專利名稱：：選擇具有抗生物膜感染功效的試劑的板的制作方法選擇具有抗生物膜感染功效的試劑的板本申請(qǐng)要求于2005年7月22日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/701,858的優(yōu)先權(quán)。I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及分析生物膜的方法和裝置，并且涉及確定抗微生物或抗生物膜試劑，優(yōu)選抗生物膜試劑的組合諸如抗生素或殺生物劑的微生物敏感性。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法和裝置包括選擇適當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)具有增強(qiáng)的治療生物膜疾病的功效的抗生物膜試劑及其組合，生物膜疾病包括但不限于銅綠假單胞菌(/^e^fowowwaen/g&asa)，特別是在囊性纖維化(CF)患者中的肺部感染。本發(fā)明提供選擇具有增強(qiáng)的治療生物膜疾病的功效的適當(dāng)?shù)目股锬ぴ噭┑姆椒ê脱b置。II.發(fā)明背景微生物的表征傳統(tǒng)上應(yīng)用分批培養(yǎng)研究的方法，其中微生物以分散或浮游狀態(tài)存在。在過(guò)去的25年里，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到在許多環(huán)境中細(xì)菌生物量的主要成分是固著細(xì)菌。近來(lái)在微生物生態(tài)學(xué)中的技術(shù)進(jìn)步己經(jīng)允許如同它們?cè)谧匀缓图膊≈写嬖谀菢訉?duì)微生物進(jìn)行仔細(xì)的研究。這些研究表明，大多微生物能夠在生物膜上生長(zhǎng)，并且微生物在生物膜上的生長(zhǎng)在物理和生理上不同于相同的微生物在分批培養(yǎng)中的生長(zhǎng)。這些不同構(gòu)成這些微生物的發(fā)病機(jī)理和它們對(duì)抗微生物試劑的敏感性的觀察到的改變?？股乜剐砸话銡w因于保護(hù)性外泌多糖基質(zhì)的產(chǎn)生和微生物生理的改變。革蘭氏-陰性桿菌銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)是在廣泛種類的工業(yè)、商業(yè)和處理操作中發(fā)現(xiàn)的許多微生物中的一種，所述工業(yè)、商業(yè)和處理操作如污水排放、再循環(huán)水系統(tǒng)(冷卻塔、空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)等)、冷凝水收集、紙漿操作、以及，一般地，任何蓄水、處理、加工、收集等系統(tǒng)。正是由于生物膜在水處理系統(tǒng)中普遍存在，所以并不奇怪還發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌與這些生物膜締合。在許多情形中，銅綠假單胞菌是主要的微生物成分。除了它在工業(yè)處理中的重要性，銅綠假單胞菌和與其締合的生物膜結(jié)構(gòu)具有影響深遠(yuǎn)的醫(yī)學(xué)意義，并且是許多病理?xiàng)l件的基礎(chǔ)。銅綠假單胞菌是一種與廣泛種類的感染相關(guān)的機(jī)會(huì)致病菌，例如，緩慢定居在患有囊性纖維化患者的肺部。作為生物膜生長(zhǎng)的銅綠假單胞菌高度抗抗生素并且抗吞噬細(xì)胞。本發(fā)明人已經(jīng)研發(fā)了具有鑒定有效消除并且控制生物膜的抗生物膜試劑和抗生物膜試劑組合的特殊目的的檢測(cè)。對(duì)于銅綠假單胞菌生物膜已經(jīng)研發(fā)了特殊的裝置和方法。這樣的產(chǎn)品應(yīng)該提高用于患有囊性纖維化肺部感染和其它假單胞菌感染的患者的抗微生物藥物治療的選擇。在這些表面上存在的生物包括許多致病的和不致病的細(xì)菌和真菌。葡萄球菌(Staphylococcusspp.)感染通常與由不銹鋼、硅氧烷、聚氨基甲酸酯組成的移植的醫(yī)學(xué)裝置相關(guān)。移植的醫(yī)學(xué)裝置首先用糖蛋白如纖連蛋白涂敷，所述糖蛋白允許葡萄球菌生物粘附到表面并且最終形成微生物生物膜。充分認(rèn)識(shí)到，當(dāng)與醫(yī)學(xué)裝置締合時(shí)，葡萄球菌(St叩h)對(duì)抗生素治療沒有反應(yīng)。對(duì)固著細(xì)菌的抗微生物活性的評(píng)估應(yīng)該更好地預(yù)測(cè)關(guān)于葡萄球菌感染的臨床功效。現(xiàn)在，認(rèn)為致病真菌如念珠菌屬(C"m/Wa)和煙曲霉(Jwwg///Mls/M/m'gWM)是重要的感染，并且負(fù)責(zé)顯著的發(fā)病率和死亡率。通常它們與移植的裝置相關(guān)，或者在免疫損害的患者中。只是在最近才認(rèn)識(shí)到治療失敗與生物膜的形成相關(guān)。盡管已經(jīng)描述了針對(duì)抗真菌劑的抗性基因，但是基于生物膜形式的生長(zhǎng)的生理抗性可能等價(jià)于治療失敗或者比治療失敗更重要?，F(xiàn)在廣為人知，以生物膜形式的細(xì)菌比浮游細(xì)菌更加抵抗抗細(xì)菌劑。然而，檢測(cè)細(xì)菌的存在和檢測(cè)抗生素抗細(xì)菌的功效通常包括檢測(cè)浮游細(xì)菌。當(dāng)與在浮游(自由浮動(dòng))狀態(tài)的相同細(xì)菌比較時(shí)，研究已經(jīng)表明生物膜大于幾百倍的抗生素抗性。由于作為生長(zhǎng)的生物膜形式的一部分的許多表型適應(yīng)性，這種抗性是多因素的，包括但不限于發(fā)展的粘多糖包被，和在微生物中的生理改變。選擇用于治療生物膜感染的抗生素和抗生素組合繼續(xù)依賴于最小抑制濃度(MIC)測(cè)定，而不管這些檢測(cè)的公認(rèn)的缺乏功效性。一些人提議應(yīng)用生物膜抑制濃度(BIC)(Moskowitz，等；J.Clin.Microbiology(臨床微生物學(xué)雜志)，42:1915-1922(2004年5月))，但是證據(jù)表明BIC和MIC二者都針對(duì)浮游細(xì)菌，而不是固著細(xì)菌。例如，Moskowitz等在他們的方法中應(yīng)用離心，并沒有去除大部分來(lái)源于激活的生物膜的細(xì)胞，因此導(dǎo)致只針對(duì)浮游細(xì)菌的測(cè)定，或者只是部分生物膜的測(cè)定。因此這一測(cè)定可能忽略了遺留在栓(peg)上的存活細(xì)胞，因而導(dǎo)致潛在的錯(cuò)誤推論。此外，現(xiàn)有技術(shù)典型地將生物膜生長(zhǎng)在靜態(tài)(不流動(dòng))環(huán)境中，其有時(shí)影響結(jié)果。相反，本發(fā)明在其處理過(guò)程中在獨(dú)立的恢復(fù)板上應(yīng)用超聲或再生生物膜，以致可以獲得并檢測(cè)完整無(wú)缺的生物膜。此外，本發(fā)明的方法包括在動(dòng)態(tài)或流動(dòng)條件下生長(zhǎng)生物膜，并且中和抗微生物劑，二者都單獨(dú)地和共同地加強(qiáng)任何測(cè)定結(jié)果。因此，存在對(duì)于改進(jìn)的處理和測(cè)定裝置和方法的需求，所述處理和測(cè)定裝置和方法用于選擇有效的抗生物膜組合物，包括有效抗人和動(dòng)物生物膜介導(dǎo)的疾病的抗生物膜組合物，所述疾病包括但不限于CF肺部感染。III.發(fā)明概述本發(fā)明包括用于選擇單獨(dú)的或組合的，有效抗生物膜的一種或多種活性劑的改進(jìn)的方法和裝置。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述裝置和方法可以用于生物膜感染的治療。所述生物膜可以是任何生物膜，例如，由細(xì)菌、真菌、或藻類、病毒、和寄生蟲形成的那些；或者結(jié)合在它所形成的生物膜內(nèi)的微生物；或者混合的生物膜，例如，含有多于一種細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲或藻類生物膜。本發(fā)明的裝置和方法還包括研發(fā)治療方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療方法可以適合具體的患者和/或可以形成研發(fā)個(gè)性化的醫(yī)學(xué)治療或方法的基礎(chǔ)。本發(fā)明的裝置和方法還有效地治療廣泛種類的微生物，包括但不限于銅綠假單胞菌，葡萄球菌，念珠菌屬物種(Candidassp.)，和煙曲霉。本發(fā)明的裝置和方法還有效地治療由一種或多種生物膜介導(dǎo)的廣泛種類的疾病和病況，所述疾病包括但不限于囊性纖維化(CF)，包括由一種或多種細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲、藻類或它們的組合引起或介導(dǎo)的疾病和病況。本發(fā)明還提供適合生長(zhǎng)特別的一種或多種生物膜、并且適合確定有效抗所述生物膜的適當(dāng)?shù)囊环N或多種活性劑的臨床上重要的測(cè)定。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述測(cè)定提供最小生物膜根除濃度(MBEC)，最小抑制濃度(MIC)，或最小殺生物濃度(MBC)，或它們的組合。本發(fā)明提供一組單個(gè)的和/或組合的活性劑，用于選擇包含一種或多種具有抗生物膜功效的活性劑的組合物。這些試劑或試劑的組合可以用于治療患者-特異性感染的生物體。本發(fā)明提供用于選擇生物膜相關(guān)的感染疾病的組合抗生素治療的方法和裝置。本發(fā)明的裝置和方法還可以用于確定并且開發(fā)對(duì)個(gè)體患者特異性的藥物組合物。本發(fā)明的裝置和方法還為有助于公知的抗生素抗性的現(xiàn)有治療方法提供備選方案。本發(fā)明的裝置和方法還可以用于鑒定在開發(fā)適合特別患者的適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǖ倪^(guò)程中的遺傳漂移、抗生素抗性、和遺傳變異。本發(fā)明還提供適合生物膜存在的體外測(cè)定，即，基于確定最小生物膜根除濃度(MBEC)的測(cè)定。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述裝置和方法提供MBEC、最小抑制濃度(MIC)、和最小殺生物濃度(MBC)值的任何組合。本發(fā)明的裝置和方法與現(xiàn)有技術(shù)裝置相比，在下述一項(xiàng)或多項(xiàng)改進(jìn)所述裝置和方法包括檢測(cè)完整的生物膜；應(yīng)用超聲去除完整的生物膜；所述裝置和方法適用于更寬范圍的生物膜，例如，真菌的等等；抗生物膜試劑涵蓋更寬范圍的試劑，包括殺生物劑等等；所述裝置和方法是高流通量的，并且因此更加有效和節(jié)約成本；并且生長(zhǎng)生物膜得到改進(jìn)，包括增加的了解和應(yīng)用方法條件，以增強(qiáng)生物膜生長(zhǎng)。微生物生物膜存在于許多醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)系統(tǒng)，方法，處理設(shè)備中，和表面上。在這些表面存在的生物體包括許多致病的和不致病的生物膜。本發(fā)明的方法和裝置可以用于降解生物膜，無(wú)論它們?cè)谀睦锎嬖冢?，在淤積發(fā)生的工業(yè)過(guò)程中，例如，除垢漿(de-foulingpulp)和造紙廠設(shè)備，處理氣/油管線，和凈化食品加工設(shè)備，或者移植的醫(yī)學(xué)裝置，其包括導(dǎo)管、髖部移植物和套管。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本文列出的原理還適用于它們所發(fā)生的所有環(huán)境中的所有生物膜。本發(fā)明還包括完整裝置或組件、多樣的或多個(gè)組件、多樣的或多個(gè)亞組件、或它們的組合的應(yīng)用。本發(fā)明的這些和其它方面將在下述附圖、描述和權(quán)利要求中更加清楚。III.附圖簡(jiǎn)述圖1是在容器蓋子上的多個(gè)生物膜附著位點(diǎn)的底視圖。圖2是圖1接受多個(gè)生物膜附著位點(diǎn)的容器的頂面圖。圖3是圖l和2的蓋子和容器的側(cè)面圖，部分?jǐn)嗔?。圖4是本發(fā)明的一個(gè)代表性實(shí)施方案的方法步驟的流程圖。圖5顯示本發(fā)明的生物膜生長(zhǎng)和形成過(guò)程的實(shí)例。圖6顯示本發(fā)明的生物膜敏感性測(cè)定的實(shí)例。圖7顯示按照本發(fā)明恢復(fù)完整的生物膜的方法實(shí)例。圖8顯示按照本發(fā)明確定MBEC和MIC測(cè)定的方法實(shí)例。圖9是在實(shí)施例6中描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表。圖10顯示在實(shí)施例7中所用的攻擊板(challengeplate)的設(shè)置。圖11顯示在實(shí)施例10中所用的攻擊板的設(shè)置。圖12是確定生物膜的MIC、MFC和MBEC值的圖表。IV.發(fā)明詳述本發(fā)明包括用于選擇單獨(dú)的或組合的有效抗生物膜的一種或多種活性劑的改進(jìn)的方法和裝置。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述裝置和方法可以用于治療生物膜感染。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述裝置和方法可以用作診斷工具，以確定用于治療一種或多種生物膜和/或一種或多種由所述生物膜介導(dǎo)的疾病或病況的各種組合物，包括優(yōu)化組合物。本發(fā)明包括用于選擇治療生物膜的適當(dāng)?shù)目股锬ぴ噭┙M合的改進(jìn)的方法和裝置。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法和裝置提供診斷敏感性測(cè)試，并且在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在單一實(shí)驗(yàn)中提供MBEC、MBC、和MIC值。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案可以包括用于選擇針對(duì)特異的生物膜或生物膜群體的活性劑組合的方法和裝置。本發(fā)明的方法和裝置可以用于降解生物膜，無(wú)論它們?cè)谀睦锇l(fā)生，例如，在淤積發(fā)生的工業(yè)過(guò)程中；移植的醫(yī)學(xué)裝置，其包括導(dǎo)管、髖部移植物和套管；或者用于廣泛種類的感染，如眼部應(yīng)用(感染、移植、隱形眼鏡、手術(shù)操作等等)，呼吸道感染，包括肺炎和囊性纖維化，耳部感染，復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)相關(guān)的感染，尿道感染，皮膚和軟組織感染，在燒傷受害者中發(fā)生的感染，心內(nèi)膜炎，陰道感染和胃腸道感染。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本文列出的原理還適用于它們所發(fā)生的所有環(huán)境中的所有生物膜。