專利名稱：：用于產(chǎn)生胞間連絲傳導性發(fā)生改變的植物的構建體和方法用于產(chǎn)生胞間連絲傳導性發(fā)生改變的植物的構建體和方法發(fā)明領域與發(fā)明背景這種植物的構建體和方法。胞間連絲(Pd)是特化的膜通道，胞間連絲使相鄰的植物細胞相互連接，并促進通過細胞壁進行直接的胞質細胞間轉運。通過胞間連絲的轉運介導許多過程，其中，信息傳遞使得發(fā)育協(xié)調、使光合作用產(chǎn)物從成熟組織運輸?shù)桨l(fā)育組織、響應病原體侵襲、系統(tǒng)性基因沉默等(有關綜述見Ding等，1999;Zambryski和Crawford,2000;Haywood等，2002;Heinlein,2002;Heinlein和Epel,2004)。除正常功能外，胞間連絲被病毒和類病毒利用以進行感染的細胞間轉移與遠距離擴散(有關綜述見Ding等，1999;Beachy和Heinlein，2000;Citovsky和Zambryski,2000;Gafni和Epel，2002;Heinlein和Epel，2004)。在高等植物中，胞間連絲可以是單同軸通道(mono-coaxialtunnel),稱為簡單胞間連絲，或者可以是分支的，形成相互連接的同軸通道網(wǎng)(Ehlers和Kollmann，2001)。在嫩葉(庫葉)中，大多數(shù)胞間連絲是簡單胞間連絲，而在成熟葉(源葉)中則即有簡單胞間連絲又有分支胞間連絲(Oparka等，1999)。胞間連絲的外邊界被與兩個相鄰細胞的質膜(PM)連成一體的膜劃分出來。與外質膜同心的是被稱為連絲微管的第二層膜，衍生自兩個細胞的內質網(wǎng)(ER)膜并與之連為一體。同心膜之間是使相鄰細胞的細胞質相互連接的套管(sleeve)。高分辨率電子顯微圖顯示該套管內部為顆粒，這曾被不同地解釋為嵌入質膜中(Ding等，1992)和/或嵌入連絲微管中(Botha等，1993)，或者全部存在于月包質套管(cytoplasmicsleeve)內(Overall,1999)。與結構分析相反，有關胞間連絲生化組成的認識仍不完整，大多是因為難以分離出純的無亞細胞膜污染物的胞間連絲。本發(fā)明的發(fā)明人以前曾經(jīng)公開了分離含有嵌入胞間連絲的細胞壁的方法(Epel等，1996)。從由黃化玉米幼苗中胚軸制備的細胞壁組分提取的細胞壁締合蛋白質(Wallassociatedprotein,WAP),用SDS-PAGE進行分離,該組分極其富含一條約41kDa的成分，制備抗該條帶的抗血清。該抗血清(稱為S-41)主要免疫定位在胞間連絲和高爾基體上(Epel等，1996)。有報道指出用3MNaCl或pH11，但不能用2%TritonX-100,將使41kDa蛋白質從細胞壁組分中釋放出來，表明該蛋白質是外周膜蛋白(Epel等，1996)。當本申請的發(fā)明人將本發(fā)明付諸實施時，對編碼用鹽可提取的41kDa蛋白質的基因(本文稱為SE-WAP41)進行了克隆和測序，結果顯示它是可逆糖基化多肽(ReversiblyGlycosylatedPolypeptide,RGP)蛋白質家族的一員。當本申請的發(fā)明人進一步將本發(fā)明付諸實施時，還指出1類可逆糖基化多肽(本文亦稱CIRGP)靶向胞間連絲并改變其傳導性。因此，如本文將進一步描述的一樣，本發(fā)明的發(fā)明人提出可逆糖基化多肽可用于調節(jié)植物病毒的擴散、改變植物形態(tài)以及用于其它商業(yè)上重要的應用中。發(fā)明概述本發(fā)明一方面提供植物細胞，該細胞包含異源多核苷酸序列，該序列能夠指導過量表達可逆糖基化多肽或其功能部分。本發(fā)明又一方面提供抗植物病毒擴散的基因修飾植物組織，該組織包含過量表達可逆糖基化多肽或其功能部分的細胞。本發(fā)明另一方面提供改變植物組織的胞間連絲傳導性的方法，該方法包括調節(jié)可逆糖基化多肽或其功能部分在植物組織細胞內的表達水平，從而改變植物組織的胞間連絲傳導性。本發(fā)明再一方面提供產(chǎn)生抵抗植物病毒擴散的植物組織的方法，該方法包括在植物組織的細胞內過量表達可逆糖基化多肽或其功能部分，從而產(chǎn)生抵抗植物病毒擴散的植物組織。根據(jù)下述本發(fā)明優(yōu)選實施方案的另一特征，異源多核苷酸是轉錄調節(jié)子，可逆糖基化多肽是內源可逆糖基化多肽。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，轉錄調節(jié)子是啟動子或增強子。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，異源多核苷酸編碼可逆糖基化多肽或其功能部分。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，可逆糖基化多肽是l類可逆糖基化多肽。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，可逆糖基化多肽由選自以下的序列編碼SEQIDNO:8、SEQIDNO:13和SEQIDNO:25-28。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，功能部分是SEQIDNO:19-24的氨基酸270至末端(aminoacids270-end)。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，植物細胞/組織形成植物組織部分或整林植物。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，植物細胞/組織或植物還包含另外的異源多核苷酸。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，另外的異源多核苷酸編碼選自以下的分子報道分子、抗病毒分子、病毒部分、除草劑抗性分子、生物性脅迫耐受分子、非生物性脅迫耐受分子、藥物分子、生長誘導分子和生長抑制分子。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，改變胞間連絲傳導性是降低胞間連絲傳導性。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，降低胞間連絲傳導性是通過增量調節(jié)細胞中可逆糖基化多肽的表達水平實現(xiàn)的。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，增量調節(jié)是通過植物組織中表達編碼可逆糖基化多肽的異源多核苷酸實現(xiàn)的，該可逆糖基化多肽與膨化多肽(bulkingpolypeptide)融合在一起。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，改變胞間連絲傳導性是增加胞間連絲傳導性。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，增加胞間連絲傳導性是通過減量調節(jié)細胞中可逆糖基化多肽的表達水平實現(xiàn)的。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，減量調節(jié)是通過與編碼可逆糖基化多肽的多核苷酸序列至少部分互補的多核苦酸實現(xiàn)的。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，植物選自番茄、馬鈴薯、黃瓜、水稻、玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥、大豆、低芥酸油茱(canola)、歐洲油菜(mpe)和棉花。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，過量表達是通過將編碼可逆糖基化多肽或其功能部分的核酸構建體導入細胞實現(xiàn)的。本發(fā)明再一方面提供具有矮化表型的基因修飾植物，該植物包含過量表達可逆糖基化多肽的細胞。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，基因修飾植物選自番癡、馬鈴薯、黃瓜、水稻、玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥、大豆、低芥酸油菜、歐洲油菜和棉花。本發(fā)明又一方面提供產(chǎn)生具有矮化表型的植物的方法，該方法包括在植物細胞內過量表達可逆糖基化多肽，從而產(chǎn)生具有矮化表型的植物。本發(fā)明另再有一方面提供防止病毒構建體向特定植物組織擴散的方法，該方法包括在特定植物組織中過量表達可逆糖基化多肽，從而防止病毒構建體向特定植物組織擴散。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，病毒構建體是表達分子的病毒表達構建體。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，特定植物組織是植物的商用部分。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，植物的商用部分選自果實、種子、塊莖、鱗莖、莖、根和花。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，所述分子選自^Jt分子、抗病毒分子、病毒部分、除草劑抗性分子、生物性脅迫耐受分子、非生物性脅迫耐受分子、藥物分子、生長誘導分子和生長抑制分子。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，特定植物組織中過量表達可逆糖基化多肽使得該分子能夠累積在特定植物組織中。本發(fā)明又一方面提供表達構建體，該表達構建體包含至少編碼可逆糖基化多肽的功能部分的第一多核苷酸序列。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，表達構建體還包含能夠指導第一多核苷酸序列在植物細胞內表達的啟動子序列。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，表達構建體還包含在翻譯時與第一多核苷酸序列融合的第二多核苷酸序列。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，編碼多肽的第二多核苷酸序列選自GUS、tdTomato(有關綜述參見WeiWenSu2005)和GUS-tdTomato融合物。本發(fā)明再一方面提供嵌合多核苷酸，該嵌合多核苷酸包含至少編碼可逆糖基化多肽的功能部分的多核苷酸序列及與之連接的異源多核普酸序列。本發(fā)明另再有一方面提供降低植物組織的胞間連絲傳導性的方法，該方法包括表達能夠靶向植物組織細胞內胞間連絲的膨化多肽，從而降低植物組織中胞間連絲的傳導性。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，膨化多肽包括胞間連絲尋靶部分。根據(jù)所述優(yōu)選實施方案的又一個特征，胞間連絲尋靶部分衍生自可逆糖基化多肽。除非另有說明，否則所有本文所用科技術語都與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常所理解的含義相同。盡管在實際當中或在本發(fā)明檢驗中，可以使用類似于或等同于本文所述的方法和材料，但是下文記載了合適的方法和材料。萬一發(fā)生抵觸，則以本專利說明書(包括定義)為準。另外，所述材料、方法和實施例僅是示例性的，而不是限制性的。