專利名稱：用于診斷學(xué)和細(xì)胞分析的微流體方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于分析和生物分析方法領(lǐng)域且更具體來說，是關(guān)于微流體分析系統(tǒng)、 芯片實驗室系統(tǒng)和微全分析系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
分子結(jié)合和細(xì)胞特性的分析對于疾病診斷、生物醫(yī)學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)甚為重要。 因此，已研究出許多分析方法。然而，人們需要便于快速檢測的改良方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供比流式細(xì)胞術(shù)和激光掃描細(xì)胞術(shù)(LSC)具有顯著優(yōu)點的實施大規(guī)模單 細(xì)胞和分析物分析的方法。微流體形式的捕獲陣列允許高密度分析并易于圖像處理。 而且，利用本發(fā)明的芯片上樣品的制備節(jié)省時間和試劑。此外，大量單細(xì)胞在不同時 標(biāo)內(nèi)的時間相關(guān)現(xiàn)象能夠利用此裝置予以定性。本發(fā)明方法極為適于可觀察到單細(xì)胞 動態(tài)以提供快速醫(yī)學(xué)篩選的高通量定量生物學(xué)。
本發(fā)明提供可用作生物捕獲系統(tǒng)或微親和力管柱的微流體裝置。所述裝置包含一 個室，其具有入口；出口；和至少一個襯底，其中所述襯底布置于所述入口與所述出 口之間并與所述入口和所述出口流體連通；蓋子，其中所述蓋子和所述至少一個襯底 界定內(nèi)部流動空間，所述流動空間具有高度；和多個堰式捕獲器，其中所述多個堰式 捕獲器布置于所述襯底上并延伸到所述內(nèi)部流動空間中，所述多個堰式捕獲器的高度 小于所述流動空間的高度。所述流體裝置可進(jìn)一步包含額外元件，其包括(但不限于) 流體上與所述室連接的緩沖液槽；測量通過所述室的流體流動的構(gòu)件； 一或多個用于 電測量位于所述室內(nèi)的分析物或生物試劑的電極；位于所述室內(nèi)多個堰式捕獲器中至 少兩個堰式捕獲器之間的多個珠粒(例如，親和型珠粒)，所述珠?？山?jīng)官能化。所述 裝置也可包括一或多個泵和/或閥。
本發(fā)明也提供檢測流體樣品中目標(biāo)分析物或生物試劑的方法。所述方法包括使樣品與本發(fā)明微流體裝置接觸并檢測所述裝置中電或流動特性或光學(xué)的變化。
本揭示內(nèi)容的一或多個實施例的細(xì)節(jié)陳述于附圖和下文闡述中。自所述闡述和附 圖以及權(quán)利要求可清楚地了解本發(fā)明的其他特征、目的和優(yōu)點。


圖1顯示典型的夾心分析(SandwichAssay)。需要熒光標(biāo)記來確定結(jié)合事件是否成功。
圖2顯示常規(guī)凝集分析的濃度相關(guān)特性。所展示的相圖示意性地顯示了在抗原/ 所關(guān)注分子對微粒/細(xì)胞濃度的多個比率下的聚集類型。較小區(qū)域會形成大聚集體，而 大量區(qū)域即使所關(guān)注分子的濃度非常高也不會形成大聚集體。
圖3展示實施濃度相關(guān)凝集分析的大規(guī)模方法。必須大規(guī)模實施多步驟方法，包 括離心分離和再懸浮。由于此類型方法為可使所形成聚集體剪切分離的高剪切應(yīng)力方 法，因此其通常不能成功。
圖4A-C展示本發(fā)明的微流體單細(xì)胞分離分析。圖中顯示所述微流體裝置實施例 的示意圖。分支遞送通道確保含有細(xì)胞和試劑的流基本上均等地分布到每個捕獲陣列 中。僅展示一個入口和出口，然而可使用額外端口。插圖顯示一對捕獲陣列的顯微照 片中所述裝置的更多細(xì)節(jié)。
圖5A-C展示本發(fā)明的高密度單細(xì)胞分離裝置和方法。(a-b)顯示的示意圖展示利 用流過所排列懸掛障礙的細(xì)胞捕獲機(jī)制。兩層(40pm和2^im)杯狀PDMS捕獲位點 允許一部分流體流線進(jìn)入捕獲器。在捕獲細(xì)胞并部分堵塞2 pm開口區(qū)域后，通過受阻 捕獲器的流線份數(shù)減少，此達(dá)成捕獲器的自封閉特性并且大量單細(xì)胞分離。所述圖未 按比例繪制。(c)顯示單個捕獲細(xì)胞陣列的相對比圖像。比例尺為30nm。
圖6A-E顯示單細(xì)胞分離的統(tǒng)計。(a-d)顯示不同幾何形狀的細(xì)胞分離捕獲器的細(xì) 胞捕獲相對比顯微照片。從a到d捕獲器深度按10 |im、 15 pm、 30 pm和60 pm變化。 所捕獲細(xì)胞的數(shù)量隨捕獲器大小成比例變化，可觀察到捕獲器大小越小，所捕獲單細(xì) 胞就越多。(e)將針對(a)中所顯示幾何形狀的捕獲細(xì)胞分布與針對相同平均值的泊松 分布(Poisson distribution)—起繪于圖上。如果捕獲概率不依賴于先前所捕獲細(xì)胞的量， 則可預(yù)期泊松分布。在此情形下，與隨機(jī)過程相比，觀察到含有單細(xì)胞的捕獲器增加 和含有零個和大于兩個細(xì)胞的捕獲器減少。此處的數(shù)據(jù)來自四次單獨的裝載，每次裝
載均是在采集數(shù)據(jù)之前使100 含有約3xl()S個細(xì)胞/ml的細(xì)胞溶液流過所述裝置。
圖7顯示與濃度無關(guān)的凝集分析的程序。聚集體經(jīng)由許多步驟在類似于那些用于 細(xì)胞捕獲的半透性結(jié)構(gòu)上聚積而成?？墒褂瞄y在擬檢測的微粒/細(xì)胞相與分子間轉(zhuǎn)換。 與離心分離和再懸浮相比，在此情形下聚集體不會破碎。在完全阻塞通道后，珠粒堆 積并且可由肉眼觀察到，此為確定分子存在的信號。另外，可直接實施電測量來觀察 通道的阻塞。
5圖8A-G顯示本發(fā)明裝置、分析方法和測量概念的示意圖。(A)所述裝置的輪廓。 (B)將存于溶液中的官能化珠粒裝入通道中，并將珠粒擠進(jìn)兩個"堤壩"間的指定區(qū) 域。(C)將緩沖液推過珠粒堆，并用兩個電極實施電阻測量。(D)使樣品通過珠粒堆。 (E)用緩沖液洗掉樣品，并記錄電阻測量值。如果存在對所述官能化珠粒具有特異性 的分子，則其將覆蓋所述珠粒，此使得通過珠粒堆的電阻增大。(F)顯示于C部分中 的珠粒堆區(qū)域的橫截面。(G)顯示于E部分中的珠粒堆的橫截面。
圖9A-C顯示利用本發(fā)明方法和裝置的捕獲和檢測的計算。(A)顯示用于納米腔 計算的單位細(xì)胞。堆積微粒導(dǎo)致z相關(guān)面積和周長(其隨單位細(xì)胞重復(fù))。周長可用于 計算由于生物分子結(jié)合而阻塞的區(qū)域。(B)繪制通過由3 pm半徑微粒堆所建立的納米 腔系統(tǒng)的面積和周長的z相關(guān)性曲線。圖中面積最小化且周長最大化的區(qū)域在結(jié)合時 導(dǎo)致最高的電阻增加。(C)繪制多種大小的生物分子在生物分子結(jié)合時電阻比隨珠粒 堆半徑的變化曲線。
圖IOA-C展示本發(fā)明的流動和分析方法。(A)免疫色譜夾心分析的草圖。(B)樣 品可通過在堆積珠粒中間的空隙空間。(C)如果金納米顆粒結(jié)合到珠粒的表面，則光 線會散射到肉眼可見的程度。
圖ll展示本發(fā)明大規(guī)模單細(xì)胞捕獲裝置。圖中顯示了具有25,000個捕獲器/平方 厘米的高捕獲密度的大規(guī)模捕獲陣列的俯視圖。分支入口和出口允許更均勻地流向捕 獲陣列的每一區(qū)域。
圖12A-B展示用于細(xì)胞過濾的單細(xì)胞分離陣列。(a)顯示細(xì)胞捕獲機(jī)制的3D圖。 (b)自玻璃襯底懸掛下來的兩層(40 pm和10 jim)杯狀PDMS捕獲位點允許一部分流 體流線進(jìn)入捕獲器。在捕獲細(xì)胞并部分堵塞10^m開口區(qū)域后，通過受阻捕獲器的流 線份數(shù)減少，此導(dǎo)致大量單細(xì)胞分離。所述圖未按比例繪制。與直徑大于20微米的循 環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)相比，具有較小直徑(6-12 pm)的白細(xì)胞、RBC和血小板可通過所述 捕獲結(jié)構(gòu)。以此方式分離并集中CTC。
圖13A-C顯示本發(fā)明單細(xì)胞捕獲陣列的實施例。(A)顯示細(xì)胞捕獲裝置的照片， 其展示分支構(gòu)造和具有捕獲器陣列的捕獲室。比例尺為500 pm。細(xì)胞和培養(yǎng)基流自左 邊進(jìn)入并進(jìn)入個體捕獲室中且在其中分布于個體捕獲器中。(B)呈現(xiàn)捕獲裝置和機(jī)制 的圖。捕獲器模制于PDMS中并結(jié)合到玻璃襯底上。捕獲器大小偏向于主要捕獲一個 或兩個細(xì)胞。所述圖為清楚起見自實際運行裝置倒轉(zhuǎn)；運行中的裝置是玻璃襯底面向 下朝向地面操作。插圖顯示個體捕獲器的幾何形狀。所述裝置未按比例繪制。(C)顯 示具有捕獲細(xì)胞的捕獲陣列的高分辨率明視野顯微照片。在大多數(shù)情形下，細(xì)胞位于
捕獲器的同位勢最低點，而在一些情形下，兩個細(xì)胞以相同方式捕獲在捕獲器中。放 大圖顯示了所捕獲細(xì)胞的細(xì)節(jié)。捕獲是一個溫和的過程并且在常規(guī)施加的壓力下沒有 觀察到細(xì)胞變形。