本發(fā)明還包括用于治療患有由生物膜介導(dǎo)或引起的疾病或病況的患者或受試者的方法和裝置。在本發(fā)明的這些實(shí)施方案中，將來(lái)自患者或受試者的生物樣品用生物膜形成裝置處理；然后將生物膜用生物膜敏感裝置處理，以提供一種或多種針對(duì)所述生物膜具有活性的試劑。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括一種組件，其包括一個(gè)或多個(gè)預(yù)先負(fù)載一種或多種預(yù)先選擇的針對(duì)特異的一種或多種生物膜的抗生物膜試劑的板，所述板可以用于鑒定治療生物膜-介導(dǎo)的疾病或病況的有效的單個(gè)或組合的活性劑。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述方法還可以包括一個(gè)或多個(gè)下述各項(xiàng)在促進(jìn)基本上均一的生物膜生產(chǎn)的條件下生長(zhǎng)多樣的或多種生物膜；針對(duì)一大組活性劑篩選生物樣品；選擇一小組活性劑；用多樣的或多種在小組中的活性劑上樣負(fù)載檢測(cè)裝置；生長(zhǎng)來(lái)自具體的患者或受試者樣品的生物膜；針對(duì)活性劑小組，篩選來(lái)自具體的患者或受試者的生物膜；讀取結(jié)果；確定適于特別的生物膜的適當(dāng)?shù)幕钚詣┗蚧钚詣┑慕M合；如果當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)微生物產(chǎn)生明顯可見的混濁(如假單胞菌)，進(jìn)行濁度檢測(cè)；并且如果微生物不以明顯的濁度生長(zhǎng)，進(jìn)行板接種檢測(cè)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括用于選擇具有抗作為生物膜的具體的病原體的分離物的功效的抗生素的特別組合的方法，其通過(guò)針對(duì)單獨(dú)的或組合的廣泛范圍的抗生素而篩選某一物種的寬范圍的臨床分離物，以鑒定具有抗生物膜生長(zhǎng)的生物的功效的組合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括形成其中生長(zhǎng)生物膜的患者分離物的生物膜，使用如美國(guó)專利號(hào)6051423,63261卯，6410256，6596505，6599696和6599714中的一個(gè)或多個(gè)中所述的生物膜檢測(cè)裝置，用于檢測(cè)生物膜抗生素敏感性。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括確定用于治療生物膜感染的抗生素選擇，其通過(guò)針對(duì)對(duì)形成生物膜的物種特異的診斷板攻擊患者的特異性分離物的生物膜而進(jìn)行。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括將預(yù)先負(fù)載抗生素的物種特異性板再水合作為攻擊板，以鑒定具有抗特異性病原體功效的抗生素。板可以是冷凍的(不需要再水合)，或者凍干的，冷凍干燥或真空干燥的。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括一種孔板(wdlplate)，其包含冷凍的或凍干的抗生素組合，其可以再水合用于抗生素敏感性檢測(cè)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括生長(zhǎng)從分離的患者病原體獲得的生物膜，并且將所述生物膜用于敏感性檢測(cè)。本發(fā)明的實(shí)施方案包括針對(duì)所選擇的抗微生物或抗生物膜試劑的組合而攻擊生物膜，由此選擇最適宜的組合。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括在能夠形成生物膜的任何微生物的診斷和治療中提供MBEC值，并且應(yīng)用這些值治療或者開發(fā)用于任何微生物-介導(dǎo)的疾病、感染、或病況的治療方法。本發(fā)明還可以包括提供MIC和/或MBC值。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，在將生物膜生長(zhǎng)在蓋子或板上的粘附位點(diǎn)上后，將所述生物膜從生物膜粘附位點(diǎn)移下，并且迸一步培養(yǎng)所述生物膜。從生物膜粘附位點(diǎn)移下生物膜可以包括將來(lái)自每一個(gè)生物膜粘附位點(diǎn)的生物膜移動(dòng)到微量滴定板或基底的獨(dú)立的孔中。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述生物膜使用導(dǎo)致完整的生物膜從粘附位點(diǎn)移出的任何方法進(jìn)行移動(dòng)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用離心只移除一部分微生物，因此任何檢測(cè)可能是不完全或不準(zhǔn)確的。優(yōu)選地，多個(gè)生物膜粘附位點(diǎn)以多排形成，在每一排有多個(gè)位點(diǎn)；并且容器包括多個(gè)通道，每一通道用于每一排多個(gè)生物膜粘附位點(diǎn)。這樣配置的裝置或組件允許高通量的生物膜分析。在整體上，本發(fā)明包括生物膜生長(zhǎng)組件1，生物膜攻擊組件2，漂洗組件3，和生物膜移動(dòng)和再生組件4。共同使用，所述組件在單一實(shí)驗(yàn)中提供MIC、MBC禾BMBEC值。按照本發(fā)明，生物膜生長(zhǎng)組件1可以包括配置成接受蓋子10的基底或板20。蓋子IO可以配置成包括一個(gè)或多個(gè)凸起12，所述凸起12延伸到由基底20限定的空間。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物膜生長(zhǎng)組件1是搖動(dòng)的、移動(dòng)的等等，以致在所述組件中的生長(zhǎng)流體穿過(guò)凸起12流動(dòng)或移動(dòng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，基底20是培養(yǎng)基底，并且被設(shè)置成為每個(gè)凸起提供基本上相等的暴露于微生物源和其營(yíng)養(yǎng)/生長(zhǎng)肉湯。如在本說(shuō)明書其它地方所述，典型的基底包括多個(gè)通道26中的一個(gè)。一種代表性的構(gòu)型在圖3中所示。按照本發(fā)明，生物膜攻擊組件2包括配置成接受蓋子60的第二基底或板21，所述蓋子60具有典型地被生物膜覆蓋的凸起61。凸起61延伸到在板21上設(shè)置的一個(gè)或多個(gè)孔中。一種典型的第二基底21是標(biāo)準(zhǔn)的96孔微量滴定板，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該易于認(rèn)識(shí)到可以使用其它構(gòu)型。第二基底21在孔中含有一種或多種抗生物膜試劑。按照本發(fā)明，第二板21可以移開，并且用于確定非生物膜(如浮游)微生物的MIC值(參見圖8)。按照本發(fā)明，生物膜漂洗組件3包括設(shè)置成接受蓋子60的第三基底或板40，所述蓋子60具有典型地被生物膜覆蓋的凸起61。凸起61延伸到在板40上設(shè)置的一個(gè)或多個(gè)孔中。一種典型的第三板40是標(biāo)準(zhǔn)的96孔微量滴定板，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該易于認(rèn)識(shí)到可以使用其它構(gòu)型。第三板40在孔中含有一種或多種漂洗和/或中和試劑。漂洗后，然后蓋子60可以與第四基底50結(jié)合，第四基底50還叫作恢復(fù)板。蓋子60和第四基底50形成生物膜中斷組件4。所述恢復(fù)板含有恢復(fù)培養(yǎng)基，并且按照本發(fā)明，組件4可以進(jìn)行超聲處理并且再生生物膜(證實(shí)生物膜沒有被去除)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，恢復(fù)培養(yǎng)基包括一種或多種中和試劑。如在實(shí)施例中所示，在已經(jīng)暴露于恢復(fù)培養(yǎng)基后檢測(cè)蓋子60上的凸起提供微生物的MBEC值，并且從恢復(fù)板鋪板接種提供MBC值。下面描述本發(fā)明的一個(gè)代表性實(shí)施方案。如最特別在圖1、2和3中所示，本發(fā)明的一種代表性生物膜生長(zhǎng)組件包括具有凸起12的蓋子10，和基底20，所述基底20適于接受蓋子10和凸起12，并且包括至少一個(gè)通道24或孔。如在附圖中所示，所述裝置包括由組織級(jí)別的塑料或其它適宜的材料(例如，不銹鋼、鈦)組成的生物膜蓋子10，其具有從蓋子10向下延伸的凸起12。凸起12可以是生物膜可以與之粘附的生物膜粘附位點(diǎn)，并且可以設(shè)置成適合與含有通道或含有孔的底部如基底20結(jié)合使用的任何模式或形狀。凸起12的模式優(yōu)選地反映常規(guī)板如通常用于檢測(cè)步驟的96微量滴定或孔板中的通道和/或孔的模式。在本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案中，凸起12優(yōu)選地在每排至少12個(gè)凸起的至少8個(gè)排14中形成?？梢允褂闷渌呐艛?shù)或者每排的凸起數(shù)，但是由于它符合通常在生物醫(yī)學(xué)裝置中所用的96孔板，所以這是方便的數(shù)目。所示的其它的或一些凸起可以用來(lái)在培養(yǎng)后確定初始生物膜濃度。所示的代表性凸起12約1.5cm長(zhǎng)和2mm寬，但是可以是任何大小和/或形狀。生物膜生長(zhǎng)組件1還包括設(shè)置成并且適于接受具有凸起12的蓋子10的培養(yǎng)基底20。蓋子10形成凸起12的支持物，用于支持在通道24內(nèi)的生物膜粘附位點(diǎn)。蓋子10具有周圍的蓋子16，其緊密蓋在容器20的周圍壁28上，以避免在溫育過(guò)程中污染容器內(nèi)部。基底20為生物膜形成提供兩種重要的作用。第一種是含有細(xì)菌群體的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的儲(chǔ)蓄池，所述細(xì)菌群體將在凸起12上形成生物膜。第二種作用是具有適于產(chǎn)生穿過(guò)凸起的剪切力的構(gòu)型。盡管不意欲受限于任何具體的操作理論，本發(fā)明人相信由穿過(guò)凸起的流體形成的剪切力在所述凸起上促迸最理想的生物膜生產(chǎn)和形成。在凸起12上的剪切力可以通過(guò)在傾斜工作臺(tái)30上搖動(dòng)具有蓋子10的容器20而產(chǎn)生。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用在約7°-約11。之間斜度的搖動(dòng)工作臺(tái)適于大部分應(yīng)用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，搖動(dòng)工作臺(tái)應(yīng)該設(shè)定在約9°。應(yīng)該理解，本發(fā)明不應(yīng)該限制在使用目前的傾斜角度，但是用于任何具體的機(jī)器的任何斜度應(yīng)該適于生長(zhǎng)按照本發(fā)明所述的生物膜。凸起12可以懸浮在通道24中，以致凸起12的頂端可以浸沒在通道24中流動(dòng)的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。隆起26沿著通道24引導(dǎo)液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)并且穿過(guò)凸起12，并且因此產(chǎn)生穿過(guò)凸起的剪切力。搖動(dòng)容器IO引起流動(dòng)方向的重復(fù)改變，在這種情形中，液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基穿過(guò)凸起10流動(dòng)的重復(fù)逆轉(zhuǎn)，其幫助保證生物膜等比例分布在蓋子10的每一個(gè)凸起12上。搖動(dòng)容器以致液體沿著通道前后流動(dòng)不但提供極好的生物膜生長(zhǎng)環(huán)境，而且模擬天然存在的條件。每個(gè)凸起12和每個(gè)通道24優(yōu)選地具有基本上相同的形狀(在制造公差(manufacturingtolerance)內(nèi))，以保證在生物膜形成過(guò)程中穿過(guò)凸起的剪切流的均一性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通道24應(yīng)該都被設(shè)置或者連接，以致它們共有充滿皿22的相同的液體營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)菌混合物。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基本上均一的通道構(gòu)型和通向相同微生物來(lái)源的途徑促進(jìn)在每個(gè)凸起上產(chǎn)生相等的生物膜，至少等于檢測(cè)抗生物膜試劑所需要的程度。認(rèn)為這樣產(chǎn)生的生物膜是均一的。對(duì)于板上的隨機(jī)凸起，已經(jīng)獲得PO.05內(nèi)的結(jié)果。生物膜的敏感性可以通過(guò)用一種或多種抗生物膜試劑處理生物膜粘附位點(diǎn)，即，攻擊生物膜，然后檢測(cè)生物膜而進(jìn)行檢測(cè)。這可以通過(guò)將蓋子60(具有在凸起上形成的生物膜)安放在適合接受蓋子10和凸起12的第二基底21上而完成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，蓋子60以充分防止組件污染的方式與第二基底21嚙合。當(dāng)用于此處時(shí)，充分防止污染的方式是指配合結(jié)構(gòu)的構(gòu)型和組件，以致閉合的組件的內(nèi)容物免受外部污染。按照本發(fā)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用任何安排或方案攻擊一組生物膜。例如，攻擊板的所有孔可以包含相同的抗生物膜試劑；多個(gè)或多樣的孔可以包括不同劑量的相同的抗生物膜試劑；在單排上的多個(gè)或多樣的孔可以包含相同劑量或不同劑量的抗生物膜試劑；多個(gè)或多樣的排可以包含相同劑量或不同劑量的抗生物膜試劑；多個(gè)或多樣的孔或者多個(gè)或多樣的排可以包含多于一種抗生物膜試劑；或者多個(gè)或多樣的孔或者多個(gè)或多樣的排可以包含多于一種抗生物膜試劑，每個(gè)孔、每一排和/或每種抗生物膜試劑劑量不同。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，孔的構(gòu)型和排列，抗生物膜試劑的類型和數(shù)目，和每個(gè)孔的劑量應(yīng)該隨需要而變化，以實(shí)現(xiàn)特別的目的，例如，使用如對(duì)目的目標(biāo)合理的一樣多的變量，用一種或多種抗生物膜試劑檢測(cè)一種或多種生物膜。例如，在容器20的相同通道24中溫育的凸起12可以用不同的抗細(xì)菌試劑處理。