附圖簡述本文僅通過實施例并參考附圖描述本發(fā)明?，F(xiàn)在具體地參考附圖細節(jié)，須強調的是，所給出的細節(jié)僅僅作為實例，是為了說明性地論述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，并且所提供的這些詳細資料是為了提供我們認為對本發(fā)明的原理和構思方面最有用和最易理解的描述。在這點上，我們沒有試圖以比基本理解本發(fā)明所必需的更為詳細的方式來說明本發(fā)明的結構細節(jié)，附圖中的說明，使本領域技術人員了解本發(fā)明的幾種形式如何具體體現(xiàn)在實施中。附圖中圖la-c是蛋白質印跡分析，說明玉米(ZwL.cv.Jublee)細胞壁組分富含SE-WAP41。從可溶性組分(s)、膜組分(m)和細胞壁組分(w)提取的蛋白質用SDS-PAGE進行分離(6昭/泳道)，電印跡轉印至硝酸纖維素膜上，用麗春紅染色(左)，與抗血清(中)或SR41抗血清(右)反應。箭頭表示41kDa。圖2a-c表示得自生長5天的黃化玉米幼苗(圖2a)中胚軸切片的SE-WAP41mRNA狹線印跡分析(圖2b)。從中胚軸上段制備RNA樣品切片I含有中胚軸分生組織和最快速的細胞生長區(qū)；切片II還含有伸長區(qū)；切片III含有成熟的不分裂和不伸長細胞。核糖體26SrRNA探針用作加樣對照(圖2c)。圖3a-b表示暴露在光照下的黃化玉米幼苗的SE-WAP41mRNA水平。圖3a-將生長5天的黃化玉米幼苗暴露在白光下3小時、6小時和24小時，或者避光保持24小時。將從中胚軸上段lcm中提取的總RNA印跡(參見圖2c)與SE-WAP41、肌動蛋白和26S-rRNA的cDNA雜交。核糖體26SrRNA探針用作加樣對照。肌動蛋白mRNA水平降低是細胞分裂停止的指標。圖3b是表示相對SE-WAP41mRNA水平的直方圖。計算各泳道相對于26S-rRNA強度的數(shù)值。圖4為序列同源性比較，表示SE-WAP41(SEQIDNO:24)、AtRGPl(SEQIDNO:19)、AtRGP2(SEQIDNO:20)、AtRGP3(SEQIDNO:21)、AtRGP4(SEQIDNO:22)和PsRGPl(SEQIDNO:23)共有高氨基酸序列同一性。用CLUSTALX(Thompson等，1997)進行比對。黑框表示相同的氨基酸，灰框表示相似的氨基酸。圖5a-b表示通過土壤桿菌(Agrobacterium)在煙草表皮細胞48hpi中瞬時表達的AtRGP2:GFP的定位。圖5a-沿細胞壁可以觀察到點狀熒光，為跨過相鄰細胞共用細胞壁的成對熒光灶(Pairedfluorescencefoci)。圖5b-顯示AtRGP2:GFP既在細胞質的熒光小體(代表高爾基體小囊泡)內，又在跨細胞壁的成對熒光灶內的數(shù)個切片圖像。比例尺=10,。圖6a-h表示轉基因煙草植物中AtRGP2:GFP和MPTMV:GFP的穩(wěn)定表達。在表達AtRGP^GFP(圖6a)和MPTMV:GFP(圖6b)的轉基因植物中，葉表皮細胞呈現(xiàn)相同的熒光模式點狀熒光跨過細胞壁，為長條形，或為成對灶，或者看似細胞壁內部的單灶。(圖6a)和(圖6b)中白框內的區(qū)域是放大的插圖。表達AtRGP2:GFP(圖6d)和MPTMV:GFP(圖6c)植物中的毛狀體-表皮界面顯示相同的熒光模式。表達AtRGP^GFP的轉基因煙草的毛狀體(圖6f)和葉肉(SM)細胞(圖6h)中，僅在細胞間接觸的細胞壁區(qū)域(黑色箭頭)檢測到熒光，無細胞間接觸的細胞壁區(qū)域(白色箭頭)則無熒光。為了強調細胞壁的劃分，用關閉熒光通道來顯示同一毛狀體(圖6e)和葉肉細胞(圖6g):黑色箭頭表示有細胞間接觸的細胞壁區(qū)域，而白色箭頭表示無細胞間接觸的細胞壁區(qū)域。SM表示葉肉細胞，而IS則表示胞間隙。比例尺=20pm。'圖7a-d表示AtRGP2:GFP和MPTMV:GFP、而不是GONST1:YFP保留在質壁分離細胞的細胞壁內。質壁分離前72小時，胞質標記DsRedl(用紅紫色表示)在葉表皮細胞中進行瞬時表達。DsRedl標記的細胞質在表達AtRGP2:GFP的轉基因植物中，在質壁分離前緊貼著細胞壁(圖7a)，在表達AtRGP2:GFP的轉基因植物(圖7b)和表達MPTMV:GFP的轉基因植物(圖7c)中，DsRedl標記的細胞質從質壁分離細胞的細胞壁上縮回。在AtRGP2:GFP(圖7b)和MPTMV:GFP(圖7c)轉基因植物中，GFP融合蛋白(用綠色表示)保留在原生質體從細胞壁連接點縮回區(qū)域的細胞壁內。相比之下，在表達GONST1:YFP的轉基因植物中，G0NST1:YFP(用黃色表示)未保留在原生質體從細胞壁連接點縮回區(qū)域的細胞壁內(圖7d)。比例尺=20pm。圖8a-c表示與高爾基體締合的蛋白質如何決定胞間連絲的去向。圖8a-存在于高爾基體腔內的蛋白質暴露在圍繞胞間連絲的細胞壁中。圖8b-跨膜區(qū)的蛋白質到達劃分胞間連絲的質膜上。圖8c-與高爾基體膜細胞溶膠一側在外周締合的蛋白質到達面向胞間連絲胞質的胞質套管的質膜內側。圖9是一系列拍攝的錄像畫面，顯示煙草表皮細胞中瞬時表達的AtRGP2:GFP的高爾基體-小嚢泡樣遷移。圖10表示W(wǎng)T和過量表達轉基因35S::AtRGP:GFP的煙草(iV,to^cwm)(NN)植物的形態(tài)差異。這里，WT是一種生長比轉基因植抹少一周的植林，但是兩者都有相同數(shù)目的葉片-也就是說它們具有相同的生理年齡。轉基因植物的節(jié)間比WT的短。圖lla-c顯示接種TMV后4天煙草(NN)葉的壞死斑。圖lla表示W(wǎng)T植抹第三葉對的葉片，顯示出數(shù)個規(guī)則的圓形病斑。圖llb表示表達35S::AtRGP2:GFP轉基因系l-6第三葉對的葉片；該葉片的病斑比WT的少，病斑形狀不規(guī)則，尺寸較小。圖llc表示模擬品處理的葉片，沒有壞死斑或任何一點損傷。圖12a-c表示接種TMV的WT煙草(NN)和表達35S::AtRGP2:GFP的轉基因NN植抹第三葉對壞死斑的數(shù)目。統(tǒng)計每片接種葉(每株植物2片葉)的病斑數(shù)目并計算平均值，對13抹WT和8抹轉基因植物的數(shù)值取平均值，并用SD表示(圖12a)。盡管病斑數(shù)存在很大的可變性，但是WT植抹的病斑數(shù)明顯多于轉基因系l-10的病斑數(shù)(圖12b)。標準誤的平均值見圖12c(P<0.05)。WT植林第二葉對的病斑數(shù)也多于第三葉對的病斑數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)。圖13a-d表示接種TMV煙草(NN)植物葉片干的壞死斑。WT植林第二葉對(圖13a)和第三葉對(圖13b)的病斑大小相同，具有圓形和清晰的邊緣；可以分辨出病斑的三個獨特區(qū)域。相比之下，表達35S::AtRGP:GFP轉基因系1-6(圖13c)和轉基因系1-10(圖13d)第三葉對的病斑與圖13a-b所示W(wǎng)T植物的病斑相比，似乎形狀略不定形，尺寸較小。轉基因植物的病斑沒有清晰的邊緣，彼此無法區(qū)分開。接種后21天，用立體顯^f敬鏡對保存在4°C下的葉片的所有病斑進行拍照。每幅照片上的虛線條紋用毫米計量。所顯示的所有病斑來自葉片背軸面，它們的形狀相同，尺寸也來自背軸面(未顯示)。圖14a-c表示接種TMV的WT和轉基因(過量表達35S::AtRGP:GFP)煙草(NN)植物的壞死斑直徑。測量3-4片接種的WT和兩個轉基因系第三葉對的壞死斑直徑，平均值用SD表示。兩個轉基因系(l-6和l-10)的平均病斑直徑小于WT植物的直徑(圖14a)。WT和兩個轉基因系之間病斑直徑的差異有統(tǒng)計顯著性(圖14b)。除標準誤外，相同的數(shù)據(jù)見圖14c(P<0.05)。圖15a-c表示AtRGP2:CFP與高爾基體標記G0NST1:YFP的共定位。用瞬時共表達AtRGP2:CFP和GONSTl:YFP的煙草葉表皮細胞的5片光學切片圖像表示共定位。AtRGP2:CFP熒光見圖15a,G0NST1:YFP熒光見圖15b,兩者的熒光(重疊)見圖15c。比例尺=20pm。光學切片取自近角質層的上周細胞質，該處沒有胞間連絲。圖15右邊緣氣孔保衛(wèi)細胞中所見熒光是自身熒光。圖16a-c表示AtRGP2:GFP與轉基因煙草胞間連絲周圍苯胺藍染色的胼胝質的共定位。AtRGP2:GFP熒光見圖16a,苯胺藍染色的胼胝質熒光見圖16b,兩者的重疊見圖16c。圖像顯示表皮細胞間細胞壁的切片。比例尺=20pm。圖17a-b表示布雷菲德菌素A(BrefeldinA)對AtRGP2:GFP標記的高爾基體和胞間連絲的作用。用BFA處理(圖17a)或用模擬品處理(圖17b)的煙草葉表皮細胞背軸側10片光學切片的圖像。比例尺=優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明涉及具有胞間連絲傳導性發(fā)生改變的植物以及產(chǎn)生該植物的方法和構建體。參照附圖和隨附說明書，可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細說明本發(fā)明至少一個實施方案之前，應該了解本發(fā)明在其可能有其它實施方案，或者能夠以各種方式實施或進行。同樣，應當理解本文所用措辭和術語是為了說明目的，不應視為限制。胞間連絲使相鄰植物細胞相互連接，促進分子通過細胞壁進行直接胞質細胞間轉運。1960年代后期，Esau及同事用電子顯微鏡術，首次證實了病毒和胞間連絲間的直接關系，之后，大量研究證實了植物病毒利用胞間連絲作為細胞間擴散的管道。在進行胞間連絲生物化學研究時，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)41kDa蛋白質(Epel等，1996),與胞間連絲的膜部分締合。如本文實施例所記載，本發(fā)明的發(fā)明人證實這種蛋白質屬于可逆糖基化多肽(RGP)蛋白質家族，這種蛋白質家族的成員能夠改變胞間連絲傳導性。因此，本發(fā)明一方面提供改變植物組織的胞間連絲傳導性的方法。本文所用術語"改變胞間連絲傳導性"是指增加或者降低胞間連絲內轉運分子或病毒的能力。如本文下面將進一步描述的一樣，本發(fā)明的發(fā)明人設計了數(shù)種改變胞間連絲傳導性的方法。該方法是通過調節(jié)植物組織細胞內可逆糖基化多肽(RGP)及其功能部分的表達水平實現(xiàn)的。本文所用術語"植物組織"是指分離的植物組織(例如葉、根、花、莖或其部分等)，或者是指形成整抹植物部分的植物組織。適用于本發(fā)明植物的實例包括但不限于番茄、馬鈴薯、黃瓜、水稻、玉米、小麥、燕麥、大麥、黑麥、大豆、低芥酸油菜、歐洲油菜和棉花。調節(jié)可逆糖基化多肽表達水平可用來增加或者降低胞間連絲傳導性。可以通過增量調節(jié)植物細胞可逆糖基化多肽的表達水平的方法，產(chǎn)生胞間連絲傳導性降低的植物組織或整林植物?？梢酝ㄟ^增量調節(jié)內源可逆糖基化多肽的表達，或者通過在植物細胞內表達外源可逆糖基化多肽或其功能部分，達到這種增量調節(jié)?？梢酝ㄟ^基因敲入法實現(xiàn)內源可逆糖基化多肽表達的增量調節(jié)。通過將強啟動子導入內源可逆糖基化多肽基因的上游，就可以誘導可逆糖基化多肽編碼基因過量表達。植物細胞基因敲入技術的有關綜述見Tzfira和White(2005)。目前優(yōu)選外源可逆糖基化多肽或其功能部分的植物內表達。