圖14A-B顯示模擬剪切應(yīng)力。對捕獲有球形細(xì)胞的捕獲結(jié)構(gòu)的3D模型繪制速度 幅值與剪切應(yīng)力幅值的圖形。繪制距襯底z距離為20pm的速度幅值，同時繪制微通道和所捕獲細(xì)胞的邊界表面的剪切應(yīng)力幅值。(A)繪制速度幅值，其顯示捕獲結(jié)構(gòu)內(nèi)
速度減小的區(qū)域。比例從最大值50^ims"變成最小值0pms"。 (B)在裝置的下邊界繪 制剪切應(yīng)力幅值。此處，主圖中的比例從0擴(kuò)大到0.12 dyn cm—2。插圖顯示捕獲區(qū)域 的特寫鏡頭，新比例從O擴(kuò)大到0.025 dyncm人注意到在捕獲結(jié)構(gòu)內(nèi)剪切應(yīng)力減小。 比例尺為25 |Lim。
圖15A-C顯示排列的單細(xì)胞培養(yǎng)物。圖中顯示在微流體陣列內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞的顯微 照片圖像。在以平均速度(25 pm 3—1)連續(xù)灌注培養(yǎng)基+ 10% FBS超過24小時下培養(yǎng)細(xì) 胞。圖中顯示在(A)O小時，(B)12小時和(C)24小時時間的圖片。箭頭指出在此時間 段內(nèi)經(jīng)歷細(xì)胞分裂的細(xì)胞。比例尺為50pm。
圖16顯示陣列中的一致細(xì)胞特性。圖中顯示單個捕獲細(xì)胞的生長特征。圖中顯 示陣列中細(xì)胞生長電影的畫面，其展示細(xì)胞分裂(前三排)和細(xì)胞粘附的形態(tài)指示(4 排直到6排)二者。注意到在粘附細(xì)胞之間和分裂細(xì)胞之間觀察到的形態(tài)具有一致性。 接種后的小時數(shù)顯示在每個圖像的下面。在分裂后，子細(xì)胞仍留在捕獲區(qū)域內(nèi)。
圖17A-B顯示捕獲結(jié)構(gòu)和對照襯底中的細(xì)胞特性。(A)每小時報告在單細(xì)胞陣列 中個體細(xì)胞的細(xì)胞粘附、分裂和死亡。(B)繪制在對照玻璃載玻片上且沒有灌注的培 養(yǎng)物的相同特征曲線。
圖18A-B顯示捕獲結(jié)構(gòu)和對照襯底中的形態(tài)。圖中顯示在于玻璃襯底上生長24 小時后且沒有灌注的HeLa細(xì)胞形態(tài)(A)和在捕獲陣列中灌注24小時后的HeLa細(xì)胞形 態(tài)(B)。注意到類似的粘附形態(tài)。(B)中由于細(xì)胞附著到PDMS襯底上而觀察到一些不 同。比例尺為25nm。
具體實施例方式
除非另有說明，否則本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語皆具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員所通常了解的含義相同的含義。本文所述所有公開案和專利皆以引用方式 并入本文中。
除非上下文另外明確指出，否則本說明書和隨附權(quán)利要求中所用單數(shù)形式"一 (a 或and)"和"所述"包括多個所指事物。因此，例如，提及"一分析物"包括多種所 述分析物且提及"所述閥"包括提及一或多個所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的閥，
處站 寸寸。
對于生物分子識別，最普遍的方法使用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測。在此方案中，將帶 有標(biāo)記元素的識別元件結(jié)合到所關(guān)注分子上并通過洗滌方法移除未結(jié)合的識別元件 (Marquette等人，Biosensors &Bioelectronics 2006, 21， 1424-1433)。因此，僅在發(fā)生結(jié) 合時產(chǎn)生選擇性信號。在大多數(shù)情形下，將所述識別元件固定在表面上。這些技術(shù)在 測定結(jié)合信號之前通常需要帶有光源、濾波器和檢測器的復(fù)雜光學(xué)系統(tǒng)。在大多數(shù)情 形下，大型顯微鏡或微板閱讀器會用于此目的。此技術(shù)的常見市售儀器是ELISA(Engvall等人，Journal of Immunology 1972, 109, 129)。對于便攜式且廉價的診斷系統(tǒng)， 期望純粹電檢測而沒有光學(xué)變送。也利用生物分子識別的光學(xué)或電化學(xué)變送研制出多 種基于芯片的微流體裝置作為診斷系統(tǒng)(Yager等人，Nature 2006, 442, 412-418; Warsinke等人，Journal of Analytical Chemistry 2000, 366, 622-634)。此處，光學(xué)組件的 系統(tǒng)整合或電化學(xué)測量的可重復(fù)性可能具有限制性。
微粒在宏觀分析(Yingyongnarongkul等人，Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 2003， 6, 577-587)和微流體分析(Verpoorte, E.， Lab on a Chip 2003， 3， 60n-68n)中通常用作識別元件固定的固定位點。這是因為顆粒與不同元件可容易地 互換以實施不同分析并且固定的表面積較大，此導(dǎo)致隨顆粒大小減小而增加的大光學(xué) 信號。然而，基于微?；蛑榱５纳锓治鲆恢本窒抻诮Y(jié)合的熒光或比色檢測。
最典型的基于珠粒分析之一使用"夾心分析"(參見圖1)，其中抗體附著到珠粒 表面。如果抗原對抗體具有特異性，則其將隨后結(jié)合到珠粒上。隨后，將用熒光分子 標(biāo)記的第二抗體附著到抗原上形成"夾心"。此方法非常有效，但需要第二標(biāo)記步驟， 并且熒光必須用光學(xué)系統(tǒng)、光源和光檢測器監(jiān)測。
用于檢測生物分子和其相互作用的另一個方法是珠粒凝集分析(Coombs等人， British Journal of Experimental Pathology 1945， 26, 255-266; Reis等人，Transfusion 1993,
33,639-643)。在此分析中，由一些生物分子識別事件調(diào)介的多個珠粒或細(xì)胞聚集成簇 通常是以含有懸浮珠粒/納米顆粒的溶液的光學(xué)特性的變化來檢測。在此類型系統(tǒng)中， 聚集極大地取決于微粒/納米顆粒與所關(guān)注分子的比(圖2)并且因此如果濃度在最佳 范圍內(nèi)，則僅會達(dá)成陽性檢測。大規(guī)模方法可用以增大所述范圍，但需要對聚集體實 施離心分離和再懸浮(圖3)。這些手動操作不易在便攜式系統(tǒng)中實施，并且昂貴且耗 時。
流式細(xì)胞術(shù)(FC)和激光掃描細(xì)胞術(shù)(LSC)是某些用于單細(xì)胞分析的最廣泛使用的 技術(shù)。利用流式細(xì)胞術(shù)通常觀察到充分定性的細(xì)胞特性分布。簡單來說，此技術(shù)涉及 個體細(xì)胞的水力分離，所述個體細(xì)胞先前已使用可揭示所述細(xì)胞內(nèi)所關(guān)注生物分子數(shù) 量信息的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。存在光源、濾波機(jī)構(gòu)和檢測器以觀察所述個體細(xì)胞的信 號。所述技術(shù)是極高通量連續(xù)方法，其中在大多數(shù)情形下于分析后丟棄細(xì)胞。
因為流式細(xì)胞術(shù)通量很大，所以其是用于單細(xì)胞分析的使用最成功的技術(shù)；然而， 在大多數(shù)情形下流式細(xì)胞術(shù)限于定性熒光信號(GFP-融合蛋白、免疫熒光和細(xì)胞內(nèi)酶 的熒光底物)(Fay等人，Biochemistry 1991, 30， 5066-5075; Nolan等人，Nature Biotechnology 1998， 16, 633-638;和Krutzik等人，Nature Methods 2006, 3, 361-368)。 另外，流式細(xì)胞術(shù)沒有解決重要的相同個體細(xì)胞的時間相關(guān)測量，或細(xì)胞內(nèi)的熒光空 間定位問題。利用此方法分析的細(xì)胞通常在分析前于燒瓶或平皿中生長，并且因此環(huán) 境一致性限于燒瓶或平皿的一致性。值得注意的是，不能控制細(xì)胞-細(xì)胞接觸，并且可 擴(kuò)散的分泌物保持在培養(yǎng)環(huán)境中。
激光掃描細(xì)胞術(shù)(LSC)是已使用的替代技術(shù)，其中表面固定細(xì)胞上的染料通過掃描激光激活，并且可及時重復(fù)詢問(Griffm等人，F(xiàn)ebs Letters 2003, 546, 233-236; Bedner 等人，Cytometry 1998, 33, 1-9)。此處，比起FC來的優(yōu)點是可在個體細(xì)胞中獲得與時 間相關(guān)的信息，并且粘附細(xì)胞可在分析期間保持在培養(yǎng)物的最初位點上。然而，LSC 損失了通量，因為其僅可掃描板的有限區(qū)域。另外，對時間和通量進(jìn)行一定折衷，因 為掃描更多細(xì)胞會導(dǎo)致個體細(xì)胞測量之間的時間延長。對于LSC，試劑的引入是由移 液管完成并且在溶液交換后僅緩慢的時間相關(guān)變化是有意義的。此尤其是由于在整個 載玻片或板上溶液的不均勻引入和激光掃描的連續(xù)過程。如在FC中，將細(xì)胞保持在 載玻片或平皿上，并且環(huán)境控制不佳。
