專利名稱：：無限繁殖化飼養(yǎng)細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系，其培養(yǎng)基，以及這些細胞及其培養(yǎng)基在干細胞尤其是人胚胎干細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由于已經(jīng)自著床前胚泡的胚內(nèi)細胞團成功分離得到人胚胎干細胞(hESC)，現(xiàn)在己經(jīng)有可能體外無限培養(yǎng)未分化hESC，并可由此提供能夠分化為三種胚層細胞的起始原料，從而用于生殖治療[l]。按常規(guī)，直接在作為共培養(yǎng)物的飼養(yǎng)細胞層上維持hESC，這些飼養(yǎng)細胞來自小鼠或人[2-7]。近年來，已可在無飼養(yǎng)細胞的條件下培養(yǎng)hESC。在此，在胞外基質(zhì)(如基質(zhì)膠(Matrigel))上培養(yǎng)細胞，所述胞外基質(zhì)添加了飼養(yǎng)細胞層產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基(CM)[8，9]。不論物種來源如何，飼養(yǎng)細胞來自初生組織(primarytissue),因而在培養(yǎng)物中壽命有限。例如，原代飼養(yǎng)細胞只可培養(yǎng)7-9代，然后就衰老了。因此，必須日常不斷制備新鮮詞養(yǎng)細胞，這可能造成批次間差異。而且，還存在病原體可能由飼養(yǎng)細胞傳遞給hESC的問題。要獲得持續(xù)、可靠且穩(wěn)定的詞養(yǎng)細胞來源以用于hESC培養(yǎng)(尤其是大規(guī)模培養(yǎng))，一種可能的方法是將原代飼養(yǎng)細胞無限繁殖化?，F(xiàn)有技術(shù)曾用多種方法進行了無限繁殖化，其中包括用來自諸如猿病毒40(SV40)、EB病毒(EBV)和人乳頭瘤病毒(HPV)等DNA腫瘤病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)正常細胞[10-14]。近年來，有研究組報道，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)過度表達也能夠延長體細胞或已分化細胞的壽命[15，16]。發(fā)明詳述第一，本發(fā)明提供無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系。進一步地說，本發(fā)明提供由胚胎成纖維細胞獲得的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系。更進一步說，本發(fā)明的無限繁殖化飼養(yǎng)細胞是由小鼠胚胎成纖維細胞獲得的。更進一步說，所述無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系是通過一種或多種以下手段由小鼠胚胎成纖維細胞獲得的p53腫瘤抑制蛋白降解，c-myc表達上調(diào)，端粒酶活化和pRb降解。更進一步說，所述無限繁殖化詞養(yǎng)細胞系是通過導(dǎo)入HPV16的E6和E7基因由小鼠胚胎成纖維細胞獲得的。較好的是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入E6和E7基因。較好的是用編碼HPV16的E6和E7基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染胚胎成纖維細胞。較好的是，在被逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后，細胞群持續(xù)繁殖，超過其正常壽命，并且耐受G418抗生素選擇。較好的是，經(jīng)無限繁殖化后的細胞系不會轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞。較好的是，在體內(nèi)，即使將這些細胞肌肉內(nèi)注射入SCID，長達16周后也不會產(chǎn)生任何明顯的腫瘤。本發(fā)明細胞系可繁殖7代、8代或9代以上。本發(fā)明的優(yōu)選細胞系體外繁殖超過70代，且不染上任何致瘤表型。本發(fā)明細胞系支持hESC，所述hESC不論是與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)還是培養(yǎng)在添加了CM的無詞養(yǎng)細胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)保持其特征性未分化形態(tài)超過40代；所述hESC持續(xù)表達多能標記Oct-4、SSEZ-4、Tar-l-60、Tar-l-81、堿性磷酸酶，并保持正常核型；并且，在注射給SCID小鼠后，所述hESC與三種胚層的代表性組織形成畸胎瘤。本發(fā)明細胞系支持未分化hESC的生長。HESC細胞系很容易適應(yīng)這些飼養(yǎng)細胞，并在飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)基或無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)基中都保持了典型的未分化hESC培養(yǎng)物形態(tài)。這些hESC還持續(xù)表達包括Oct-4、SSEZ-4、Tar-l-60、Tar-l-81、堿性磷酸酶在內(nèi)的多能標記。較好的是，25代后，這些細胞仍具有穩(wěn)定的核型，并能夠在SDID小鼠中分化形成畸胎瘤。較好的是，對hESC無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物進行的mRNART-PCR分析證實這些細胞保持Oct-4陽性，而E6和E7抗原陰性。本發(fā)明提供通過E6和E7抗原過度表達而無限繁殖化的原代MEF。優(yōu)選實施方式之一中，所述細胞系是本發(fā)明所述的AE-MEF。細胞系A(chǔ)E-MEF依照關(guān)于國際公認的用于專利申請目的的微生物保藏布達佩斯條約保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏日為2005年5月9日，保藏號為PTA-6705。本發(fā)明還提供保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為PTA-6705的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系。本發(fā)明還提供包含于合適培養(yǎng)基中的作為前文第一項內(nèi)容所述無限繁殖飼養(yǎng)細胞系的培養(yǎng)物，以及包含第一項內(nèi)容所述無限繁殖飼養(yǎng)細胞系的組合物，所述無限繁殖飼養(yǎng)細胞系包含于合適的載體或稀釋劑中。