表達的可逆糖基化多肽可以是例如，AtRGPl(AF013627;SEQIDNO:13)、AtRGP2(AF013628;SEQIDNO:8)、AtRGP3(AF034255;SEQIDNO:25)、AtRGP4(AF329280;SEQIDNO:26)、PsRGPl(U31565;SEQIDNO:27)和SE-WAP41(U89897;SEQIDNO:28),其它的可逆糖基化多肽見下表1?？赡嫣腔嚯牡墓δ懿糠职ㄔ诳赡嫣腔嚯牡腃端部分內，例如SEQIDNO:19-24的氨基酸270至末端(C端氨基酸)。優(yōu)選已表達的可逆糖基化多肽(或其功能部分)與膨化多肽(體積增大的多肽序列，實例見下)連接。通過在植物中表達多核苷酸序列，該序列包括至少編碼可逆糖基化多肽的功能部分的序列，該序列與編碼膨化多肽的序列(例如綠色熒光蛋白)在翻譯時融合，可以有效地降低胞間連絲傳導性。膨化多肽可引起胞質套管的尺寸減小，因此，產(chǎn)生微小屏障(nanobarrier),這與融合蛋白的大小成比例。非常大的可逆糖基化多肽融合蛋白(例如與Gus、td-tomato、td-tomato:GUS融合的可逆糖基化多肽)可以用來逐步降低胞質套管(直徑約10nm)的傳導率，只允許小分子(例如簡單糖)轉運。外源可逆糖基化多肽或其部分的表允許大到已知尺寸或斯托克半徑(Stokesradius)的分子轉運。如以下實施例部分所示，本發(fā)明的發(fā)明人首次提出，表達把向胞間連絲的膨化多肽(例如GFP)的植物細胞以降低胞間連絲傳導性為特來有效地降低胞間連絲傳導性。植物組織內源性可逆糖基化多肽(RGP)表達水平的減量調節(jié)可以用來增加胞間連絲傳導性。可以通過本發(fā)明為任何植物內源性可逆糖基化多肽設定耙標，優(yōu)選為1類可逆糖基化多肽，見下表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>可以用干擾轉錄和/或翻譯的各種分子(例如反義RNA、siRNA、核糖核酸酶或DNA核酶)，在基因組水平和/或轉錄水平上，或者在蛋白質水平(用例如抗體、切割多肽的酶等)上，減量調節(jié)內源可逆糖基化多肽的表達水平。下面是適于減量調節(jié)植物內源可逆糖基化多肽的表達水平和/或活性的非詳盡的調節(jié)物/方法。能夠減量調節(jié)內源可逆糖基化多肽的調節(jié)物的一個實例是能夠與可逆糖基化多肽表位特異性結合的抗體或抗體片段。本文所用術語"表位"是指抗原上的任何抗原決定簇，能與抗體互補位結合。表位決定簇通常由分子(例如氨基酸或糖側鏈)的化學活性表面集合組成，通常具有特殊的三維結構特征以及特殊的電荷特征。在植物內產(chǎn)生多克隆抗體和單克隆抗體及其片段的方法是本領域眾所周知的(參見例如Harlow和Lane，1988)?？梢酝ㄟ^DNA編碼片段在植物內表達來制備本發(fā)明的抗體片段。Fv片段包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)的締合。這種締合可以是非共價的，見lnbar等(1972)?；蛘?，可變鏈可以通過分子間的二硫鍵連接，或者通過化學試劑(例如戊二醛)交聯(lián)。優(yōu)選Fv片段包含通過肽接頭連接的VH鏈和VL鏈。通過構建包含編碼VH區(qū)和VL區(qū)的DNA序列的結構基因，由寡核苷酸連接該基因，來制備這些單鏈抗原結合蛋白(sFv)。將結構基因插入表達載體，隨后將載體導入植物細胞(下面將進一步描述植物可表達構建體)?？贵w片段的另一種形式是編碼單一互補決定區(qū)(CDR)的肽?？梢酝ㄟ^構建編碼目標抗體CDR的基因獲得CDR肽("最小識別單位")。例如，用聚合酶4連式反應，由抗體產(chǎn)生細胞的RNA合成可變區(qū)，來制備這種基因。參見例如Larrick和Fry(1991)。能夠減量調節(jié)植物內源可逆糖基化多肽的另一種調節(jié)物是小干擾RNA(siRNA)分子，用于RNA干擾(RNAi)過程。RNAi為兩步過程，第一步起始步驟，可能是通過dsRNA特異性核糖核普酸酶的RNA酶III家族成員切酶的作用，以依賴ATP的方式加工(切割)dsRNA(直接導入或通過轉基因或病毒)，將輸入的雙鏈(dsRNA)消化成21-23個核普酸(nt)的小干擾RNA(siRNA)。連續(xù)切割反應使RNA降解成19-21bp雙鏈體(siRNA)，每個都具有2個核苷酸3'突出端(Hutvagner和Zamore,2002和Bernstein,2001)。第二步中，稱為效應步驟，siRNA雙鏈體與核酸酶復合物結合形成RNA誘導性沉默復合物(RISC)。依賴ATP的siRNA雙鏈體解旋需要活化的RISC。然后，活化的RISC通過堿基對相互作用靶向同源轉錄物，從siRNA的3'端將mRNA切割成12個核苷酸的片段(Hutvagner和Zamore，2002;Hammond等，2001;Sharp,2001)。雖然切割機制有待闡明，但是研究表明，每個RISC都含有一種siRNA和RNA酶(Hutvagner和Zamore，2002)。由于RNAi的顯著效應，從而提示RNAi途徑中的擴增步驟。可以通過輸入dsRNA的復制產(chǎn)生較多siRNA，或者通過所形成的siRNA的復制，引起擴增?；蛘吡硗饪梢酝ㄟ^RISC的多次更新活動(multipleturnoverevent)實現(xiàn)擴增(Hammond等，2001;Sharp,2001;Hutvagner和Zamore,2002)。有關RNAi的更多信息，可參見以下綜述Tuschl(2001);Cullen(2002)和Brantl，S.(2002)。可以如下進行適用于本發(fā)明RNAi分子的合成。首先，在AUG起始密碼子下游掃描RGPmRNA序列的AA二核苦酸序列。記錄每次出現(xiàn)的AA和19個3'-相鄰核苷酸作為可能的siRNA靶位點。優(yōu)選siRNA耙位點選自可讀框(ORF)，為非翻譯區(qū)(UTR)，富含調節(jié)蛋白結合位點。UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合物可能干擾siRNA內切核酸酶復合物的結合(Tuschl,2001)。然而，應當理解的是，定向非翻譯區(qū)的siRNA也可能是有效的，如GAPDH所證實的一樣，其中定向5，UTR的siRNA介導細胞GAPDHmRNA降低約90°/。，并且蛋白質水平完全凈皮消除(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。其次，用任何序列比對軟件，例如可得自NCBI服務器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的BlastN軟件，將可能的靶位點與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(例如擬南芥、人、小鼠、大鼠等)進行比較。過濾掉與其它編碼序列有顯著同源性的推定靶位點。選擇合格的耙序列作為siRNA合成的模板。優(yōu)選的序列為包括低G/C含量的序列，如與包括G/C含量高于55%的序列相比，被證實在介導基因沉默時更有效的序列。優(yōu)選沿目標基因長度選擇數(shù)個耙位點用于評價。為了更好地評價所選擇的siRNA,優(yōu)選結合使用陰性對照。優(yōu)選陰性對照siRNA包括與siRNA相同的核苷酸組成，但與基因組缺少顯著同源性。因此，優(yōu)選使用合成siRNA核苷S吏序列，前提條件是不與任何其它基因有任何顯著同源性。合適可逆糖基化多肽定向siRNA的示例是SEQIDNO:32-33。能夠減量調節(jié)植物內源可逆糖基化多肽的另一種調節(jié)物是DNA核酶分子，它能夠特異性地切割可逆糖基化多肽的mRNA轉錄物或DNA序列。DNA核酶為單鏈多核苷酸，能夠切割單鏈和雙鏈目標序列(Breaker和Joyce,1995;Santoro和Joyce,1997)。已經(jīng)i殳計出DNA核酶的通用模型("10-23"模型)。"10-23"DNA核酶具有15個脫氧核糖核苷酸的催化結構域，兩側各與7-9個脫氧核糖核苷酸的底物識別域相接。這種類型的DNA核酶能在嘌呤:嘧啶連接點上有效地切割其底物RNA(Santoro和Joyce,1997);有關DNA核酶的綜述，可參見Khachigian,(2002)。Joyce等(美國專利第6,326,174號)公開了識別單鏈和雙鏈目標切割位點的合成工程DNA核酶的構建和擴增的實例。最近，觀察到針對人尿激酶受體的類似設計的DNA核酶抑制尿激酶受體表達，并且成功地抑制結腸癌細胞的體內轉移(Itoh，T.等，Abstract409，AmericanSocietyofGeneTherapy5thAnnualMeeting(美國基因治療協(xié)會第五屆年會第409號摘要)(www.asgt.org),2002年6月5-9日，Boston,Mass.USA)。在另一項應用中，與bcr-abl致癌基因互補的DNA核酶，在抑制白血病細胞致癌基因的表達，以及在降低慢性髓細胞性白血病(CML)和急性成淋巴細胞性白血病(ALL)病例的自體骨髓移植復發(fā)率中獲得了成功。用能夠特異性地與編碼可逆糖基化多肽的mRNA轉錄物雜交的反義多核苷酸，同樣可以實現(xiàn)植物內源可逆糖基化多肽的減量調節(jié)。在考慮對反義方法十分重要的兩個方面的同時，必需獲得能用于有效地減量調節(jié)可逆糖基化多肽的反義分子設計。第一個方面是將寡核苷酸遞送到合適細胞的細胞質中，而第二個方面是寡核苷酸的設計，該寡核苷酸在植物細胞內與規(guī)定的mRNA特異性地結合，在某種意義上抑制其翻譯。根據(jù)說明目標mRNA和寡核苷酸結構變化能量學的熱力學循環(huán)，可獲得鑒定這些與其目標mRNA具有最高預測結合親和性(highestpredictedbindingaffinity)的序列的算法(參見例如Walton等，1999)。該算法已成功地用于實施細胞的反義方法。例如，Walton等人開發(fā)出的算法使得科學家能夠成功設計出兔卩珠蛋白(RBG)和d、鼠腫瘤壞死因子-a(TNF-a)轉錄物的反義寡核苷酸。同一研究小組最近報道了細胞培養(yǎng)中，適當選擇的針對三個模型目標mRNA(人乳酸脫氫酶A、人乳酸脫氬酶B和大鼠gpl30)的寡核苷酸的反義活性，如動態(tài)PCR技術(kineticPCRtechnique)的評價一樣，證實了在幾乎所有情況下都是有效的，包括具有磷酸二酯和硫代磷酸寡核普酸化學成分的兩種細胞類型的三個不同目標的測試。另外，還發(fā)表了用體外系統(tǒng)設計和預測特異性寡核苷酸功效的幾種方法(Matveeva等，1998)。靶向RGPmRNA的合適反義寡核苷酸的示例是SEQIDNO:34-35。多項研究證實了植物細胞中反義寡核苷酸的可行性和活性[參見例如Tang等，2005;Smigocki,A.C.,Wilson,D.(2004);Sheehy等，1988]。因此，目前得到一致認同的是，上述反義
技術領域：
