肽合成。然后通過RP-HPLC或者任何其他純化技術(shù)對所述Jl^a制品進(jìn)行純化，并且用質(zhì)譜法儀鋒DI-T0F)進(jìn)行分析。然后使合成肽與來自生活在瘧疾病區(qū)并且被所述病原體感染的個(gè)體的一份血清或者一^jk清相接觸，以評估所iiJr清是否與所述合成抗原結(jié)合并因此產(chǎn)生陽性抗體反應(yīng)。進(jìn)一步分析這些反應(yīng)以確^A否存在IgGl和IgG3亞類，所述亞類已經(jīng)顯示出在惡性癡原蟲作為病原體的情況下，可通過一種^/^性細(xì)l^性抑制(ADCI)機(jī)制減少尸/的生M而發(fā)揮保護(hù)功能(Oeuvrayetal，1994)?？刹捎肁DCI和浸潤抑制測定法(0koyehetal，1999，Haynesetal，2002)，通過親和色鐠法純化的肽特異性抗體對抗體進(jìn)行生物活'1^"測。通常，所述病原體可以選自結(jié)核分枝桿菌、力t^、弓形蟲、埃博拉病毒、鏈球菌、惡性癡原蟲、腦膜炎球菌(meningicoccus)和葡萄球菌(staphyloccoccus)。若病原體是惡性癡原蟲，從文獻(xiàn)(Betts，2002，F(xiàn)lorensetal，2002，Bozdechetal，2003)中獲得的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)^i且數(shù)據(jù)使得也可以評估這些分子是否存在于所述紅內(nèi)期中。本發(fā)明還包括一種用于確定在樣品中是否存在本發(fā)明的抗原肽或者混合抗原組合物的診斷工具，所述工具包括i)4吏所述樣品與一種針對本發(fā)明的抗原肽或者混合抗原組合物的抗體相"^觸，并ii)確定所述抗體是否與所述樣品的一個(gè)組分結(jié)合。本發(fā)明還包括一種用于確定樣品中是否存在針對^^發(fā)明的抗原肽或者混合抗原組合物的抗體的診斷工具，所述工具包括0使所述樣品與本發(fā)明的抗源肽或者混合抗原組^^接觸，并1i)確定是否有抗體與本發(fā)明的所述抗原肽的一個(gè)組分或者所述混合抗原纟且*結(jié)合。本文^^I的"樣品，，是一種物質(zhì)、材料或者種群的一個(gè)等飾分或者4議性部分。例如，樣品可以是一個(gè)血液樣品、生物組織樣品、M或者糞便樣品。優(yōu)選地，所述樣品為血液。本文使用的是生活在病原體病區(qū)并且已經(jīng)或者疑似感染了所述病原體的人類個(gè)體。"組分"是指可^^發(fā)明的抗體識(shí)別的^^r氨基酸、核酸、脂質(zhì)或者M(jìn)。本發(fā)明還包括一種包含獲自癡原蟲物種的至少一種^f、肽的蛋白，所述抗原肽包含至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域。優(yōu)選地，所述蛋白包含選自SEQIDNo.1-132，SEQIDNo.134-SEQIDNo.153和SEQIDNo.159-SEQIDNo.163M酸序列的序列、所*列的生物學(xué)活性片段、所述序列的^"嵌合沐、所#列的結(jié)合物和/或所*列的變體。最優(yōu)選地，所述蛋白是PF14-0089(包含SEQIDNo.38)或者蛋白PFD0520c。通常，可化學(xué)合成包含本發(fā)明的至少一種^^、肽的蛋白并且用ELISA測定對其進(jìn)行識(shí)別檢測。但是也考慮了佳JHi^r其他的重組技術(shù)或回收方法，例如在一個(gè)宿主細(xì)胞中，由編碼所述蛋白的核苷酸序列表i^斤述蛋白。本發(fā)明還包括一種可用于刺激哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答的包含一種含有至少一種4^發(fā)明的抗源、肽的蛋白的疫苗組^，以;SJ斤i^疫苗紐/^的用途。本發(fā)明還包括一種識(shí)別含有至少一種本發(fā)明的抗原肽的蛋白的抗體，以及所述抗體在診斷工具中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括純化的和分離的核酸序列，所述序列包括i)編碼本發(fā)明的蛋白的核苷^列，ii)與i)互補(bǔ)的核酸序列，iii)i)或者ii)的簡并核酸序列，iv)在嚴(yán)旨fr下能與i)、ii)或者iii)雜交的核酸序列，v)編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的截短物或者類似物的核酸序列，vi)和/或i)、ii)、iii)、iv)或者v)的片段。