為解決環(huán)境控制、快速時標(biāo)測量、圖像處理和分泌的生物分子分離等方面的問題， 己提出數(shù)種單細(xì)胞分離方法。據(jù)報道，許多微流體技術(shù)允許個體細(xì)胞的光學(xué)詢問與試 劑的快速交換相結(jié)合。
一般來說，微流體技術(shù)利用微制造來小型化流體通道和導(dǎo)管。以允許通過流體灌 注和壓力梯度動力學(xué)控制試劑和細(xì)胞的方式建立通道和結(jié)構(gòu)系統(tǒng)。大多數(shù)技術(shù)需要復(fù) 雜的操作或制造來分離個體細(xì)胞。
本發(fā)明闡述使用半透性障礙物(本文稱為"堰式捕獲器")在微流體平臺內(nèi)被動 建立個體捕獲細(xì)胞或分析物的一致陣列。在一些方面中，本發(fā)明提供不需要光學(xué)反饋 的平臺。在此平臺中，個體細(xì)胞和分析物的微環(huán)境得以較佳控制，包括分別由分離和 灌注引起的接觸和可擴(kuò)散刺激。本發(fā)明堰式捕獲器結(jié)構(gòu)的特征是允許在小于30秒內(nèi)被
動捕獲陣列中的單細(xì)胞和分析物。改變捕獲器的幾何排列也允許通過捕獲各組鄰近細(xì) 胞或分析物而改變細(xì)胞-細(xì)胞(或結(jié)合伙伴，例如抗原-抗體)接觸的數(shù)量。雖然與FC 的通量相比通量減小，但微流體整合允許數(shù)十至數(shù)百個單細(xì)胞并行實施快速時標(biāo)測量。
如本文進(jìn)一步闡述，本發(fā)明提供一種方法，由此小分子間的結(jié)合事件可通過簡單 且廉價的壓力型或阻抗型測量以及低成本光電二極管光源和檢測器的雜交整合檢測。 因此，排除了一般與基于珠粒分析有關(guān)的昂貴光學(xué)器件的需要。所述裝置可用作便攜 式定點照護(hù)診斷裝置。
本發(fā)明提供實施簡化的濃度相關(guān)聚集以用于生物分析的微流體工具。因此，排除 了離心分離和再懸浮的需要并增大了檢測聚集的靈敏度范圍。本發(fā)明裝置、系統(tǒng)和方 法可用于免疫分析、定點照護(hù)診斷學(xué)、DNA雜交檢測、血型測定、單細(xì)胞分析以及癌 癥檢測、微小殘留疾病檢測、多種臨床病狀中血小板活化的高通量篩選-用于心血管疾 病治療、改變細(xì)胞特性的藥物的高通量篩選、血液中稀有細(xì)胞檢測和活體外毒物學(xué)篩 選，此處僅列舉少數(shù)用途。
本發(fā)明實例性流體裝置10在圖4B中予以闡釋。裝置IO流體系統(tǒng)布置于襯底25 上。襯底25可為可用于形成流體通道的任何材料。所述襯底和/或堰式捕獲器的表面 可經(jīng)改良以使其適于附著結(jié)合配體(例如生物分子)?？捎糜谒鲅b置的襯底包括(但 不限于)可直接使用或可用涂層(例如金屬或聚合物)改良的金屬、玻璃和塑膠。所 述襯底可為金屬、玻璃或硅表面。在一實施例中，所述襯底可由多種材料制成，其包括(但不限于)硅(例如硅晶圓、二氧化硅、氮化硅、玻璃和熔融硅石)、砷化鎵、磷 化銦、鋁、陶瓷、聚酰亞胺、石英、塑膠、樹脂和聚合物(包括聚甲基丙烯酸甲酯、 丙烯酸樹脂、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯和其他苯乙烯共聚
物、聚丙烯、聚四氟乙烯)、高溫合金、鋯合金、鋼、金、銀、銅、鉤、鉬、鉭、KOVAR、 KEVLAR、 KAPTON、 MYLAR、黃銅、藍(lán)寶石和其類似物。當(dāng)任何樣品處理步驟需 要基于光的技術(shù)時，高質(zhì)量玻璃(例如高熔點硼硅酸鹽或熔融硅石)由于其UV傳輸 特性而被使用。此外，所述裝置的部分可視需要涂覆各種涂層來減少非特異性結(jié)合， 以允許附著結(jié)合配體而有利于生物相容性、流阻和其類似物。
流體裝置IO包含至少一個入口端口 20，其與至少一個流動室30 (圖示為流動室 30a和30b)流體連接。流動室30包含多個捕獲器式堰式捕獲器35。堰式捕獲器35 可位于整個流動室30中，或可位于與入口端口 20最接近的區(qū)域或入口端口 20的遠(yuǎn)側(cè) 區(qū)域。多個堰式捕獲器35可稱為陣列。流動室30與一般在所述室遠(yuǎn)端(雖然其他出 口端口可能安排在室30內(nèi)的任何地方)的至少一個出口端口 40流體連接。
微流體入口端口20、室30、出口端口 40和任何其他流體通道可通過任何適宜微 機(jī)械加工技術(shù)形成于適宜材料(例如硅晶圓)上。理想地，所選材料應(yīng)能夠被滅菌并 且不應(yīng)對可用于所述流體裝置的生物試劑(例如細(xì)胞、多肽和其類似物)造成生物威 脅。裝置10的流體流動區(qū)域一般設(shè)計在襯底25中，襯底25隨后通過蓋子45封閉(參 見，例如，圖4C)。蓋子45或襯底25可由透明材料形成。透明材料允許對所述裝置 中的細(xì)胞或其他生物材料方便地進(jìn)行可視化監(jiān)控。所述蓋子可通過數(shù)種業(yè)內(nèi)所熟知的 手段連接(固定不變地或可移動地)。例如，可使用諸如環(huán)氧樹脂或其他膠粘物等結(jié)合 劑。在一方面中，將蓋子45可滑動地安裝于室30內(nèi)以使蓋子45可在所述室內(nèi)向上或 向下移動，從而增大了室30的容積。封閉所述實施例中所述蓋子的方法已為業(yè)內(nèi)所熟 知。
參照圖4C，進(jìn)一步詳細(xì)顯示包含堰式捕獲器35和蓋子45的流動室30 (也參見 圖13B)，同樣例示的是生物試劑65 (例如，細(xì)胞或分析物)。如此處進(jìn)一步闡述，堰 式捕獲器35位于室30內(nèi)以基本上(而非完全地)減少室30內(nèi)的流體流動。堰式捕獲 器35經(jīng)設(shè)計以具有足夠大小來俘獲/捕獲流過室30的流體內(nèi)的細(xì)胞或分析物。例如， 流體接觸的襯底表面與流體接觸的蓋子表面間的距離是42微米的地方(參見，例如， 圖13B)，所述堰式捕獲器延伸到流體室30的流體流動空間中一段距離以防止生物試 劑65流出堰式捕獲器35。在圖4C和圖13B所圖示的實例中，其中襯底表面與蓋子 表面間的距離是42微米，堰式捕獲器35包含延伸約40微米到流體室30的流體流動 空間中的堰式捕獲器高度60。因此，大約2微米仍作為減小的流體流動空間55。在操 作中，堰式捕獲器35具有進(jìn)入到室30的流動空間中的足夠深度以抑制生物試劑65(例 如，細(xì)胞或分析物)通過("捕獲"生物試劑65),同時允許流體通過減小的流體流動 空間55。
在一實施例中，堰式捕獲器35能夠被收縮進(jìn)流體流動空間中以允許在分析后流
10動室30的清洗物通過。所述方法包括selanoid驅(qū)動或其他技術(shù)。在一實施例中，將與 堰式捕獲器相對的表面移動到距所述堰式捕獲器較遠(yuǎn)處，由此增大減小的流體流動空 間55。例如，在測量或分析后，將堰式捕獲器收縮進(jìn)襯底中或增大堰式捕獲器與相對 表面(例如蓋子)間的距離以允許流體流動和流動室外的生物試劑通過。
堰式捕獲器35可為阻止生物試劑65通過("捕獲"生物試劑65)同時允許流體 在與堰式捕獲器35關(guān)聯(lián)的減小流體流動空間55中流動的任何形狀。例如，如附圖中 所示，堰式捕獲器35具有凹形。
如圖4C中所示，捕獲陣列的幾何排列一般以交錯方式設(shè)計以最優(yōu)化生物試劑捕 獲。以所述幾何排列和流動方式可捕獲位于捕獲陣列中的多種生物試劑。
在一方面中，堰式捕獲器35可包含可用于結(jié)合試劑并提供聚集的結(jié)合劑。在此 方面中，結(jié)合配體可固定不變地或可移動地固定在堰式捕獲器表面上。如果目標(biāo)分析 物存在于樣品中，則結(jié)合配體會俘獲所述目標(biāo)分析物。流體樣品一般會包含目標(biāo)分析 物和官能化的包含結(jié)合劑的珠粒。
在另一方面中，包含官能化珠粒(所述官能化珠粒包含結(jié)合劑)的第一流體以流 體方式通過微流體裝置10，繼之包含目標(biāo)試劑的流體樣品(參見，例如，圖7)。
所述過程包含(一方面)自溶液中捕獲目標(biāo)分析物(例如，免疫特異性俘獲)， 繼之其他目標(biāo)試劑和結(jié)合劑的聚集體。聚集體的捕獲會發(fā)生在所述捕獲陣列內(nèi)。所述 結(jié)合劑(若需要)可通過各種化學(xué)和物理特性直接固定到堰式捕獲器上，例如生物素 直接衍生化，和與結(jié)合到金襯墊的抗生蛋白鏈菌素或官能化的烷烴硫醇連接。
在本發(fā)明另一方面中，提供微親和力流體管柱。參照圖8A-C，微親和力流體管 柱100包含緊密堆積微球體或珠粒150的區(qū)域。所述珠?？捎扇魏尾牧现瞥刹⑶冶砻?可進(jìn)行官能化。 一般來說，所述珠粒會脫離芯片進(jìn)行官能化，并隨后裝入微親和力流 體管柱100中。流體管柱100中的兩個堰式捕獲器(例如，堤壩)200a和200b將抓 獲所述珠粒以建立微親和力流體管柱100。 一旦裝入珠粒，即可干燥所述裝置并隨后 載運和/或存儲。圖8C-G展示如何使用微親和力流體管柱100的基本想法。將樣品推 過珠粒堆150 (參見，例如，圖8D)。如果存在目標(biāo)分析物或生物試劑，則其將特異 性結(jié)合到官能化珠粒150上。比起其他技術(shù)來，所述管柱的優(yōu)點是抗體與抗原間的擴(kuò) 散距離極其小。這意味著可使分析時間最小化，并且使靈敏度最大化。用力使全部樣 品通過微親和力流體管柱100，這允許最大抗體-抗原相互作用。圖8E展示在將樣品 洗掉后如何用抗體涂覆珠粒。圖SF和8G分別代表(C)和(E)中管柱區(qū)域的橫截面。所 述微親和力流體管柱技術(shù)在玻璃和PDMS二者中均有效。另外，能夠通過依序裝入不 同的珠粒溶液將不同類型的珠粒裝入相同的管柱中。此技術(shù)的一個優(yōu)點是可在相同通 道中同時進(jìn)行對照實驗。也可通過簡單引入越來越小的珠粒到微親和力流體管柱100 的流體通道中堆積不同尺寸的珠粒(包括納米顆粒)。