以這種方式，由于在任何一個(gè)通道里的生長(zhǎng)條件沿著整個(gè)通道非常相似，并且對(duì)于懸浮在所述通道中的每個(gè)凸起12也是非常相似的，所以可以獲得一致的結(jié)果。這幫助提高用不同抗細(xì)菌試劑處理不同凸起12的可靠性。這一實(shí)例表明不同的排列適合與本發(fā)明的組件一起使用。一些不同的常規(guī)方法可以用于計(jì)數(shù)細(xì)菌。它可以通過(guò)培養(yǎng)超聲處理的細(xì)菌，采用連續(xù)稀釋并且視覺計(jì)數(shù)菌落形成單位而進(jìn)行，或者可以使用自動(dòng)方法，例如使用光學(xué)讀數(shù)儀確定光密度。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，濁度的光學(xué)讀數(shù)對(duì)于實(shí)際應(yīng)用過(guò)于不準(zhǔn)確，并且優(yōu)選地應(yīng)該應(yīng)用活體染料技術(shù)以將存活能力檢測(cè)自動(dòng)化，其通過(guò)用活體染料處理生物膜，并且檢測(cè)由染色的生物膜發(fā)出的光的強(qiáng)度而進(jìn)行。在使用活體染料技術(shù)的情形中，生物膜不需要進(jìn)一步培養(yǎng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以使用用于細(xì)胞群體的其它染料；稍后這些染料可以提取出來(lái)并且讀數(shù)OD(剩余細(xì)胞生物量的檢測(cè))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)可以這樣進(jìn)行，即，通過(guò)超聲處理細(xì)胞直到它們裂解并且釋放ATP，然后加入螢光素酶，以產(chǎn)生機(jī)械可讀的光學(xué)輸出量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)可以使用共焦顯微鏡在凸起上的生物膜上直接進(jìn)行，盡管應(yīng)該考慮到這很難自動(dòng)化。在下述實(shí)例中，結(jié)果在連續(xù)稀釋后從人工計(jì)數(shù)獲得。細(xì)菌存活下降到零的抗細(xì)菌試劑的濃度(MBEC)可以從所述檢測(cè)容易地估計(jì)。同樣地，還可以從所述檢測(cè)確定MIC。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在一些情形中，在生物膜中不包含宿主成分的情況下，不形成生物膜。因此，宿主成分可以在細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程中加入到容器中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以形成生物膜?？梢约尤氲乃拗鞒煞职ㄑ宓鞍缀蛠?lái)自宿主生物體的細(xì)胞。對(duì)于檢測(cè)不同宿主細(xì)胞和成分的作用，通道24的末端25可以通過(guò)壁密封，以防止在一個(gè)通道中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基流到另一個(gè)通道中，因此將在每個(gè)通道生長(zhǎng)的細(xì)菌與其它通道分開。這樣描述的裝置還可以用來(lái)檢測(cè)用于抑制生物膜生長(zhǎng)的涂層，和檢測(cè)可以增強(qiáng)生物膜形成的涂層。在初始步驟中，凸起12可以用待檢測(cè)的涂層包被，然后將生物膜在所述凸起上生長(zhǎng)。然后，可以對(duì)生物膜進(jìn)行檢測(cè)，或者用抗細(xì)菌試劑處理然后進(jìn)行檢測(cè)。所述檢測(cè)可以在原位的或者在移開生物膜之后進(jìn)行。不同的涂層可以在不同排的栓上進(jìn)行檢測(cè)。增強(qiáng)的生物膜形成可以用來(lái)產(chǎn)生用于生物發(fā)酵的大的有活力的生物膜。當(dāng)用于本文時(shí)，組件是指設(shè)計(jì)或者配置成協(xié)同工作的元件或成分的綜合集合。本發(fā)明的典型的組件包括蓋子及其相對(duì)應(yīng)的基底。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，一個(gè)組件的元件可以與獨(dú)立的組件一起作用或工作。例如，組件l的蓋子可以用作組件2的蓋子，即，具有不同的基底。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，蓋子可以以可移動(dòng)的、密封的方式與基底嚙合。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，蓋子可以以閉合的，密封的方式與基底嚙合；在這些實(shí)施方案中，可需要適合組件的其它元件，以致它們可以移動(dòng)，例如，一個(gè)或多個(gè)可以移動(dòng)的凸起。當(dāng)用于本文時(shí)，攻擊板是指具有一個(gè)、多樣的或多個(gè)孔構(gòu)型等的任何基底，所述板用于將一種或多種生物膜暴露于一種或多種抗生物膜試劑。典型的攻擊可以用來(lái)確定包含一種或多種抗生物膜試劑的環(huán)境中的生物膜生長(zhǎng)。在本發(fā)明方法的后續(xù)步驟中，所述攻擊板可以用來(lái)確定任何浮游微生物的MIC值。一種代表性的攻擊板在圖6和8中顯示。當(dāng)用于本文時(shí)，恢復(fù)板是指具有一個(gè)、多樣的或多個(gè)孔構(gòu)型等的任何基底，所述板用來(lái)在已經(jīng)暴露于抗生物膜試劑后漂洗生物膜，中和任何抗生物膜試劑，以在所述組件超聲處理后收集任何分解的生物膜，或者它們的組合。在本發(fā)明方法的后續(xù)步驟中，所述恢復(fù)板可以用來(lái)確定在本方法中形成的任何生物膜的MBEC值。一種代表性的恢復(fù)板在圖7和8中顯示。當(dāng)用于本文時(shí)，中和試劑是指適于減小或者抵消由抗生物膜試劑引起的任何毒性的任何組合物。如果它對(duì)于所用的抗生物膜試劑和對(duì)于具體的生物膜是有效的，那么中和試劑是適宜的。中和試劑的選擇在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。一些中和試劑和組合物在實(shí)施例中顯示。如在圖7中所示和在實(shí)施例中所述，恢復(fù)培養(yǎng)基是包含一種或多種中和試劑的組合物。當(dāng)用于本文時(shí)，活性劑或抗生物膜試劑是指有效減少、降解或者消除生物膜或生物膜樣結(jié)構(gòu)的一種或多種試劑。本發(fā)明包括但不限于，已經(jīng)公知的活性劑，例如，抗生素，抗微生物劑，和殺生物劑。一種或多種活性劑可以獨(dú)立作用；一種或多種活性劑可以組合或協(xié)同作用；一種或多種活性劑可以順序或連續(xù)地應(yīng)用。當(dāng)用于本文時(shí)，活性劑組或文庫(kù)是指按照預(yù)先確定的方法分組的多樣的或多種活性劑的集合。例如，第一文庫(kù)可以包含一種或多種活性劑，所述活性劑在有效抗具體的生物膜中表現(xiàn)出某種程度的潛力。第二文庫(kù)可以以第一文庫(kù)的子集起始，并且設(shè)計(jì)成縮小有效活性劑的選擇，或者提供關(guān)于活性劑的具體子集的更多的信息。一組或文庫(kù)還可以包含按照預(yù)先確定的方法，例如，可變的劑量，而分組的專有(proprietary)或非專有活性劑組。當(dāng)用于本文時(shí)，含有活性劑的組合物包含一種或多種活性劑，并且還可以包含一種或多種其它試劑，包括但不限于細(xì)菌素或其它抗細(xì)菌肽或多肽，一種或多種消毒劑等，一種或多種表面活性劑等，一種或多種載體、生理鹽水等，一種或多種稀釋劑等，以及一種或多種防腐劑等。當(dāng)用于本文時(shí)，樣品是指從患者、動(dòng)物或環(huán)境采集的生物或流體樣品；樣品確切地包含任何來(lái)源或潛在來(lái)源的微生物?；颊叩姆蛛x物來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室方法，并且還通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室操作(CLSI)制備用于檢測(cè)。用于攻擊板的接種物包括應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)，美國(guó)專利號(hào)6051423,6326190,6410256,6596505,6599696和6599714，而以標(biāo)準(zhǔn)密度形成的生物膜。當(dāng)用于本文時(shí)，生物膜攻擊包括將在栓MBEC裝置上生長(zhǎng)的生物膜培養(yǎng)物置于預(yù)先包裝的攻擊盤的孔中，以致患者的分離物暴露于某種濃度范圍的針對(duì)它們抗目標(biāo)生物體的協(xié)同作用進(jìn)行選擇的抗生素譜。所用的培養(yǎng)時(shí)間和條件以及培養(yǎng)基隨分離物而不同。當(dāng)用于本文時(shí)，功效是基于組合的抗生素具有生物膜活性的能力，并且基于MIC(最小抑制濃度)、MBC(最小殺生物濃度)禾nMBEC(最小生物膜根除濃度)而定義。檢測(cè)細(xì)菌抗生素敏感性的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)是最小抑制濃度(MIC)，其檢測(cè)細(xì)菌在它們的浮游階段的敏感性。MIC是確定細(xì)菌在其生物膜階段的真正抗生素敏感性的有限的值。另一方面，MBEC檢測(cè)允許在生物膜階段的細(xì)菌的直接測(cè)定，并且包括在生物膜生長(zhǎng)裝置或板上形成生物膜，將生物膜暴露于一種或多種測(cè)試抗生素或活性劑確定的時(shí)間周期，將生物膜轉(zhuǎn)移到具有新鮮細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基的第二個(gè)板上，并且將生物膜培養(yǎng)過(guò)夜。MBEC值是防止細(xì)菌從處理過(guò)的生物膜再生的最低活性劑稀釋度。當(dāng)用于本文時(shí)，處理方案是指活性劑的劑量，活性劑的組成，和它應(yīng)該施用的頻率。使用本發(fā)明的裝置和方法，所述處理方案可以適合具體的人或動(dòng)物，具體的一種生物膜或多種生物膜，和/或具體的疾病或病況。對(duì)于一些疾病和病況，例如，CF，可以理想地在不同的時(shí)間進(jìn)行獨(dú)立的檢測(cè)，以優(yōu)化治療療程。例如，據(jù)信，當(dāng)患者和感染改變時(shí)，CF患者的病況隨著時(shí)間改變；監(jiān)測(cè)這些變化并且在需要時(shí)改變?nèi)魏翁幚韺⑹怯欣慕Y(jié)果。當(dāng)用于本文時(shí)，有利的結(jié)果是指任何程度抗微生物或生物膜的功效。益處的實(shí)例包括但不限于在生物膜或形成生物膜的微生物中的減低，消除，根除，或減少；并且處理微生物的能力被生物膜掩蓋或防止。在治療患者的方式中的改進(jìn)的代表性實(shí)例包括但不限于治療具體的患者的能力或潛能，使治療方案在具體的時(shí)間適合具體的患者的能力；和能夠選擇一種或多種特別的活性劑的提高的能力。當(dāng)用于本文時(shí)，敏感性檢測(cè)或相似的短語(yǔ)是指確定活性劑是否并且以多少量影響在生物膜中的微生物的生長(zhǎng)或狀態(tài)。在本發(fā)明的裝置和方法中，敏感性檢測(cè)與現(xiàn)有技術(shù)方法不同，在于其使用高通量的裝置，在非靜止環(huán)境中形成生物膜，通過(guò)流動(dòng)系統(tǒng)產(chǎn)生生物膜。當(dāng)用于本文時(shí)，高通量是指同時(shí)或者在同一步驟中生長(zhǎng)和/或檢測(cè)大量生物膜和/或大量抗生物膜試劑的能力。典型地，高通量體現(xiàn)為以一種或多種組件存在的結(jié)構(gòu)元件，以提高生長(zhǎng)或被檢測(cè)的物質(zhì)的速度或數(shù)量，例如，96孔檢測(cè)板，適合并且設(shè)置成與96孔板嚙合的頂蓋，具有與所述孔相對(duì)應(yīng)的栓的頂蓋，和具有通道的生物膜生長(zhǎng)板，以致你可以同時(shí)處理大量的單個(gè)生物膜。實(shí)施例下述用于實(shí)施例1-4:抗生素和其它抗微生物劑儲(chǔ)液應(yīng)該以在攻擊板中所用的最高濃度的5X預(yù)先制備。例如，去離子水或適當(dāng)?shù)娜軇┯脕?lái)制備5120pgml"活性劑的抗生素儲(chǔ)液。參考臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(ClinicalLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)文獻(xiàn)M100-S8關(guān)于應(yīng)該使用哪種溶劑和稀釋劑的詳情。大部分抗生素儲(chǔ)液在-7(TC穩(wěn)定最少6個(gè)月。對(duì)于科研應(yīng)用，適當(dāng)?shù)貞?yīng)用中和劑來(lái)確定最小殺細(xì)菌和殺真菌濃度。這些試劑減少生物活性化合物從攻擊到恢復(fù)培養(yǎng)基的殘余物的毒性。例如，可以使用|3-內(nèi)酰胺酶中和青霉素，或L-半胱氨酸中和Hg^和一些其它的重金屬陽(yáng)離子。下述實(shí)驗(yàn)在殺生物劑敏感性檢測(cè)中使用通用的中和劑，所述中和劑是調(diào)節(jié)產(chǎn)品開發(fā)方面必需的。這一實(shí)施例描述如下1.OgL-組氨酸l.OgL-半胱氨酸2.0g還原谷胱甘肽用雙蒸水補(bǔ)足到20ml。通過(guò)具有0.20pm濾器的注射器以除菌。這一溶液可以保存在-2(TC。補(bǔ)足1升適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基(陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MHB)。將這種培養(yǎng)基每升補(bǔ)充20.0g皂苷和每升補(bǔ)充10.0g吐溫-80。用稀釋的NaOH調(diào)節(jié)到正確的pH(在20。C7.0±0.2)。向用于恢復(fù)板的每20ml補(bǔ)充表面活性劑的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入500通用中和劑。在圖4中提供這一實(shí)驗(yàn)方案的綜述。完成這一方案需要的天數(shù)取決于要檢驗(yàn)的微生物的生長(zhǎng)速率。所述方案被分成6個(gè)相續(xù)的步驟，每一步驟在下文部分中詳細(xì)敘述。這種方案研發(fā)用于Nimc牌，平底，96孔微量滴定板。這些微量板具有每孔300^的最大體積。對(duì)于不同牌子的微量滴定板，這里列出的培養(yǎng)基和緩沖液的體積可能需要調(diào)整。實(shí)施例1.步驟1-生長(zhǎng)需要的微生物的傳代培養(yǎng)物1如果使用低溫儲(chǔ)液(在一7(TC)，將需要的細(xì)菌或真菌菌株的第一傳代培養(yǎng)物劃線到適當(dāng)?shù)沫傊桨迳稀Ｔ谒鑫⑸锏淖罴焉L(zhǎng)溫度培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間階段。