本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明蛋白的所述純化的和分離的核酸序列的至少一個(gè)拷貝的表達(dá)載體，以及一種包含所述純化的和分離的核酸序列或者所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明范圍內(nèi)還涵蓋一種試劑盒，所述試劑盒包含本文描述的疫苗組合物，任3^3￡包^[吏用試劑和/或說明書。備選地或者另外地，所述試劑盒還可以包括商業(yè)上和用戶方面所需的其他物質(zhì)，所述物質(zhì)包括緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。本申請說明書通篇引用了各種參考文獻(xiàn),每篇參考文獻(xiàn)通過引用的方式全部納A^^文中。通過參考以下的實(shí)施例可以M分i^解前面的說明。然而，這些實(shí)施例為實(shí)施本發(fā)明的方法的示例，并不^1意欲限制>^發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1膽合成中使用的化學(xué)藥品和溶劑購自Fluka(Buchs,Switzerland)和Novabiochem(Laufelfinger，Switzerland),坦桑尼亞混合Ajk清、布基納法索和坦桑尼亞成人個(gè)體血清和裂殖子切片獲自于瑞士熱帶研究所(STI:Basel,Switzerland).子胞子切片從Nijmegen(Hoiland)獲得。在瑞士洛桑大學(xué)(UniversityofLausanne,Switzerland)生物化學(xué)系，使用AdvancedChemTech(HatleyStGeorge,UK)ACT348Omega多通道合成儀和AppliedBiosystem合成儀431A(FosterCity,CA)，采用Fmoc固相合成法來合成所述所有的肽。由于已經(jīng)預(yù)測蛋白PF14_0089的1-46殘基片段包含一個(gè)前導(dǎo)序列和一個(gè)跨膜序列(plasmodb.org;2004年9月)，因此合成該蛋白的47-186絲。使用RP-HPLC(d8制備柱)純化肽粗制品并且通it^鐠法(MALDI-T0F;AppliedBiosystem)進(jìn)4亍分析。96孑L孩i量滴定板(MaxisorpF96，Nunc,Denmark)用濃度為5jig/ml的肽(50jil/孔)在4°C包被過夜(0/N)。用含0.05%的吐溫20(PBS-T;Sigma，St-Louis,M0，USA)的磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌該板，并用含5%脫脂奶粉的PBS-T溶液在室溫(RT)下封閉1個(gè)小時(shí)。將個(gè)體小鼠血清或者個(gè)體人血清用PBS-T-2.5°/。脫脂奶粉(PBS-T-乳)從1/200開始進(jìn)行連續(xù)稀釋，并加到所ittl上，在RT下孵育1個(gè)小時(shí)。經(jīng)過洗滌之后，加入用PBS-T-乳稀釋(1/1000)的堿性磷酸酶(Sigma,St-Louis,M0，USA)偶聯(lián)的山羊抗小鼠或山羊抗人多價(jià)免疫球蛋白，并將該板孵育1小時(shí)。洗滌板，并且用對硝基苯磷酸酯(Sigma，St-Louis，M0，USA)顯示酶的存在。使用MultiskanAscentReader測定405nm下的吸光度。將樣品吸光度(0D)大于陰性對照(正常小鼠血清或者來自未患病供體的Aik清)的平均吸光度(0D)值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的最高稀釋度確定為所述測試樣品的滴度。實(shí)施例2:使用親和色鐠法純化特異性抗體絲-舊潛微斜條將5mg的抗原稀釋在1mL的偶聯(lián)緩沖液中(含0.5MNaCl的0.1MNaHC03，pH8.0)。用1mMHC1溶脹CNBr-瓊脂糖4B(AmershamBioscienceAB，Uppsala,Sweden),然后用偶聯(lián)緩沖液洗滌該^R。將抗原溶液加至皿中并在室溫下將該混合物攪拌1小時(shí)。偶M應(yīng)之后，用偶聯(lián)緩沖液洗掉多余的抗原。在室溫下用乙醇胺(O.25M;pH8.O)處理30分鐘以封閉剩余的活性基團(tuán)。