所述方法是基于建立具有分子結(jié)合位點的納米腔系統(tǒng)，其中所述納米腔在結(jié)合所 關(guān)注分子(而不是非特異性分子)時尺寸減小可察覺到的份數(shù)。先前，已顯示涂覆有蛋白質(zhì)的珠粒與未經(jīng)涂覆的珠粒相比會導(dǎo)致其通過的納米孔的電阻增大。在所述情形 下，需要電阻的時間相關(guān)動力學(xué)測量，并且在分析前對珠粒進(jìn)行預(yù)處理。然而，在本 發(fā)明中，測量是在用分析物直接處理的靜止納米腔系統(tǒng)中進(jìn)行(圖8)。結(jié)合分析物隨 后使橫截面面積減小并使所測量的跨越所述納米腔系統(tǒng)的流阻和電阻增大。所述納米 腔系統(tǒng)可通過堆積微粒(珠粒)形成或呈靜止聚合物相形式。因為官能化珠粒可預(yù)堆 積在簡單裝置中，所以具有極大潛力用作一次性定點照護(hù)診斷裝置。
所捕獲生物試劑(例如，細(xì)胞或多肽)的檢測可以數(shù)種方法(例如，流速、流阻、 電檢測或光學(xué)檢測)進(jìn)行。電檢測可通過基于電導(dǎo)、電容或電荷的檢測達(dá)成。或者， 檢測可通過局部光學(xué)刺激和隨后的檢測(例如通過熒光)光學(xué)達(dá)成。
分析儀表可以操作方式與每個個體堰式捕獲器關(guān)聯(lián)或與作為整體的捕獲陣列關(guān) 聯(lián)。所述分析儀表可包含電極、光檢測器、顯微鏡焦點或其他類似感測裝置。在一實 施例中，所述入口端口和/或出口端口包含可測量電阻、流體流過所述室的阻抗的感測 儀器，其中流體流動的減少是生物試劑捕獲的指示。
電極可放置在珠粒堆內(nèi)部或外部來實施所述測量。將電極放置在珠粒堆內(nèi)部增加 了制造的復(fù)雜性，但具有降低背景電阻的附加優(yōu)點。另外，將電極放置在珠粒堆內(nèi)部 有助于防止由于堵塞導(dǎo)致的誤確認(rèn)，因為珠粒會將顆粒濾除在珠粒堆外。
對微粒的緊密堆積陣列的通過納米腔系統(tǒng)的電阻變化進(jìn)行模擬(圖9)。已知周長，
并假定飽和結(jié)合，可計算結(jié)合各種大小分子的納米腔的阻塞面積。對于各種大小的微 粒和生物分子，在圖9C中繪制在結(jié)合時電阻增加的曲線。此分析表明，對于平均直 徑為50A的蛋白質(zhì)分子，若要達(dá)到約10%的電阻變化需1 pm直徑或更小的珠粒大小。 然而，如果實施夾心分析，其中在初始結(jié)合后較大顆粒與所關(guān)注分子相結(jié)合，則可期 待甚至更大的變化。
如果在大型大規(guī)模色譜管柱的兩端引入電極、或在含有電極的離心管中的另一具 體構(gòu)造中(其中分析物通過離心力推動通過微粒堆)，則通過微粒堆或納米腔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 的電測量也可應(yīng)用到通過所述管柱的電測量。
對于阻抗測量，避免雙層電容影響并測量溶液電阻影響方面甚為重要。此可通過 增加雙層電容并將頻率區(qū)域集中到(例如)介于102至106&之間達(dá)成。
除電阻變化外，預(yù)期流阻變化會大得多，這是由于流阻與橫截面積的平方倒數(shù)成 正比，反之則相反。納入壓力變送器(與微流體裝置串聯(lián)或整合到裝置中)可用以檢 測分子結(jié)合。此概念的初始測試顯示，當(dāng)隨后用抗生蛋白鏈菌素涂覆7 pm生物素化珠 粒時流阻加倍。
對于定點照護(hù)診斷裝置，無儀器檢測將是理想的，并且達(dá)成此的一個方法是使用 免疫色譜測試。此測試?yán)媚z態(tài)金顆粒可非常有效地散射光的事實。當(dāng)許多金納米顆 粒聚集到一起時，光會被散射，并且看到的顏色取決于納米顆粒的大小。驗孕利用免 疫色譜測試，并且具有膠態(tài)金納米顆粒。 一般地，所述納米顆粒的大小可產(chǎn)生一條藍(lán) 色線。所述分析可在本發(fā)明微流體裝置中實施。圖IOA顯示所述分析的夾心樣排列。
12可用對人體響應(yīng)疾病而產(chǎn)生的抗體具有特異性的抗原對珠粒實施官能化。當(dāng)將樣品推 過微親和力流體管柱時，所述樣品會通過珠粒間的空隙空間(圖IOB)。隨后抗體(如 果存在)將結(jié)合到珠粒的表面。 一旦推過樣品，則將附著到抗人類抗體的金納米顆粒 溶液推過所述管柱。所述抗人類抗體將結(jié)合到珠粒表面上的抗體(如果其存在)上。 如果抗體不存在，則抗人類抗體不會結(jié)合到珠粒上，并且納米顆粒將通過管柱。當(dāng)在 管柱中俘獲到足夠納米顆粒時，則所述納米顆粒會將光散射到肉眼可見的程度(圖 IOC)。通過將高靈敏度且快速的微親和力管柱與不需要額外儀器的檢測方法組合，所 述裝置對于診斷篩選是非常成功的。
此概念已通過將連接抗生蛋白鏈菌素的40 nm金顆粒結(jié)合到塞進(jìn)微流體裝置內(nèi)管 柱中的生物素化珠粒上實施。所述珠粒堆變成引人注目的粉紅色，并且可容易地與對 照實驗區(qū)分開來。對照裝置由塞進(jìn)管柱中的普通珠粒組成。對照通道的顏色在引入膠 態(tài)金溶液后仍未改變，因為在金與珠粒間無特異性結(jié)合。
本發(fā)明系統(tǒng)和方法可使用微流體流動調(diào)節(jié)器(例如一或多個本文所述微泵)來控 制流速。例如，所述泵可為微機(jī)電(MEMS)微流體泵。所述微泵可以基本上不變或根 據(jù)系統(tǒng)需要調(diào)整的預(yù)定頻率運行。
本發(fā)明微流體裝置可包含其他處理室，所述處理包括(例如)細(xì)胞裂解、細(xì)胞移 除、細(xì)胞分離和其類似物、自其他樣品組份的期望目標(biāo)分析物的分離、目標(biāo)分析物上 的化學(xué)或酶促反應(yīng)、目標(biāo)分析物的檢測和其類似物。本發(fā)明裝置可包括一或多個用于 樣品處理和存儲、廢物或試劑存儲的槽；通向所述槽和介于所述槽之間的流體通道， 包括微流體通道。如本文更全面闡述，所述通道可包含電泳分離系統(tǒng)(例如，微電極)； 控制流體移動的閥；泵，例如電滲、電水力或電動泵；以及檢測器。本發(fā)明裝置可經(jīng) 設(shè)計以同時或依序處理一個或多個樣品或分析物。
如圖4中所示，所述組件包括(但不限于)樣品入口端口20、出口端口和其類似 物。其他組件可包括流體泵；流體閥；用于加熱和冷卻的熱模塊；用于分析試劑的存 儲模塊；相互作用室；以及檢測模塊。
所述至少一個入口端口 20和所述至少一個出口端口 40可包含控制遞送和從室30 移除流體的閥。
因此，本發(fā)明裝置包括至少一個允許樣品自入口端口 20或槽流向系統(tǒng)其他組件 或模塊的流動通道。如所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，所述流動通道可根據(jù)通道的 用途以多種方式設(shè)置。例如，開始于樣品入口端口的單流動通道可分成多個較小的通 道，以使原始樣品分成分立的子樣品來并行處理或分析?；蛘撸瑏碜圆煌K(例如， 樣品入口端口和試劑存儲模塊)的數(shù)個流動通道可一起進(jìn)入室30中。如所屬技術(shù)領(lǐng)域 的技術(shù)人員所了解，存在大量可能的設(shè)置；重要的是流動通道允許樣品和試劑從所述 裝置的一部分移動到另一部分。例如，流動通道的路徑長度可視需要改變；例如，當(dāng) 需要混合及時控反應(yīng)時，可使用較長的流動通道。
在一實施例中，本發(fā)明裝置包括至少一個用于將樣品引入到裝置中的入口端口20。此可為流動室30的一部分或與流動室30分離或為混合室；換句話說，樣品可自 樣品入口端口直接進(jìn)入包含多個堰式捕獲器的室中。
在本發(fā)明另一方面中，本發(fā)明裝置可包括細(xì)胞處理室。當(dāng)樣品包含含有目標(biāo)分析 物的細(xì)胞或包含需要分成亞群來檢測目標(biāo)分析物或期望細(xì)胞的細(xì)胞時，細(xì)胞處理室是 有用的。例如，血液中目標(biāo)分析物的檢測可能需要移除血細(xì)胞以有效分析，或在檢測 之前必須將細(xì)胞(和/或細(xì)胞核)裂解。在本上下文中，"細(xì)胞"包括真核和原核細(xì)胞、 以及在分析前可能需要處理(例如在目標(biāo)核酸檢測之前自病毒顆粒釋放核酸)的病毒 顆粒。隨后將樣品提供到包含堰式捕獲器35的室30中。