的最新進展，已經(jīng)產(chǎn)生了高度精確的反義設計算法和各種各樣的寡核苷酸遞送系統(tǒng)，使得普通技術人員能夠設計和實施適于減量調節(jié)已知序列表達的反義方法，而無需借助過多的嘗試實驗法。能夠減量調節(jié)植物內源可逆糖基化多肽的另一種調節(jié)物是能夠特異性地切割編碼可逆糖基化多肽的mRNA轉錄物的核糖核酸酶分子。核糖核酸酶因切割編碼目標蛋白質的mRNA而越來越多地被用于基因表達的序列特異性抑制(Welch，P.J.等(1998).ThepossibilityofdesigningribozymestocleaveanyspecifictargetRNAhasrenderedthemvaluabletoolsinbothbasicresearchandcommercialapplications(設計切割任何特定目標RNA的核糖核酸酶的可能性使之成為基礎研究和商業(yè)應用中有價值的工具)(Lutzelberger和Kjems2006))。應當理解的是，至少可逆糖基化多肽催化部分或胞間連絲締合部分的非功能性類似物，同樣可以通過顯性負調控作用，用作減量調節(jié)內源可逆糖基化多肽表達水平的調節(jié)物?？梢杂脦追N已知方法中的一種，使導入植物細胞的核酸構建體內的上述增量調節(jié)物或減量調節(jié)物的每一種進行表達。然而，應當理解的是，這些調節(jié)物中的一些(例如抗體)還可以通過例如注射，直接導入才直物細月包。用來表達本發(fā)明增量調節(jié)物或減量調節(jié)物的核酸構建體，可以是任何植物能表達構建體。合適表達載體的實例包括但不限于pCAMBIA載體(可得自CAMBIA公司)和Gateway載體(可得自Invitrogen公司)。本發(fā)明構建體所用植物啟動子可為組成型啟動子、組織特異性啟動子、誘導型啟動子或嵌合啟動子。組成型植物啟動子的實例包括但不限于CaMV35S啟動子、CaMV19S啟動子、FMV34S啟動子、甘蔗桿狀病毒(sugarcanebacilliformbadnavirus)啟動子、CsVMV啟動子、擬南芥ACT2/ACT8肌動蛋白啟動子、擬南芥泛蛋白UBQ1啟動子、大麥葉硫素BTH6啟動子和水稻肌動蛋白啟動子。組織特異性啟動子的實例包括但不限于菜豆屬菜豆蛋白貯存蛋白啟動子、DLEC啟動子、PHS啟動子、玉米醇溶蛋白貯存蛋白啟動子、大豆的羽扇豆球蛋白y啟動子、AT2S1基因啟動子、擬南芥的ACT11肌動蛋白啟動子、油菜(Srara/cawapw"的napA啟動子和馬鈴薯patatin基因啟動子。誘導型啟動子是被特殊刺激(例如病理脅迫)誘導的啟動子，包括但不限于病理脅迫中hsr203J和str246C活性物質。優(yōu)選本發(fā)明所用啟動子為強組成型啟動子，使得在植物轉化后，實現(xiàn)構建體插入片段的過量表達。有許多將核酸構建體導入單子葉植物和雙子葉植物的方法(Potrykus,I.1991;Shimamoto等，1989)。這些方法依賴于核酸構建體或其部分穩(wěn)定整合到植物基因組內，或者核酸構建體在瞬時表達的情況下，這些序列不會遺傳給植物子代。另外，存在幾種方法，可將核酸構建體直接導入含DNA細胞器(例如葉綠體)的DNA內。有兩種主要方法來實現(xiàn)將外源序列(例如包括在本發(fā)明的核酸構建體內的外源序列)的基因組穩(wěn)定地整合到植物基因組(i)土壤桿菌介導的基因轉移(Klee等1987，Klee和Rogers(I989);Gatenby,AA.(1989))。(ii)直接DNA攝取Paszkowski等，1989;包括用于原生質體直接攝取DNA的方法(Toriyama，K.等(1988))。通過對植物細胞短暫電休克(electricshock)誘導的DNA攝取(Zhang等，1988;Fromm等(1986))。通過粒子轟擊將DNA注入植物細胞或組織內(Klein等，1988;McCabe等，1988;Sanford,1990);使用微量移液管系統(tǒng)(Neuhaus等，1987;Neuhaus和Spangenberg，1990)或者通過DNA與萌發(fā)花粉直接溫育(DeWet等，1985;Ohta,1986)。土壤桿菌系統(tǒng)包括采用含有將整合到植物基因組DNA的規(guī)定DNA區(qū)段的質粒載體。植物組織的接種方法完全取決于植物品種和土壤桿菌遞送系統(tǒng)。廣泛應用的方法是葉盤法，可以用提供良好來源的引發(fā)整抹植物分化的任何組織外植體進行(Horsch等，1988)。補充方法采用土壤桿菌遞送系統(tǒng)與真空浸潤相結合。土壤桿菌系統(tǒng)尤其可用于產(chǎn)生轉基因雙子葉植物。有許多將DNA直接轉移到植物細胞內的方法。在電穿孔方法中，原生質體被短暫暴露在強電場中。在顯微注射方法中，用非常小的微量移液管將DNA機械地直接注入細胞內。在微粒轟擊方法中，使DNA吸附在微粒(例如硫酸鎂晶體、鴒顆?；蚪痤w粒)上，微粒被物理加速送入細胞或植物組織中。轉化后使植物進行繁殖。植物繁殖最常見的方法是通過種子。然而，種子繁殖再生存在不足，這是因為植物遵循孟德爾定律規(guī)定的遺傳變異，而種子是由植物產(chǎn)生的，所以農(nóng)作物因雜合性(缺乏一致性)而產(chǎn)生這種不足?；旧希苛７N子在遺傳上各不相同，每一粒都將按自身的獨特性狀生長。因此，優(yōu)選所產(chǎn)生的轉化植物，使得再生植物具有親本轉基因植物相同的性狀和特征。因此，優(yōu)選轉化植物通過微繁殖(micropropagation)再生，這使得轉化植物快速一致的繁殖。瞬時表達方法，可用于瞬時表達本發(fā)明核酸構建體內所包括的分離的核酸，包括但不限于上述顯微注射和轟擊(但是在利于瞬時表達條件下)，以及病毒介導的表達，其中包裝或未包裝重組病毒載體(包括核酸構建體)被用于感染植物組織或細胞，使得在其中建立的繁殖重組病毒能表達非病毒核酸序列。已經(jīng)被用于植物宿主轉化的病毒包括CaMV、TMV和BV。用植物病毒進行植物轉化，可參見美國專利4,855，237(BGV)、EP-A67,553(TMV)、曰本公布申請?zhí)?3-14693(TMV)、EPA194,809(BV)、EPA278,667(BV)和Gluzman，Y.等，CommunicationsinMolecularBiology:ViralVectors(分子生物學通訊病毒載體)，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork,第172-189頁(1988)。用于在許多宿主(包括植物)內表達外源DNA的假病毒顆粒參見WO87/06261。上述文獻以及Dawson等，1989;Takamatsu1987;French1986和Takamatsu1990例舉了用于導入植物中和表達非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的構建。當病毒是DNA病毒時，則可以構建成病毒本身?；蛘?，首先將病毒克隆到細菌質粒中，以易于用外源DNA構建所需病毒載體。然后從質粒上切下病毒。如果病毒是DNA病毒，則可將細菌源的復制物與病毒DNA連接在一起，然后通過細菌復制。該DNA的轉錄和翻譯將產(chǎn)生外殼蛋白，將給病毒DNA包上衣殼。如果病毒是RNA病毒，則一般將病毒克隆成為cDNA并插入質粒中。然后質粒用來進行所有的構建。通過轉錄質粒病毒序列，并翻譯病毒基因以產(chǎn)生給病毒RNA包衣殼的外殼蛋白，來產(chǎn)生RNA病毒。上述文獻以及美國專利第5,316,931號例舉了用于導入植物中和表達非病毒外源核酸序列(例如包括在本發(fā)明構建體內的核酸序列)的植物RNA病毒的構建。在一個實施方案中，提供植物病毒核酸，其中從病毒核酸中剔除天然外殼蛋白編碼序列，插入非天然植物病毒外殼蛋白編碼序列和非天然啟動子，優(yōu)選非天然外殼蛋白編碼序列的亞基因組啟動子，所述植物病毒核酸能夠在植物宿主內表達，包裝重組植物病毒核酸和確保宿主被重組植物病毒核酸系統(tǒng)性感染。或者，可以通過在外殼蛋白基因內插入非天然核酸序列，使外殼蛋白基因鈍化，從而產(chǎn)生蛋白質。重組植物病毒核酸可含有一個或多個額外的非天然亞基因組啟動子。每個非天然亞基因組啟動子能夠在植物宿主內轉錄或表達相鄰的基因或核酸序列，而且每個非天然亞基因組啟動子彼此不能夠重組，也不能與天然亞基因組啟動子重組。如果包括一個以上的核酸序列，則可以緊接天然植物病毒亞基因組啟動子或者天然和非天然植物病毒亞基因組啟動子插入非天然(外源)核酸序列。非天然核酸序列在亞基因組啟動子控制下，在宿主植物內轉錄或者表達，產(chǎn)生所需產(chǎn)物。在第二個實施方案中，提供與第一個實施方案一樣的重組植物病毒核酸，只是將天然外殼蛋白編碼序列緊接一個非天然外殼蛋白亞基因組啟動子，而不是緊接非天然外殼蛋白編碼序列插入。在第三個實施方案中，提供重組植物病毒核酸，其中天然外殼蛋白基因緊接其亞基因組啟動子，并且在病毒核酸內插入一個或多個非天然亞基因組啟動子。插入的非天然亞基因組啟動子能夠在植物宿主內轉錄或表達緊接的基因，而且不能夠彼此重組及與天然亞基因組啟動子重組。可以緊接非天然核酸序列插入非天然亞基因組植物病毒啟動子，使所述序列在亞基因組啟動子控制下，在宿主植物內轉錄或表達，產(chǎn)生所需產(chǎn)物。在第四個實施方案中，提供與第三個實施方案一樣的重組植物病毒核酸，只是天然外殼蛋白編碼序列被非天然外殼蛋白編碼序列替換。病毒載體用由重組植物病毒核酸編碼的外殼蛋白包衣殼，產(chǎn)生重組植物病毒。使用重組植物病毒核酸或重組植物病毒感染合適的宿主植物。重組植物病毒核酸能夠在宿主內復制，在宿主內進行系統(tǒng)性擴散，并在宿主內轉錄或表達外源基因(分離的核酸)，產(chǎn)生所需的蛋白質。的植物的方法和構建體。植物細胞胞間連絲傳導性的改變可用于下列情況(i)病原體抗性-通過降低胞間連絲傳導性，可以限制或隔離病毒在感染組織中擴散，因此降低病毒致病性和病毒對植物存活力的總體效果。(ii)商業(yè)上有重要用途的多肽的病毒表達-表達可逆糖基化多肽或其部分的植物，或者可逆糖基化多肽-融合蛋白可用于商業(yè)上有重要用途的分子(例如胰島素、內皮生長抑素、淋巴細胞生成素、抑蛋白酶肽)的病毒表達。胞間連絲傳導性在某種意義上受可逆糖基化多肽、可逆糖基化多肽融合蛋白或其部分的限制，使得胞間連絲能夠將由重組病毒表達的商業(yè)上有重要用途的產(chǎn)物轉運至收獲植物組織(例如果實)，同時將病毒顆粒截留在感染部位，因此，阻止病毒轉運至植物的收獲部分。(iii)改變器官大小(果實/花/塊莖等)-通過可逆糖基化多肽融合蛋白的組織特異性表達，可以改變特異性組織中胞間連絲的功能，因此影響糖的分配[參見Olesinski等，1996]。本文所用術語"約"是指土10%。根據(jù)以下實施例，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)勢和新的特征對于本領域普通技術人員是顯而易見的，這些實施例并不是限制性的。另外，本文上述的本發(fā)明各個不同的實施方案和方面，以及所附權利要求書部分所要求保護的范圍都可以在下述實施例中找到實驗支持。實施例下面參考以下實施例，并結合上述說明書，以非限制性方式對本發(fā)明進行說明。實施例11類可逆糖基化多肽((C1)RGP)改變胞間連絲傳導性方法植物材料將玉米(ZeamaysL.cv.Jublee)(RogerBros.Co.，IdahoFalls,USA)種子浸泡過夜，25。C下，在潮濕的蛭石上避光生長5天。在25。C、長曰照條件(16小時光照/8小時黑暗周期)下，將煙草(Nicotianatabacumcv.Samson和Nicotianatabacumcv.Xanthi)才直凈勿種在裝有等體禾只土;t裏和蛭石(PeckaHipperGan，Rehovot，Israel)混合物的10cm盆中。SE-WAP41的提取和孩i量測序按文獻方法(Epel等，1996)由黃化玉米幼苗中胚軸上段第一個lcm制備細胞壁組分(CW)。在fC下，將40g新鮮組織的細胞壁組分在50mlSE-緩沖液(3MNaCl，5.6%17-巰基乙醇，50mMHepespH7.4)中溫育過夜，通過離心(12,000RPM，5分鐘)從細胞壁組分中分離出鹽提取的(SE)蛋白質。然后，將沉淀的細胞壁用等體積(50ml)不含NaCl的提取緩沖液洗滌，通過上述離心法除去細胞壁，合并上清液。