第二，本發(fā)明的內(nèi)容是提供第一項內(nèi)容所述無限繁殖飼養(yǎng)細胞系生長產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。所述條件培養(yǎng)基可與胞外基質(zhì)例如基質(zhì)膠連用。第三，本發(fā)明提供培養(yǎng)干細胞的方法，其中使用第一項內(nèi)容所述細胞系作為詞養(yǎng)細胞。較好的是，所述干細胞是人干細胞。更好的是，所述干細胞是人胚胎干細胞。第四，本發(fā)明提供培養(yǎng)干細胞的方法，其中采用了第二項內(nèi)容所述的條件培養(yǎng)基。較好的是，所述干細胞是人干細胞。更好的是，所述干細胞是人胚胎干細胞。第三、第四項內(nèi)容所述的方法包括在培養(yǎng)容器例如細胞工廠中放大未分化hESC的數(shù)量。所述放大的數(shù)量可達>108個細胞。第五，本發(fā)明提供用本發(fā)明第三或第四項內(nèi)容所述方法培養(yǎng)的干細胞。較好的是，所述干細胞是人干細胞。更好的是，所述干細胞是人胚胎干細胞。人胚胎干細胞(hESC)是多能干細胞，具有在培養(yǎng)物中無限繁殖且同時保留其分化為多種不同類型細胞的潛能。然而，hESC培養(yǎng)物必需有與之直接接觸的飼養(yǎng)細胞或飼養(yǎng)細胞產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基(CM)。詞養(yǎng)細胞的最常用來源是小鼠原代胚胎成纖維細胞(MEF)。本項研究中，我們考察了在體外用編碼HPV16E6和E7基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染后是否能延續(xù)原代MEF的繁殖能力直至超出其正常壽命。E6蛋白過度表達造成p53腫瘤抑制蛋白降解，并上調(diào)c-myc表達和激活端粒酶[17]。另一方面，表達的E7蛋白與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白pRb結(jié)合，從而導(dǎo)致pRb降解[18]。已證明，E6和E7的表達都能夠有效地使正常的人成纖維細胞、哺乳動物上皮細胞和包皮角質(zhì)形成細胞無限繁殖[ll,19，20]。在此，我們通過E6和E7抗原過度表達成功實現(xiàn)了原代MEF的無限繁殖化。所得無限繁殖MEF、AE-MEF在體外持續(xù)繁殖70代以上，且不染上任何致瘤表型。此外，此前以原代MEF(飼養(yǎng)細胞或無飼養(yǎng)細胞條件)培養(yǎng)的3種hESC細胞系很容易適應(yīng)AE-MEF。在形態(tài)學(xué)上，這些hESC維持未分化形態(tài)，并持續(xù)表達多能干細胞特征性胞內(nèi)標記和胞外標記。hESC培養(yǎng)物還保持了正常的核型，并在SCID小鼠模型中形成畸胎瘤。本項研究中，我們通過編碼HPV16的E6和E7基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染實現(xiàn)了原代MEF的無限繁殖。所得無限繁殖細胞系A(chǔ)E-MEF能夠繁殖7-9代以上(此時，原代細胞已衰老)，壽命延續(xù)超過70代。當測試其支持hESC生長的能力時發(fā)現(xiàn)，不論是在與AE-MEF的共培養(yǎng)物中還是在添加了AE-MEF產(chǎn)生的CM的無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中，〉40代的hESC保持了特征性未分化形態(tài)。所述培養(yǎng)物還持續(xù)表達多能干細胞標記Oct-4、SSEZ-4、Tar-l-60、Tar-l-81、堿性磷酸酶，并保持正常核型。此外，注射給SCID小鼠后，所述hESC與三種胚層的代表性組織形成畸胎瘤。最后，研究還顯示，將AE-MEF用于培養(yǎng)容器例如細胞工廠可能實現(xiàn)非分化hESC的擴大培養(yǎng)(放大至>108細胞)。研究結(jié)果表明，無限繁殖飼養(yǎng)細胞可提供穩(wěn)定且可再現(xiàn)的詞養(yǎng)細胞來源以用于hESC擴增和研究，因而優(yōu)于原代飼養(yǎng)細胞。在形態(tài)學(xué)上，這些hESC維持未分化形態(tài)，并持續(xù)表達多能干細胞特征性胞內(nèi)標記和胞外標記。hESC培養(yǎng)物還保持了正常的核型，并在SCID小鼠模型中形成畸胎瘤。附圖簡述圖l:原代EMF的無限繁殖化。(a):感染了表達E6/E7的逆轉(zhuǎn)錄病毒的MEF(AE-MEF)其第7代(o)和第45代(A)的生長曲線，或感染對照逆轉(zhuǎn)錄病毒的MEF(AC-MEF)其第7代(—的生長曲線。每日采集培養(yǎng)物樣本，用臺盼藍排除法測定細胞數(shù)。(b):RT-PCR分析E6/E7感染細胞(AE-MEF，第2和第4泳道)和對照病毒感染細胞(AC-MEF，第1和第3泳道)內(nèi)HPV-E6基因和HPV-E7基因表達。用1%瓊脂糖凝膠分辨擴增產(chǎn)物。MW,100-bpDNA階梯試劑盒(Promega)。圖2:hESC細胞系直接在AE-MEF上培養(yǎng)的HES-3細胞(左圖)或在添加了AE-MEF產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基的Matrigd上培養(yǎng)的HES-3細胞(右圖)的形態(tài)。使用立體顯微鏡下放大40倍(a和b，比例條二400pm)和相差顯微鏡下放大40倍(c和d，比例條二300iam)和放大100倍(e，比例條=lOOiam)的代表性菌落圖像。圖3:飼養(yǎng)細胞上的hESC細胞系(a-d)或無詞養(yǎng)細胞(e-g)培養(yǎng)物中hESC細胞系的胞內(nèi)Oct-4流式細胞計數(shù)分析。將hESC單細胞懸液固定，透化，用抗Oct-4的單克隆抗體染色。用FICT-偶聯(lián)抗小鼠抗體檢測被標記細胞。陰影區(qū)代表陰性對照染色，空白區(qū)代表Oct-4mAb染色。圖4:與AE-MEF共培養(yǎng)(上圖)或用AE-MEF產(chǎn)生的CM培養(yǎng)(下圖)的HES-3上細胞表面標記的表達。細胞用SSEA-4(a,e)、Tra-l-60(b,f)、Tra-l-81(c，g)和堿性磷酸酶(d,h)染色。對于SSEA-4和Tra-1-60/81，菌落再用偶聯(lián)了PE的第二抗體染色。就AP而言，用羅丹明濾光鏡觀察到發(fā)熒光的紅色沉淀說明活性檢測為陽性。比例條^100i^m。圖5:在添加AE-MEF產(chǎn)生的CM的無詞養(yǎng)細胞條件下傳代14代(70PD)的HES-3細胞形成的畸胎瘤的切片。腸樣上皮細胞(a)、神經(jīng)上皮細胞(b)、肌肉(c)、軟骨(d)和骨(e)。比例條-20(im。圖6:用飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)(a)和在無飼養(yǎng)細胞條件下培養(yǎng)(b)的未分化HES-3細胞的細胞遺傳學(xué)分析。