然后先用醋酸鈉緩沖液(O.1M;pH4.0)洗滌^，之后再用偶聯(lián)緩沖液洗滌?？乖?瓊脂糖偶聯(lián)體可以立即使用或者在4"C下M于含1mM的疊氮化物的PBS(lx)中。用含0.5M氯化鈉的PBS(lx)將混合Ajfe清稀釋四倍并且與抗原-瓊脂糖偶聯(lián)體混合。然后將該混合液在41C下輕輕地旋轉(zhuǎn)攪拌過夜。離心后收集人血清并且在-20X:保存?zhèn)溆?。?mL的三羥曱基氨基曱烷(trizmabase)TRIS(20mM,含0.5MNaCl，pH8.0)洗滌抗原-瓊脂糖偶聯(lián)體，然后用5mL的TRIS(20mM,pH8.0)洗滌。用甘氨酸(O.1M，pH2.5)洗脫結(jié)合的抗體。收集到的級分用TRIS(1M,pH8)中和。/《淑^絲試發(fā)卿"在室溫下將用戶/子胞子包被的玻片干燥30分鐘，用100%的丙酮在4X:下固定10分鐘，用PBS-T洗滌2次，小心地干燥，并用含5%胎牛血清(FCS)的PBS封閉30分鐘(20jiL/孔)。用100%的丙酮將用尸尸裂殖子包4皮的玻片在-20。C下固定15分鐘，并在室溫下干燥過夜。使用PBSlx-2.5%脫脂奶粉制備適當(dāng)稀釋的抗體或血清稀釋液，并加到玻片上(IOjtL/孔)，并在恒濕箱中于室溫下孵育1小時(shí)(子孢子)或者37。C下孵育30分鐘(裂殖子)。用PBS-T洗滌以后，加入以1/50稀釋于伊文思藍(lán)溶液中的與Alexafluor488(MolecularProbes,Oregon,USA)偶聯(lián)的山羊抗小鼠多價(jià)免疫球蛋白(1/50000)(400pL/玻片)，并且在避光的條件下在恒濕箱中于室溫下孵育50分鐘(子孢子)或者37匸下孵育30分鐘(裂殖子)。洗滌后用50%的甘油覆蓋玻片、密封并用Zeica200顯^t鏡讀數(shù)。從Harlan(Horst，Holland)購買五周齡至七周齡的雌性CB6F1小鼠。將用PBS(lx)或水溶解并且用MontanideISA720乳化的20叫JlU/oC^部皮下注射至小鼠。用不同肽的混合物或者M(jìn)al6P1.37的片段和PfB0145c和PfD0110w的片段而言，注射量分別為10叫/小鼠和5^g/小鼠。在3周和6周后，對動(dòng)物注射抗原進(jìn)4于加強(qiáng)免疫。在每次加強(qiáng)后的第十天，對小鼠取血以通過ELISA評估是否存在特異性抗體。如果進(jìn)行陽性IFAT，可以根據(jù)WinterandMilstein(Nature,1991,349293-299)分離單克隆抗體。結(jié)果見表7。/《凝處i戎雄試驗(yàn)"在室溫下將用/V子胞子包被的玻片干燥30分鐘，用100%的丙酮在4匸下固定10分鐘，用PBS-T洗滌2次，小心地干燥，并用含5%胎牛血清(FCS)的PBS封閉30分鐘(20jiL/孔)。用100%的丙酮將用尸尸裂殖子包被的玻片在-20"C下固定15分鐘并且在室溫下干燥過夜。用PBSlx-2.5%脫脂奶粉制備適當(dāng)稀釋的抗體或血清稀釋液，并加到玻片上(IO^L/孔)，并在恒濕箱中于室溫下孵育1小時(shí)(子孢子)或者37t:下孵育30分鐘(裂殖子)。用PBS-T洗滌以后，加入以1/50稀釋于伊文思藍(lán)溶液的與Alexafluor488(MolecularProbes,Oregon,USA)偶聯(lián)的山羊抗小鼠多價(jià)免疫球蛋白(1/50000)或者山羊抗人IgG(Fc特異性)FITC偶聯(lián)物(Sigma)(400jiL/玻片)，并且在避光的條件下在恒濕箱中于室溫下孵育50分鐘(子孢子)或者37。C下孵育30分鐘(裂殖子)。洗滌后用50。/。的甘油覆蓋玻片、密封并且用Zeica200顯微鏡讀數(shù)。在添加了0.5%albumaxI(GibcoBRL-Invitrogen)的RPMI-1640中培養(yǎng)烏干達(dá)帕洛阿爾托昧(UgandaPaloAltostrain)(FUP/C)。為了進(jìn)行ADCI測定，將血液階段的寄生蟲培養(yǎng)物在1%的A型豬皮明膠(Sigma-Aldrich)上浮集24小時(shí)使其成熟后，再至少經(jīng)過連續(xù)兩次的山梨糖醇處理，使所述各血液階段寄生蟲培養(yǎng)物同步化。用于親和純化的巴布亞新幾內(nèi)亞(PNG)成人混合血清是在1992年7月在受美國國際發(fā)展局支持的瘧疾疫苗流行病學(xué)和評價(jià)項(xiàng)目(MVEEP)框架內(nèi)(力的一次截面調(diào)查過程中從東塞皮克省的Maprik區(qū)收集得到。