用100kDa超濾脫鹽和濃縮后，切斷轉運(Amicon，Millipore,Billerica,USA),蛋白質按文獻方法(Epel等，1996)進行SDS-PAGE分離。從凝膠上切取41kDa條帶(含有約ll嗎蛋白質)。在凝膠中用胰蛋白酶消化后，從凝膠中提取肽，進行RF-HPLC分離，用自動化Edman降解法(得自Eurosequence公司(Netherlands))進行微量測序。從表達文庫分離SE-WAP41由得自生長5天的黃化玉米幼苗第一片葉中胚軸分生組織的含poly(A)RNA的ZAPII(Stratagene,LaJolla,USA)構建的cDNA文庫，用按文獻方法(Epel等，1996)得到的純化S-41多克隆抗血清(1:2000稀釋)進行篩選。所用的S-41抗血清首先用A蛋白柱純化，然后用連接有細菌總蛋白的瓊脂糖凝膠4B柱純化(Harlow和Lane,1988)。使用1:4000稀釋的堿性磷酸酶連接的山羊抗兔抗體(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc.,WestGrove,PA)，在BCIP和NBT存在下，通過呈色反應，來鑒定由S-41識別的蛋白質表達噬菌斑(Sambrook等，1989)。所有DNA方法都通過標準技術進行(Sambrook等，1989)。在StratageneZAP切除方案后，將分離的噬菌體轉化成質?？寺?。在含有所有分離克隆的噬菌斑的硝酸纖維素濾膜上，與用隨機引物DNA標記試齊'J盒(BoehringerMannheim,Mannheim,Germany)中的i丈射性18標記的任意選擇的克隆cDNA,在高嚴格性條件下通過雜交對雜交組進行測定。采用簡并正向引物5，-TTYTTYCANCCWTAYCAYCT-3，(SEQIDNO:1)其中Y=A或G，W=A或T,N=A或G或C或T，及與側翼載體區(qū)序列互補的反向引物(反向T7引物5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'SEQIDNO:2)，在分離的嗟菌斑上通過PCR對克隆進行篩選。抗重組SE-WAP41抗血清的制備對于重組SE-WAP41的表達，用正向引物5，-CGAATTCATATGGCGGGCACGGTGACG-3，(SEQIDNO:3)和分別包含側翼Ndel和BamHI位點的反向引物5'-CCGGATCCTACTTTGGCCTTGCCATTTGC-3，(SEQIDNO:4)，對cDNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆到與聚His(His10SEQIDNO:5)融合的pET16(Novagen，Darmstadt,Germany)的相應位點上。將所得質粒pET16:SE-WAP41轉化到BL21(DE3)細胞內，在對數(shù)期培養(yǎng)物中用2mMIPTG處理4小時，誘導His10:SE-WAP41表達。融合蛋白用Ni-NTA-瓊脂糖微珠進行親和純化(Qiagen，Hilden,Germany),用咪唑洗脫后，再用層析法純化，結合蛋白用因子Xa(Sigma)在柱內從His尾標上切割下來。將純化蛋白與完全弗氏佐劑(DifcoLaboratories,DetroitMI,U.S.A)混合，將混合物注射到一月齡雌性NewZealand兔背部10-20個部位。隨后的四次加強注射劑用不完全弗氏佐劑制備，注射間隔四周?？扇苄约毎M分和膜細胞組分的制備對文獻方法(Yahalom等，1991)加以改進，制備和分級分離細胞提取物將從第一次勻漿得到的濾液與氮裂解轟擊法(nitrogendisruptionbomb)得到的濾液合并，于4°C離心(90，000xg)1小時。收集19上清液用于可溶性蛋白的分析。將沉淀重新懸浮于緩沖液HM/7.5(20mMTris-HClpH7.5,0.25M蔗糖，lOmMEGTA,2mMEDTA和lmM苯曱基磺酰氟[PMSF])，在相同條件下再次沉淀，用于提取膜蛋白。RNA轉錄物狹線印跡分析從黃化幼苗中胚軸的三個部位收獲植物材料，在液氮中冷凍，用TRIzol試劑(GibcoBRLLifeTechnologies,Gaithersburg，USA)，按生廠商所述方法提取總RNA。IO嗎RNA用乙醛酸處理，用1.4%瓊脂糖凝膠分離，被動地轉移到Hybond-N尼龍濾膜(Amersham)上。在含有0.26M磷酸緩沖液(pH7.2)、7%SDS、lmMEDTA、1%BSA的溶液中，與隨機引物32P標記探針進行雜交，對于SE-WAP41(含有包括3，和5，非編碼序列的全部cDNA)和玉米26S-rRNA在65。C下進行，對于大豆肌動蛋白在55。C下進行。在6rC下，濾膜依次用含有1%SDS的0.26M磷酸緩沖液(pH7.2)、含有0.1%SDS的2xSSC和含有0.1%SDS的1XSSC洗滌。26S-rRNA基因用作加樣對照。用FujiBAS1000磷光影像分析儀(phosphoimager)(Fuji，Japan)進行掃描。植物表達質粒的構建為了產(chǎn)生質粒pBinGFP、pBinDsRedl和pBinCFP，將分別含有花椰菜花葉病毒35S啟動子、Q序列增強子(SEQIDNO:6)、合成GFP(sGFP)基因(SEQIDNO:29)(Chiu等，1996)或DsRedl基因(ClontechLaboratoriesInc.)(SEQIDNO:30)或ECFP基因(ClontechLaboratoriesInc.)(SEQIDNO:3l)以及一氧化氮合酶轉錄終止子(SEQIDNO:7)的表達盒克隆到pBINPLUS(Vanengelen等，1995)的Hindlll-EcoRI位點。為了構建質粒pBinAtRGP2:GFP和pBinAtRGP2:CFP，用含有Xbal位點和EcoRI位點的正向引物205,-TCTAGAATTCATGGTTGAGCCGGCGAATACTG-3，(SEQIDNO:9)和含有Xbal位點的反向引物5，-TCTAGATACTGCTCTCAAGCTTTTGCCACTG-3'(SEQIDNO:10)，使AtRGP2基因(SEQIDNO:8)在不含終止密碼子時通過PCR進行擴增，并分別克隆到存在于pBinGFP或pBinCFP的Q增強子序列和sGFP/ECFP起始密碼子之間唯一的Xbal位點上。采用EcoRI消化以驗證AtRGP2在pBinAtRGP2:GFP和pBinAtRGP2:CFP中的方向。用5，-TCTAGAATTCATGGCGCAATTGTATTCTTCCGTG-3'(SEQIDNO:11)正向引物和5'-TCTAGAATTTTTGCCTTTTGGTGCCTCAGC-3，(SEQIDNO:12)反向引物，按相同方法構建質粒pBinAtRGP3:GFP。pBinAtRGP1:GFP的構建法相同，只是用含有AvrII位點和EcoRI位點的正向引物5'-CCTAGGAATTCATGGTTGAGCCGGCGAACAC畫3，(SEQIDNO:14)和含有AvrII位點的反向引物5，-CCTAGGAGCTTTAGTGGGTGGGTTAAGCTC-3，(SEQIDNO:15)，進行AtRGPl(SEQIDNO:13)擴增，將AvrII-AtRGPl-AvrII片段克隆到pBinGFP唯一的Xbal位點上。用5，-CCTAGGAA丁TCATGGCGGGCTACAACCTCGAAGCTATC-3'(SEQIDNO:16)正向引物和5，-CCTAGGCTTGGCCTTGACATCTTTGCCATCGCTC-3'(SEQIDNO:17)反向引物，按與pBinAtRGPl:GFP相同的方法構建質粒pBinAtRGP4:GFP。瞬時表達用土壤桿菌葉片注射法(Agrobacteriumleafinjection),誘導瞬時表達(Lavy等，2002)。用lml無針注射器，在煙草(N.tabacumcv.Samson或cv.Xanthi)葉片下表面注射帶有規(guī)定質粒的根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefacienes)菌抹GV3101。瞬時表達的觀測限于葉片下表面的表皮細胞。注射后24-48小時，檢測GFP熒光。注射后72小時一企測DsRedl焚光。煙草的穩(wěn)定轉化為了產(chǎn)生表達AtRGP2:GFP或GONSTl:YTFP的轉基因植物，用改進的葉盤法(Gallois和Marinho，1995)，通過帶有pBinAtRGP2:GFP質?；騪BinGONSTl:YPP質粒的根癌土壤桿菌菌林GV3101轉化野生型煙草(N.tabacumcv.Samson)。使葉盤與土壤桿菌溫育30分鐘，用MurashugySkoog培養(yǎng)基(含有2pg/ml細胞分裂素和0.8pg/mlIAA)洗滌，并接種到培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)。與Gallois和Marinho的培養(yǎng)基相反，生根培養(yǎng)基中不含激素。對TO植抹葉片進行分析。驕胝質染色及與AtRGP2:GFP共定位葉片切段用0.1%苯胺藍的DDW溶液和1M甘氨酸的混合物(PH=9.5，體積比分別為2:3，至少在使用前一天預混合)溫育40分鐘，使胼胝質染色。用DMRBE熒光光學顯微鏡(Leica)觀察共定位；用BP340-380nm激發(fā)光濾光片，RKP400二色鏡(dichromaticmirror)和LP425nm發(fā)射光濾光片，觀察苯胺藍染色的胼胝質焚光；用BP450-490nm激發(fā)光濾光片，RKP510二色鏡和BP515-560nm發(fā)射光濾光片，觀察AtRGP2:GFP熒光。GFP和苯胺藍單色照片用ZeissLSM5圖像瀏覽器分別轉換成紅紫色和黃色，用AdobePhotoshop7.0ME轉換成彩色圖像，分別得到白色背景的綠色圖像和藍色圖像。質壁分離將穩(wěn)定表達AtRGP2:GFP或MPTMV:GFP的葉片在30%甘油中溫育，使之發(fā)生質壁分離。將葉切片放入顯微鏡載玻片上的質壁分離溶液中固定。在發(fā)生質壁分離前72小時，通過土壤桿菌葉片注射，使DsRedl在葉片中瞬時表達。用布雷菲德菌素A處理在AtRGP2:GFP瞬時表達時，土壤桿菌注射后約22小時，在煙草葉片背軸面主脈一側注射50嗎/mlBFA的0.1%DMSO溶液，主脈相對的一側則是注射0.1%DMSO的模擬品。用lml無針注射器進行注射，以便完全注滿表皮下的胞間隙。沿側脈軸(baso-petalaxis)，切取位于兩側與主脈距離相等，面積相同的葉^殳，用共焦顯樣i術4企測。在BFA/DMSO注射后2-5小時(土壤桿菌注射后24-27小時)，用CLSM對穿過葉表皮細胞厚0.9nm的光學切片進行掃描。被拍照的細胞不包括毛狀體基部的大細胞，也不包括緊接氣孔保衛(wèi)細胞的小細胞。用4林植物的共4片葉，重復實驗兩次。在IO個BFA處理細胞和10個模擬品處理細胞中，統(tǒng)計熒光標記的胞間連絲。在5個連續(xù)光學切片(表示接近中層細胞)中，對每個細胞中熒光標記的胞間連絲總數(shù)進行計數(shù)。熒光共焦顯孩吏術熒光共焦顯微術用ZeissR510共焦激光掃描顯微鏡進行。用設置為488nm的氬激光器進行GFP激發(fā)，用525nm士20nmBP-濾光片組合檢測發(fā)射。用設置為458nm的氬激光器進行CFP激發(fā)，用500nm土25nmBP-濾光片檢測發(fā)射。對于CFP如果使用YFP,則用設置為514nm的氬激光器進行YFP激發(fā)，用550nm土20nmBP-濾光片組合檢測發(fā)射。