在本發(fā)明另一方面中，所述系統(tǒng)包含至少一個泵。所述泵可為任何類型泵裝置， 包括基于電極的泵。機(jī)電泵可用于本發(fā)明系統(tǒng)，例如基于電容驅(qū)動、熱驅(qū)動和壓電驅(qū) 動的機(jī)電泵。適宜的芯片上的泵包括(但不限于)電滲(EO)泵和電水力(EHD)泵；業(yè) 內(nèi)有時將所述基于電極的泵稱為"電動(EK)泵"。所有所述泵均依賴于沿流動通道放置 的電極的設(shè)置。如業(yè)內(nèi)所闡述，每個所述基于電極的泵的設(shè)置略有不同；例如，EHD 泵的效率取決于兩個電極間的間距，兩個電極越靠近，用以實現(xiàn)流體流動所需要的電 壓越小?；蛘?，對于EO泵，由于電極僅與施加力有關(guān)，因此電極間的間距應(yīng)較大， 可高達(dá)移動流體的通道長度的一半；且如同在EHD中一般與產(chǎn)生電荷(力將作用于其 上)無關(guān)。
在一實施例中，使用電滲泵。電滲(EO)是基于如下事實在離子材料存在下，許 多固體(包括石英、玻璃和其他)的表面變得以不同方式帶電荷，帶正電荷或帶負(fù)電 荷。帶電荷表面會吸引水性溶液中帶相反電荷的抗衡離子。施加電壓導(dǎo)致抗衡離子遷 移到帶相反電荷的電極，并且也移動大量流體。體積流速與電流成正比，并且在流體 中產(chǎn)生的體積流動也與所施加的電壓成正比。電滲流動可用于具有一定電導(dǎo)性的液體 并且通常不適于非極性溶劑。
在另一實施例中，使用電水力(EHD)泵。在EHD中，當(dāng)施加電壓時，與流體接觸
的電極轉(zhuǎn)移電荷。此電荷轉(zhuǎn)移通過向流體轉(zhuǎn)移電子或自流體移出電子發(fā)生，以使液體 沿著自帶電荷電極至帶相反電荷的電極的方向流動。EHD泵可用來泵送諸如非極性溶
劑等電阻性流體。
在另一方面中，所述泵在所述微流體裝置或室30的外面。在所述方面中，所述 泵可為蠕動泵、注射泵或其他業(yè)內(nèi)常用泵。
在本發(fā)明另一方面中，本發(fā)明裝置包括至少一個流體閥，其可控制流體流入或流 出所述裝置的模塊或室或?qū)⑵浞至饔谝换蚨鄠€通道中。多種閥為業(yè)內(nèi)所熟知。例如， 在一實施例中，所述閥可包含毛細(xì)屏障，如在PCTUS97/07880 (其以引用方式并入本 文中)中所概述。在所述實施例中，所述通道通向經(jīng)設(shè)計以有利于形成使液體表面(例 如開口處的彎月面)最小化的能量的較大空間。 一般來說，毛細(xì)屏障包括恰在通入較 大空間(例如室)的開口之前提高通道垂直高度的堤壩。此外，如美國專利第5,858,195 號(其以引用方式并入本文中)中所述，可使用"虛擬閥"類型。在又一實施例中，本發(fā)明裝置包括允許引入流體(包括樣品)至本發(fā)明任何模塊 中并隨后關(guān)閉端口以避免樣品損失的封閉端口。
本發(fā)明裝置可包括至少一個存儲模塊以分析試劑(例如，緩沖液、樣品、結(jié)合劑)。 所述存儲模塊與系統(tǒng)的其他模塊利用流動通道連接并且可包含坑或室，或延長的流動 通道。其可含有任何數(shù)量的試劑、緩沖液、酶、電子介體、鹽和其類似物(包括冷凍 干燥試劑)。
在另一實施例中，本發(fā)明裝置包括混合模塊；與存儲模塊一樣，所述混合模塊再 次為延長的流動通道(尤其用于混合)、坑或室。尤其在延長的流動通道的情形下，在 通道側(cè)面上可能有突起以達(dá)成混合。
本發(fā)明裝置可包括檢測模塊。例如，所述檢測模塊可納入電感測和光學(xué)照明二者
以使方案得以實現(xiàn)，其中標(biāo)記探針或細(xì)胞包括多個經(jīng)光化學(xué)離解的檢測部分，以將來 自單個探針的檢測到的信號放大到超出背景閾值之外。
在一方面中，本發(fā)明檢測模塊包含電極。此處所謂"電極"指的是一種組合物， 當(dāng)將其連接到電子裝置時，其能夠感測到電流或電荷并將電流或電荷轉(zhuǎn)變成信號?；?者，可將電極定義為一種可向溶液施加電位和/或在溶液中的物質(zhì)之間來回傳遞電子的 組合物。電極已為業(yè)內(nèi)所熟知且包括(但不限于)某些金屬和其氧化物，包括金；鉑； 鈀；硅；鋁；金屬氧化物電極，包括鉑氧化物、鈦氧化物、錫氧化物、銦錫氧化物、 鈀氧化物、硅氧化物、鋁氧化物、鉬氧化物(M0206)、鎢氧化物(W03)和釕氧化物；和 碳(包括玻璃碳電極、石墨和碳糊)。
在另一方面中，所述檢測器可為能夠檢測光學(xué)變化的光學(xué)檢測器。光學(xué)變化可能 為與聚集體或細(xì)胞有關(guān)的發(fā)光或熒光標(biāo)記存在的結(jié)果。
在一實施例中，利用電子檢測，包括電流分析法、伏安法、電容法和阻抗法。適 宜技術(shù)包括(但不限于)電重量測定法；庫侖法(coulometry)(包括控制電位庫侖法和 恒電流庫侖法)；伏安法(循環(huán)伏安法、脈沖伏安法(常規(guī)脈沖伏安法、方波伏安法、 差分脈沖伏安法、Osteryoung方波伏安法和恒電量脈沖技術(shù))；溶出分析(陽極溶出分 析、陰極溶出分析、方波溶出伏安法)；電導(dǎo)測量(電解電導(dǎo)、直接分析)；時間相關(guān) 電化學(xué)分析(計時電流分析法、計時電位分析法、循環(huán)計時電位分析法和電流分析法、 交流極譜法、計時電流測定法(chronogalvametry)和計時庫侖法)；交流阻抗測量；電容 測量；交流伏安法；和光電化學(xué)。
因此，本發(fā)明提供用于檢測目標(biāo)分析物或生物試劑(包括細(xì)胞)的包含具有多個 堰式捕獲器的襯底的裝置。所述襯底可由多種材料制成且可采用多種設(shè)計來構(gòu)造。在 一些情形下，所述襯底的一部分可以移動；例如，界定室30的所述襯底/蓋子可為可 在使用后自裝置移開的可拆卸盒子。
如所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解，本發(fā)明裝置可以多種方式制成。適宜制造技 術(shù)再次由所選擇的襯底而定。實例性方法包括(但不限于)多種微機(jī)械加工和微制造 技術(shù)，包括薄膜沉積工藝(例如旋涂)、化學(xué)汽相沉積、激光制造、光刻和其他利用濕
15化學(xué)工藝或等離子體工藝的蝕刻技術(shù)、壓紋、噴射模塑和粘結(jié)技術(shù)。此外，還有用于 產(chǎn)生期望流體導(dǎo)向路徑的印刷技術(shù)，即印刷材料的圖案可容許定向的流體傳送。
此外，應(yīng)了解，雖然此處的大部分討論針對具有堰式捕獲器的平面襯底的使用， 但也可使用其他幾何形狀。例如，兩個或多個平面襯底可經(jīng)堆疊以產(chǎn)生在一個平面內(nèi) 或平面間含有連續(xù)堰式捕獲器的三維裝置。
在本發(fā)明方法和系統(tǒng)中，微粒的微流體處理有助于聚集體的形成和聚集事件的檢
測二者。所述技術(shù)允許用于診斷應(yīng)用(免疫感測和DNA雜交檢測)的便宜、無標(biāo)記、
容易操作的生物分子檢測方法。檢測可利用基于微流體室中聚集體積聚的簡單的電方 法、壓力方法和肉眼光學(xué)方法。為有助于聚集，利用微流體方法交替地涂覆結(jié)合識別 元件的微粒層和檢測到的生物分子層，以克服聚集分析中的非線性濃度相關(guān)困難(圖7)。
所述方法使用如本文所述的裝置，其包含(1)容納微粒/納米顆粒的半透性結(jié)構(gòu) (例如，堰式捕獲器)；(2)在與所述顆粒結(jié)合的分子和與涂覆顆粒結(jié)合的其他顆粒間 的轉(zhuǎn)換暴露物件；和(3)在一個以上位置處結(jié)合的分子和識別元件(例如多克隆抗體)。 其他方法和特征可包含(1)放大持續(xù)聚集事件的方法，例如通道對其他顆粒的完全 不透性-此導(dǎo)致微通道中顆粒聚積和指示分子存在的肉眼可見聚集體；(2)也可電測量 占據(jù)微通道的大量珠粒，使用芯片上的電極和在102到106 Hz范圍內(nèi)的高頻率阻抗測 量來測量與雙層電容支配區(qū)域相對的溶液電阻支配區(qū)域。電化學(xué)直流和交流測量可用 于橫跨電極發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移的情況。
可用于本發(fā)明方法和系統(tǒng)的結(jié)合配體(例如生物分子)的實例包括一般在活有機(jī) 體中發(fā)現(xiàn)的分子(例如聚合物)。實例包括(但不限于)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和碳水化 合物。
本文所用術(shù)語"目標(biāo)分析物"和"生物試劑"是指欲檢測樣品中的分子或有機(jī)體。 目標(biāo)分析物的實例包括(但不限于)多核苷酸、寡核苷酸、病毒、多肽、抗體、天然 存在的藥物、合成藥物、污染物、變應(yīng)原、影響因子(affector)分子、生長因子、趨化 因子、細(xì)胞因子和淋巴因子。
生物試劑包括有機(jī)和無機(jī)分子，其包括生物分子。例如，所述分析物可為環(huán)境污
染物(包括農(nóng)藥、殺蟲劑、毒素和其類似物)；化學(xué)品(包括溶劑、聚合物、有機(jī)材料
和其類似物)；治療分子(包括治療和濫用藥物、抗生素和其類似物)；生物分子(包
括，例如，激素、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、細(xì)胞膜抗原和受體(神經(jīng)
受體、激素受體、營養(yǎng)受體和細(xì)胞表面受體)或其配體)；全細(xì)胞(包括原核和真核細(xì)
胞)；病毒(包括，例如，反轉(zhuǎn)錄病毒、庖疹病毒、腺病毒、慢病毒)；孢子；和其類
似物。目標(biāo)分析物和生物試劑的其他實例包括(但不限于)免疫球蛋白，尤其是IgE、