該區(qū)域是瘧疾的高發(fā)流行區(qū)。從PNG醫(yī)學(xué)研究咨詢委員會(huì)(MedicalResearchAdvisoryCommittee)獲得了對于MVEEP的倫理學(xué)許可。通過靜脈穿刺:iUk至含EDTA的管中。從位于首都瓦加杜古以北15-50km的烏布里滕加省摩西高原中部的Goundry村收集所述血清。其氣候具有蘇丹大平原區(qū)域的特征，從十一月至次年五月為旱季，從六月至十月為雨季。瘧疾傳播在所述雨季高發(fā)并且具有顯著的季節(jié)性。從布基納法索的衛(wèi)生部獲得倫理學(xué)許可。在1998年瘧疾低傳播季節(jié)的截面調(diào)查過程中，在獲得父母和監(jiān)護(hù)人的知情同意之后，收集各種肝素靜脈血樣品。在一項(xiàng)受ColombianResearchCouncil(C0LCIENCIAS)資助的項(xiàng)目的框架下，于2002年二月至五月進(jìn)行的一次截面調(diào)查過程中，在獲得人知情同意之后，在位于哥倫比亞太平洋海岸的主要港口Buenaventura收集血清。所述區(qū)域存在惡性癡原蟲(A尸a/c/，r咖)和間日癡原蟲(P.r/ra力兩種瘧疾的不穩(wěn)定傳播。從UniversidaddelValle的倫理委員會(huì)(InstitutionalReviewBoard)獲得對人志愿受試者取血的倫理學(xué)許可。通過靜JMl血至含EDTA的管中，并且將血清分裝并冰凍儲(chǔ)存?zhèn)溆?。從生活在病區(qū)的免疫的個(gè)體制備混合的非洲人免疫球蛋白(PIAG)，并且從1000名以上沒有癡疾病史的法國成年供體的混合群中得到陰性對照IgG(N-IgG)。簡而言之，4吏用尺寸排阻TrisacrylGF05M(PallBioS印ra)柱并且接著使用離子交換DEAECeramicHyperDF柱(PallBioS印ra)純化陽性和陰性對照中的IgG級分。然后用RPMI對純化的IgG進(jìn)行全面的透析，4匸保存?zhèn)溆谩j&卓裙勿^的浙備從沒有過往瘧疾史的健康血液供體(LecourbeBloodBank,Paris,France)的細(xì)胞單采法樣品制備血單核細(xì)胞(MN)。使用Ficoll密度梯度(JPrep，Techgen)分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)并且用10mMHEPES緩沖的無Ca2+和Mg2+的HBSS(二者都來自GibcoBRL-Invitrogen)洗滌。然后把細(xì)胞分配到聚苯乙烯96孔平底培養(yǎng)板(TPP，Switzerland)上并通過在5%0)2的潮濕氣氛中在371C孵育2小時(shí)以選擇貼附的MN。通過非特異性酯酶測試(ot-醋酸萘酯酶；SigmaAldrich)估計(jì)，這種方法獲得的貼附細(xì)胞中超過90%是MN。在ADCI測試之前檢測來自每個(gè)供體的MN，并且只有那些沒有直接抑制效應(yīng)的MN才被應(yīng)用于測定中。實(shí)施例3潛,使用序列譜進(jìn)行的所述基因組篩選，識(shí)別出幾個(gè)包含推定的a-螺旋巻曲螺旋區(qū)域的蛋白。存在于蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中并且具有最高的巻曲螺旋度的區(qū)域被選擇用于后續(xù)的肽合成。通過從所述文獻(xiàn)(Betts,2002，F(xiàn)lorensetal，2002，Bozdechetal，2003)中獲得的蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本申請人評估了這些分子是否存在于紅內(nèi)期。分析/評價(jià)的結(jié)合識(shí)別了152個(gè)巻曲螺旋區(qū)域。選出存在于同一蛋白或者不同蛋白中的95個(gè)巻曲螺旋區(qū)段(30-70氨基酸長，具有最高的巻曲螺氣l)。大部分選出的抗原被一組生活在病區(qū)的供體血清在不同程度上識(shí)別(5-93%)(表2)。因此，識(shí)別到71個(gè)長度為200-10，000氨基酸的新蛋白。特異性針對許多肽的、親和色譜純化的抗體也從生活在坦桑尼亞的成年供體獲得(表2)。這些抗體可對感染的紅細(xì)胞染色(圖1、表3)。另外，化學(xué)合成這些蛋白的其中之一(PF14—0089),并且用ELISA測定中進(jìn)^f亍識(shí)別檢測(表2)。