在兩種培養(yǎng)物的hESC中都看到了正常的雌性核型(46XX)。圖7:RT-PCR分析AE-MEF(a)和HES-3無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物(b)中HPV-E6、HPV-E7、Oct-4和(3-肌動蛋白的表達。用1X瓊脂糖凝膠分辨RT-PCR的擴增產(chǎn)物。圖8:流式細胞計數(shù)分析用三頸燒瓶(a)和細胞工廠(b)以AE-MEF放大培養(yǎng)的HES-3細胞的胞內(nèi)Oct-4。陰影區(qū)代表陰性對照染色，空白區(qū)代表Oct-4mAb染色。本發(fā)明的最佳實施方式材料與方法細胞培養(yǎng)人胚胎干細胞系HES-2(46X，X)、HES-3(46X，X)和HES-(46X,Y)獲自ESCellInternational37°C/5%C02，在明膠包覆的器官培養(yǎng)皿中用絲裂霉素-C滅活的飼養(yǎng)細胞(4Xl(^細胞/cm"(共培養(yǎng)物)或用添加了飼養(yǎng)細胞產(chǎn)生的CM的基質(zhì)膠包覆器官培養(yǎng)皿(無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物)培養(yǎng)這些細胞。用于培養(yǎng)hESC的培養(yǎng)基是KNOCKOUT(KO)培養(yǎng)基，含85XKO-DMEM(添加15%KO血清替代物、lmML-谷胺酰胺、1%非必需氨基酸和0.1mM2-巰基乙醇)和4-8ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(Invitrogen)。每日更換培養(yǎng)基，每周進行培養(yǎng)物傳代，傳代前先按照現(xiàn)有技術(shù)所述進行酶處理[4]。在無詞養(yǎng)細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)皿中加入基質(zhì)膠(BectonDickinson)的冷KO-DMEM稀釋液(稀釋度l:30)于40。C培養(yǎng)過夜。MEF和MEF條件培養(yǎng)基(CM)的制備用Robertson等[2l]所述的方法自129Xl/SvJ小鼠(交配后13.5天)胚胎分離原代MEF。將單層原代MEF(第4代)培養(yǎng)至鋪滿，用10pig/ml絲裂霉素-C處理2.5-3小時。處理后，用0.25X胰蛋白酶-EDTA剝離細胞，然后接種到前述器官培養(yǎng)皿的F-DMEM培養(yǎng)基上。F-DMEM培養(yǎng)基的組成為90%DMEM高濃葡萄糖、10%FBS、2mML-谷胺酰胺、25U/ml青霉素和25pg/ml鏈霉素(Invitrogen)。接種后24小時，將培養(yǎng)基換成KO培養(yǎng)基，平衡24小時后加入hESC或收集MEF-CM。對于MEF-CM，在培養(yǎng)皿上按1.4X1()5細胞/cm2的密度接種經(jīng)絲裂霉素-C處理的MEF，加入KO培養(yǎng)基后每過24小時收集一次CM。過濾CM(0.22pm)，再添加8ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子(Invitrogen)。無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系A(chǔ)E-MEF的建立將原代MEM的第3代(3X105細胞)接種到75cm2T型燒瓶中，在F-DMEM培養(yǎng)基中貼壁過夜。然后，在8ng/ml聚凝胺(PoIybrene)(Sigma-Aldrich)存在下，37°C，用含有PA317LXSNHPV16E6E7或PA317PXSN包裝細胞系(分別為CRL-2203和CRL-2202，ATCC)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的除菌過濾上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞8小時[22]。此后，除去含病毒培養(yǎng)基，換以新鮮F-DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)3天。轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞在100|iig/ml的G418(Sigma-Aldrich)中選擇14天。建成的飼養(yǎng)細胞系A(chǔ)E-MEF在不加抗生素的F-DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，儲備物則冷凍保存于90%FBS和10%DMSO中。生長速度和倍增時間每日(接種后1-6天)在用0.25X胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)處理后采集MEF單細胞懸液和hESC單細胞懸液。用臺盼藍排除法測定每份樣本的活細胞數(shù)和生存力。繪制活細胞數(shù)-時間圖以估算指數(shù)生長期的比生長速度。據(jù)此，用公式td^ln(2)/V計算倍增時間(td)，(Li為比生長速度(小時")。Oct-4表達的流式細胞計數(shù)分析采用流式細胞術(shù)和免疫熒光方法估測hESC細胞群的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達水平。用胰蛋白酶采集單細胞懸液，將細胞固定、透化(CaltagLaboratories),并與1:20稀釋的小鼠抗Oct-4單克隆抗體(SantaCruz)—起培養(yǎng)。然后，用1XBSA/PBS洗滌細胞，與1:500稀釋的偶聯(lián)了FITC的山羊oc-小鼠抗體(DAKO)避光培養(yǎng)。培養(yǎng)后，再次洗滌細胞，將細胞重懸在1%BSA/PBS中用于FACScan分析(BectonDickinsonFACSCalibur)。所有培養(yǎng)都在室溫下進行15分鐘。用適當?shù)耐N型對照進行細胞染色，作為陰性對照。免疫細胞化學(xué)室溫下，在4%多聚甲醛中固定細胞45分鐘，并抗SSEA-4抗體(純，DevelopmentStudiesHybridomasBank)、Tra-l-60抗體和Tra-1-81抗體(30(ig/m1,Chemicon)在室溫下培養(yǎng)1小時。用FITC-偶聯(lián)山羊a-小鼠抗體(1:500稀釋，DAKO)顯示抗體定位。堿性磷酸酶染色用VectorRed堿性磷酸酶底物試劑盒I(VectorLaboratory),按照制造商說明書進行堿性磷酸酶染色。簡而言之，用PBS洗滌hESC—次，然后與VectorRed底物工作溶液在室溫下避光培養(yǎng)45分鐘。用羅丹明激發(fā)和發(fā)射濾光鏡觀測反應(yīng)產(chǎn)物。