對(duì)于大部分細(xì)菌菌株，所述第一傳代培養(yǎng)物可以用石蠟?zāi)?Parafilm)包裹，并且在4。C保存多達(dá)14天。2檢驗(yàn)所述第一傳代培養(yǎng)物的純度(即，在平板上只應(yīng)該存在單菌落形態(tài))。3從所述第一傳代培養(yǎng)物或從臨床分離物，將第二傳代培養(yǎng)物劃線到適當(dāng)?shù)沫傊桨迳?。在所述微生物的最佳生長(zhǎng)溫度培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間階段。第二傳代培養(yǎng)物應(yīng)該在它第一次從溫育移開的時(shí)刻開始的24小時(shí)之內(nèi)使用。4檢驗(yàn)第二傳代培養(yǎng)物的純度。不推薦在含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)傳代培養(yǎng)物?？股睾推渌刮⑸飫┛赡茉诩?xì)菌中引發(fā)適應(yīng)性脅迫反應(yīng)和/或可能在群體中增加突變體的積聚。這可能導(dǎo)致異常的敏感性確定。步驟2-接種組件這一步驟，接種組件，在圖5中圖示。概括地，新鮮的第二傳代培養(yǎng)物用來(lái)產(chǎn)生匹配l.OMcFarland標(biāo)準(zhǔn)的接種物。這種溶液用生長(zhǎng)培養(yǎng)基1比30稀釋。將22ml的1比30的稀釋液加入到本發(fā)明組件的基底的槽中。將所述裝置置于搖動(dòng)臺(tái)上以輔助在聚苯乙烯栓上形成生物膜。推薦下述步驟應(yīng)該在生物安全柜中(如果可用的話)進(jìn)行。然而，在工作臺(tái)上應(yīng)用無(wú)菌技術(shù)是可能的1.打開無(wú)菌96孔微量滴定板。對(duì)于每次高通量檢測(cè)，將微量滴定板從A到F'排'的4(列，用180lal生理鹽水溶液填充。2.將1.5ml(對(duì)于同時(shí)接種的每個(gè)另外的裝置加1.0ml)需要的肉湯生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到無(wú)菌玻璃檢測(cè)管中。3.使用無(wú)菌棉簽，收集在第二瓊脂傳代培養(yǎng)物表面上的細(xì)菌菌落。棉簽頂端覆蓋一薄層細(xì)菌。4.將所述棉簽浸沒在肉湯中懸浮細(xì)菌。目的是產(chǎn)生匹配1.0McFarland標(biāo)準(zhǔn)(即3.0X108cfoml")的混懸液。小心不要在溶液中形成細(xì)菌團(tuán)。5.重復(fù)步驟2，部分3和4根據(jù)需要進(jìn)行多次，以匹配光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。6.將29ml適當(dāng)?shù)娜鉁L(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，TSB)加入到無(wú)菌的50ml聚丙烯或玻璃管中。向所述聚丙烯或玻璃管中加入l.Oml1.0McFarland標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌混懸液。這種1.0McFarland標(biāo)準(zhǔn)(即I,OXIO7cfiiml")的30倍稀釋物作為所述裝置的接種物。7.打開所述裝置的無(wú)菌包裝。將所述接種物倒入試劑儲(chǔ)存器中。使用無(wú)菌移液器，將22ml接種物加入到用所述裝置包裝的槽中。將栓蓋放置到槽上。校準(zhǔn)在這一步驟中所用的接種物的體積，以致生物膜覆蓋被步驟3(下文)設(shè)置的攻擊板中所用的抗微生物劑體積完全浸沒的表面積。使用更大體積的接種物可能導(dǎo)致在栓的高處形成生物膜，其物理地避免暴露在該攻擊步驟中。8.將所述裝置放置在適當(dāng)溫度的濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中的搖動(dòng)臺(tái)上。所述臺(tái)應(yīng)該設(shè)置在每分鐘3-5次搖動(dòng)。關(guān)鍵是搖動(dòng)臺(tái)的角度設(shè)置在9°-16°的傾斜。這種運(yùn)動(dòng)必須是對(duì)稱的。9.將接種物樣品連續(xù)稀釋(10倍)(重復(fù)3或4次)。這些是用來(lái)檢驗(yàn)接種物中的起始細(xì)胞數(shù)的對(duì)照。10.在適當(dāng)標(biāo)記的系列瓊脂平板上從10—6到10"點(diǎn)滴接種接種物的連續(xù)10倍稀釋物。將點(diǎn)滴板溫育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間階段，并且為生長(zhǎng)打分。實(shí)施例2.步驟3-設(shè)置抗微生物攻擊板下述部分描述怎樣在攻擊板上設(shè)置單一抗微生物劑的連續(xù)兩倍稀釋梯度。這只是一個(gè)實(shí)例。抗微生物劑攻擊板可以以抗微生物劑的任何組合所需要的任何方式設(shè)置。重要地是攻擊板的每個(gè)孔的終體積是200^1。這是確保將生物膜完全浸沒在抗微生物劑中。1.取一個(gè)全新的無(wú)菌96孔微量滴定板，并且在層流罩超靜臺(tái)中將其打開。2.在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中設(shè)定需要的抗微生物劑的工作溶液。不要將所述抗微生物劑稀釋超過(guò)20%(g卩，每4份生長(zhǎng)培養(yǎng)基不超過(guò)1份儲(chǔ)備的抗微生物劑溶液)?？刮⑸飫┑墓ぷ魅芤簯?yīng)該以與在攻擊板中檢測(cè)的最高濃度相等的濃度制備。3.將200pl生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到攻擊板的第1'列，和第12'列'。這些將分別作為無(wú)菌狀態(tài)和生長(zhǎng)對(duì)照。4.將100生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入到微量滴定板的第3-11'列'。5.將200nl工作溶液加入到微量滴定板的第2'列'。6.將100^工作溶液加入到微量滴定板的第3《列'和第4(列'。7.使用多通道微量移液器，通過(guò)上下吹吸將第4'列'的內(nèi)容物混合?；旌虾螅瑥牡?'列，中的孔轉(zhuǎn)移100pl到第5<列，中相對(duì)應(yīng)的孔中。8.混合，從第5'列，轉(zhuǎn)移IOOjal到第6'列'。沿著微量滴定板的長(zhǎng)連續(xù)重復(fù)這一混合和轉(zhuǎn)移步驟，直到達(dá)到第ll^列'。9.將第11列的內(nèi)容物上下混合。從第11'列'中的每個(gè)孔中吸取100并且棄之。10.向第4-11'列，的孔中加入100pl生長(zhǎng)培養(yǎng)基。11.將蓋子重新放置在攻擊板上。輕輕敲打板，以促進(jìn)殺生物劑/抗生素和培養(yǎng)基的混合。步驟4-暴露生物膜本步驟，將生物膜暴露于一種或多種抗微生物劑，圖示在圖6中。簡(jiǎn)言之，將上文準(zhǔn)備的組件從旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上移下，并且將生物膜在生理鹽水溶液中漂洗。然后將漂洗的生物膜浸沒在攻擊板的抗微生物劑中，并且溫育需要的暴露時(shí)間。1.在每個(gè)孔中用200fil生理鹽水溶液設(shè)置無(wú)菌微量滴定板。這一板將用來(lái)漂洗栓，以從生物膜上去除松散附著的浮游細(xì)胞(這叫作'漂洗板，)。2.本步驟將用來(lái)確定在4個(gè)樣品栓上和來(lái)自4個(gè)孔的浮游培養(yǎng)物的生物膜生長(zhǎng)。對(duì)于每個(gè)接種的裝置，在A排4'列'中用200pl生理鹽水溶液設(shè)置無(wú)菌微量滴定板(即，每3個(gè)裝置需要1個(gè)微量滴定板)。用180^生理鹽水溶液填充B-F排。在第二個(gè)微量滴定板中，對(duì)于每個(gè)接種的裝置，用lS0(il生理鹽水溶液填充從A到H排的4'列'。第一個(gè)微量滴定板將用來(lái)進(jìn)行生物膜培養(yǎng)物的連續(xù)稀釋，第二個(gè)將用來(lái)檢驗(yàn)在含有接種物的微量滴定板的孔中浮游細(xì)胞的生長(zhǎng)。3.在需要的溫育時(shí)間之后，將高通量的組件從搖動(dòng)臺(tái)上移下，并且移入層流罩超靜臺(tái)。將栓蓋從槽上移下，并且將栓浸沒在漂洗板的孔中。在進(jìn)行下述步驟4時(shí)讓所述漂洗板靜置1-2分鐘。4.使用微量移液器將20)^1浮游培養(yǎng)物(在裝置的波狀槽中)轉(zhuǎn)移到在步驟2(直接見上文)設(shè)置的后一板'A，排的180pl鹽水中。重復(fù)這一操作3次，總共4X20pl整分試樣。5.將浮游培養(yǎng)物棄入適當(dāng)?shù)纳镂：π詮U品中。6.在層流罩超靜臺(tái)中，將一對(duì)鑷子浸沒在95%的乙醇中。在通風(fēng)櫥(flowhood)中用酒精燈灼燒鑷子。當(dāng)使用酒精燈時(shí)要小心。在使用70%乙醇消毒后手晾干之前不要點(diǎn)燃酒精燈，并且不要灼燒鑷子。7.使用灼燒的鑷子，將栓A1、Cl、E1和G1從組件的蓋子折斷，并且將它們浸沒在步驟2設(shè)置的第一個(gè)板的A排中(并且分別在不同'列')的200W的鹽水中。8.使用灼燒的鑷子，將栓B1、Dl、F1和H1折斷并且丟棄。9.將組件的栓蓋插入到攻擊板中。將所述攻擊板置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)箱持續(xù)需要的暴露時(shí)間。考慮到MIC確定的擴(kuò)大的次數(shù)，溫育可以在備選溫度進(jìn)行。10.將含有樣品栓的微量滴定板置于超聲清潔器(超聲發(fā)生器)的托盤中。在設(shè)定的'高'處超聲5-30分鐘(需要的時(shí)間取決于被檢測(cè)的微生物)。由超聲發(fā)生器在水中產(chǎn)生的振動(dòng)首先從水中傳播，然后通過(guò)鋼制的插入盤傳播，并且最后傳播到所述裝置，以應(yīng)用振動(dòng)將生物膜從96栓的表面分解到鹽水中。11.在相對(duì)應(yīng)的微量滴定板的孔中連續(xù)稀釋20(il浮游培養(yǎng)物的整分試樣(來(lái)自步驟4)。一旦超聲處理完成，用生物膜培養(yǎng)物重復(fù)這一連續(xù)稀釋步驟。12.在適當(dāng)標(biāo)記的系列瓊脂平板上用浮游的和生物膜培養(yǎng)物的連續(xù)10倍稀釋物點(diǎn)滴接種，從10—s到l(^和從10's到l(A將點(diǎn)滴板溫育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間階段，并且為生長(zhǎng)打分。步驟5-中和與恢復(fù)本步驟，中和抗微生物劑并且恢復(fù)存活的生物膜細(xì)菌，圖示在圖7中。簡(jiǎn)言之，在暴露后，將生物膜在生理鹽水中漂洗兩次。然后，將生物膜轉(zhuǎn)移到含有中和劑和恢復(fù)培養(yǎng)基的微量滴定板中。在水層超聲發(fā)生器(watertablesonicator)中通過(guò)超聲處理將生物膜分解到其中。1.向全新的96孔微量滴定板的每個(gè)孔中加入200pl適當(dāng)?shù)幕謴?fù)培養(yǎng)基(含有中和劑，參見部分3.2的實(shí)施例)。這一板叫作"咴復(fù)板'。2.為所用的每個(gè)組件準(zhǔn)備2個(gè)漂洗板。3.將攻擊板從培養(yǎng)箱移出，并且置于層流罩超靜臺(tái)中(或者使用小心的無(wú)菌技術(shù))。將栓蓋移開并且將栓浸沒在漂洗板的生理鹽水中。將攻擊板用漂洗板的無(wú)菌蓋子蓋上。大約1分鐘后，將所述栓蓋從第一個(gè)漂洗板轉(zhuǎn)移到第二個(gè)漂洗板中。將攻擊板蓋上，并且如果適當(dāng)保留用于MIC確定。4.將所述栓蓋從第二個(gè)漂洗板轉(zhuǎn)移到上文設(shè)置的恢復(fù)板。將恢復(fù)板(包含裝置的栓)轉(zhuǎn)移到超聲發(fā)生器的托盤中。高度超聲5-30分鐘(這取決于生物膜的厚度)。振動(dòng)將把生物膜從96栓表面分解到恢復(fù)板中。5.超聲處理后，將栓蓋從恢復(fù)板移開并且代替所述微量滴定板的原始蓋子?，F(xiàn)在所述裝置的蓋子可以丟棄到高壓滅菌廢物中。6.將所述恢復(fù)板置于培養(yǎng)箱中，并且溫育最少24-72小時(shí)，這取決于被檢驗(yàn)的生物體。存活細(xì)胞計(jì)數(shù)為了在用抗微生物劑處理后生物膜的存活細(xì)胞計(jì)數(shù)，從恢復(fù)板轉(zhuǎn)移100pl恢復(fù)培養(yǎng)基(含有超聲的生物膜)到連續(xù)稀釋板的A排。另外設(shè)置這一板以在B-F排的每個(gè)孔中含有180^生理鹽水溶液。使用多通道移液器從A排連續(xù)稀釋20pl。在向微量滴定板的每排轉(zhuǎn)移之間確保更換多通道移液器上的管尖(tip)。在適當(dāng)標(biāo)記的瓊脂平板上點(diǎn)滴接種生物膜培養(yǎng)物(其已被連續(xù)稀釋IO倍)。溫育最少48小時(shí)，以保證存活微生物的最大程度的恢復(fù)。在溫育后，計(jì)數(shù)在板上恢復(fù)的細(xì)菌。應(yīng)用下部分的公式確定生物膜群體的殺死。為了計(jì)算死亡和存活(log-kill)，應(yīng)用下述公式log-kill=log10(初始cfWml)_log10(暴露后剩余的cfWml)備選地，log-kill=log1()[l/(1—％殺死(以小數(shù)))]為了計(jì)算殺死百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用下述公式%殺死=[1一(剩余cfU/ml)/(初始cfWml)]X100為了計(jì)算存活百分?jǐn)?shù)，應(yīng)用下述公式-%存活=[(暴露后剩余cfU/ml)/(初始cfii/ml)]X100為了計(jì)算存活百分?jǐn)?shù)的對(duì)數(shù)，應(yīng)用下述公式1og。/。存活=10§1()(%存活)顯微鏡檢對(duì)于許多顯微鏡技術(shù)，可以理想地將生物膜固定在所述組件的栓表面上?？梢詰?yīng)用下述方案來(lái)制備用于掃描電鏡(SEM)和共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)的生物膜。在上述標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟中，每個(gè)攻擊板具有8個(gè)生長(zhǎng)對(duì)照(在暴露之前)。這些當(dāng)中的4個(gè)用作生長(zhǎng)對(duì)照。其余4個(gè)可以用于顯微鏡檢，而不是丟棄。固定生物膜用于掃描電鏡(SEM)準(zhǔn)備工作溶液在下述步驟中戴上保護(hù)性手套，并且在通風(fēng)櫥中處理這些高毒性化學(xué)二甲胂酸緩沖液0.1M:將16g二甲胂酸溶解在l升雙蒸H20中；調(diào)整到pH7.2。二甲胂酸緩沖液中2.5%的戊二醛將2ml70%戊二醛溶解在52ml二甲胂酸緩沖液中(產(chǎn)生2.5%的溶液)。還可以使用5%的溶液(2ml戊二醛在26ml二甲胂酸緩沖液中)。