對于DsRedl如果使用YFP,則用設置為488nm的氬激光器進行YFP激發(fā)，用525nm士20nmBP-濾光片組合檢測發(fā)射。不同的YFP條件用來防止熒光通道之間的滲透(bleed-through)。用設置為543nm的氦-氖激光器進行DsRedl激發(fā)，用587.5nm士27.5nmBP濾光片^f企測發(fā)射。為了暴露葉肉以便成像，用手撕開葉片，以便撕開葉片切段下表面的表皮。用ZeissLSM-5圖像瀏覽器進行圖像分析。結果SE-WAP41是可逆糖基化多肽蛋白本發(fā)明的發(fā)明人之前曾公開了S-41免疫標記的胞間連絲和高爾基體(Epel等，1996)。因為該抗血清是針對SDS-PAGE凝膠的蛋白質條帶產(chǎn)生的，所以可識別可能存在于條帶中的不止一種蛋白質。此外，該抗血清與另外兩種蛋白質發(fā)生交叉反應。為了在分子水平表征一種或多種被靶向胞間連絲的S-41識別的蛋白質，采用組合的實驗方法。一種方法中，利用S-41篩選用mRNA產(chǎn)生的表達文庫，mRNA得自生長5天的玉米幼苗分生組織。篩選約4.3xl()S噬斑形成單位得到40個被S-41識別的克隆。雜交實驗顯示，分離克隆代表兩個稱為Hl和H2的雜交組，分別含有19個和21個克隆，表明S-41從表達文庫中鑒定出兩個獨特的蛋白質。平行地，對S-41識別的純化SE-WAP41，即鹽可提取的41kDa細胞壁締合蛋白質(Epel等，1996)進行微量測序，得到25個氨基酸長的序列NLDFLGMWRPFFQPYHLIIVQDGDP(SEQIDNO:18)。根據(jù)該序列合成簡并引物，以鑒定編碼SE-WAP41內部序列的分離克隆。在PCR反應中，簡并引物與得自文庫載體序列的反向引物結合使用，以鑒定之前采用S-41抗血清分離的克隆，該序列編碼含有測序肽的蛋白質。鑒定出多個克隆，全都屬于H1雜交組，證實了該雜交組編碼SE-WAP41蛋白。用與插入片段兩側的載體序列互補的引物，通過另外的PCR反應，測定屬于H1的各個克隆的插入片段長度，對具有最長插入片段的克隆進行測序。插入片段的可讀框編碼含有364個氨基酸的蛋白質，質量計算值為41,038道爾頓，與41kDa細胞壁締合蛋白質匹配。預計基因產(chǎn)物含有之前通過SE-WAP41微量測序所獲得的內部序列，證實了所述克隆編碼SE-WAP41。將編碼SE-WAP41蛋白的玉米基因序列存入EMBL和NCBI數(shù)據(jù)庫(檢索號U89897)。與可逆糖基化多肽蛋白質家族成員6SE-WAP41(pfam03214)的高序列同源性，導致將SE-WAP41注釋為可逆糖基化多肽蛋白質。對H2雜交組的代表進行測序，發(fā)現(xiàn)其編碼醛縮酶蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。用針對重組SE-WAP41產(chǎn)生的抗血清僅僅鑒定出細胞壁組分中含量極高的41kDa蛋白質。用大腸桿菌(E.coli)表達的SE-WAP41作為his尾標融合物來免疫兔。從一只兔中獲得抗血清，稱為SR-41,在蛋白質印跡分析中，對純化重組蛋白表現(xiàn)出良好的免疫原性活性。對得自可溶組分、膜組分和細胞壁組分的SR-41蛋白質進行蛋白質印跡分析證實，與膜組分和可溶組分相比，細胞壁組分中SE-WAP41極其豐富(圖la-c)，膜組分和可溶組分的標記較弱，這提示SE-WAP41與這些組分的締合水平較低。該蛋白質印跡分析還證實SR-41抗血清識別41kDa蛋白質(圖lb)，但不識別S-41標記的其它主要條帶(圖lc)。SE-WAP41mRNA表達水平在分生組織和伸長組織中最高簡單初生胞間連絲和次生胞間連絲的形成及其成為分支胞間連絲的變化主要發(fā)生在分生組織及擴展組織和/或伸長組織中(Ehlers和Kollmann，2001;Roberts和Oparka，2003)。如果SE-WAP41是胞間連絲締合蛋白質(Pdassociatedprotein)，則預期在黃化玉米幼苗中其表達在中胚軸節(jié)中應當最高，中胚軸是分生組織，該區(qū)正好在節(jié)的下方1-2厘米，是細胞進行強烈伸長的區(qū)域。因此，沿中胚軸發(fā)育梯度，對長為1cm的各4爻進行SE-WAP41mRNA表達水平的比較。用SE-WAP41cDNA探針的RNA印跡分析顯示，SE-WAP41轉錄水平在含有中胚軸節(jié)的區(qū)段最高，細胞擴展最強，轉錄水平并沿中胚軸發(fā)育梯度降低(圖2a-c)。在第二個實驗系統(tǒng)中，進一步檢測了細胞分裂與mRNA表達水平的相關性。將黃化幼苗暴露在光下引起中胚軸分生組織停止細胞分裂(Iino，1982;Yahalom等，1987)。黃化幼苗暴露在光下后，在不同時間，用RNA印跡分析檢測玉米中胚軸的SE-WAP41mRNA表達水平。暴露在光下后，3小時后SE-WAP41mRNA水平降低2倍，6小時后降低3.5倍，24小時后降低10倍(圖3b)。肌動蛋白mRNA水平顯示出類似的降低(圖3a)，表示細胞分裂停止。瞬時表達的AtRGP:GFP與胞間連絲和高爾基體小嚢泡締合用擬南芥基因進行了進一步研究，因為擬南芥基因組已被完整測序并注明了可讀框。擬南芥基因組編碼稱為AtRGPl、AtRGP2、AtRGP3和AtRGP4的四個同源基因(分別為SEQIDNO:19-21),這些基因屬于1類可逆糖基化蛋白(C1RGP)。這些擬南齊蛋白質與SE-WAP41呈高度的氨基酸序列同一性(圖4)。氨基酸序列分析(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)顯示，AtRGP2與SE-WAP41最為同源，共享87%氨基酸序列同一性。使AtRGP2編碼序列與GFP編碼序列融合，AtRGP2:GFP嵌合體用土壤桿菌葉片注射法，在煙草葉表皮細胞中進行瞬時表達。共焦顯微術在側表皮細胞的幾個獨特位點顯示出熒光。在細胞壁的相對一側檢測到點狀成對的熒光灶-與是胞間連絲締合蛋白質的AtRGP2的模式一致(圖5a-b)。還觀察到整個細胞質中成小熒光灶的熒光(圖5b)，小熒光灶通過液泡在整個細胞質中和沿胞質絲快速移動，某種程序上有高爾基體小嚢泡的特征(圖9)。將PsRGPl，一種與SE—WAP41和AtRGP蛋白共享高序列同一性的C1RGP(圖4)免疫定位到反面高爾基體(Dhugga等，1997):這支持AtRGP2:GFP移動灶代表高爾基體的推測。為了驗證移動灶的確是高爾基體，使用與黃色熒光蛋白(YellowFluorescenceprotein)融合的高爾基體核普酸糖轉運蛋白1(GolgiNucleotideSugarTransporter1,GenBank檢索號NM—l79621)(GONSTl:YFP),已經(jīng)證實黃色焚光蛋白能標記高爾基體(Baldwin等，2001)。AtRGP2當與青色熒光蛋白(CyanFluorescenceProtein)融合(AtRGP2:CFP)并與GONSTl:YFP共表達時，顯然與GONSTl:YFP共定位(圖15a-c)。細胞內大的無定形區(qū)域和細胞核內小區(qū)域內也可觀察到熒光(數(shù)據(jù)未顯示)，無定形區(qū)域顯然代表在瞬時表達時，由細胞內產(chǎn)生的大量AtRGP2:GFP所產(chǎn)生的包含體。為了檢測胞間連絲締合是否是CIRGP的普遍特性，構建AtRGPl:GFP、AtRGP3:GFP和AtRGP4:GFP，并在煙草葉表皮細胞中進行瞬時表達。這些融合蛋白顯示熒光模式在所有方面都與AtRGP2:GFP所表現(xiàn)的模式相同(數(shù)據(jù)未顯示)，只是AtRGPl:GFP熒光水平低得多。這些熒光模式與是胞間連絲締令蛋白的AtRGPl、AtRGP3和AtRGP4的一致。所4企測的所有4個擬南芥可逆糖基化多肽蛋白的觀測結果看來都與胞間連絲締合，表明胞間連絲締合是C1RGP成員的普遍特性。^!定表達的AtRGP2:GFP與胞間連絲締合產(chǎn)生在花椰菜花葉病毒35S啟動子控制下，組成型表達AtRGP2:GFP融合物的轉基因煙草植物。這些植物中，AtRGP2:GFP熒光定位于細胞壁內的點狀熒光灶(圖6a)。該模式類似于組成型表達已知胞間連絲標記煙草花葉病毒移動蛋白的GFP融合物(MPTMV:GFP)的轉基因煙草植物代表的模式(圖6b)。毛狀體基部的細胞壁尤其富含胞間連絲。表達轉基因MPTMV:GFP的煙草植物顯示特有的密集點狀模式，其中這些胞間連絲是熒光標記的(圖6c)。表達轉基因AtRGP2:GFP的植物表示出相同模式(圖6d)，支持AtRGP2位于胞間連絲的結論。AtRGP2:GFP熒光僅見于含有胞間連絲、兩個細胞接觸的細胞壁區(qū)域，而沒有胞間連絲的細胞壁區(qū)域是未標記的，與毛狀體細胞和葉肉細胞表現(xiàn)的一樣。煙草毛狀體為毛狀結構，從表皮表面突出出來，由單行的數(shù)個細胞組成(圖6e)。因此，煙草毛狀體細胞既具有含有胞間連絲的細胞壁，這些細胞壁將兩個細胞分隔開來，又具有側邊細胞壁，這些細胞壁僅與毛狀體周圍的空間接觸，沒有胞間連絲。葉肉細胞(圖6g)，同樣具有無細胞間接觸的區(qū)域，其中細胞壁面向胞間隙并且沒有胞間連絲，還具有細胞間接觸區(qū)域，其中細胞壁含有胞間連絲。在毛狀體細胞(圖6f)和葉肉細胞(圖6h)中，僅在細胞間有接觸的細胞壁區(qū)域檢測到熒光。細胞壁的這種區(qū)別性標記進一步表明，AtRGP2與胞間連絲締合，或者與圍繞胞間連絲的細胞壁鞘(wallsheath)締合。為了驗證細胞壁內的點狀熒光灶的確代表胞間連絲，采用苯胺藍染色的胼胝質。胼胝質已廣泛用作胞間連絲標記(Baluska等，1999;Gorshkova等，2003和Bayer等，2004)。當表達AtRGP2:GFP的轉基因煙草葉片用苯胺藍染色時，明顯與苯胺藍染色胼胝質共定位的AtRGP2:GFP(圖16a-c),存在于胞間連絲周圍。不表達GFP的野生型煙草，當用苯胺藍染色，并在GFP條件下拍照時，顯示沒有熒光標記的胞間連絲(數(shù)據(jù)未顯示)。同樣，表達轉基因AtRGP2:GFP的轉基因煙草不用苯胺藍染色，但在苯胺藍條件下拍照時，也顯示沒有熒光標記的胞間連絲(數(shù)據(jù)未顯示)。這些陰性對照實驗證實，共定位不是GFP與苯胺藍通道之間熒光滲透的結果。成熟的煙草組織中，在流動體(mobilebodies)中未檢測到AtRGP2:GFP熒光，可能是在穩(wěn)定表達過程中存在的穩(wěn)態(tài)水平較低所致。AtRGP2:GFP保留在質壁分離細胞的細胞壁內葉片細胞的質壁分離引起細胞原生質體皺縮，以及質膜從細胞壁縮回，保留的胞間連絲嵌入到細胞壁中(Turner等，1994)。為了了解AtRGP2與胞間連絲的締合，在表達轉基因AtRGP2:GFP煙草植物的葉片中誘導質壁分離。使用熒光染料DsRedl(—種胞質標記)，在質壁分離過程中更好的顯現(xiàn)縮回的細胞質和質膜。在穩(wěn)定表達AtRGP2:GFP的轉基因煙草植物的葉表皮細胞內瞬時表達DsRedl,然后使細胞質壁分離，從而對這些細胞的細胞質進行標記(圖7a)。質壁分離后，AtRGP2:GFP熒光明顯保留在細胞質開始與兩側細胞壁分離的細胞壁區(qū)域內(圖7b)。該結果證實，點狀部位不在周細胞質內，也不是質膜締合的，但卻嵌入細胞壁。這與在質壁分離的穩(wěn)定表達MPTMV:GFP的轉基因煙草植物中得到的結果類似(圖7c)。為了檢測任何穩(wěn)定表達的高爾基體定位GFP融合蛋白是否與胞間連絲締合，產(chǎn)生G0NST1:YFP表達轉基因煙草植物。當這些植物發(fā)生質壁分離時，無熒光保留在細胞壁內(圖7d)。布雷菲德菌素A抑制用AtRGP2:GFP標記胞間連絲AtRGPGFP融合物既存在于胞間連絲內又存在于高爾基體內，引導本發(fā)明的發(fā)明人假設，URGP通過高爾基體遞送到胞間連絲。