RNA分離和逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用MachereyNagel的NucleoSpinRNAII試劑盒自hESC和MEF分離總RNA，用紫外分光光度法定量。用l^g總RNA進行標準逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用寡聚dT引物和ImPromII逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)。用Oct-4、(5-肌動蛋白、HPV16E6和HPV16E7的特異性引物(表l)進行PCR。擴增循環(huán)參數(shù)為30輪循環(huán)，每輪包括95°C1分鐘，55°C1分鐘和72°C1分鐘。此后是72°C10分鐘的最后延長。在1%瓊脂糖凝膠上觀測擴增產(chǎn)物，用溴乙錠染色。SCID小鼠模型AMEF和hESC經(jīng)酶處理后，用22號無菌針頭將約4.5X106細胞后腿肌肉注射給四周齡SCID小雄鼠。挑出現(xiàn)腫瘤(注射后約9-10周)的小鼠殺死，摘取腫瘤，用10%福爾馬林固定。將腫瘤蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin&eosinstaining)后制成石蠟切片進行組織學(xué)檢查。核型由NUS婦產(chǎn)科系的細胞遺傳實驗室或KK婦女兒童醫(yī)院進行核型分析。hESC共培養(yǎng)物的擴大培養(yǎng)為了進行hESC的擴大培養(yǎng)，在組織培養(yǎng)瓶(T75，75cm2)、三頸燒瓶(TF，500cm"和細胞工廠(CF，632cm、Nunc)上進行共培養(yǎng)物的擴增。培養(yǎng)條件與前文所述相近。將絲裂霉素-C滅活的飼養(yǎng)細胞接種到明膠化培養(yǎng)表面，每個表面的接種密度都是4Xl(^細胞/cm2。為了進行傳代，用磷酸鹽緩沖液+(PBS+)洗滌細胞，然后室溫下與0.05X胰蛋白酶(Invitrogen)培養(yǎng)2-3分鐘。輕輕拍打，使細胞與培養(yǎng)瓶脫離，然后通過反復(fù)抽吸將其分散成小塊。接著，中和掉胰蛋白酶，按1:3的接種比將細胞小塊接種到已種有滅活飼養(yǎng)細胞的新的明膠化培養(yǎng)皿中。結(jié)果無限繁殖化MEF的建立和鑒定用同時編碼HPV16-E6、HPV16-E7和新霉素抗性的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代MEF的第3代(AE-MEF)。用僅含新霉素抗性的對照逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞作為陰性對照(AC-MEF)。感染后傳過4代后(感染后約12天，P7)，AE-MEF持續(xù)繁殖(圖la)，倍增時間約為19.7小時。而且，AE-MEF的生長速度和倍增時間與原代MEF的第4代相當(表2)。相反，對照病毒感染的細胞(AC-MEF)在第7代表現(xiàn)出衰老跡象，因為在相同的6日期間內(nèi)，活細胞數(shù)沒有明顯增加(圖la)。45代后(群體倍增數(shù)為165)，AE-MEF保持著近似于第7代的生長動力學(xué)特征(圖la)，目前已培養(yǎng)超過70代，繁殖能力仍未下降(數(shù)據(jù)未顯示)。分離了第7代△E-MEF和AC-MEF的RNA，用RT-PCR檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒感染所導(dǎo)入的E6和E7基因的表達。由圖lb看，AE-MEF中E6和E7兩基因的mRNA表達明顯(分別為泳道2和4)，但在對照病毒感染的AC-MEF中未檢到表達(泳道1和3)。為了確定AE-MEF是否會形成腫瘤，在用E6和E7無限繁殖化后，取5X1(^細胞注射給SCID小鼠。對小鼠進行定期檢查，細胞注射16周后仍未檢出明顯腫瘤(數(shù)據(jù)未顯示)。在飼養(yǎng)細胞條件和無飼養(yǎng)細胞條件下使用無限繁殖MEF的hESC的生長和形態(tài)將人ES細胞系HES-3直接常規(guī)培養(yǎng)在原代MEF上(共培養(yǎng)物)或常規(guī)培養(yǎng)在添加了原代MEF培養(yǎng)物產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基的基質(zhì)膠上(無飼養(yǎng)細胞)。為了判定無限繁殖MEF細胞系A(chǔ)E-MEF是否能夠支持hESC細胞的非分化生長，將HES-3接種于相應(yīng)的培養(yǎng)條件，但以AE-MEF取代原代MEF。為制備共培養(yǎng)物，接種到AE-MEF上的HES-3細胞塊擴增并形成菌落而將飼養(yǎng)細胞推開。由此形成成纖維細胞包圍菌落的十分清晰的菌落邊界(圖2a和2c)。在形態(tài)學(xué)上，菌落內(nèi)的hESC保持著高度的集簇性和高核質(zhì)比(圖2e)。為制備無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物，盡管沒有飼養(yǎng)細胞，添加了AE-MEF條件培養(yǎng)基的基質(zhì)膠上的hESC仍形成了清晰且緊密的菌落，與飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)的hESC相似(圖2b和2d)。有意思的是，發(fā)現(xiàn)在未分化菌落邊界圍繞有已分化的成纖維細胞樣細胞，但后者的密度明顯低于hESC(圖2d)。在飼養(yǎng)細胞和無飼養(yǎng)細胞條件下，HES-3細胞持續(xù)保持未分化hESC形態(tài)達連續(xù)傳代40次以上(群體倍增數(shù)(PD)為210)。在飼養(yǎng)細胞和無飼養(yǎng)細胞條件下傳代10次以上的另兩個hESC細胞系，HES-2和HES-4也觀察到相似的形態(tài)特征(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，HES-3細胞在所述兩種培養(yǎng)條件下的比生長速度和倍增時間相當(表2)，并與現(xiàn)有文獻報道一致[4，23]。未分化hESC獨特標記的鑒定未分化hESC特征性地表達一系列標記，例如胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子0ct-4和細胞表面標記如SSEA-4、Tra-l-60、Tra-1-81。我們用流式細胞計數(shù)法比較了飼養(yǎng)細胞和無飼養(yǎng)細胞條件下所有3個hESC細胞系的Oct-4表達(圖3)。和培養(yǎng)在原代MEF上的HES-3細胞(圖3a)—樣，>88%的AE-MEF上培養(yǎng)的HES-2、HES-3和HES-4細胞呈Oct-4染色陽性(分別見圖3c、3b和3d)。