標(biāo)準(zhǔn)方案這種固定技術(shù)對(duì)于生物膜是破壞性的。然而，這允許對(duì)潛在的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的檢查。1.使用一對(duì)灼燒的鑷子，將栓從MBECTM-HTP裝置上折斷。2.將栓在0.9%鹽水中漂洗1分鐘。這破壞松散附著的浮游細(xì)菌。3.將栓在0.1M二甲胂酸(pH7.2)的2.5c/。戊二醛中固定。在4"C栓在這種溶液中放置16小時(shí)。4.在這一固定步驟之后，將栓在0.1M二甲胂酸中洗滌一次大約10分鐘。5.將栓在雙蒸水中洗滌一次大約10分鐘。6.將栓在70%乙醇中脫水15-20分鐘。7.空氣干燥最少24小時(shí)。8.封固標(biāo)本，并且通過(guò)SEM檢查。備選方案這種固定技術(shù)較少破壞性。可能觀察到細(xì)胞外聚合基質(zhì)和一些(雖然脫水的)生物膜結(jié)構(gòu)。1.使用一對(duì)灼燒的鑷子，將栓從MBECTM-HTP裝置上折斷。2.將栓在0.9%鹽水中漂洗2分鐘。這破壞松散附著的浮游細(xì)菌。3.將栓在0.1M二甲胂酸(pH7.2)的2.5。/。戊二醛中固定。在2(TC栓在這種溶液中放置2-3小時(shí)。4.空氣干燥最少120小時(shí)。5.封固標(biāo)本，并且通過(guò)SEM檢査。固定生物膜用于共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)在磷酸緩沖鹽水中的5%戊二醛將2ml70%的戊二醛溶解在26ml磷酸緩沖鹽水中(產(chǎn)生5%的溶液)。標(biāo)準(zhǔn)方案1.使用一對(duì)灼燒的鑷子，將栓從蓋子上折斷。2.將栓在0.9%鹽水中漂洗1分鐘。這破壞松散附著的浮游細(xì)菌。3.將栓在磷酸緩沖鹽水(pH7.2)中的5Q/。戊二醛中固定。在3(TC栓在這種溶液中放置0.5-l小時(shí)。4.將栓在0.9%鹽水中漂洗1分鐘。5.將栓用適當(dāng)?shù)臒晒鈭F(tuán)染色，并且使用共焦激光掃描顯微鏡檢查。表面包被組件的凸起栓或凸起的表面可以用許多物質(zhì)包被，以促進(jìn)苛求微生物的生長(zhǎng)。例如，由特定的念珠菌屬物種(Cam/Waspp.)形成的生物膜通過(guò)用1.0。/。L-賴氨酸溶液包被栓而增強(qiáng)。栓蓋還可以用羥基磷灰石(hydroxyapetite)、膠原或鉑包被。實(shí)施例3確定MBEC值為了確定最小生物膜根除濃度(MBEC)值，在恢復(fù)板的孔中檢查濁度(視覺上的)。備選地，使用微量滴定板讀數(shù)儀，獲得在650nm的光密度檢測(cè)(OD650)。清澈的孔(OD650<O.l)表明生物膜根除。實(shí)施例4確定MIC值為了確定最小抑制濃度(MIC)值，在攻擊板的孔中檢查濁度(視覺上的)。備選地，使用微量滴定板讀數(shù)儀，獲得在650nm的光密度檢測(cè)(OD650)。MIC定義為抑制生物體生長(zhǎng)的最小抗生素濃度。清澈的孔(OD650<O.l)表明在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間后的抑制。實(shí)施例5背景銅綠假單胞菌(尸"wc/omo"asaerag/"ora(Ps))和金黃色葡萄球菌(5Vap/7y/ococcmaMm^(Staph))在組織和移植的表面上形成生物膜，這導(dǎo)致頑固的感染，由于生物膜-特異的抗性機(jī)制，所述頑固感染通常對(duì)抗微生物劑治療沒有反應(yīng)。應(yīng)用MIC選擇用于生物膜感染的抗微生物劑治療通常不適用。1^/^￡0@檢測(cè)用于評(píng)估生物膜和浮游細(xì)菌對(duì)單一的和組合的試劑的抗微生物劑敏感性。方法Ps(來(lái)自囊性纖維化患者的12份分離物)和葡萄球菌(Staph)(來(lái)自與裝置相關(guān)的感染的12份分離物)的生物膜在MBEC檢測(cè)蓋子的栓(pins)上形成。然后將生物膜和浮游細(xì)菌暴露于不同的抗生素和抗生素組合24小時(shí)(表1和2)。所述檢測(cè)提供作為生物膜和浮游生物體的每種分離物對(duì)單獨(dú)的或組合的抗微生物劑的定性敏感性。結(jié)果表i.對(duì)單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的i3萄球菌抗性抗生素浮游的生物膜抗生素浮游的生物膜GM/CLOX112VAN/GM112GM細(xì)P312CLIN/AMP612GM/CFZ312VA畫F了11GM/CL1N1012CIPRO/RIF1210GM/RIF1212CIPRO/CFZ412GM/C1PRO912CLOX/RIF812C畫R1F1212GM610CLIN/CLOX412AMP1212CLIN/VAN412CFZ212CLIN/CFZ412CIPRO1012C匿CIPRO1012VAN612VAN/CFZ112CUN912VAN/CLOX312CLOX312VAN/CIPRO112表2.對(duì)單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的Ps抗性抗生素浮游的生物虔GM/AZTRGM/CFTZTB/AZTRTB/CFTZP+T/TBP+T/GMAK/AZTRAK/P+TTB/CIPRO■MPGM/IMPCLO/RIFAK/CFTZAK細(xì)P13311223188241212121212121212121212121211抗生素浮游的生物膜CLO汀MS03CFTZ/AZTR1112CIPRO/AK512CIPRO/AZTR03P+T412CLO212AZTR09IMP1212結(jié)論對(duì)于每種菌株抗性模式是獨(dú)特的。作為浮游形式，PS和葡萄球菌菌株對(duì)多種抗生素敏感，但是作為生物膜顯著更有抗性。某些抗生素當(dāng)組合時(shí)比單一試劑更加有效。^48￡0@檢測(cè)可以用于選擇治療生物膜相關(guān)的感染的抗生素。實(shí)施例6生物膜(bioFILM)PA抗微生物劑敏感性系統(tǒng)生物膜PA面板設(shè)計(jì)用來(lái)確定浮游的和生物膜銅綠假單胞菌二者的抗2212248833ocG微生物劑敏感性。概述和原理這種肉湯稀釋物抗微生物劑敏感性檢測(cè)具有各種單獨(dú)的和組合的抗微生物劑，其稀釋在由臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所TM(CLSI)定義的絕對(duì)斷點(diǎn)濃度(categoricalbreakpointconcentration)的陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯(CAMHB)中。使用95個(gè)栓的接種蓋子，將面板孔接種浮游的和生物膜銅綠假單胞菌。然后將面板和具有栓的蓋在35'C溫育最少16小時(shí)。浮游生物的敏感性和抗性通過(guò)在35'C溫育16-24小時(shí)后檢測(cè)在抗微生物劑存在下的抑制和生長(zhǎng)而確定。將含有已經(jīng)暴露于抗微生物劑的生物膜細(xì)菌的具有栓的蓋置于在96孔板中只含有CAMHB的恢復(fù)培養(yǎng)基中。生物膜敏感性和抗性通過(guò)檢測(cè)繼續(xù)在35X:溫育16-24小時(shí)后的抑制和生長(zhǎng)而確定。方法材料生物膜(bioFILM)PA斷點(diǎn)面板有蓋無(wú)菌恢復(fù)面板無(wú)菌MBECTM具有95個(gè)栓的接種蓋無(wú)菌MBECTM托盤(用于生長(zhǎng)接種物)無(wú)菌漂洗面板0.5McFarland硫酸鋇濁度標(biāo)準(zhǔn)接種物水接種物肉湯(胰胨肉胨培養(yǎng)液)檢測(cè)和恢復(fù)肉湯，陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)具有一次性管尖的100pl移液器多通道微量移液器(推薦具有12通道的50-300pl)搖動(dòng)平臺(tái)(9。傾斜角)25ml移液器具有螺旋蓋的無(wú)菌50ml管定性對(duì)照生物體(銅綠假單胞菌，ATCC27853)定性對(duì)照?qǐng)?bào)告形式96孔微量滴定板(l個(gè)用于栓洗滌，和l個(gè)用于恢復(fù)板)振蕩器步驟概述A.接種物準(zhǔn)備CLSI推薦通過(guò)菌落計(jì)數(shù)而定時(shí)檢查接種物密度。對(duì)于銅綠假單胞菌ATCC27853的期望結(jié)果應(yīng)該接近大約5Xl()SCFU/m^3。1.主要接種方法推薦用濁度標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)直接接種銅綠假單胞菌。a.使用無(wú)菌木制涂布棒或細(xì)菌環(huán)，觸及來(lái)自18-24小時(shí)非抑制性瓊脂平板的4-5個(gè)大的或5-10個(gè)小的形態(tài)相似的、充分分離的菌落的表面。b.在3ml接種物水(高壓滅菌的蒸餾水)中乳化，并且與0.5McFarland標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。c.振蕩混懸液2-3秒。d.將88gl標(biāo)準(zhǔn)化的混懸液移液到無(wú)菌的22ml胰胨肉胨培養(yǎng)液(TSB)中。緊密蓋上。顛倒8-10次或者將樣品振蕩幾秒鐘以混合。2.準(zhǔn)備生物膜(bioFILM)PA接種栓蓋a.從包裝移出MBECTM托盤和95個(gè)栓的蓋(如果包裝的完整性被破壞不要使用)。b.從托盤移出栓蓋。c.吸取在TSB中的22ml銅綠假單胞菌混懸液(參見Id)到槽型托盤中。d.將95個(gè)栓的接種蓋放置在托盤上(檢査栓蓋正確排列以牢固地配合托盤)。e，將組裝的栓蓋和托盤放置在具有大約9。傾斜的搖動(dòng)平臺(tái)上。排列槽，使之與搖動(dòng)方向平行。在35t:溫育，每分鐘3-4次搖動(dòng)。由于傾斜角太大或者平臺(tái)搖動(dòng)不對(duì)稱，所以一些搖動(dòng)器不適合生物膜(bioFILM)PA檢測(cè)。操作者應(yīng)該檢查以確定搖動(dòng)器滿足這一檢測(cè)必要的要求。f.溫育4-6小時(shí)。這足以產(chǎn)生約l()Scfli/栓的生物膜。B.面板準(zhǔn)備l.從冷凍保藏中移出待用的面板。打開封袋，移出面板，并且允許平衡到室溫30-60分鐘。C.浮游生物抗微生物劑敏感性檢測(cè)1.將準(zhǔn)備好的MBECTM95個(gè)栓的蓋放置在解凍的bioFILMPA面板上。2.應(yīng)該獲得3-7X105CFU/ml的最終浮游銅綠假單胞菌的孔濃度2。3.應(yīng)該通過(guò)將接種物劃線到血瓊脂平板上并且溫育16-20小時(shí)而準(zhǔn)備純度板。如果在純度板上存在不止一種菌落形態(tài)，那么保證重新分離檢測(cè)菌落和重新檢測(cè)所述面板。D.抗微生物劑面板培養(yǎng)1.將所述面板以3-5個(gè)為組疊放，以保證在培養(yǎng)過(guò)程中均勻的熱量分布。2.將所述面板在無(wú)C02培養(yǎng)箱中在35"C培養(yǎng)16-24小時(shí)。3.在16-24小時(shí)培養(yǎng)之后，浮游生物面板準(zhǔn)備好進(jìn)行讀數(shù)。4.移開帶栓的蓋(參見/下述部分El.)。5.讀取浮游生物抗微生物劑敏感性結(jié)果(參見下述F)。E.生物膜抗微生物劑敏感性檢測(cè)1.將帶栓的蓋置于每孔含有200gl±10gl接種物水的96孔板中大約30秒。進(jìn)行這以便從栓上去除任何殘余的抗生素。2.將帶栓的蓋置于每孔含有200glCAMHB的96孔恢復(fù)板中。3.為了確保在培養(yǎng)過(guò)程中均勻的熱量分布，將所述面板以每組不多于5個(gè)疊放。4.將所述面板在無(wú)C02培養(yǎng)箱中在35'C培養(yǎng)16-24小時(shí)。5.培養(yǎng)16-24小時(shí)后，生物膜恢復(fù)面板準(zhǔn)備好進(jìn)行讀數(shù)。6.移開帶栓的蓋并且丟棄。7.讀取生物膜抗微生物劑敏感性結(jié)果(參見下述F)。F.對(duì)關(guān)于浮游生物的和生物膜敏感性的面板進(jìn)行讀數(shù)1.在16-20小時(shí)培養(yǎng)之后，移出面板。2.用沒有棉絨的棉紙擦拭面板底部，以去除可能存在的任何凝聚物或殘?jiān)?.在抗微生物劑孔中的生長(zhǎng)出現(xiàn)混濁，其可能采取下述形式在整個(gè)孔中的白色霧狀，在孔中央的白色塊狀(whitebutton)，或者在整個(gè)孔中的細(xì)小顆粒生長(zhǎng)。不充分的或沒有生長(zhǎng)定義為在孔中或肉湯中的微白色。4.對(duì)面板進(jìn)行讀數(shù)的預(yù)防措施a.如果生長(zhǎng)孔混濁，那么只對(duì)所述面板進(jìn)行讀數(shù)。b.如果無(wú)菌對(duì)照孔(SC)混濁，或者如果在生長(zhǎng)孔或生長(zhǎng)對(duì)照(GC)中沒有生長(zhǎng)，那么不要對(duì)抗微生物劑敏感性孔進(jìn)行讀數(shù)。G.讀取浮游生物抗微生物劑敏感性:描述結(jié)論編碼在16-20小時(shí)培養(yǎng)后，在更高和更低的抗微生物劑濃度的抗微生物劑中沒有生長(zhǎng)敏感型S在更低濃度的抗微生物劑中生長(zhǎng)，但是在更高濃度的抗微生物劑中不生長(zhǎng)中間型I在兩種濃度的抗微生物劑中都生長(zhǎng)抗性型R結(jié)果解釋通過(guò)比較生物體的斷點(diǎn)敏感性與可獲得的抗微生物劑的血液或尿液水平，而確定敏感性。下表列出在CLSI文獻(xiàn)M100-S9中顯示的解釋標(biāo)準(zhǔn)。J.解釋斷點(diǎn)*抗微生物劑敏感性中間型抗性阿米卡星<1632>64氨曲南<816>32頭孢吡肟<816>—32頭孢他啶<816>32氯霉素<816>32環(huán)丙沙星<12>4多粘菌素E<2->4慶大霉素<48>16美羅培南<48>_16哌拉西林/三唑巴坦<16/432/4>64/4>28/4甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<2/38->4〃6妥布霉素<48>16阿米卡星/氨曲南<16/832/16>64/32阿米卡星/頭孢吡后<湖32/16>64/32阿米卡星/頭孢他啶<扁32716>64/32阿米卡星/環(huán)丙莎星<16/132/2>64/4阿米卡星/多粘菌素E<搬->64/4阿米卡星/美羅培南<湖32/8>64/15阿米卡星/哌拉西林/三唑巴坦<湖6/432/32/4-3潔/4>64/128/4阿米卡星/甲氧芐啶/磺胺甲噁唑—<16/測(cè)->64/4/76氯霉素/頭孢他啶<8/816/16>32/32氯霉素/美羅培南<8/416/8>32/16環(huán)丙沙星/氨曲南<1/82/16>4/32環(huán)丙沙星/多粘菌素E<1/2->4/4環(huán)丙沙星/美羅培南<1/42/8>4/16環(huán)丙沙星/哌拉西林/三唑巴坦<1/湖2/32/4-2/64/4>4/128/4環(huán)芮沙星A甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<1/2/38->W76慶大霉素/氨曲南<4/88/16>16/32慶大霉素/頭孢吡肟<4/88/16>16/32慶大霉素/頭孢他啶<4/88/16>16/32慶大霉素/環(huán)丙沙星<4/18/2>湖慶大霉素/多粘菌素E<4/2->16/4慶大霉素/美羅培南<4/48/8>16/16慶大霉素/哌拉西林/三唑巴坦<4/湖8/32/4-8/64/4>16/128/4慶大霉素/甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<4/2/38->16/4/76妥布霉素/氨曲南<4/168/32>16/64妥布霉素/頭孢吡后<4/88/16>16/32妥布霉素/頭孢他啶-<4/88/16>16/32妥布霉素/環(huán)丙沙星<4"8/2>15/4妥布霉素/多粘菌素E<4/2->16/4妥布霉素/美羅培南<4/48/8>湖6妥布霉素/哌拉西林/三唑E坦<4/湖8/32/4-8/64/4>16/128/4妥布霉素/甲氧芐啶/磺胺甲噁唑<4/2/38->16/4/76甲氧芐啶'/磺胺甲噁唑/氨曲南<2/38/16->4/76/64甲氧芐啶/磺胺甲噁唑/頭孢他啶<2/38/8->4/76/32甲氧芐啶/磺胺甲噁唑/美羅培南一<2/38/4->一4/76/16甲氧芐啶/磺胺甲噁唑/哌拉西林/<一2/38/15/4-;>4/76/128/'基于在CLSI文獻(xiàn)M100-S16中顯示的解釋斷點(diǎn)1.Murray,PR.,E丄Baron，M,A.Pfaller，F(xiàn).C.Tenover和R.H.Yolken(eds)2003.ManualofClinicalMicrobiology(臨床微生物學(xué)手冊(cè))，第8版.AmericanSocietyofMicrobiologyWashington,D.C.