布雷菲德菌素A(BFA),—種高爾基體的破裂劑(有關綜述見Nebenftihr等，2002)，被用來檢驗該假設。在AtRGP2:GFP的瞬時表達過程中，用BFA處理的煙草葉片表皮細胞與未用BFA處理的細胞進行比較。BFA處理細胞顯示熒光標記的高爾基體的數(shù)量減少(圖17a-b)。統(tǒng)計5個連續(xù)的代表每個細胞中層的共焦切片的熒光標記灶，熒光標記灶在相距太近以致于不能個別分辨出來的紋孔場中含有標記的胞間連絲或胞間連絲束。平均起來，BFA處理細胞呈現(xiàn)24.4±2.95焚光標記的胞間連絲，而模擬品處理細胞呈現(xiàn)77.3士10.85焚光標記的胞間連絲。因此，當與未用BFA處理的細胞相比時，BFA處理細胞顯示，焚光標記的胞間連絲的平均數(shù)目減少約3倍。成對樣品T檢驗顯示，結果具有顯著性差異PO.OOl。在破壞高爾基體的BFA存在下，AtRGP2:GFP標記的胞間連絲數(shù)目較低的事實，結合AtRGP的GFP融合物標記高爾基體的觀測結果，證實aRGP在到達胞間連絲前要通過高爾基體。實施例2與綠色熒光蛋白融合的胞間連絲締合蛋白AtRGP2的過量表達削弱轉基因煙草植物中煙草花葉病毒在細胞間的擴散本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)指出，擬南芥的1類可逆糖基化多肽((C1)RGP)是胞間連絲締合蛋白，通過高爾基體遞送至胞間連絲(Pd)(Sagi等，2005)。發(fā)明人還提供和分析了各種數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明該蛋白質是一種靶向內胞間連絲質膜的外高爾基體的外周締合膜(outerGolgiperipherally-associatedmembrane)(Sagi等,2005)。為了檢驗1類可逆糖基化多肽阻斷胞間連絲傳導的假設，給WT(NN)植物接種煙草花葉病毒(TMV)。在該煙草品系中，可以復制和在細胞間擴散的TMV病毒將引起超敏反應(HR),這可用于病毒感染性和擴散的定量和定性分析。材料與方法在以下相同物理條件下，使煙草(TV.toZacwwcvXanthi)(NN)植物，WT和兩個獨立的轉基因系(對于35S::AtRGP2:GFP是純合的)生長，并接種煙草花葉病毒(TMV):溫度23。C,短日照外界(溫室)光照條件，每日澆水。由于轉基因系特定的發(fā)育延遲，因此在WT和轉基因植物的相同生理年齡(4-5對葉)時接種(圖1)。在WT植物萌發(fā)后生長2個月時接種，而轉基因植物在萌發(fā)后生長2.5個月時接種。純合轉基因植物表現(xiàn)出矮化形態(tài)。用免疫純化的完整TMV顆粒進行(母液濃度lmg/ml)接種。該母液溶液用0.05M磷酸鈉緩沖液(pH-7)進一步稀釋成最終工作濃度10ng/ml(接種物)。選擇第二、第三和/或第四對完全發(fā)育成熟的葉片用于接種。每抹植物用病毒接種不超過4片葉。采用WT和轉基因相對應的葉對接種，葉片尺寸大致相同。接種方法如下將金剛砂(320粗砂)均勻撒在整個近軸葉表面上，然后將150(1lTMV接種物液滴(10ng/ml)沿中脈接種，在葉表面上摩擦，30-60秒鐘后，用自來水簡單沖洗。對照(模擬品)用相同體積但僅磷酸鈉緩沖液的溶液接種。接種后4天，收獲葉片，保存在4t:下。對葉片進行拍照，統(tǒng)計壞死斑數(shù)目。另測量WT和轉基因系的病斑直徑，在立體顯微鏡下拍照。結果給WT(13林)和轉基因植物(每系8抹)接種TMV。接種后4天(dpi)在WT和轉基因植物中，壞死斑清晰可見。WT每片葉的病斑數(shù)比過量表達AtRGP2:GFP的轉基因植物的多(圖1la-c和12a-c)。雖然WT和轉基因系葉片之間的病斑數(shù)目可變性大，但是壞死斑數(shù)目間的差異(圖12a-c)及其大小和形狀的差異(圖13a-d)仍清晰可見。WT和轉基因系l-10之間的差異有統(tǒng)計顯箸性(圖12b)。病斑的形狀和大小在WT和轉基因植物之間存在差異(圖13a-d和14a-c)。WT植物中壞死斑直徑比兩個轉基因系(圖14a)的大，而且這種差異有統(tǒng)計顯著性(圖14b)。病斑數(shù)的可變性可能是由于金鋼砂覆蓋葉表面不均勻和/或接種時對葉片的壓力不相等所致。然而，壞死斑的形狀和大小在WT和轉基因植物之間明顯不同。WT植物具有特征性的圓形大病斑，有清晰的邊緣，可以分辨出三個獨特區(qū)域(圖13a-b)。兩個轉基因系上的病斑尺寸較小，形狀不規(guī)則，不如WT—樣圓，有不清楚的彌散邊緣(圖13c-d)。WT植物第二對葉片上病斑的直徑比第三對葉的大，數(shù)量也比第三對葉的多(圖14a-c)。這是因為第二片葉發(fā)育時間長，比第三片葉大。因此，僅可比較WT和轉基因植物中大小大致相同的第三對葉片(圖12a-c和14a-c)。結論本研究公開了基因的克隆和測序，所述基因編碼屬于可逆糖基化多肽蛋白質家族pfam03214的蛋白質[TheConservedDomainArchitectureRetrievalTool(CDART)]。RGPpfam03214是高度保守的植物特異性蛋白質家族，存在于單子葉植物(Gupta等，2000;Langeveld等，2002)和雙子葉植物(Dhugga等，1997;Delgado等，1998;Bocca等，1999;Zhao和Liu,2002)中。該家族的成員在UDP-葡萄糖、UDP畫木糖和UDP-半乳糖存在下進行可逆的自身糖基化(Dhugga等，1991;Dhugga等，1997;Delgado等，1998);糖基化發(fā)生在Arg殘基上(Singh等，1995)。疏水簇分析提示可逆糖基化多肽可能是糖基轉移酶(glycotransferases)(Saxena和Brown,1999)?？赡嫣腔嚯谋环譃閮深?，本文稱為C1RGP和C2RGP。有研究提示，C2RGP的成員類似于加工糖基轉移酶，它含有兩個保守域，稱為A域和B域(Langeveld等，2002)。有研究提示，根據(jù)結構分析，SE-WAP41所屬C1RGP的成員為非加工糖基轉移酶，因為它們具有A域，但缺乏以加工糖基轉移酶為特征的B域(Saxena和Brown，1999)。最新數(shù)據(jù)提示該家族的成員，特別是C1RGP成員，可能起到UDP-糖載體的作用，導致假設它們在將UDP-糖從細胞質遞送到高爾基體膜上的轉運蛋白中發(fā)揮作用(Faik等，2000;Porchia等，2002),在高爾基體膜上，跨膜-糖基轉移酶12在將UDP-糖轉運到高爾基體腔內時發(fā)揮作用。然而，沒有提出C1RGP可由高爾基體轉運到胞間連絲，并摻入胞間連絲中的可能性。本研究的結論是，C1RGP是胞間連絲締合蛋白。細胞組分的分級分離實驗顯示，含有胞間連絲的細胞壁組分中富含SE-WAP41。穩(wěn)定表達AtRGP2:GFP，或者瞬時表達AtRGPl:GFP、AtRGP2:GFP、AtRGP3:GFP和AtRGP4:GFP的煙草表皮細胞的共焦顯微鏡術顯示，細胞壁相對兩側成對熒光灶的焚光模式類似于表達已知胞間連絲標記MPTMV:GFP的煙草細胞所表現(xiàn)的焚光模式。此外，表達轉基因AtRGP2:GFP的煙草中，毛狀體和葉肉細胞的共焦顯微術顯示，熒光灶僅存在于含有胞間連絲的細胞壁內，沒有胞間連絲的細胞壁內則不存在。存在于胞間連絲周圍的苯胺藍-染色胼胝質與細胞壁內的AtRGP2:GFP熒光灶共定位證實，這些AtRGP2:GFP灶代表了胞間連絲。質壁分離實驗提供了進一步的支持。在質壁分離過程中，質膜隨細胞質從細胞壁上脫離而縮回，但是嵌入細胞壁的胞間連絲則保持不動(Tumer等，1994)。AtRGP2:GFP熒光保留在發(fā)生質壁分離表皮細胞的細胞壁內，甚至保留在從細胞壁兩側開始分離的細胞質區(qū)域內，該事實表明這些蛋白質是胞間連絲締合的。GONSTl:YFP,另一種高爾基體定位熒光融合蛋白，當在轉基因煙草中穩(wěn)定表達時，不與胞間連絲締合，正如質壁分離所證實的一樣，該事實表明與胞間連絲締合對aRGP是特異性，通過與任何高爾基體定位的熒光融合蛋白共有的某些默認途徑(defaultpathway)是不會發(fā)生的。因為胞間連絲合成主要發(fā)生在分生組織和生長組織中，所以預期C1RGP合成和與高爾基體締合將發(fā)生在這些區(qū)域內。實際上，RNA印跡分析證實了這種相關性，在進行細胞分裂和伸長的區(qū)域內測得較高的SE-WAP41mRNA水平。所有擬南芥C1RGP蛋白質似乎是胞間連絲締合的事實，提示與胞間連絲締合可能是C1RGP的普遍特性。有證據(jù)提示高爾基體起載體作用，由它將C1RGP遞送到胞間連絲中，因為PsRGPl曾被免疫定位到反面高爾基體上(Dhugga等，1997)，擬南芥細胞懸液組分的分級分離數(shù)據(jù)表明，AtRGPl定位在高爾基體上(Delgado等，1998)。AtRGP2:GFP的瞬時表達顯示，該熒光融合蛋白與流動體，即在細胞質內流動的高爾基體小嚢泡締合。通過AtRGP2:CFP與已知高爾基體標記GONSTl:YFP共定位，來證實這些流動體是高爾基體小嚢泡。在瞬時表達過程中，高爾基體破裂藥(disruptingdrug)BFA大大減少在整個細胞溶膠中所見的AtRGP2:GFP灶的數(shù)目，該事實進一步支持這些灶代表高爾基體小嚢泡的結論。最重要的是，在高爾基體破裂劑BFA存在下，通過瞬時表達AtRGP2:GFP標記的胞間連絲減少約三倍，這證實了穿過高爾基體是AtGRP2:GFP靶向胞間連絲所必需的。由于已知高爾基體小囊泡參與初生胞間連絲和次生胞間連絲的形成，故認為高爾基體用作將C1RGP遞送至胞間連絲的載體。在高爾基體內與胞間連絲內，AtRGP2:GFP水平之間的顯著性差異很可能是因為AtRGP2:GFP在胞間連絲內永久性累積，而在高爾基體中，蛋白質在轉運中，通過高爾基體網(wǎng)絡從合成位點穿梭到達胞間連絲的最終目的地。在瞬時表達過程中，細胞在非常短的時間內，異常地產(chǎn)生非常大量的AtRGP2:GFP，使得其能夠作為與高爾基體締合的熒光進行檢測。不同細胞組分的蛋白質印跡，不僅在膜組分和細胞壁組分中檢測到C1RGP，而且還在可溶組分中檢測到C1RGP。然而，免疫金電子顯微鏡術檢測發(fā)現(xiàn)，除與高爾基體締合外，幾乎沒有細胞溶膠性的可逆糖基化多肽(Epel等，1996;Dhugga等，1997)。高爾基體締合蛋白質可存在于高爾基體腔內，具有穿過高爾基體膜的跨膜區(qū)，或者可在外周與高爾基體膜的細胞溶膠側連接。對于通過高爾基體d、嚢泡遞送到胞間連絲的蛋白質，這些可能性的一種都可能導致蛋白質到達胞間連絲內的不同目的地。如果高爾基體小嚢泡與質膜融合，則它們的腔外溢到細胞壁內，而它們的細胞溶膠側則面向細胞溶膠。因此，存在于高爾基體腔內的蛋白質可能外運到圍繞著胞間連絲的細胞壁內(圖8a),而具有跨膜區(qū)的蛋白質則可能變成具有面向暴露在質外體域的高爾基體腔的胞間連絲質膜內在蛋白(圖8b)，在外周與高爾基體膜的細胞溶膠側締合的蛋白質可能達到面向胞間連絲胞質套管的質膜內側(圖8c)。目前的生物信息數(shù)據(jù)(http:〃smart.embl-heidelberg.de/和http:〃psort.nibb.ac.jp)及生4匕凄t才居表明豌豆、玉米和擬南芥C1RGP在外周與外高爾基體膜締合(Dhugga等，1991;Epel等，1996;Dhugga等，1997;Delgado等，1998)。因此，非常有可能在高爾基體與胞間連絲質膜融合時，或者在胞間連絲附近，C1RGP可與面向胞間連絲胞質套管的質膜連接。