相似地，當細胞維持在添加了AE-MEF產(chǎn)生的CM的無詞養(yǎng)細胞條件下時，>97%的細胞(全部3個hESC細胞系)都呈Oct-4陽性(圖3e-3g)。而且，AE-MEF(圖4，上圖)或AE-MEFCM(圖4，下圖)上培養(yǎng)的HES-3細胞還呈SSEA-4(圖4a，4e)、Tra-l-60(圖4b，4f)、Tra-1-81(圖4c，4g)陽性，并具有高堿性磷酸酶活性(圖4d，4h)。為了評價體內(nèi)形成分化組織的潛能，將在飼養(yǎng)細胞上維持和采用AE-MEF的無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物維持的HES-3細胞注射給SCID小鼠。IO周后，都觀察到了畸胎瘤。制備腫瘤切片進行組織學(xué)檢查。由切片看，可鑒定到三種胚層的代表性組織，包括腸樣上皮細胞(內(nèi)胚層，圖5a)、神經(jīng)上皮細胞(外胚層，圖5b)、肌肉、軟骨和骨(中胚層，圖5c-e)。而且，還對至少連續(xù)傳代25次(130PD)的飼養(yǎng)細胞和無飼養(yǎng)細胞細胞群的HES-3細胞進行了細胞遺傳學(xué)檢査(圖6a和6b)。分析結(jié)果顯示，兩種條件下培養(yǎng)的HES-3細胞都保持了正常核型(46X,X)。最后，因為是用逆轉(zhuǎn)錄病毒對原代MEF進行的無限繁殖化，確定AE-MEF不產(chǎn)生病毒十分重要，否則會使hESC感染E6和E7抗原。在40代之后的HES-3無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中，RT-PCR沒有檢出E6和E7表達(圖7b)。但檢出了Oct-4表達，這表明hESC仍未分化。作為對照，也對AE-MEF進行了RT-PCR(圖7a)。此時可檢出，飼養(yǎng)細胞表達E6和E7抗原，但不表達Oct-4。用AE-MEF進行HES-3共培養(yǎng)物的放大培養(yǎng)為了證明AE-MEF可用于非分化hESC的放大培養(yǎng)，將共培養(yǎng)物由器官培養(yǎng)皿擴增到組織培養(yǎng)瓶。然后將組織培養(yǎng)瓶中的細胞作為接種物用于將hESC擴增到三頸燒瓶和細胞工廠的規(guī)模。由表3看，在這些大培養(yǎng)容器中，7天后的總細胞得率約為2-3Xl()S細胞。還可以看到，盡管三頸燒瓶和細胞工廠與器官培養(yǎng)皿相比分別將表面積增大的208倍和263倍，細胞密度仍保持為約0.37-0.47Xl()6細胞/cm2。而且，三頸燒瓶和細胞工廠中擴增hESC的89%-96%保持Oct-4染色陽性(圖8a和8b)?？偟目磥恚陨辖Y(jié)果顯示，可以用AE-MEF共培養(yǎng)物將未分化hESC擴增到相當大的量。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>組織培養(yǎng)瓶75.0三頸燒瓶500.0細胞工廠632.029,40.39187.50.37295.30.47討論飼養(yǎng)細胞是hESC培養(yǎng)物中的必要組分。不象小鼠胚胎干細胞，hESC或培養(yǎng)成與飼養(yǎng)細胞直接接觸的共培養(yǎng)物，或培養(yǎng)在添加了飼養(yǎng)細胞-CM的無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中。hESC在這些條件下保持未分化表型。然而，一個主要局限是，目前用于hESC的飼養(yǎng)細胞源自小鼠或人的初生組織。作為正常體細胞，它們在培養(yǎng)物中的壽命有限，復(fù)制有限次數(shù)后就衰老了。用HPV16E6和E7抗原轉(zhuǎn)導(dǎo)原代細胞已顯示能將人成纖維細胞的壽命延長到群體倍增數(shù)200以上[19]。本項研究中，我們證明，用HPV16E6和E7感染可將原代MEF的壽命從7-9代延長至超過70代(群體倍增數(shù)為250)。RT-PCT證實有E6和E7表達。曾有報道稱，用諸如SV40、E6/E7等基因使細胞無限繁殖化處境艱難，大多數(shù)細胞衰老。在這群細胞中，持續(xù)分裂的細胞最終形成了無限繁殖細胞系[24]。有意思的是，用AE-MEF沒有發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。在以逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后，細胞群持續(xù)繁殖，超過了它們的正常壽命，并耐受G418抗生素選擇。在體內(nèi)，給SCID小鼠肌內(nèi)注射AE-MEF16周后也沒有出現(xiàn)任何明顯的腫瘤。這證實無限繁殖化后，AE-MEF未變成致瘤性。相比之下，注射等量的hESC，9-10周后出現(xiàn)了直徑約l-2cm的畸胎瘤。用E6和E7抗原進行細胞無限繁殖化的一個重要問題是，雖然可通過降解p53和視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白實現(xiàn)無限繁殖化，但有報道稱，E6和E7也可能影響無限繁殖細胞的其它路徑和細胞功能。Murvai等[25]發(fā)現(xiàn)，HPV16E7還抑制NIH/3T3細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子-(32(TGF-(52)啟動子的活性。在人角質(zhì)形成細胞內(nèi)，E6和E7過度表達引起TGF-P2mRNA表達和生物活性TGF-(32分泌降低[26]。另一方面，HPV16E6顯著誘導(dǎo)TGF-[31啟動子活性(6倍)，但這一效果對細胞類型特異，僅見于成纖維細胞中，在上皮細胞中則沒有[27]。本項研究中，E6和E7無限繁殖化沒有改變AE-MEF支持未分化hESC生長的能力。我們發(fā)現(xiàn)，3個hESC細胞系能容易地適應(yīng)這些飼養(yǎng)細胞，并且，在飼養(yǎng)細胞和無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中都保持未分化hESC培養(yǎng)物的典型形態(tài)。這些hESC還持續(xù)表達多能干細胞標記，包括Oct-4、SSEA-4、Tra-l-60、Tra-l-81和堿性磷酸酶。25代后，細胞仍保持穩(wěn)定的核型，并能夠在SCID小鼠中分化形成畸胎瘤。此外，HES-3無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物的mRNA的RT-PCR分析證實，細胞保持Oct-4陽性，E6和E7抗原陰性。后一結(jié)果很重要，因為這證明AE-MEF用于hESC是安全的，不存在由飼養(yǎng)細胞將這兩抗原傳遞給hESC危險。在我們?yōu)樯a(chǎn)大量未分化hESC所進行的努力中，我們證實，可以在大型培養(yǎng)容器例如細胞工廠中用AE-MEF實現(xiàn)HES-3細胞共培養(yǎng)物的擴大培養(yǎng)(約2-3X108細胞)。