(華盛頓美國(guó)微生物學(xué)會(huì))2.ClinicalStandardLaboratoryInstituteTM(2006)(臨床標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室研究所TM(2006)).Methodsfordilutionantimicrobialsusceptibilitytestsforbacteriathatgrowaerobically(用于關(guān)于需氧生長(zhǎng)細(xì)菌的稀釋抗微生物劑敏感性檢測(cè)的方法)滯6版.批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)M7-A7.3.ClinicalStandardLaboratoryInstituteTM(2006)(臨床標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室研究所(關(guān)于抗微生物劑敏感性檢測(cè)的性能標(biāo)準(zhǔn))；第16次信息增刊，Wayne,賓夕法尼亞CLSI文獻(xiàn)M100-S16，ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所)，940WestRoadSuite1400,Wayne,賓夕法尼亞.實(shí)施例7使用在圖10中所示的攻擊板設(shè)置和斷點(diǎn)，重復(fù)在實(shí)施例6中描述的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例8在本研究中，使用銅綠假單胞菌生物膜檢測(cè)試劑盒檢測(cè)在不同濃度的10種抗生素以及這些抗生素的組合的作用，并且比較抗生素對(duì)兩種銅綠假單胞菌菌株CF6649和CF6106的作用?；陲@示抗生素組合和微生物生物膜之間的效力的初步研究結(jié)果，而選擇抗生素和抗生素組合。形成生物膜:準(zhǔn)備生物體的混懸液，以致在TSB中的混濁度匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)(大約3.0X108cfU/mL)。通過(guò)1/30稀釋所述混懸液而準(zhǔn)備30mL接種物，其為107cfo/mL的初始接種物。將22mL接種物放置到本發(fā)明組件的槽中，并且更換栓蓋。將所述裝置放置在35'C大約9°傾斜并且每分鐘3-4次搖動(dòng)的搖動(dòng)平臺(tái)上，槽與搖動(dòng)方向平行。目的是產(chǎn)生>105cfb/栓的生物膜；這在不到24小時(shí)的培養(yǎng)中獲得。96孔組織培養(yǎng)板用來(lái)準(zhǔn)備攻擊板。將20每種檢測(cè)抗生素置于所述96孔組織培養(yǎng)板中，并且將180iaL陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)加入到所述微量滴定板的每個(gè)孔中，以獲得檢測(cè)藥物的1:10稀釋物。兩個(gè)孔(G12和H12)空著或者包含200pL無(wú)菌正常鹽水。G12和H12作為無(wú)菌對(duì)照。類似地，A12和B12作為生長(zhǎng)對(duì)照。將具有栓的蓋子安放在攻擊板上，并且在35'C培養(yǎng)24小時(shí)。準(zhǔn)備漂洗板，其在無(wú)菌的96孔微量滴定板中含有鹽水(每孔200|iL)。還準(zhǔn)備恢復(fù)板，其在另一個(gè)96孔微量滴定板中含有CAMHB(每孔200HL)。將栓置于鹽水中。將栓轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，然后高度超聲處理5分鐘，以去除存活的生物膜。然后將栓在35X:培養(yǎng)20-24小時(shí)，以允許存活的細(xì)菌生長(zhǎng)至混濁。通過(guò)視覺檢查攻擊板的孔的混濁度，并且在650nm的板讀數(shù)儀上而確定浮游生物的MIC。確定在攻擊培養(yǎng)過(guò)程中每種抗生素對(duì)從生物膜上脫落的浮游細(xì)菌的MIC(最小抑制濃度)。MIC定義為抑制生物體生長(zhǎng)的抗生素的最小濃度。清澈的孔(A,O.l)表示抑制。通過(guò)讀取恢復(fù)板的混濁度而確定每種抗生素的生物膜MBEC(最小生物膜根除濃度)。MBEC定義為抑制生物膜細(xì)菌在恢復(fù)培養(yǎng)基中再生的最小抗生素濃度。清澈的孔(A65。0.1)表示抑制。銅綠假單胞菌MBEC檢測(cè)板:GM=慶大霉素，AK=阿米卡星，CFTZ=頭孢他啶，TMS-甲氧芐啶/磺胺甲噁唑，P+T^哌拉西林/三唑巴坦(濃度以哌拉西林給出)，AZTR-氨曲南，IMP-亞胺培南，TB-妥布霉素，CIPRO二環(huán)丙沙星,GC-生長(zhǎng)對(duì)照，SC-無(wú)菌對(duì)照。浮游和生物膜形式的銅綠假單胞菌對(duì)單獨(dú)的和組合抗微生物劑的敏感性可以快速(48小時(shí))并且可重現(xiàn)性地確定(表l)。對(duì)于每種分離物，抗性模式是獨(dú)特的。以浮游形式時(shí)銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素敏感，但是作為生物膜時(shí)顯著更有抗性。表h抗單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的銅綠假單胞菌分離物的數(shù)目<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>特定的抗生素當(dāng)組合時(shí)比單一試劑更加有效。本檢測(cè)為臨床醫(yī)生提供10種單獨(dú)的和82種在斷點(diǎn)濃度的抗生素組合。對(duì)于臨床醫(yī)生，這一檢測(cè)可以用于選擇治療在囊性纖維化患者中普遍的生物膜相關(guān)的感染的抗生素。本實(shí)驗(yàn)表明，每種菌株具有獨(dú)特的生物膜敏感性。由于浮游形式的數(shù)據(jù)在分離物之間非常相似，所以這是令人驚訝的。這些結(jié)果清楚地表明，生物體對(duì)單獨(dú)的抗生素或抗生素組合具有不同的敏感性，這取決于它們的生長(zhǎng)條件(浮游的或生物膜)。實(shí)施例9葡萄球菌檢測(cè)板組件開發(fā)一種原型葡萄球菌檢測(cè)板，以評(píng)估可以用于治療葡萄球菌感染的抗生素和抗生素組合。所選擇的抗生素和抗生素組合是基于證明抗生素組合和微生物生物膜之間的效力的初步研究的結(jié)果。所述原型96孔板描述如下葡萄球菌檢測(cè)板GM=慶大霉素；CLIN=克林霉素；CFZ=頭孢唑啉;CLOX=氯唑西林；RIF=利福平；VAN=萬(wàn)古霉素；LIZD=利奈唑胺;AMP=氨芐青霉素舒巴坦合劑(ampicillinsublactamj);Cipro=環(huán)丙沙星;GC=生長(zhǎng)對(duì)照；SC=無(wú)菌對(duì)照浮游和生物膜形式的金黃色葡萄球菌對(duì)單獨(dú)的和組合抗微生物劑的某些抗生素當(dāng)組合時(shí)比作為單獨(dú)的試劑更加有效。本檢測(cè)為臨床醫(yī)生提供10種單一的和82種在斷點(diǎn)濃度的抗生素組合。這一實(shí)驗(yàn)表明，每種菌株具有獨(dú)特的生物膜敏感性。由于浮游形式的數(shù)據(jù)在分離物之間非常相似，所以這是令人驚訝的。這些結(jié)果清楚地表明，生物體對(duì)單獨(dú)的抗生素或抗生素組合具有不同的敏感性，這取決于它們的生長(zhǎng)條件(浮游的或生物膜形式)。實(shí)施例1C):比較浮游和生物膜形式的念珠菌屬物種和煙曲霉對(duì)抗真菌劑的敏感性可以快速(約48小時(shí)之內(nèi))并且可重現(xiàn)性地確定(表2)。對(duì)于每種分離物，抗性模式是獨(dú)特的。以浮游形式時(shí)金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素和抗生素組合敏感，但是作為生物膜時(shí)顯著更有抗性。表2:抗單獨(dú)的抗生素和抗生素組合的金黃色葡萄球菌分離物的數(shù)目抗生素浮游的生物膜抗生素浮游的生物膜GEN2/CL02GEN4/CLO0GEN2細(xì)P0GEN4扁P1GEN2/CFZ3GEN4/CFZ1GEN2/CLN5GEN4/CLN7GEN2/RIF11GEN4/RIF11G4GEN4/CIP2CUN1/RIF10CLIN2/RIF10CLIN1/CLO2CLIN2/CLO2CUN1/VAN1CUN2A/AN0CUN1/CFZ4CUN2/CFZ2GM24GM43AMP4/210AMP8/410CFZ44CFZ86CIP17CUN1/CIP9CLIN2/CIP10VAN2/CFZ0VAN4/CFZ1VAN2/CLO0VAN4/CLO0VAN2/CIP1VAN4/CIP0VAN2/GM0VAN4/GM0CL11細(xì)4CLI2扁2VAN4/RIF7VAN8/RIF7ClP2/CFZ3CIP4/CFZ7ClP2/RIF4ClP4/RlF3CL02/RIF5CL04/RlF4CIP27VAN25VAN41CLI18CL145CL022CL0420092902290112222222210222110101110111111111111111122222222229822011111111001119o2o11222222222敏感性三種念珠菌的臨床分離物用于本研究，包括一種白念珠菌(a/^oms)和兩種非白念珠菌物種。白念珠菌(C.a/6/Cara)ATCC14053從卡爾加里大學(xué)(UniversityOfCalgaiy)生物科學(xué)系獲得。熱帶念珠菌(C./ro;/cafe)99916和光滑念珠菌(C.g/Wmto)14326從進(jìn)行連續(xù)流動(dòng)腹膜透析(continuedambulatoryperitonealdialysis,CAPD)的患者的滲析液中獲得。還檢測(cè)煙曲霉。使用本發(fā)明的組件，進(jìn)行念珠菌屬和曲霉屬生物膜的生物膜形成和抗微生物劑敏感性的檢測(cè)。所述裝置特征在于具有分布在蓋子上的96個(gè)栓或凸起的微量滴定板蓋。每個(gè)栓為微生物提供附著、定居和形成均一的生物膜的表面。所述栓正好嚙合標(biāo)準(zhǔn)96孔微量滴定板的孔。蓋子與具有用于生長(zhǎng)、洗滌和培養(yǎng)真菌的專用槽的基底聯(lián)合使用。從Sabouraud葡聚糖瓊脂(SDA)(BBL微生物系統(tǒng)，科克艾斯維爾，Md)上的24小時(shí)培養(yǎng)物挑取念珠菌物種的菌落，并且置于Mueller-Hinton肉湯(MHB)(Difco實(shí)驗(yàn)室，底特律，密歇根州.)，以致混懸液匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)。然后將這一混懸液在MHB中1:30稀釋，并且移取25ml到基底的槽室中。將閉合的組件(具有栓的蓋子放置在基底上)放置在37'C培養(yǎng)箱中設(shè)置成每分鐘搖動(dòng)板3.5轉(zhuǎn)的HoefferRed搖動(dòng)器(VWR,科學(xué)(Scientific))上。白念珠菌和熱帶念珠菌進(jìn)行有氧培養(yǎng)，而光滑念珠菌在10%C02中培養(yǎng)。在初步實(shí)驗(yàn)中確定，光滑念珠菌需要10。/。C02氛圍用于形成生物膜。在接種后l，2，3,4,5,6,7,22,23,24和26小時(shí)，通過(guò)隨機(jī)從所述裝置的蓋子上移下3個(gè)栓，而獲得關(guān)于每種分離物的生長(zhǎng)曲線。將移下的栓放置在含有200pl鹽水的微量離心管中，并且超聲處理(Aquasonic超聲發(fā)生器,VWR科學(xué)(Scientific)，)5分鐘。進(jìn)行連續(xù)稀釋，并且在SDA上迸行存活的念珠菌物種細(xì)胞的平板計(jì)數(shù)。將含有22小時(shí)念珠菌物種生物膜的其它栓用在磷酸緩沖的鹽水溶液(PBSS)中的2.5。/。戊二醛進(jìn)行固定，風(fēng)干過(guò)夜，并且準(zhǔn)備用于掃描電鏡。在初步研究中確定形成煙曲霉生物膜的最佳條件。首先將栓在1%L-賴氨酸(希格瑪化學(xué)公司,圣路易斯,Mo)中浸泡過(guò)夜，然后在層流罩超靜臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。將50^體積的煙曲霉孢子混懸液添加到在500ml錐形瓶(Erlynmeyerflask)中的250ml胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSB)(Difco,底特律，密歇根州)中。將所述燒瓶在37t:以150rpm搖動(dòng)20小時(shí)。將在液體肉湯頂部的玻璃上生長(zhǎng)的附著菌絲體細(xì)胞用無(wú)菌棉簽移下。將這轉(zhuǎn)移到具有平衡到4匸的250ml新鮮TSB的混合器(韋林氏(Waring))中。菌絲體以中等速度在冰上攪拌2分鐘。這重復(fù)3次。然后將煙曲霉混懸液(25ml)轉(zhuǎn)移到生物膜生長(zhǎng)裝置的槽中。將包含賴氨酸-處理的栓的蓋子放置在混懸液中，并且將所述裝置轉(zhuǎn)移到上文所述的Red搖動(dòng)器上。將板在37'C培養(yǎng)25小時(shí)，在每個(gè)栓上形成明顯的生物膜。對(duì)包含24小時(shí)曲霉屬生物膜的栓進(jìn)行掃描電鏡檢査。最小生物膜根除濃度檢測(cè)生物膜敏感性檢測(cè)使用所述組件的具有栓的蓋子，現(xiàn)在其含有在托盤中搖動(dòng)24小時(shí)后形成的生物膜。將蓋子上的每個(gè)栓在96孔微量滴定板(Falcon)中的200)il磷酸緩沖的鹽水溶液(PBSS)中輕輕洗滌一次。