不論其功能都清楚的是，RGP,特別是C1RGP被轉運到胞間連絲。對于這類蛋白質的所有成員而言都是事實，因為，正如本文所述，本文所用的所有AtRGP蛋白質當在煙草中表達時，都精確地靶向胞間連絲。因此可以斷定，負責C1RGP靶向胞間連絲的信號和將它們遞送到胞間連絲的機制都是普遍且是不依賴于品種的。用病毒擴散模型和表型觀察法，檢測C1RPG在植物中的功能，特別是在胞間連絲中的功能。對于將發(fā)生的超壽文反應，在感染植物細胞中進行最初復制后，病毒必會復制并擴散到最少數(shù)目的細胞內。本發(fā)明轉基因植物中，壞死斑數(shù)目減少以及病斑尺寸減小，表明C1RPG改變了胞間連絲傳導性，因此抑制病毒顆粒通過胞間連絲的最初擴散。這種抑制導致與轉基因植物的WT植物相比，轉基因植物中所觀察到的壞死斑減少。另外，本發(fā)明的轉基因植物在高度和節(jié)間長度上，也可從表型上與WT植物區(qū)分開來。因此，本發(fā)明提供轉基因植物，該轉基因植物能夠使病毒感染局部化，并且具有有商業(yè)價值的表型。應當了解的是，為了清楚起見在不同的實施方案內容中加以描述的本發(fā)明的某些特征，同樣也可合并起來在一個實施方案中提供。相反，為簡明起見在一個實施方案內容中加以描述的本發(fā)明的各種特征，同樣也可單獨或以任何合適的再合并方式予以提供。盡管本發(fā)明結合其具體的實施方案加以描述，但是明顯的是許多替換、修改和變化對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，本發(fā)明包括所有落入所附權利要求書精神和大范圍中的這些替換、修改和變動。本說明書所提及的所有出版物、專利、專利申請和GenBank檢索號都通過引用全部結合到本說明書中，其程度與每個獨立出版物、專利、專利申請和GenBank才企索號具體而單獨指明通過引用結合到本文中一樣。另外，在本申請任何參考文獻的引用或標示都不得解釋為參考文獻Baldwin,T,C.，Handford，M.G.,Yuseff，M丄，Orellana,A.和Dupree,P.(2001).IdentificationandcharacterizationofGONSTl，aGolgi-localizedGDP隱mannosetransporterinArabidopsis(擬南芥中高爾基體定位的GDP-甘露糖轉運蛋白GONSTl的鑒定與表征)。PlantCell13,2283-2295。Baluska,F.，Samaj,J"Napier,R.和Volkmann,D.(1999).Maizecalreticulinlocalizespreferentiallytoplasmodesmatainrootapex(玉米4丐網(wǎng)蛋白優(yōu)先定位于根端胞間連絲)。PlanU19,481-488。Bayer，E.，Thomas,C丄.和Maule,A丄(2004).PlasmodesmatainArabidopsisthalianasuspensioncells(擬南芥懸液細胞中的胞間連絲)。Protoplasma223，93-102。Beachy，R.N,和Heinlein，M.(2000).RoleofP30inreplicationandspreadofTMV(P30在TMV復制與擴散中的作用)。Traffic1，540-544。Bernstein,E.(2001).RoleforabidentateribonucleaseintheinitiationstepofRNAinterference(二齒型核糖核酸酶在RNA干擾起始步驟中的作用)。Nature363-366。Bocca，S.N.，Kissen,R.，Rojas-Beltran，J.A.，Noel，F(xiàn).,Gebhardt，C.，Moreno,S.，duJardin,P.禾口Tandecarz,J.S.(1999)，MolecularcloningandcharacterizationoftheenzymeUDP-glucose:proteintransglucosylasefrompotato(馬鈴薯的UDP-葡萄糖:蛋白質轉葡糖基酶的分子克隆與表征)。PlantPhysiologyandBiochemistry37，809-819。Botha,C.E丄,Hartley,B丄和Cross,R.H.M.(1993).TheUltrastmctureandComputer-EnhancedDigitalImage-AnalysisofPlasmodesmataattheKranzMesophyll-BundleSheathInterfaceofThemeda-TriandraVarImberbis(Retz)Camus,A.InConventionally-FixedLeafBlades(Themeda-TriandraVarImberbis(Retz)Camus，A的常規(guī)固定葉片中，克蘭茨葉肉-維管束鞘界面胞間連絲的超微結構與計算機放大數(shù)碼圖像分析)。AnnBot-London72,255-261。Brantl,S.(2002).Antisense-RNAregulationandRNAinterference(反義RNA調節(jié)和RNA干擾)。BiochimBiophysActa1575,15-25。Breaker,R.R.禾口Joyce,G.F.(1995).ADNAenzymewithMg2+-dependentRNAphosphoesteraseactivity(具有依賴Mg"的RNA石粦酸酯酶活性的DNA酶)。CurrBiol2，655-660。Chiu，W.L,Niwa,Y.，Zeng,W.,Hirano,T.，Kobayashi,H,和Sheen,J.(1996).EngineeredGFPasavitalreporterinplants(才直物中作為重要凈艮道分子的工程GFP)。Curr.Biol.6,325-330。Citovsky,V.和Zambryski，P.(2000).SystemictransportofRNAinplants(RNA在植物中的系統(tǒng)性轉運)。TrendsPlantSci.5,52-54。Cullen，B.R.(2002).RNAinterference:antiviraldefenseandgenetictool(RNA干擾抗病毒防御和遺傳工具)。NatImmunol3,597-599。Delgado,IJ.，Wang,Z.H.，deRocher,A.,Keegstra，K.和Raikhel，N.V.(1998).CloningandcharacterizationofAtRGPl-AreversiblyautoglycosylatedArabidopsisproteinimplicatedincellwallbiosynthesis(涉及細胞壁生物合成的可逆自身糖基化擬南芥蛋白AtRGPl的克隆與表征)。PlantPhysiol.116,1339-1349。DeWet,J.M丄，Bergquist,R.R.,Harlan,J.R.，Brink,D.E.,Cohan,CE.，Newell,C.A.禾口DeWet，A.E.1985.ExogenousDNAtransferinmaize("Zeam，」usingDNA-treatedpollen(玉米(Zeaw，)中應用DNA處理花4分的夕卜源DNA轉移)。五x/en'me"to/Afam》w/ado"Ovw/e77mwe，第197—209頁。Chapman,G.P.,Mantell,S.H"Daniels,W.(主編).Longman,London。Dhugga,K.S.，Tiwari,S.C.和Ray,P.M.(1997).Areversiblyglycosylatedpolypeptide(RGPl)possiblyinvolvedinplantcellwallsynthesis:Purification,genecloning,andtrans-Golgilocalization(可逆糖基化多肽(RGP1)可能參與植物細胞壁合成純化、基因克隆與反面高爾基體定位)。PNatlAcadSciUSA94，7679-7684。Dhugga,K.S,,Ulvskov,P.，Gallagher,S.R.和Ray,P.M.(1991).PlantPolypeptidesReversiblyGlycosylatedbyUdp國Glucose-PossibleComponentsofGolgiBeta-GlucanSynthaseinPeaCells(通過Udp-葡萄糖的可逆糖基化的植物多肽-豌豆細胞內高爾基體(3葡聚糖合酶可能的組分)。J.Biol.Chem.266,21977-21984。Ding，B.,Turg眼，R.和Parthasarathy,M.V.(1992).SubstructureofFreeze-SubstitutedPlasmodesmata(冷凍置換的胞間連絲的亞結構)。Protoplasma169,28-41。Ding,B.,Itaya,A.和Woo，Y.M.(1999).Plasmodesmataandcell-to-cellcommunicationinplants(才直物月包間連絲與細月包間通ifl)。IntRevCytoll卯，251-+。DawsonWO,LewandowskiDJ,HilfME,BubrickP，RaffoAJ,ShawJJ,GranthamGL和DesiardinsPR.(1989)Virology172:285-292。Ehlers,K.和Kollmann，R.(2001).Primaryandsecondaryplasmodesmata:structure,origin,andfunctioning(初生與次生月包間連絲結構、起源和功能)。Protoplasma216，1-30。Epel，B丄.，窗Lent，J.W,M.，Cohen,L.，Kotlizky,G.，Katz，A.和Yahalom,A.(1996).A41kDaproteinisolatedfrommaizemesocotylcellwallsimmunolocalizestoplasmodesmata(從玉米中胚軸細月包壁分離的41kDa蛋白質免疫定位到胞間連絲)。Protoplasma191,70-78。Faik,A.，Desveaux，D.和Maclachlan,G.(2000).Sugar-nucleotide-bindingandautoglycosylatingpolypeptide(s)fromnasturtiumfruit:biochemicalcapacitiesandpotentialfunctions(旱金蓮果實中糖-核苷酸結合多肽和自身糖基化多肽生化能力與潛在功能)。BiochemicalJournal347,857-864。French,R.,Janda，Mi和Ahlquist,P.1986.BacterialgeneinsertedinanengineeredRNAvirus:efficientexpressioninmonocotyledonousplantcells(插入工程RNA病毒的細菌基因在單子葉植物細胞內的有效表達)。5We膨231:1294—1297。Fromm，M.E.，Taylor,L.P.和Walbot,W.1986.Stabletransformationofmaizeaftergenetransferbyelectroporation(通過電穿孔基因轉移后玉米的穩(wěn)定轉化)。A^we319:791—7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