盡管表面積比在器官培養(yǎng)皿中擴大了208-263倍，但培養(yǎng)7日后可獲得相當?shù)拿芏惹椅唇档图毎|(zhì)量。近年來，我們還用本發(fā)明方法成功地使3種人包皮成纖維細胞(hF)系無限繁殖化，己知這些細胞系支持hESC擴增[4]。與AE-MEF—樣，無限繁殖hF細胞系A(chǔ)E-Hs68保持了支持未分化HES-3細胞在飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)物(〉26代)和在無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物(>16代)中繁殖的能力。HES-3細胞的倍增時間是34.5小時和36.4小時，而原代Hs68共培養(yǎng)物上HES-3細胞的倍增時間為33.3小時。hESC還保持了Oct-4、GCTM-2、SOX-2、Tra-l-60和Tra-l-81染色陽性(結(jié)果未顯示)。結(jié)論是，以上結(jié)果顯示，用E6和E7使細胞無限繁殖化是一種全面解決方案，可兼用于小鼠和人飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞能夠持續(xù)繁殖超出其正常壽命并保持支持hESC擴增的能力是有利的，因為無需頻繁制備原代飼養(yǎng)細胞。這種穩(wěn)定的詞養(yǎng)細胞來源將提高培養(yǎng)結(jié)果的再現(xiàn)性，尤其是在飼養(yǎng)細胞和無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)條件下的hESC擴大培養(yǎng)中，還消除了不同批次飼養(yǎng)細胞質(zhì)量不一致的問題。而且，還可對這些無限繁殖飼養(yǎng)細胞進行篩以確保它們不含潛在病原體，避免病原體由飼養(yǎng)細胞傳遞給hESC。參考文獻1.ThomsonJA，ltskovitz-EldorJ,ShapiroSS等，來源于人成纖維細胞的胚胎干細胞系(Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts).ScienceI998;282:1145-1147.2.RichardsM,FongCY,ChanWK等，人飼養(yǎng)細胞支持人內(nèi)細胞塊和胚胎干細胞持續(xù)未分化生長(Humanfeederssupportprolongedundifferentiatedgrowthofhumaninnercellmassesandembryonicstemcells.)NatBiotechnol2002;20:933-936.3.ReubinoffBE,PeraMF,FongCY等，人成纖維細胞的胚胎干細胞系體外的體細胞性分化(Embryonicstemcelllinesfromhumanblastocysts:somaticdifferentiationinvitro.)NatBiotechnol2000;18:399-404.4.ChooAB，PadmanabhanJ,ChinAC等，用人詞養(yǎng)細胞擴增人多能胚胎干細胞(Expansionofpluhpotenthumanembryonicstemcellsonhumanfeeders.)BiotechnolBioeng2004:88:321-331.5.AmitM，MarguletsV,SegevH等，用于人胚胎干細胞的人飼養(yǎng)細胞層(Humanfeederlayersforhumanembryonicstemcells.)BiolReprod2003;68:2150-2156.6.RichardsM，TanS，F(xiàn)ongCY等，各種人飼養(yǎng)細胞支持人胚胎干細胞持續(xù)未分化生長的比較性評估(Comparativeevaluationofvarioushumanfeedersforprolongedundifferentiatedgrowthofhumanembryonicstemcells.)StemCells2003;21:546-556.7.Hovatta0，MikkolaM，GertowK等，采用人包皮成纖維細胞作為飼養(yǎng)細胞來生產(chǎn)人胚月臺干細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)(Aculturesystemusinghumanforeskinfibroblastsasfeedercellsallowsproductionofhumanembryonicstemcells.)HumReprod2003;18:1404-1409.8.CarpenterMK,RosierES,FiskGJ等，四種維持在無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的人胚月臺干細胞的特性(Propertiesoffourhumanembryonicstemcelllinesmaintainedinafeeder-freeculturesystem.)DevDyn2004;229:243-258.9.XuC,lnokumaMS,DenhamJ等，未分化人胚胎干細胞的無飼養(yǎng)細胞生長(Feeder-freegrowthofundifferentiatedhumanembryonicstemcells.)NatBiotechnol2001;19:971-974.10.BryanTM,ReddelRR.SV40-誘導(dǎo)的人細胞無限繁殖化(SV40-inducedimmortalizationofhumancells.)CritRevOncog1994;5:331-357.11.GudjonssonT,VilladsenR，NielsenHL等，具有干細胞特征的人乳房上皮細胞系的分離、無限繁歹直4七禾口鑒定(lsolation,immortalizationandcharacterizationofahumanbreastepithelialcelllinewithstemcellproperties.)GenesDev2002;16:693-706.12.JhaKK,BangaS,PalejwalaV等，SV40-介導(dǎo)的無限繁殖化(SV40-Mediatedimmortalization.)ExpCellRes1998:245:1-7.13.SugimotoM,ldeT,GotoM等，重新審視EB病毒轉(zhuǎn)化的人B-類淋巴母細胞系的衰老、無限繁殖化和端粒維持(Reconsiderationofsenescence,immortalizationandtelomeremaintenanceofEpstein-Barrvirus-transformedhumanB-lymphoblastoidcelllines.)MechAgeingDev1999;107:51-60.14.YamamotoA，KumakuraS，UchidaM等，通過導(dǎo)