IgG和IgM，且尤其為與治療學(xué)或診斷學(xué)相關(guān)抗體，包括但不限于，人白蛋白、載脂
蛋白(包括載脂蛋白E)、人絨毛膜促性腺素、皮質(zhì)醇、a-甲胎蛋白、甲狀腺素、促甲
狀腺激素(TSH)、抗凝血酶等各物的抗體；藥物的抗體(包括抗癲癇藥物(苯妥英(phenytoin)、撲米酮(primidone)、卡馬西平(carbamazepine)、乙琥胺、丙戊酸和苯巴比 妥(phenobarbitol))、作用于心臟的藥物(地高辛(digoxin)、利多卡因(lidocaine)、普魯 卡因胺(procainamide)和丙吡胺)、支氣管擴(kuò)張藥(茶堿)、抗生素(氯霉素、氨苯磺胺)、 抗抑郁藥、免疫抑制劑、濫用藥物(苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻素、可卡因(cocaine) 和鴉片劑)和數(shù)種病毒的抗體(包括正粘病毒(例如，流感病毒)、副粘病毒(例如， 呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒)、腺病毒、鼻病毒、冠狀病毒、呼腸病毒、 囊膜病毒(例如，風(fēng)疹病毒)、細(xì)小病毒、痘病毒(例如，天花病毒、痘苗病毒)、腸 道病毒(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus))、肝炎病毒(包括A、 B和C)、庖疹病毒(例如，單純皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、愛潑斯 坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus))、輪狀病毒、諾沃克病毒(Norwalk viruses)、漢他病毒 (hantavirus)、沙粒病毒、棒狀病毒(例如，狂犬病病毒)、反轉(zhuǎn)錄病毒(包括HIV、 HTLV-I和-II)、乳多泡病毒(例如，乳頭瘤病毒)、多瘤病毒和微小核醣核酸病毒和其 類似物)和細(xì)菌的抗體(包括多種病原性和非病原性相關(guān)原核生物，包括芽孢桿菌 (Bacillus);弧菌(Vibrio)，例如，霍亂弧菌(V. cholerae);埃希氏菌(Escherichia)，例如， 腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic E. coli);志賀氏菌(Shigella)，例如，痢疾志賀氏菌 (S. dysenteriae);沙門菌(Salmonella)，例如，傷寒沙門菌(S. typhi);分枝桿菌 (Mycobacterium),例如，結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(M. leprea);梭 菌(Clostridium)，例如，肉毒梭菌(C. botuli皿m)、破傷風(fēng)梭菌(C. teteni)、艱難梭菌(C. difficile)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens);棒狀桿菌(Comyebacterium),例如，白喉棒狀 桿菌(C. diphtheriae);鏈球菌(Streptococcus)，化膿性鏈球菌(S. pyogenes)、肺炎鏈球菌 (S. pneumoniae);葡萄球菌(Staphylococcus)，例如，金黃色葡萄球菌(S. aureus);嗜血 菌(Haemophilus)，例如，流感嗜血桿菌(H. influenzae);奈瑟球菌(Neisseria)，例如，腦 膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)、淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae);耶爾森菌(Yersinia)， 例如，蘭伯氏賈第蟲(G. lamblia)、鼠疫耶爾森菌(Y. pestis);假單胞菌(Pseudomonas)， 例如，銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、惡臭假單胞菌(P. putida);衣原體(Chlamydia)，例 如，沙眼衣原體(C. trachomatis);博德特菌(Bordetella)，例如，百日咳博德特菌(B. pertussis);密螺旋體(Treponema)，例如，蒼白密螺旋體(T. palladium);和其類似物)； 酶(和其他蛋白質(zhì))，包括但不限于用作心臟病指示劑或用于心臟病治療的酶，包括肌 酸激酶、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌鈣蛋白T、肌紅蛋白、纖維蛋白原、 膽固醇、甘油三酯類、凝血酶、組織型纖溶酶原激活物(tPA);胰腺疾病指示劑，包括 淀粉酶、脂肪酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶；肝功能酶和蛋白質(zhì)，包括膽堿酯酶、膽紅素 和堿性磷酸酶；醛縮酶、前列腺酸性磷酸酶、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶和細(xì)菌和病毒酶 (例如HIV蛋白酶)；激素和細(xì)胞因子(其中許多起細(xì)胞受體的配體作用)，例如紅細(xì) 胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白細(xì)胞介素(包括IL-l直至IL-n)、胰島素、 胰島素樣生長因子(包括IGF-1和IGF-2)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(包 括TGF-a和TGF-P)、人生長激素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子(EGF)、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、瘦素、VEGF、 PDGF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、促乳素、促腎上腺皮質(zhì)激 素(ACTH)、降鈣素、人絨毛膜促性腺素、皮質(zhì)醇、雌二醇、濾泡剌激激素(FSH)、促 甲狀腺激素(TSH)、促黃體激素(LH)、孕酮和睪酮；和其他蛋白質(zhì)(包括a-甲胎蛋白、 癌胚抗原CEA、癌癥標(biāo)志物和其類似物)。此外，也可直接檢測任何通過使用抗體間 接檢測的生物分子；換句話說，病毒或細(xì)菌細(xì)胞、治療和濫用藥物和其類似物的檢測 可直接實施。
適宜目標(biāo)分析物包括碳水化合物，其包括(但不限于)如下癌癥的標(biāo)志物乳癌 (CA15-3、 CA549、 CA27.29)、與抗原有關(guān)的粘蛋白樣肉瘤(MCA)、卵巢癌(CA125)、 胰腺癌(DE-PAN-2)、前列腺癌(PSA)、 CEA和結(jié)腸直腸癌和胰腺癌(CA19、 CA50、 CA242)。適宜目標(biāo)分析物也包括金屬離子，尤其重金屬和/或有毒金屬，包括但不限 于鋁、砷、鎘、硒、鈷、銅、鉻、鉛、銀和鎳。
目標(biāo)分析物和生物試劑可以數(shù)種不同樣品類型的形式存在，其包括但不限于體液 (包括血液、淋巴液、唾液、陰道和肛門分泌物、尿、糞便、汗液和眼淚)和實體組 織(包括肝、脾、骨髓、肺、肌肉、腦和其類似物)。例如，廣義來說，樣品包括(但 不限于)環(huán)境樣品、工業(yè)樣品和生物樣品。環(huán)境樣品包括來自環(huán)境的材料，例如土壤 和水。工業(yè)樣品包括在制造過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物或廢物。生物樣品可為動物(包括人類)、 流體(例如，血液、血漿和血清)、固體(例如，大便)、組織、液體食物(例如，牛 奶)和固體食物(例如，蔬菜)。
結(jié)合配體、伙伴或同源物是指能夠或懷疑能夠物理上相互作用的兩個分子(例如， 蛋白質(zhì))。在上下文合適的情況下，由于互補(bǔ)性能夠彼此雜交的兩個核酸分子理解為結(jié) 合伙伴。聚集體可通過結(jié)合配體與其關(guān)聯(lián)結(jié)合伙伴的相互作用形成。
本文所用術(shù)語"互補(bǔ)的"或"互補(bǔ)性"是用以指通過堿基配對規(guī)則相關(guān)的多核苷 酸(即核苷酸序列)。例如，序列"5'-A-G-T-3'"與序列"3'-T-C-A-5'"互補(bǔ)?；パa(bǔ)性 可為"部分的"，其中僅一些核酸堿基按照堿基配對規(guī)則是匹配的?；蛘?，核酸之間存 在"完全的"或"全部的"互補(bǔ)性。核酸鏈間互補(bǔ)性的程度對核酸鏈間雜交的效率和 強(qiáng)度具有重要影響。
提供以下實施例來闡釋而非限制本發(fā)明。在下文中詳細(xì)闡述所述實例中采用的科 學(xué)方法的各項參數(shù)并大體上為實踐本發(fā)明提供指導(dǎo)。
實例