這個(gè)新蛋白被78-10(^的來自布基納法索和坦桑尼亞的成Ajk清識(shí)別。親和純化的抗體可以識(shí)別寄生蟲感染的紅細(xì)胞。另外，該蛋白也與對坦桑尼亞兒童的保護(hù)作用有關(guān)。這些肽在小鼠體內(nèi)也具有免疫原性并且特異性血清在IFAT中呈陽性(表7)。還分離了在IFAT中呈陽性的單克隆抗體。表3使用親和純化的對大部分識(shí)別肽特異的抗體在寄生蟲生命周期的不同階段進(jìn)行間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)。結(jié)果表示為弱陽性(+/-)和陽性(+)。在裂殖體晚期進(jìn)行抑制測定以評估染色特異性。結(jié)果表示為觀測到的抑制(+)、非抑制(_)和部分抑制(+/-)作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>向含2xl()S的按以上描述純化的MN的孔中加入50^1的0.5%寄生蟲血癥和4%的血細(xì)胞比容的未同步化的寄生蟲培養(yǎng)物。然后在孔中補(bǔ)加測試Ab和對照的Ab，并且用培養(yǎng)液將總體積調(diào)至lOOjil。在48小時(shí)和72小時(shí)之后，向每個(gè)孔中加入的培養(yǎng)基，并且在96小時(shí)之后終止ADCI測定，并且通過光學(xué)顯孩i鏡檢查Giemsa染色的涂片，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)>50，000的涂片被確定為最終的寄生蟲血癥。對于每個(gè)測試抗體(Ab)都有兩個(gè)包括如下對照的孔l)非特異的單核細(xì)胞抑制(對匪+寄生蟲和MN+N-IgG+寄生蟲兩者)和2)通過對照或測試IgG直接抑制(對N-IgG+寄生蟲和測試Ab+寄生蟲兩者)。使用終濃度為lmg/ml的PIAG和N-IgG,并分別作為陽性和陰性對照。使用濃度為15jig/ml的免疫純化測試Ab。考慮到由于測試Ab與MN的協(xié)同效應(yīng)引起的寄生蟲生長抑制，特異性生長抑制指數(shù)(SGI)的計(jì)算如下SGI=100x[1-WMN和測試Ab的寄生蟲血癥/。/。測試Ab的寄生蟲血癥)/(。/。MN和N-IgG的寄生蟲血癥鄺N-IgG的寄生蟲血癥)]。表4ADCI實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表示為特異性生長抑制指數(shù)(SGI)。使用的陽性對照(SGI=100%)是從高度免疫的非洲成年人混合血清中純化的IgG級分，在oc-8、oc-9.......的意思是分別針對SEQIDNo.8或者No.9的抗體。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>實(shí)施例4射戎掘W潛話4吏用Fmoc合成法和AppliedBiosystem合成儀431A共線性合成包含不同肽組合(表)的結(jié)合抗原肽構(gòu)建體。為了避免新抗原肽的形成，通過一個(gè)連接物一一例如在表中示出的免疫沉默連接物聚乙二醇(PEG01-63-0141;NovaBiochem/Merck)——將單個(gè)的抗原肽連接起來。表5肽SEQIDNo.蛋白序列LR162154MAL6P1.37(PEG)PFB0145c(PEG)PF14—0089KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT(PEG)TISSLSNKIVNYESKIEELEKELKEVK(PEG)NITNINKNIENIKNDMSNLN麗NDSNQLR162A155PFA0170c(PEG)MAL6P1.37(PEG)PFB0145c(PEG)PF14—0089VNNLDSTVNYMNSTGNN1NNI(PEG)KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT(PEG)TISSLSNKIVNYESKIEELEKELKEVK(PEG)NITNINKNIENIKNDMSNLNNMNDSNQLR179156MAL13PL304(PEG)PF08—0048EKLKKYNNEISSL腿LDILNEKMGKCT(PEG)GGLKNSNHNLNNIEMKYNTLNN醒NSINKLR179A157PFB0145c(PEG)MAL13P1.304(PEG)PF08—0048LDENEDNIKKMKSKIDDMEKEIKYR(PEG)EKLKKY腦EISSLKKELDILNEKMGKCT(PEG)GGLKNSNHNLNNIEMKYNTLN麗NSINKLR181158PFD0520c(PEG)PF08—0048(PEG)MAL6P1.37TKKLNKELSEGNKELEKLEKNIKELEET匿LENDIKV(PEG)EKLKKYNNEISSLKKELDILNEKMGKCT(PEG)KKRNVEEELHSLRKNYNIINEEIEEIT表6利用37個(gè)布基納法索成人血清、42個(gè)坦桑尼亞成人血清和39個(gè)哥倫比亞成Ajk清，進(jìn)行針對與表5的肽的抗體應(yīng)答。