入16型人乳頭瘤病毒E6或E7基因?qū)⒄Ｈ伺咛コ衫w維細胞無限繁殖化(lmmortalizationofnormalhumanembryonicfibroblastsbyintroductionofeitherthehumanpapillomavirustype16E6orE7genealone)，lntJCancer2003;106:301-309.15.BodnarAG,OuelletteM,FrolkisM等，導(dǎo)入端粒酶延長正常人細胞的壽命(Extensionoflife-spanbyintroductionoftelomeraseintonormalhumancells.)Science1998;279:349-352.16.XuC，JiangJ,SottileV等，來源于人胚胎干細胞的無限繁殖化成纖維細胞樣細胞支持未分化細胞的生長(lmmortalizedfibroblast-likecellsderivedfromhumanembryonicstemcellssupportundifferentiatedcellgrowth).StemCells2004;22:972-980.17.KlingelhutzAl，F(xiàn)osterSA,McDougallJK.16型人乳頭瘤病毒E6基因產(chǎn)物激活端粒酶(TelomeraseactivationbytheE6geneproductofhumanpapillomavirustype16.)Nature1996;380:79-82.18.BoyerSN,WazerDE,BandV.人乳頭瘤病毒-16的E7蛋白誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白通過泛肽-蛋白酶體路徑降解(E7proteinofhumanpap川omavirus-16inducesdegradationofretinoblastomaproteinthroughtheubiquitin-proteasomepathway.)CancerRes1996;56:4620-4624.19.ShigaT,ShirasawaH,ShimizuK等，通過導(dǎo)入16型人乳頭瘤病毒(HPV-16)E6-E7基因使正常人成纖維細胞無限繁殖化(Normalhumanfibroblastsimmortalizedbyintroductionofhumanpap川omavimstype16(HPV-16)E6-E7genes),MicrobiolImmunol1997;41:313-319.20.HalbertCL，DemersGW,GallowayDA,16型人乳頭瘤病毒E7基因足夠使人上皮細胞無限繁歹直《七(TheE7geneofhumanpapillomavirustype16issufficientforimmortalizationofhumanepithelialcells.)JVirol1991;65:473-478.21.Robertson,E.丄胚月臺干細胞系(Embryo-derivedstemcelllines).干ij于RobertsonEl編，《畸胎癌與胚胎干細胞》(Teratocarcinomasandembryonicstemcells).Oxford:IRLPress,1987:71-112.22.WazerDE，LiuXL，ChuQ等，用人乳頭瘤病毒16E6或E7基因使不同的人孚L房上皮細胞無限繁殖it(lmmortalizationofdistincthumanmammaryepithelialcelltypesbyhumanpap川omavirus16E6orE7.)ProcNatlAcadSciUSA1995;92:3687-3691.23.CowanCA，KlimanskayaI,McMahonI等，從人胚泡衍生胚胎干細胞(Derivationofembryonicstem-celllinesfromhumanblastocysts).NEnglJMed2004;350:1353-1356.24.丫eagerTR,ReddelRR.構(gòu)建無限繁殖化人細胞系(ConstructingImmortalizedhumancelllines.)CurrOpinBiotechnol1999;10:465-469.25.MurvaiM，BorbelyAA,KonyaI等，人16型乳頭瘤病毒E6或E7癌基因?qū)D(zhuǎn)化生長因子(TGF)p-2啟動子的作用(Effectofhumanpap川omavirustype16E6andE7oncogenesontheactivityofthetransforminggrowthfactor-beta2(TGF-beta2)promoter.)ArchVirol2004;149:2379-2392.26.NeesM，GeogheganJM,MunsonP等，人16型乳頭瘤病毒E6或E7蛋白抑制轉(zhuǎn)化生長因子(3-2在頸角質(zhì)形成細胞中的分化依賴性表達(Humanpapillomavirustype16E6andE7proteinsinhibitdifferentiation-dependentexpressionoftransforminggrowthfactor-beta2incervicalkeratinocytes).CancerRes2000;60:4289-4298.27.DeyA,AtchaIA，BagchiS.HPV16E6癌蛋白在成纖維細胞中通過一段特殊的富GC序列激活轉(zhuǎn)化生長因子|3-1啟動子(HPV16E6oncoproteinstimulatesthetransforminggrowthfactor-beta1promoterinfibroblaststhroughaspecificGC-richsequence).VirologyI997;228:190-199.權(quán)利要求1.一種無限繁殖飼養(yǎng)細胞系。2.—種無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，由胚胎成纖維細胞制得。3.—種無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，由小鼠胚胎成纖維細胞制得。4.一種無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，通過一種或多種以下手段由小鼠胚胎成纖維細胞制得p53腫瘤抑制蛋白降解，c-myc表達上調(diào)，端粒酶活化和pRb降解。5.—種無限繁殖詞養(yǎng)細胞系，通過導(dǎo)入HPV16的E6和E7基因由胚胎成纖維細胞制得。6.如權(quán)利要求5所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述E6和E7基因通過轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)入。7.