然后將具有栓的蓋子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)96孔微量滴定板中，所述板含有在200nlRPMI1640(希格瑪，圣路易斯，Mo)或含有1%DMSO的RPMI1640(參見測(cè)試藥物部分)中的2倍稀釋的抗真菌劑。在栓暴露于藥物24小時(shí)后，移下具有栓的蓋子，并且在鹽水中輕輕漂洗兩次。然后將具有栓的蓋子放置在含有RPMI1640恢復(fù)培養(yǎng)基的96孔板中。將所述栓在超聲發(fā)生器中超聲處理5分鐘(念珠菌屬物種)或7分鐘(曲霉屬)，以將附著的細(xì)胞去除到恢復(fù)培養(yǎng)基中。將20pl恢復(fù)培養(yǎng)基的整分試樣點(diǎn)滴接種在SDA(念珠菌屬物種)或四碘四氯熒光素瓊脂(煙曲霉)上，以獲得MBEC。所述組件還用來(lái)確定最小抑制濃度(MIC)和最小殺真菌濃度(MFC)。在650nm檢測(cè)含有抗生素和從生物膜上脫落的浮游細(xì)胞的孔的混濁度，以獲得MIC。將來(lái)自每個(gè)孔的20ial樣品也點(diǎn)滴接種在Sabouraud葡聚糖瓊脂(念珠菌屬物種)或四碘四氯熒光素瓊脂(煙曲霉)上，以獲得MFC。念珠菌屬物種和煙曲霉的浮游形式敏感性-按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)國(guó)家委員會(huì)(NationalCommitteeforClinicallaboratoryStandards,NCCLS)的指導(dǎo)，確定最小抑制濃度(MIC)和最小殺真菌濃度(MFC)。簡(jiǎn)言之，在鋪板之前將念珠菌屬物種在-7(TC保存在聚苯乙烯球體上。在開始檢測(cè)之前24小時(shí)將這些生物體劃線到Sabouraud葡聚糖瓊脂(Microbk)logie)板上。從所述瓊脂板上挑取24小時(shí)菌落，并且放置于Muellar-Hinton肉湯(MHB,Microbiologie)中，以致濁度匹配0.5的McFarland標(biāo)準(zhǔn)。然后，將這1:10稀釋在MHB中，以獲得大約1X105-5X10sCFU/ml的混懸液。將5體積的這一混懸液添加到在96孔微量滴定板(Nunclon)的孔中，所述孔中含有連續(xù)稀釋在RPMI1640培養(yǎng)基(希格瑪)中的200nl抗真菌劑。在檢測(cè)前煙曲霉以孢子混懸液保存在4t:。將所述孢子混懸液(50稀釋到250mlTSB中，并且將5pl這一混懸液添加到含有上述抗真菌劑稀釋液的每個(gè)檢測(cè)孔中。然后，將檢測(cè)孔與所述抗真菌劑一起在37t:溫育24小時(shí)。在溫育后通過(guò)在微量滴定板讀數(shù)儀(Softmax，VWR)上在650nm讀取濁度，而獲得念珠菌的MICs。還將20^每個(gè)孔的整分試樣鋪板(SDA)，并且在37"C培養(yǎng)24小時(shí)后從它們獲得MFCs。關(guān)于曲霉屬M(fèi)FCs這樣確定通過(guò)將來(lái)自每個(gè)孔的100^鋪板到四碘四氯熒光素瓊脂上，然后用無(wú)菌玻璃涂布器涂布。在菌落計(jì)數(shù)前將接種的生物在25。C保存3天。檢測(cè)的藥物。伊曲康唑，氟康唑，和酮康唑從在比利時(shí)布魯塞爾的楊森制藥(JanssenPharmaceuticals)獲得。制霉菌素5-氟胞嘧啶，灰黃霉素，兩性霉素B和多粘菌素B從希格瑪化學(xué)公司，圣路易斯，Mo獲得。5-氟胞嘧啶，多粘菌素B硫酸鹽和制霉菌素溶解在雙蒸水中到濃度10.24mg/ml，并且在檢測(cè)孔在1024昭/ml-0.125嗎/ml范圍內(nèi)稀釋在RPMI中。兩性霉素B溶解在純二甲亞砜(dimethylsulfoxone)(DMSO)中至51.2mg/ml的濃度最大值。將這連續(xù)稀釋，以獲得在檢測(cè)孔中在RPMI1640(希格瑪，圣路易斯，Mo)和l。/。DMSO中的512/ig/ml到0.016嗎/ml的兩性霉素B。氟康唑，伊曲康唑，酮康唑和灰黃霉素溶解在純DMSO中到濃度102.4mg/ml，并且進(jìn)一步稀釋，以獲得在檢測(cè)孔在RPMI1640和1。/。DMSO中的1024嗎/ml到0.032昭/ml藥物的范圍。為了確定1%DMSO對(duì)真菌細(xì)胞的作用，含有在RPMI1640中1%DMSO而沒有藥物的對(duì)照孔與所有含有DMSO的檢測(cè)孔平行進(jìn)行。另外，所有的檢測(cè)都包括不進(jìn)行接種的無(wú)菌對(duì)照孔，以及不含抗真菌劑的生長(zhǎng)對(duì)照孔。生物膜在裝置表面上的生長(zhǎng)每個(gè)念珠菌物種在所述裝置的每個(gè)柃上形成生物膜，以在接種后22小時(shí)之后達(dá)到105-106CFU/栓。光滑念珠菌是最苛求菌，需要10。/。CO2來(lái)形成生物膜。當(dāng)有氧培養(yǎng)時(shí)，20小時(shí)之后，光滑念珠菌只生長(zhǎng)大約5X103CFU/栓，而在10%C02中它生長(zhǎng)到平均4.1X104CFU/栓。曲霉屬生物膜似乎更緊密地附著到栓上。在24小時(shí)培養(yǎng)之后，曲霉屬生長(zhǎng)至l()SCFU/栓(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)于念珠菌的所有物種，在MBEC裝置的栓上形成的生物膜都是相似的。念珠菌細(xì)胞均一地包被整個(gè)栓，并且包入大量外泌多糖基質(zhì)。念珠菌細(xì)胞在某些區(qū)域生長(zhǎng)為伸長(zhǎng)細(xì)胞的凸起的簇。曲霉屬生物膜由在24小時(shí)后云集在整個(gè)栓上的規(guī)律的分生孢子梗組成。外泌多糖附著到栓表面，并且包圍每個(gè)曲霉屬分生孢子梗?？拐婢舾行砸种聘∮蔚募?xì)胞(MIC)、殺死浮游的細(xì)胞(MFC)和殺死生物膜真菌(MBEC)所需要的抗生素濃度總結(jié)在表3中。從NCCLS方法和從在所述裝置栓上形成的生物膜釋放的浮游細(xì)胞而獲得的MIC和MFC值類似或者相同。從所述裝置獲得的MIC和MFC是高度可重現(xiàn)性的。真菌生物膜普遍比浮游細(xì)胞更難消除(表3)。對(duì)于所有檢測(cè)的念珠菌物種，獲得相似的結(jié)果。一般地，MBEC超過(guò)MIC或MFC幾個(gè)數(shù)量級(jí)。盡管兩性霉素B(AmphoteracinB)、制霉菌素、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑都有效殺死浮游的念珠菌細(xì)胞，但是只有制霉菌素有效抗生長(zhǎng)為生物膜的相同念珠菌。例如，兩性霉素B，一種多烯抗真菌藥，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用于抗白念珠菌的浮游培養(yǎng)物時(shí)，其具有0.09嗎/ml的平均MIC和0.02嗎/ml的平均MFC。相反，殺死白念珠菌的生物膜細(xì)胞需要平均12pg/ml的同一種藥物?；尹S霉素和多粘菌素B對(duì)浮游的和固著的念珠菌無(wú)效。由于曲霉屬細(xì)胞在96孔微量滴定板中成團(tuán)，這使得通過(guò)板讀數(shù)儀進(jìn)行分析變得不準(zhǔn)確，所以不能獲得煙曲霉的MIC。MFC值(通過(guò)將100pl的孔內(nèi)容物點(diǎn)滴接種到四碘四氯熒光素瓊脂上而獲得)表明浮游曲霉屬對(duì)兩性霉素B、伊曲康唑、酮康唑和制霉菌素的敏感性(表1)。相反，即使在最高的檢測(cè)濃度，也沒有一種抗真菌劑有效抗煙曲霉生物膜。即使在極高的濃度，唑類藥物抑制，但不殺死生物膜細(xì)胞。在藥物治療之后，能生存的細(xì)胞的存活不是有利結(jié)果，并且可能助于產(chǎn)生念珠菌的唑類-抗性菌株(8)?？梢酝茰y(cè)，這些藥物對(duì)消除生物膜細(xì)胞的失敗在于它們必須被細(xì)胞主動(dòng)吸收。減小的藥物攝取率或這些生物膜生物體對(duì)外泌多糖的抑制可能防止藥物到達(dá)它的靶點(diǎn)酶。小于或等于8^g/ml的抗念珠菌物種的氟康唑MIC表明所述物種對(duì)所述藥物敏感(16)。按照這些標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)的白念珠菌和熱帶念珠菌菌株將歸類為對(duì)氟康唑敏感。然而，對(duì)于氟康唑和伊曲康唑的MBEC值(>1024嗎/ml)大大超過(guò)這兩種分離物的64pg/ml的斷點(diǎn)，這表明所述生物膜細(xì)胞是抗性的。盡管氟康唑和伊曲康唑只是已經(jīng)確定這些試驗(yàn)性斷點(diǎn)的藥物，但是對(duì)于酮康唑和5-氟胞嘧啶觀察到相同的趨勢(shì)。這可以解釋為什么唑類通常對(duì)治療某些慢性念珠菌病和念珠菌相關(guān)的移植裝置的病例無(wú)效(4,5,12)。多烯，制霉菌素和兩性霉素B，是消除念珠菌生物膜的最有效的試劑。然而，在臨床情形中兩性霉素B16pg/ml的MBEC可能達(dá)不到——允許的人血清峰值濃度為2嗎/ml。所述多烯在真菌的血漿膜上作用而不需要吸收到細(xì)胞中的能力可以解釋它們?cè)谒鶛z測(cè)的抗生物膜細(xì)胞的藥物中相關(guān)的有效性。一旦提供蛋白表面，諸如L-賴氨酸，曲霉屬就容易在栓表面形成規(guī)律的生物膜。曲霉屬生物膜的形態(tài)特征與在組織內(nèi)和在醫(yī)學(xué)裝置上存在的生物膜沒有不同。盡管所述生物膜很快形成，但是它仍然抵抗所有檢測(cè)的試劑。如同念珠菌生物膜，似乎生長(zhǎng)速率不影響抗性。在曲霉屬生物膜中觀察到大量的外泌多糖，其可能對(duì)抗性很重要。對(duì)于侵入性肺部、竇和大腦曲霉病使用兩性霉素B治療的患者的初步死亡率報(bào)道分別為86%，66%和99%。只有54%的病例對(duì)14天的治療表現(xiàn)出任何反應(yīng)。盡管多烯對(duì)曲霉屬表現(xiàn)出體外功效，但是它們主要影響侵入性曲霉病的治療。MBEC檢測(cè)的結(jié)果將預(yù)測(cè)這種治療失敗。盡管迄今為止還沒有消除煙曲霉的備選的化學(xué)治療劑，但是所述組件可以用于篩選可能有潛力開發(fā)成有前途的治療的試劑。應(yīng)該確定藥物的體外成功不能外推到治療方法的成功，但是藥物的體外失敗應(yīng)該預(yù)測(cè)治療的失敗。從本研究中，預(yù)測(cè)唑類，5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、和多粘菌素B在治療生物膜念珠菌感染中不成功，而多烯可能有效或可能無(wú)效。從本研究清楚的是念珠菌和曲霉屬物種附著到塑料上，并且生物膜的形成趨向于允許這些生物體耐受暴露于比在分批培養(yǎng)中生長(zhǎng)的相同物種高出許多倍的濃度的抗微生物劑中。當(dāng)它們能夠以生物膜形式生長(zhǎng)時(shí)，特征性描述抵抗分批培養(yǎng)的生物體的抗真菌劑不再是令人滿意的。為了準(zhǔn)確評(píng)估特別的試劑清除生物膜生物體感染的能力，由于發(fā)現(xiàn)它們將在宿主中或天然存在，即，表現(xiàn)出深刻改變的生理并且包在保護(hù)性外泌多糖基質(zhì)中，所以敏感性檢測(cè)應(yīng)該在細(xì)胞上進(jìn)行。實(shí)施例ll如上文所述，本發(fā)明的裝置可以負(fù)載一種或多種抗生物膜試劑?？赡艿目股锬ぴ噭┑牟煌暾痛硇粤斜戆?，但不限于抗生素，包括但不限于下述種類和在種類中的成員氨基糖苷類，如慶大霉素，妥布霉素，奈替米星，阿米卡星，卡那霉素，鏈霉素，新霉素，喹諾酮類/氟喹諾酮類，萘啶酸，西諾沙星，諾氟沙星，環(huán)丙沙星，甲氟哌酸，氧氟沙星，依諾沙星,氟羅沙星，和左氧氟沙星；抗假單胞菌藥，如羧芐西林，卡茚西林，替卡西林，阿洛西林，美洛西林，哌拉西林頭孢菌素類，頭孢噻吩，頭孢匹林(Cephaprin)，頭孢氨芐，頭孢拉定，頭孢羥氨芐，頭孢唑林頭孢孟多，頭孢西丁，頭孢克洛，頭孢呋辛，頭孢替坦，頭孢雷特，頭孢呋辛醋氧乙酯，頭孢尼西頭孢噻肟，拉氧頭孢，頭孢唑肟，頭孢曲松，頭孢哌酮，頭孢他啶(Cftazidime),其它頭孢菌素類，如頭孢噻啶，和頭孢磺啶；其它卩-內(nèi)酰胺；抗生素，如亞胺培南，氨曲南p-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸，力百汀，舒巴坦；磺胺類藥，如磺胺，磺胺甲噁唑，磺胺醋酰，磺胺嘧啶，磺胺異噁唑，磺胺西汀，磺胺多辛，磺胺米隆，對(duì)-氨基苯甲酸，甲氧芐啶-磺胺甲噁唑；尿道抗菌藥，如烏洛托品，呋喃妥因，非那吡啶和其它萘基吡啶藥；青霉素類藥，如青霉素(PenicillinG)和青霉素V,青霉素酶抗性甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，氯唑西林，用于革蘭氏-陰性菌的雙氯西林青霉素/氨基青霉素藥氨芐青霉素(多鏈絲霉素)，阿莫西林，環(huán)青霉素，巴氨西林；四環(huán)素類，如四環(huán)素，氯四環(huán)素，地美環(huán)素，美他環(huán)素，多西環(huán)素,二甲胺四環(huán)素；其它抗生素，如氯霉素(Chlormycetin),紅霉素，林可霉素，克林霉素，大觀霉素，多粘菌素B(多粘菌素E),萬(wàn)古霉素，桿菌肽；結(jié)核病藥，如異煙肼，利福平，乙胺丁醇，吡嗪酰胺，Ethinoamide,對(duì)氨水楊酸，環(huán)絲氨酸；抗真菌劑，如兩性霉素B，環(huán)胞菌素，氟胞嘧啶咪唑類和三唑類酮康唑，咪康唑，伊曲康唑，氟康唑，灰黃霉素；局部抗真菌劑，如克霉唑，益康唑，咪康唑，特康唑，布康唑，奧昔康唑，硫康唑，環(huán)吡酮胺，鹵普羅近，托萘酯，萘替芬，多烯，兩性霉素B，那他霉素實(shí)施例12使用96-栓蓋和槽的高通量篩選(HTP)檢測(cè)提供的方法是一個(gè)怎樣使用本發(fā)明的裝置和方法評(píng)估化合物抗生物膜和浮游細(xì)菌的抗微生物活性的實(shí)例。材料列表無(wú)菌蓋和槽(l)無(wú)菌96孔組織培養(yǎng)板(3)平臺(tái)搖動(dòng)器(傾斜角度大約9。)超聲發(fā)生器針頭(needlenose)鑷子(任選)方法描述形成生物膜1.使用來(lái)自新鮮過(guò)夜劃線的平板的單一菌落，制備所述生物體的混懸液，以致在TSB或其它適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中濁度匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)(大約3.0Xl()Scfu/mL)。通過(guò)將所述混懸液l/30稀釋，而制備30mL接種物，初始接種物為10、fo/mL?？燎笊矬w可能需要補(bǔ)充的培養(yǎng)基以在肉湯中生長(zhǎng)。2.打開無(wú)菌生長(zhǎng)組件。將22mL接種物加入到槽中，并且更換栓蓋。將所述裝置放置在35'C大約9。傾斜并且每分鐘3-4次搖動(dòng)的搖動(dòng)平臺(tái)上，槽與搖動(dòng)方向平行。目的是產(chǎn)生>105池/栓的生物膜，通常24小時(shí)的培養(yǎng)是足夠的。注意由于傾斜角太大或者平臺(tái)搖動(dòng)不對(duì)稱，所以一些搖動(dòng)器不適合所述檢測(cè)。操作者應(yīng)該檢査以確定搖動(dòng)器滿足這一檢測(cè)必要的要求。3.稀釋并且點(diǎn)滴接種接種物樣品，以檢査接種物數(shù)目(應(yīng)該包含大約lXl(^cfu/mL)，并且檢測(cè)在所述培養(yǎng)物中的污染物。4.