結(jié)果表示為％(值>平均陰性對照+3SD)、比例(實(shí)驗(yàn)OD/平均OD陰性對照)和未測定(nd)。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>^;遂合戎^逸會(huì)餘W—神祐C5F7'/、篇使用特異性針對不同的肽和混合抗原組合物的親和純化的抗體，在寄生蟲生命周期的不同階段進(jìn)行免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)。結(jié)果表示為弱陽性(+/-)和陽性(+)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例5惡性癡原蟲3D7基因組翻ilUi行生物信息學(xué)分析(Gardner,2002)。包含用于^t感的廣義亭列鐠的^^序的名為//Voo"的軟件(Bucheretal.，1996)被應(yīng)用于尋找短a-螺旋巻曲螺旋區(qū)域。通過將^酸序列與相應(yīng)的已知巻曲蝶旋區(qū)域比對ilM^建所述巻曲螺旋鐠。使用兩個(gè)包含四個(gè)和五個(gè)七重復(fù)的譜進(jìn)行分析。利用這種方法選擇的巻曲螺旋區(qū)域也經(jīng)過COILS程序的檢測。使用以下程序?qū)x定的包含a-螺旋巻曲螺旋的蛋白進(jìn)一步檢測它們的可能的表面定位和GPI錨定鑒定潛在的信號肽(PSORT，http:〃爾.psort.org/psortb/，SignalP，http:〃麗.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、跨膜區(qū)域(TMPREDhttp:〃麗.ch.embnet.org/software/TMPRED—fornuhtml和TMHMMhttp:〃麗.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和GPI-錨定蛋白http://mendel-imp-univie.ac.at/sat/gpi/gpi—server,html。此夕卜，還4^J)惡性癡原蟲在無性的紅內(nèi)期發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的公開數(shù)據(jù)(www.PlasmoDB.org)，檢查該階^1否存在所鑒定的蛋白。權(quán)利要求1.一種源自于瘧原蟲物種的、包含至少一個(gè)卷曲螺旋區(qū)域的抗原肽，其特征在于所述抗原肽選自SEQIDNo.1-132、SEQIDNo.134-SEQIDNo.153和SEQIDNo.159-SEQIDNo.163的氨基酸序列、所述氨基酸序列的生物學(xué)活性片段、所述氨基酸序列的分子嵌合體、所述氨基酸序列的結(jié)合物和/或所述氨基酸序列的變體。2.權(quán)利要求l的抗原肽，其特征在于所述抗原肽的結(jié)合物選自SEQIDNo.154、155、156、157和158。3.—種源自于瘧原蟲物種的混合抗原組合物，包含至少2種權(quán)利要求1或者2的抗原肽。4.權(quán)利要求3的混合抗原組合物，其特征在于所述組合物選自下列的結(jié)合i)SEQIDNo.l、2和3，或ii)SEQIDNo.16、33、38和2或iii)SEQIDNo.35、27、4、34、24和37。5.權(quán)利要求1-2的^^M者權(quán)利要求3-4的;^^^原纟且*在制備用于刺激哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答的疫苗組合物中的應(yīng)用。6.—種用于刺激哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的疫苗組合物，其特征在于所述疫苗組合物包含權(quán)利要求1-2的抗原肽或者權(quán)利要求3-4的混合抗原組合物。