如權(quán)利要求6所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述胚胎成纖維細胞被編碼HPV16的E6和E7基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。8.如權(quán)利要求7所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述細胞群體在感染逆轉(zhuǎn)錄病毒后持續(xù)繁殖超過它們的正常壽命，并耐受G418抗生素選擇。9.如權(quán)利要求7所述的無限繁殖詞養(yǎng)細胞系，無限繁殖化后，所述細胞系不會轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞。10.如權(quán)利要求9所述的無限繁殖詞養(yǎng)細胞系，在體內(nèi)，將所述細胞肌內(nèi)注射入SCID小鼠后，16周后仍未引起明顯腫瘤。11.如權(quán)利要求1所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述細胞系繁殖超過7、8或9代。12.如權(quán)利要求11所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述細胞系體外繁殖超過70代而不染上任何致瘤性表型。13.如權(quán)利要求1所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述細胞系支持hESC，不論是在共培養(yǎng)物中還是在添加了CM的無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中，>40代的所述hESC保持了特征性未分化形態(tài)；持續(xù)表達多能標記Oct-4、SSEZ-4、Tar-l-60、Tar-l-81、堿性磷酸酶，并保持正常核型；注射給SCID小鼠后，所述hESC與三種胚層的代表性組織形成畸胎瘤。14.如權(quán)利要求1所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述細胞系支持未分化hESC生長。15.如權(quán)利要求1所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，hESC細胞系很容易適應(yīng)所述飼養(yǎng)細胞系，并且，在飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物和無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中都保持未分化hESC的典型形態(tài)。16.如權(quán)利要求15所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，所述hESC持續(xù)表達多能標記，所述標記包括Oct-4、SSEZ-4、Tar-l-60、Tar-l-81和堿性磷酸酶。17.如權(quán)利要求15所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，25代后，所述hESC仍保持穩(wěn)定的核型，并能夠在SCID小鼠內(nèi)分化形成畸胎瘤。18.如權(quán)利要求15所述的無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，HES無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物mRNA的RT-PCR分析證實細胞保持Oct-4陽性，E6和E7抗原陰性。19.通過E6和E7過度表達無限繁殖化的原代MEF。20.本發(fā)明所述的細胞系A(chǔ)E-MEF。21.—種無限繁殖飼養(yǎng)細胞系，保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為PTA-6705。22.權(quán)利要求1-21中任一項所述無限繁殖飼養(yǎng)細胞系在合適培養(yǎng)基中形成的培養(yǎng)物。23.—種組合物，包含權(quán)利要求1-21中任一項所述無限繁殖詞養(yǎng)細胞系，所述細胞處于合適的載體或稀釋劑中。24.—種條件培養(yǎng)基，由權(quán)利要求1-21中任一項所述無限繁殖飼養(yǎng)細胞系產(chǎn)生。25.如權(quán)利要求24所述的條件培養(yǎng)基，與胞外基質(zhì)例如基質(zhì)膠聯(lián)用。26.—種培養(yǎng)干細胞的方法，包括采用權(quán)利要求1-21中任一項所述無限繁殖飼養(yǎng)細胞系作為飼養(yǎng)細胞。27.如權(quán)利要求26所述的方法，所述干細胞是人干細胞。28.如權(quán)利要求27所述的方法，所述干細胞是人胚胎干細胞。29.—種培養(yǎng)干細胞的方法，包括采用權(quán)利要求24或25所述的條件培養(yǎng)基。30.如權(quán)利要求29所述的方法，所述干細胞是人干細胞。31.如權(quán)利要求30所述的方法，所述干細胞是人胚胎干細胞。32.如權(quán)利要求26-31中任一項所述的方法，在培養(yǎng)容器例如細胞工廠中產(chǎn)生放大量的未分化hESC。33.如權(quán)利要求32所述的方法，所述放大量大于108細胞。34.—種干細胞，是用權(quán)利要求26-31中任一項所述方法培養(yǎng)的。35.如權(quán)利要求34所述的人干細胞。36.如權(quán)利要求32所述的人胚胎干細胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系。該無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系可由胚胎成纖維細胞獲得，所述成纖維細胞可以是小鼠胚胎成纖維細胞。本發(fā)明還提供包含在合適培養(yǎng)基中的本發(fā)明無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物是一組合物，其中包含處于合適載體或稀釋劑中的本發(fā)明無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系和通過培養(yǎng)本發(fā)明無限繁殖化飼養(yǎng)細胞系產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供培養(yǎng)干細胞的方法以及由此獲得的細胞，所述方法包括使用本發(fā)明的細胞系和條件培養(yǎng)基。文檔編號C12N5/10GK101189329SQ200680013370公開日2008年5月28日申請日期2006年2月23日優(yōu)先權(quán)日2005年2月23日發(fā)明者A·B·H·徐,S·K·W·胡申請人:新加坡科技研究局