無(wú)菌對(duì)照(任選)。使用酒精灼燒的鑷子，折斷栓A1、Bl、Cl和Dl，以致不再存在細(xì)菌能夠附著的凸起。這些位置將作為本檢測(cè)的無(wú)菌對(duì)照。第2天抗生素儲(chǔ)液抗生素儲(chǔ)液應(yīng)該提前制備，并且保存在-7(TC。去離子水或適當(dāng)?shù)娜軇┯脕?lái)制備5120pg/ml活性劑的儲(chǔ)液。參考NCCLS文獻(xiàn)M100-S8關(guān)于應(yīng)該使用哪些溶劑和稀釋劑的詳細(xì)內(nèi)容。以250^L的整分試樣(足夠用于2個(gè)攻擊板)保存儲(chǔ)液。在-7(TC大部分抗生素的儲(chǔ)液穩(wěn)定最少6個(gè)月。第2天制備抗生素攻擊板1.使用96孔組織培養(yǎng)板來(lái)準(zhǔn)備攻擊板。指定要在本檢測(cè)中檢測(cè)的抗生素，并且將它們分配在A-H排。這一板設(shè)置將允許以10種濃度的8種不同的抗生素進(jìn)行檢測(cè)。注意MBEC板適合96孔板(例如Nunc)，但是不是所有96孔板都兼容。2.制備1024昭/mL的工作溶液，這通過(guò)將2005120嗎/mL的儲(chǔ)液加入到800^L陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)中進(jìn)行，其提供用于兩排的足夠的工作溶液。工作溶液必須在它們制備的同一天使用。3.攻擊板可以怎樣制備的一個(gè)實(shí)例如下將200CAMHB加入到A1，Bl,C1和D1孔中。這些將作為無(wú)菌對(duì)照。將200nLCAMHB加入到弁2列A-H孔中。這些將作為生長(zhǎng)對(duì)照。將IOOCAMHB加入到第4-12列的所有孔中。這些將用來(lái)稀釋抗生素的工作濃度。將200^L指定抗生素的工作溶液加入到第3列的孔中。將100pL抗生素的工作溶液加入到第4和5列的孔中。使用8通道移液器準(zhǔn)備稀釋液，在列之間更換管尖#5孔混合并且轉(zhuǎn)移100^iU,6L;#6L:混合并且轉(zhuǎn)移IOOpU,7L，繼續(xù)直至,12孔;#12孔混合并且棄掉IOOpL。將100mLCAMHB加入到第5-12列的孔中，以使得所有孔的體積達(dá)到200pL。這種稀釋方案將導(dǎo)致在第3列中1024pg/mL的抗生素濃度減少到第12列中的2pg/mL。這些濃度可以相應(yīng)調(diào)整，以適合研究的需要。生物膜的抗生素攻擊1.準(zhǔn)備0.9%鹽水的漂洗板(每孔20(HiL)。通過(guò)將栓放入漂洗板中大約1分鐘，而漂洗來(lái)自栓的浮游的細(xì)菌。2.生物膜接種物檢査(任選)使用灼燒的鑷子，移下栓E1、Fl、Gl禾nHl，將每個(gè)栓放置在稀釋板的200(iL鹽水中。將樣品栓E1-H1高度超聲處理5分鐘，以使生物膜細(xì)菌移下，然后連續(xù)稀釋至1(T7，并且點(diǎn)滴接種到TSA(或適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基)上，并且培養(yǎng)過(guò)夜以確定cfW栓。3.將具有剩余的栓的蓋子轉(zhuǎn)移到攻擊板上，并且在35'C培養(yǎng)24小時(shí)?；謴?fù)存活的生物膜1.在無(wú)菌96孔微量滴定板中準(zhǔn)備鹽水漂洗板(每孔200(iL)。2.在另一個(gè)96孔微量滴定板中準(zhǔn)備CAMHB恢復(fù)板(每孔200pL)。3.將栓在鹽水中漂洗大約l分鐘。不要丟棄攻擊板。將栓轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，然后高度超聲處理5分鐘，以移下存活的生物膜。丟棄栓蓋，并且蓋上恢復(fù)板。在35。C培養(yǎng)20-24小時(shí)，以允許存活的細(xì)菌生長(zhǎng)至混濁。如果需要關(guān)于每個(gè)孔的存活cfu/栓的數(shù)據(jù)，可以在超聲步驟后立即從恢復(fù)板的每個(gè)孔取出50(iL，并且轉(zhuǎn)移到稀釋板，在鹽水中連續(xù)稀釋，并且點(diǎn)滴接種(100-107)到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上。確定浮游生物的MIC1.檢查攻擊板的孔的混濁度(視覺上)或者在650nm板讀數(shù)儀上檢査。2.確定在攻擊培養(yǎng)過(guò)程中每種抗生素對(duì)從生物膜上釋放出來(lái)的浮游細(xì)菌的MIC。MIC定義為抑制生物體生長(zhǎng)的最小抗生素濃度。清澈的孔(A65(X0.1)表明抑制。3.記錄每種抗生素的MIC值。確定生物膜MBEC1.通過(guò)讀取恢復(fù)板的濁度而確定每種抗生素的MBEC。MBEC定義為抑制生物膜細(xì)菌在恢復(fù)培養(yǎng)基中再生的最小抗生素濃度。清澈的孔(A650O.l)表示抑制。2.記錄每種抗生素的MBEC值。實(shí)施例13使用96孔微量滴定板檢測(cè)生理和遺傳(P&G)使用96孔微量滴定板，可以形成不同生物體的多種生物膜，或者同種生物體的等價(jià)生物膜。這種方法可以用于研究生物膜形成或抗微生物劑檢測(cè)中的變量。應(yīng)該注意，這種檢測(cè)可以用來(lái)篩選生物膜形式的遺傳突變體，用來(lái)比較不同分離物或不同物種的細(xì)菌的MBEC值，用來(lái)比較生長(zhǎng)為生物膜的不同分離物中的基因表達(dá)，或者用于需要不同分離物的生物膜的許多其它形式中。下文所述的方法描述用于檢測(cè)生長(zhǎng)為生物膜的多種生物體針對(duì)單一抗微生物劑的測(cè)定。材料列表無(wú)菌蓋子和托盤無(wú)菌96孔組織培養(yǎng)板(3)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器超聲發(fā)生器針頭鑷子(任選)方法描述第l天形成生物膜1.使用來(lái)自新鮮過(guò)夜劃線的平板的單一菌落，準(zhǔn)備每種生物體(最多12種/板)的混懸液，以致在TSB或其它適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中濁度匹配1.0的McFarland標(biāo)準(zhǔn)(大約3.0X108cfii/mL)。2.1/30稀釋以獲得10、fb/mL的接種物。在指定的列，每測(cè)試孔放入150pL每種生物體的起始接種物。列可以設(shè)置成最多檢測(cè)8種分離物，l個(gè)孔作為生長(zhǎng)對(duì)照和ll種抗生素濃度，或者12種分離物，l個(gè)孔作為生長(zhǎng)對(duì)照，禾口7種抗生素濃度(如果需要，l列可以指定為無(wú)菌對(duì)照)。3.打開無(wú)菌組件。將所述蓋子放置在含有細(xì)菌接種物的96孔微量滴定板上。將所述裝置放置在35。C大約150rpm的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上。一些物種可能需要更低的培養(yǎng)溫度或增加的C02。目的是產(chǎn)生〉10、fli/栓的生物膜；通常24小時(shí)的培養(yǎng)是足夠的。4.稀釋并且點(diǎn)滴接種接種物樣品，以檢查接種物數(shù)目(應(yīng)該包含大約lX10、fo/mL)，并且檢測(cè)在所述培養(yǎng)物中的污染物。第2天抗生素儲(chǔ)液抗生素儲(chǔ)液應(yīng)該提前制備，并且保存在-7(TC。去離子水或適當(dāng)?shù)娜軇┯脕?lái)制備5120g/ml活性劑的儲(chǔ)液。參考NCCLS文獻(xiàn)M100-S8關(guān)于應(yīng)該使用哪些溶劑和稀釋劑的詳細(xì)內(nèi)容。在-7CTC大部分抗生素的儲(chǔ)液穩(wěn)定最少6個(gè)月。第2天準(zhǔn)備抗生素攻擊板1.使用96孔組織培養(yǎng)板來(lái)準(zhǔn)備攻擊板。注意所述板適合96孔板(例如Nunc)，但是不是所有96孔板都兼容。2.將在陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的MuellerHinton肉湯(CAMHB)中制備的每種檢測(cè)抗生素濃度置于在需要的范圍內(nèi)2倍稀釋的抗生素的微量滴定板的一排中(每孔200iaL總體積)。第2天生物膜的抗生素攻擊1.準(zhǔn)備0.9%鹽水的漂洗板(每孔200^L)。通過(guò)將栓放入漂洗板中大約1分鐘，而漂洗來(lái)自栓的浮游的細(xì)菌。2.將所述栓蓋轉(zhuǎn)移到攻擊板上，并且在35。C培養(yǎng)24小時(shí)。第3天恢復(fù)存活的生物膜1.在無(wú)菌96孔微量滴定板中準(zhǔn)備鹽水漂洗板(每孔200pL)。2.在另一個(gè)96孔微量滴定板中準(zhǔn)備CAMHB恢復(fù)板(每孔200pL)。3.將栓在鹽水中漂洗大約l分鐘。不要丟棄攻擊板。將栓轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基中，然后高度超聲處理5分鐘，以移下存活的生物膜。丟棄栓蓋，并且蓋上恢復(fù)板。在35。C培養(yǎng)20-24小時(shí)，以允許存活的細(xì)菌生長(zhǎng)至混濁。注意如果需要關(guān)于每個(gè)孔的存活cfti/栓的數(shù)據(jù)，可以在超聲處理步驟后立即從恢復(fù)板的每個(gè)孔取出50pL，并且轉(zhuǎn)移到稀釋板，在鹽水中連續(xù)稀釋，并且點(diǎn)滴接種(100-107)到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上。第3天確定浮游生物的MIC1.檢查攻擊板的孔的混濁度(視覺上)或者在650nm板讀數(shù)儀上檢查。2.確定在攻擊培養(yǎng)過(guò)程中每種抗生素對(duì)從生物膜上釋放出來(lái)的浮游細(xì)菌的MIC(最小抑制濃度)。MIC定義為抑制生物體生長(zhǎng)的最小抗生素濃度。清澈的孔(A65(X0.1)表明抑制。3.記錄每種抗生素的MIC值。第4天確定生物膜MBEC1.通過(guò)讀取恢復(fù)板的濁度而確定每種抗生素的MBEC(最小生物膜消除濃度)。MBEC定義為抑制生物膜細(xì)菌在恢復(fù)培養(yǎng)基中再生的最小抗生素濃度。清澈的孔(A650O.l)表示抑制。2.記錄每種抗生素的MBEC值。盡管已經(jīng)描述了一些優(yōu)選的實(shí)施方案，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離本發(fā)明范圍下可以進(jìn)行各種改變和改進(jìn)。在前述說(shuō)明書中的術(shù)語(yǔ)和表述用于本文作為描述的術(shù)語(yǔ)，并且沒有限制，并且在應(yīng)用所述術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)沒有排除所示和所述的特征的等價(jià)物或其部分的目的，它被視作僅由下述權(quán)利要求定義和限定的本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種處理一種或多種生物膜的方法，其包括a)生長(zhǎng)生物膜，其中所述生長(zhǎng)包括使生物膜經(jīng)受剪切力；b)將所述生長(zhǎng)的生物膜在攻擊板上暴露于一種或多種抗生物膜試劑；c)在恢復(fù)板上移下并且中和所述暴露的生物膜；d)通過(guò)評(píng)估任何生物膜在所述攻擊板上的生長(zhǎng)而確定MIC值；e)通過(guò)評(píng)估任何生物膜在所述恢復(fù)板上的生長(zhǎng)而確定MBEC值；和f)通過(guò)評(píng)估所述恢復(fù)板可存活細(xì)胞計(jì)數(shù)而確定MBC值。2.—種處理一種或多種生物膜的方法，其包括選擇抗生物膜試劑的有效組合，其中有效的組合基本上由兩種或多種相同或不同劑量的活性劑組成；將所述生物膜與抗生物膜試劑的組合接觸；并且對(duì)于每種組合，確定MIC、MBEC、MBC、或它們的組合。3.權(quán)利要求l的方法，其中確定MIC、MBEC禾nMBC值。4.權(quán)利要求1的方法，其還包括在接觸步驟之后，中和所述抗生物膜試劑。5.權(quán)利要求3的方法，其還包括分解并且收集所述生物膜。6.—種用于檢測(cè)固著微生物的MBEC檢測(cè)，其包括在預(yù)選的第一板上形成生物膜；移下所述生物膜并且將所述生物膜放置在第二板上；將所述生物膜暴露于至少一種活性劑；和確定所述活性劑抗所述生物膜的效力。7.—種用于確定生物膜的MIC、MBEC和MBC值和確定適合處理所述生物膜的組合物的處理方法，其包括1)提供具有第一基底和第一蓋子的第一組件，所述第一蓋子具有從其上延伸出來(lái)的凸起，所述第一組件設(shè)置成在一個(gè)或多個(gè)凸起上生長(zhǎng)一種或多種生物膜；2)提供包含第二基底和所述第一蓋子的第二組件，所述第二組件設(shè)置成將在所述凸起上的生物膜暴露于一種或多種抗生物膜試劑；3)提供包括第三基底和所述第一蓋子的第三組件，所述第三組件設(shè)置成漂洗在所述凸起上的任何生物膜；和4)包括第四基底和所述第一蓋子的第四組件，所述第四組件設(shè)置成并且適于將所述生物膜從所述凸起上移下。8.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載營(yíng)養(yǎng)組合物的第一基底的第一組件。9.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載一種或多種生物膜試劑的第二基底的第二組件。10.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載漂洗組合物的第三基底的第三組件。11.權(quán)利要求7的處理方法，其包括提供具有預(yù)先負(fù)載恢復(fù)組合物的第四基底的第四組件。全文摘要本發(fā)明是一種可以用于選擇具有抗生長(zhǎng)為生物膜的微生物的功效的抗生素組合的診斷板。所述板允許在多個(gè)凸起上生長(zhǎng)生物膜，并且隨后將在所述板的所有凸起上的生物膜同時(shí)用獨(dú)立的濃度和抗生物膜試劑的組合進(jìn)行攻擊。當(dāng)與它們以浮游狀態(tài)生長(zhǎng)時(shí)相比較，所述浮游狀態(tài)通常用于確定它們的抗生素敏感水平，當(dāng)它們生長(zhǎng)為生物膜時(shí)，微生物對(duì)抗生素的抗性更高。在抗生物膜試劑攻擊中脫離生物膜的微生物的生長(zhǎng)確定最小抑制濃度(MIC)，其與浮游狀態(tài)的微生物的敏感性相關(guān)。在隨后的恢復(fù)步驟中來(lái)自生物膜的任何存活的微生物的生長(zhǎng)確定最小生物膜根除濃度(MBEC)，其與生長(zhǎng)為生物膜的微生物的敏感性相關(guān)。在恢復(fù)步驟中計(jì)數(shù)存活的微生物確定最小殺生物濃度(MBC)。文檔編號(hào)C12Q1/06GK101283104SQ200680030645公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2006年7月24日優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日發(fā)明者奧瓦爾·切里,默爾·E·奧爾森申請(qǐng)人:創(chuàng)新技術(shù)公司