7.—種抗體，其特征在于所述抗體識(shí)別權(quán)利要求1-2的抗原肽或者權(quán)利要求3-4的混合抗原組合物。8.權(quán)利要求7的抗體，其特征在于所述抗體選自a-8、ot-9、oc-11/12、a-13、a-14、a-27、a-86、a-102、a-99、oc-68、ot-41、a-110、oc-78、a-135、a-136、a-138、oc-146和a-151或者它們的混合物。9.一個(gè)純化的和分離的核^列，所#列包括i)編碼權(quán)利要求1或2的抗原肽的核苷酸序列，ii)與i)互補(bǔ)的核酸序列，iii)i)或者ii)的簡并核酸序列，iv)在嚴(yán)*降下能與0、ii)或者iii)雜交的核酸序列，v)編碼權(quán)利要求1或2的抗原肽的截短物或者類似物的核酸序列，vi)和/或編碼權(quán)利要求1或2的所述抗原肽的生物活性片段的i)、ii)、iii)、iv)或者v)的片段。10.—種表達(dá)載體，所"達(dá)載體包*利要求9的純化的和分離的核酸序列的至少一個(gè)拷貝。11.一種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包^5l利要求9的純化的和分離的核酸序列或者權(quán)利要求10的表達(dá)載體。12.權(quán)利要求6的疫苗組合物在制備用于治療和/或預(yù)防瘧疾的藥劑中的應(yīng)用。13.—種產(chǎn)生用于制備抗癡原蟲物種疫苗組合物的抗原肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a)識(shí)別是否存在編碼至少一個(gè)所述癡原蟲物種基因組中的巻曲螺旋區(qū)域的序列，b)選擇編碼至少一個(gè)巻曲螺旋區(qū)域的所述序列，c)^^成一種與步驟b)中選出的包含至少一個(gè)巻曲螺凌區(qū)域的序列相對應(yīng)的抗原肽，d)合成的抗原肽與生活在瘧原蟲物種病區(qū)的至少一個(gè)，的血清樣品相e)確定所#清樣品是否有至少一種抗體與所述合成的抗原肽結(jié)合。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于所述步驟a)用一種生物信息學(xué)工具進(jìn)行。15.—種診斷工具，所述診斷工具用于確定在一個(gè)樣品中是否存在權(quán)利要求1-2的抗原肽或者權(quán)利要求3-4的混合抗原組合物，所述診斷工具包括i)使所述樣品與一種針對權(quán)利要求1-2的抗原肽或者權(quán)利要求3-4的混合抗原組合物的抗體相接觸，并且ii)確定所述抗體是否結(jié)合所述樣品中的一個(gè)組分。16.—種診斷工具，所述診斷工具用于確定在一個(gè)樣品中是否存在權(quán)利要求1-2的肽的抗體或者權(quán)利要求3-4的一種混合抗原組合物的抗體，所述診斷工具包括i)使所述樣品與權(quán)利要求1-2的抗原肽或者權(quán)利要求3-4的混合抗原組合物相接觸，并且ii)確定是否有抗體結(jié)合權(quán)利要求1-2的抗原肽的一個(gè)組分或者權(quán)利要求3-4的混合抗原組合物。17.—種蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)包括至少一種權(quán)利要求l的抗原肽。18.權(quán)利要求17的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)是包含SEQIDNo.38的PF14-0089或者是包含SEQIDNo.147的蛋白質(zhì)PFD0520c。19.一種試劑盒，所述試劑盒包^L利要求6的疫苗組合物，任i^4還包^^^Jl試劑和/或^J)i兌明書。全文摘要本發(fā)明一般涉及病原體肽抗原及其用途領(lǐng)域，所述用途例如用于制備一種針對所述病原體的疫苗。更具體地，本發(fā)明涉及一種源自于瘧原蟲物種序列的抗原肽，并包括其抗體和其生產(chǎn)和使用方法。文檔編號C12N15/09GK101287752SQ200680038012公開日2008年10月15日申請日期2006年8月16日優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日發(fā)明者A·卡佳瓦,A·賈法沙德,G·科拉迪恩,P·德魯赫申請人:洛桑大學(xué);巴斯德研究所