在本發(fā)明一方面的使用中，將細(xì)胞通過微流體裝置的分支入口端口引入到包含捕 獲陣列的個體室中(圖4)。將單細(xì)胞分離進(jìn)由兩個通道高度水平組成的規(guī)則高密度陣 列中。較大的40 ^un通道高度作為細(xì)胞溶液的主要流體導(dǎo)管，而2 ^un高度區(qū)域用以 形成提高的捕獲區(qū)域(圖5)。具有2 pm空隙使得小部分流體流線可以攜帶細(xì)胞進(jìn)入 捕獲器。 一旦細(xì)胞進(jìn)入捕獲器并部分堵塞所述2^im空隙，則進(jìn)入堰式捕獲器捕獲區(qū)域 的流體流線(和細(xì)胞)份數(shù)會減少。此導(dǎo)致大量單細(xì)胞分離(圖5、圖6a-e)。實際上， 捕獲概率取決于先前所捕獲細(xì)胞的數(shù)量。此通過將泊松分布與實驗測量的分布進(jìn)行比較統(tǒng)計學(xué)顯示于圖6e中(N499捕獲位點，4次單獨裝載)。如果捕獲獨立于先前捕 獲事件，則數(shù)據(jù)應(yīng)符合泊松分布。此處，顯示單細(xì)胞超過泊松分布，而0、 3和4個捕 獲細(xì)胞有所降低。如果試圖解釋捕獲純粹取決于幾何擬合，則預(yù)計捕獲兩個細(xì)胞更為 普遍，因為通道高度大于典型哺乳動物細(xì)胞直徑的兩倍(40fim相比于15pm)。
如本文所述，可使用多種堰式捕獲器大小和幾何形狀。保持相同的堰式捕獲器寬 度和通道高度，堰式捕獲器的深度可在10到60 pm間變化。表示凹處"深度"的捕獲 結(jié)構(gòu)的深度不應(yīng)與稱為"高度"的通道深度相混淆。所述各種深度導(dǎo)致捕獲細(xì)胞數(shù)量 的差異(圖6)。對于lOpm深的堰式捕獲器，大于50%的堰式捕獲器含有單細(xì)胞，隨 堰式捕獲器深度增加，單細(xì)胞分離的份數(shù)降低。對于10pm深的堰式捕獲器捕獲細(xì)胞 數(shù)量的分布顯示于圖6e中。由于過多細(xì)胞經(jīng)歷較高剪切力并且自較為不穩(wěn)定的位置移 開，因此陣列密度也影響單細(xì)胞的捕獲效率。
我們發(fā)現(xiàn)所述裝置非常有效且容易使用，其能夠在小于30秒內(nèi)實施捕獲。而且， 在證實了所述方法的效用后，已成功制造并運行了所述裝置。當(dāng)與其他流體機(jī)械捕獲 方法比較時，所述方法的不同之處包括隨電阻增大捕獲器的"自封閉"、使用簡單流過 程序即可增強(qiáng)單細(xì)胞分離的幾何形狀調(diào)整、和高密度陣列能力。與流式細(xì)胞術(shù)(FC)相 比，盡管FC能在數(shù)個時間點詢問成百上千的細(xì)胞，但其不能在長時間段內(nèi)分析相同 細(xì)胞，也不能在個體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行位置相關(guān)熒光分析。用FC尤其難以探測的是在向細(xì) 胞添加化合物時的快速時間相關(guān)變化。本文所提出的裝置和技術(shù)具有彌補(bǔ)FC中所有 所述空白的潛力，并具有中等通量。
人們已通過觀察細(xì)胞生長和分裂以及在個體細(xì)胞陣列中的酶含量來展示動力學(xué) 細(xì)胞分析?？蓪⒓?xì)胞長時間保持在含有適當(dāng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，且尤其有用的是在固 定位置的懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)物，所述細(xì)胞不附著到表面且利用其他方法難以觀察。
微流體芯片制造。捕獲陣列培養(yǎng)裝置的模具是如Di Carlo等人所述使用負(fù)性光阻 劑(SU-8 50和SU-8 2002， Microchem公司，3000 rpm旋轉(zhuǎn)速度，40 pm和2 jim厚) 制造。按照制造商說明書制備聚二甲基硅氧烷(PDMS， Sylgard 184, Dow Coming),將 其在真空室中脫氣1小時并隨后澆注在模具上并在7(TC烘箱中固化2小時。用手術(shù)刀 從模具上切下PDMS并隨后小心地剝離模具。用平刃針沖出流體入口和出口以便進(jìn)行 管連接。在結(jié)合前將玻璃載玻片和PDMS結(jié)構(gòu)二者均用氧等離子體(0.5托,40 W)處理 20秒。
細(xì)胞培養(yǎng)和制備。實驗中使用HeLa (人類子宮頸癌)細(xì)胞系(美國典型培養(yǎng)物 保藏中心(American Type Culture Collection), Bethesda, MD)。通過使用補(bǔ)充有10%胎牛 血清(FBS)的杜貝克氏改良鷹氏培養(yǎng)基(Dubelcco's Modified Eagle Medium)(DMEM)每 周傳代兩次保持所述細(xì)胞。為進(jìn)行裝載，使用5 mL胰蛋白酶EDTA (0.25 °/。， Gibco, Carlsbad, CA)自100 mm直徑的培養(yǎng)皿分離粘附細(xì)胞。隨后添加等量的DMEM十FBS 到減活的剩余胰蛋白酶中。隨后將細(xì)胞離心得到沉淀并重新懸浮于經(jīng)磷酸鹽緩沖的鹽 水pH 7.4 (PBS, Gibco, Carlsbad, CA)中。關(guān)鍵實驗細(xì)節(jié)是在15分鐘胰蛋白酶消化之內(nèi)捕獲懸浮細(xì)胞以減少與表面的非特異性粘附。通過與三通閥連接的注射器將剛懸浮的
細(xì)胞引入先前填充有PBS的裝置中。對于對照實驗，將經(jīng)懸浮細(xì)胞引入PDMS孔所包 含的玻璃載玻片上并在培養(yǎng)箱或(37'C)加熱臺中培養(yǎng)以用于延時實驗。
芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)。在裝載前首先用70。/。乙醇將管道、閥和裝置滅菌5分鐘。隨 后用無菌PBS注入裝置和管道。先前步驟全部在生物安全罩中實施以減少污染。隨后， 添加細(xì)胞溶液并將細(xì)胞捕獲至期望密度。接下來，將閥轉(zhuǎn)到無菌培養(yǎng)基+10。/。FBS并 且啟動流動以灌注細(xì)胞。使用注射泵(Cole-Parmer)以0.75 pl min'1流速在捕獲區(qū)域產(chǎn)生 約25 pm s—1的平均速度。在觀測圖像期間將細(xì)胞保持在培養(yǎng)箱中或在顯微鏡臺上加熱 至37"以用于延時實驗。
顯微鏡方法和數(shù)據(jù)分析。對于延時實驗，用加熱臺裝備Olympus MIC-D顯微鏡。 利用提供的MIC-D軟件每3到6分鐘采集延時圖像。利用IrfanView分析圖像以確定 形態(tài)和細(xì)胞分裂。長軸為短軸1.3倍的細(xì)胞視為"粘附細(xì)胞"。如果細(xì)胞自粘附形態(tài)收 縮，變成球形并隨后分成兩個子細(xì)胞則將其確定為分裂。如果細(xì)胞顯示起泡、在6小 時內(nèi)無運動或形狀變化或其他凋亡特征，則將其確定為凋亡。
裝置模擬。對于細(xì)胞培養(yǎng)，了解并控制細(xì)胞表面上的剪切應(yīng)力甚為重要，因為細(xì) 胞路徑可由高剪切應(yīng)力激活而導(dǎo)致不期望的細(xì)胞特性。利用有限元方法(FEMLAB 3.0, Comsol公司)對經(jīng)分離捕獲結(jié)構(gòu)周圍的流動場進(jìn)行3D模擬。利用Navier-Stokes方程 來模擬僅具有粘性項(即在子域中p = 0)的流體流動。邊界條件由25 pms—1的平均入 口速度和設(shè)定為0的出口壓力組成。計算域的側(cè)壁設(shè)定為對稱，以模擬一排捕獲結(jié)構(gòu)。 模擬單個捕獲器(粗篩孔)而不是陣列。采集貫穿所述域的速度和所述域邊界處的剪 切應(yīng)力分量二者。
成功制造捕獲陣列并進(jìn)行測試。所述裝置由并行連接的分支捕獲室構(gòu)成(圖13A)， 而在所述室內(nèi)的陣列由U形PDMS結(jié)構(gòu)構(gòu)成，所述U形PDMS結(jié)構(gòu)高度為40 pm且 偏移所述襯底2pm (圖13B-C)。每個室在其寬度上含有4至5個捕獲器(圖13C)。 而且，每排捕獲器不對稱地偏移先前排(圖13C)。定性觀察到與對稱偏移排相比，不 對稱的捕獲器排可更好地填充整個室。測試數(shù)個長度的捕獲器深度(10pm、 15pm、 30lam和60pm)以獲得最佳的個體細(xì)胞分離。我們發(fā)現(xiàn)10微米深的捕獲器最始終如 一地捕獲個體HeLa細(xì)胞(平均直徑為約15 pm)。對于其他具有不同平均直徑的細(xì)胞 類型，最佳捕獲器大小應(yīng)有所不同。另外，由于群體中存在細(xì)胞大小分布，可能偏向 于捕獲可更容易占據(jù)捕獲位點的較小細(xì)胞。
對于含有球形捕獲細(xì)胞的單個3D捕獲器結(jié)構(gòu)，如Materials in Methods中所述模 擬流體速度和剪切應(yīng)力。實施此來確定捕獲細(xì)胞的剪切應(yīng)力條件以與生理學(xué)上相關(guān)的 剪切應(yīng)力進(jìn)行比較。對于實驗中所用的0.75 (iL min'1流速，最大速度達(dá)到約50 )am s—1 并且在通道中間自襯底z=20 )im位置處單個被占據(jù)捕獲器周圍的速度幅值的分布顯示 于圖14A中。在捕獲器前面和后面的區(qū)域中，速度如預(yù)計的那樣減小。還模擬球形捕 獲細(xì)胞上的剪切應(yīng)力并且繪制在相同流動條件下通道底部表面上捕獲細(xì)胞的分布曲線(圖14B)。底部表面的剪切應(yīng)力接近粘附細(xì)胞會感受到的剪切應(yīng)力。此處，在捕獲結(jié)
構(gòu)外部觀察到的平均剪切應(yīng)力為6xl(T2 dyn cm—2并且在捕獲器中的平均剪切應(yīng)力為 2.5xl0'3dyncm'2。此導(dǎo)致主流與捕獲器內(nèi)之間的剪切應(yīng)力比為約24。球形捕獲細(xì)胞上 的平均剪切應(yīng)力也為3.5xl(T3 dyn cm々。所述數(shù)字比血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷的約10 dyn cnT2 的生理學(xué)剪切應(yīng)力低很多，但與間隙滲流所引起的剪切應(yīng)力相當(dāng)。對于低雷諾數(shù) (Reynold's number),所述裝置中觀察到的剪切應(yīng)力比仍獨立于流速并且是表征自主流 所捕獲單細(xì)胞"隔離"程度的數(shù)值。
在培養(yǎng)基+ 10y。FBS的恒定灌注下獲得單個HeLa細(xì)胞的規(guī)則陣列培養(yǎng)物。對于 25 pLmin"流速，每3分鐘獲取培養(yǎng)在顯微鏡臺上的HeLa細(xì)胞捕獲陣列的延時圖像 (圖15)。 12和24小時后的細(xì)胞顯示于圖15B-C中。最初，此序列的單細(xì)胞捕獲率 為70% (圖15A)。在12小時后，觀察到形態(tài)的小變化，其自球形形態(tài)轉(zhuǎn)向粘附形態(tài)。 而且，在少數(shù)情形下觀察到細(xì)胞分裂(頂部紅箭頭-圖15B)。在24小時后，大多數(shù) 細(xì)胞顯示粘附形態(tài)并且用箭頭做出標(biāo)志的兩個細(xì)胞已分裂。在一些情形下，也觀察到 細(xì)胞脫離捕獲結(jié)構(gòu)。對于分裂和粘附細(xì)胞，捕獲結(jié)構(gòu)中數(shù)個細(xì)胞隨時間的特性顯示于 圖16中。應(yīng)注意，在大多數(shù)情形下，在細(xì)胞分裂后兩個子細(xì)胞仍分離在捕獲結(jié)構(gòu)中。 另一個有趣的觀察是所捕獲HeLa細(xì)胞的粘附方向性。觀察到大部分生長中HeLa細(xì)胞 的長軸與捕獲結(jié)構(gòu)的長軸平行。而且在所述情形下，看來似乎細(xì)胞變得粘附到與玻璃 襯底相對的PDMS結(jié)構(gòu)上。此可能是由于血清中含有促粘附蛋白質(zhì)，促粘附蛋白質(zhì)可 粘附到偏向附著的疏水PDMS表面。在一些情形下，由于捕獲器界面處的衍射PDMS 結(jié)構(gòu)上的粘附可能限制顯微鏡分析。為限制粘附，將來的研究可以利用高濃度的會涂 覆所述PDMS表面的牛血清白蛋白(BSA)處理。
細(xì)胞粘附、死亡、分裂和自捕獲器脫離的動力學(xué)定量分析實施24小時時間段并 在圖17A中繪制曲線。此處，觀察到在15小時后50%的細(xì)胞顯示粘附形態(tài)。在24小 時后，6%的細(xì)胞顯示出凋亡特征，而15%的細(xì)胞已從最初捕獲位點附近脫離。24小 時后捕獲結(jié)構(gòu)內(nèi)的高水平保持可能歸因于捕獲結(jié)構(gòu)內(nèi)的剪切遮蔽。另外，5%的細(xì)胞在 24小時后經(jīng)歷細(xì)胞分裂。將所述結(jié)果與使用相同玻璃襯底沒有捕獲器或灌注的對照實 驗中的細(xì)胞特性進(jìn)行比較(圖17B)。在此實驗中，50%的細(xì)胞在近似14小時后粘附， 而5%的細(xì)胞在24小時后凋亡，并且僅1%的細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞分裂。將細(xì)胞視為"粘附 細(xì)胞"的要求是其長度為其寬度的1.3倍。
粘附形態(tài)通過將捕獲結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞特性與對照實驗中在類似條件下培養(yǎng)的細(xì)胞 進(jìn)行比較證實(圖18)。在玻璃載玻片上(圖18A)和所述裝置中(圖18B)看到的 圖像中觀察到類似的粘附和拉長形態(tài)。
本發(fā)明提供基于微流體的水力捕獲方法以建立可用灌注動力學(xué)控制的單個粘附 細(xì)胞陣列。培養(yǎng)HeLa細(xì)胞并在24小時后觀察到在原始捕獲位置的高水平保持。另外， 細(xì)胞分裂、粘附和凋亡特性與在相同襯底上的靜置培養(yǎng)相當(dāng)，表明細(xì)胞所受應(yīng)力沒有 超過正常培養(yǎng)條件。在細(xì)胞分裂后，也觀察到子細(xì)胞保持在原始捕獲結(jié)構(gòu)內(nèi)。與先前
21單細(xì)胞陣列相比，通過接觸和可擴(kuò)散元素二者的細(xì)胞-細(xì)胞通信是所述裝置中的可控制 參數(shù)。所述技術(shù)可用于單細(xì)胞的代謝、藥代動力學(xué)、藥物毒性、剪切應(yīng)力激活和化學(xué) 信號路徑激活和抑制研究。
權(quán)利要求
1、一種微流體裝置，其包含入口；出口；和至少一個襯底，其中所述襯底布置于所述入口端口與所述出口端口之間并與所述入口端口和所述出口端口流體連通；蓋子，其中所述蓋子和所述至少一個襯底界定內(nèi)部流動室，所述流動室具有高度；多個堰式捕獲器，其中所述多個堰式捕獲器布置于所述襯底上并延伸到所述內(nèi)部流動室中，所述多個堰式捕獲器的高度小于所述流動室的高度；和至少一個檢測裝置，其中所述至少一個檢測裝置測量通過所述室的流動動力學(xué)或電特性。
2、 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其進(jìn)一步包含流體上與所述室連接的緩沖 液槽。
3、 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其進(jìn)一步包含用于測量通過所述室的流體 流動的構(gòu)件。
4、 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其進(jìn)一步包含用于電測量位于所述室內(nèi)的 分析物或生物試劑的電極。
5、 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其進(jìn)-步包含多個珠粒，所述珠粒位于所 述室內(nèi)多個堰式捕獲器中的至少兩個堰式捕獲器之間。
6、 如權(quán)利要求5所述的微流體裝置，其中所述多個珠粒經(jīng)官能化以結(jié)合分析物 或生物試劑。
7、 如權(quán)利要求5所述的微流體裝置，其中所述珠粒具有不同直徑。
8、 如權(quán)利要求5所述的微流體裝置，其中所述珠粒包含結(jié)合的納米顆粒。
9、 如權(quán)利要求5所述的微流體裝置，其中所述珠粒經(jīng)核酸和/或多肽官能化。
10、 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其包含引導(dǎo)通過所述室的流體流動的構(gòu)件。
11、 如權(quán)利要求8所述的微流體裝置，其中所述引導(dǎo)流動的構(gòu)件包含至少一個泵。
12、 如權(quán)利要求l所述的微流休裝置，其進(jìn)一步包含多個可操作以開始、停止或 減少通過所述系統(tǒng)的流體流動的閥。
13、 如權(quán)利要求l所述的微流體裝置，其中所述蓋子在所述室內(nèi)可移動。
14、 如權(quán)利要求13所述的微流體裝置，其進(jìn)一步包含用于測量通過所述珠粒的 電阻變化的構(gòu)件。
15、 如權(quán)利要求l所述的微流體裝置，其進(jìn)一步包含通過測量所述室內(nèi)流阻或壓 力的變化而測量與堰式捕獲器關(guān)聯(lián)的分析物或生物試劑的構(gòu)件。
16、 如權(quán)利要求5所述的微流體裝置，其進(jìn)一步包含通過測量所述室內(nèi)流阻或壓 力的變化而測量與珠粒關(guān)聯(lián)的分析物或生物試劑的構(gòu)件。
17、 如權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述多個堰式捕獲器經(jīng)設(shè)計以捕獲分 析物并促進(jìn)凝集。
18、 如權(quán)利要求l所述的微流體裝置，其中所述多個堰式捕獲器經(jīng)設(shè)計以捕獲生 物試劑。
19、 如權(quán)利要求18所述的微流體裝置，其中所述生物試劑是細(xì)胞或病毒顆粒。
20、 一種檢測流體樣品中目標(biāo)分析物或生物試劑的方法，其包含 使所述樣品與如權(quán)利要求l所述的微流體裝置接觸和檢測選自由電阻、流量、流體壓力和光學(xué)組成的群組的變化。
全文摘要
本發(fā)明提供分子識別檢測和細(xì)胞分析的方法。本發(fā)明提供光學(xué)和非光學(xué)方法二者。所述方法利用在半透性結(jié)構(gòu)中俘獲顆粒。本發(fā)明闡述實施生物分子和細(xì)胞分析的特異性微流體系統(tǒng)構(gòu)造。
文檔編號C12M1/34GK101548004SQ200680030231
公開日2009年9月30日 申請日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月19日
發(fā)明者喬舒亞·坦納·內(nèi)維爾, 盧克·P·李, 迪諾·迪卡洛 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會