專利名稱:病毒診斷方法及其使用的池的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種適于病毒診斷方法中使用的單個扁平底部型的池
(single flat-based well)。更具體地說,該池具有與彎曲的底部相對的平 面或扁平的底部。本發(fā)明還涉及采用這種單個池的病毒診斷方法。在該方 法的一個實施方案中,采用了添加有激素和酶的專門研制的組織培養(yǎng)基。
背景技術:
用于鑒別病毒的常規(guī)診斷過程包括下述步驟將所選的對某種病毒易 感的特定細胞系接種于容器,然后將假定含有病毒的生物樣品接種于該細 胞培養(yǎng)物。此類生物樣品除了包括其它物質外,還包括唾液、尿、排泄物、 腦脊液(CSF)、呼吸液和諸如來自嘴、鼻腔、咽喉、皮膚和生殖器的化 驗樣本。隨后對接種的細胞培養(yǎng)物進行培養(yǎng)并考察所述細胞經由病毒^"發(fā) 的細胞病變效應。由于某些病毒僅生長于某些細胞,因此可以病毒i秀發(fā)細 胞病變效應(CPE)或未誘發(fā)細胞病變效應的細胞類型為基礎對病毒進行 鑒別。
對于此過程具有大量備選的實驗方案,其包括下述步驟使已接種有 病毒制品的細胞經受胰蛋白酶作用(trypsonisation)以便除去該細胞,隨 后使用對源自病毒的多肽具有特異性的單克隆抗體來檢測病毒,所述源自 病毒的多肽使用報道分子,比如熒光素(FITC)分子進行標記。另外的 備選方案包括在培養(yǎng)管內的蓋玻片以便促進細胞的恢復。
常規(guī)的(或傳統(tǒng)的鼓法)方法使用了接種有適當細胞系的螺旋蓋管 (screw cap tubes)。在細胞達到約80%的融合率后,將該管接種適當?shù)臉颖?并監(jiān)控CPE長達三周。第一周須每天監(jiān)控CPE。第二周和第三周必須減 少監(jiān)控頻率。通常,需要盲傳來促進病毒的恢復。
由于需要每天對管進行監(jiān)控,因此常規(guī)管法的一個不利之處在于費時 費力。通常,為了避免主觀性,兩名人員通過光學顯微鏡對相同管的CPE
進行檢查。此外,并不是所有病毒均能引起可見的CPE,而且并不是所有 的病毒都能通過該方法來檢測。而且,在常規(guī)的管法中監(jiān)控到的CPE信 息高度依賴于細胞系的易感性以及病毒產生可見CPE的能力。樣本的毒 性還可能不利地產生類似于病毒CPE的變化,從而得出錯誤的結杲。此 外,某些病毒只有在很長的時間周期后才產生CPE(例如細胞巨化病毒 (CMV))。由于通過常規(guī)管法獲得的結果主要是基于CPE檢測并且不 能按慣例通過任何其他的方法進行確證,因此可能出現(xiàn)不準確的診斷。常 規(guī)管法的另一個局限性在于每個樣本很難使用2個或3個以上的管,這可 歸因于其導致的管堆積。例如,僅在第一周,40個樣本每天就會產生500 個管。
快速培養(yǎng)法(shell vial method )是目前本領域4支術人員用于病毒恢復 的最先進的方法。該方法使用具有半透明蓋子的、直徑為16 mm的5 ml 塑料瓶(快速培養(yǎng)瓶)。適當?shù)奶幚碇螅瑢A形的(13mm)蓋玻片插 入該瓶。將易感的細胞系接種于瓶中,所述細胞系在蓋玻片上單層生長。 當細胞單層達到約80-90%的融合率時,棄去培養(yǎng)基并將所述單層和瓶^妄 種上患者的樣本。隨后,監(jiān)控培養(yǎng)瓶的CPE,之后除去蓋玻片。然后將蓋 玻片固定于顯微鏡的載玻片并使用單克隆抗體染色。
快速培養(yǎng)法的優(yōu)勢在于接種后可以通過對瓶進行離心來促進病毒的 恢復,快速培養(yǎng)法可將獲得結果所需的時間長度縮短至2-3天。此外,使 用快速培養(yǎng)法無需等待可見的CPE??梢栽诘诙虻谌斐ドw玻片并使 用適當?shù)膯慰寺】贵w進行染色且使用抗體抗原染色來確證結果。
但是,快速培養(yǎng)法也有一些局限性。由于蓋玻片需要下述的特殊處理 因此快速培養(yǎng)法是耗時的比如使用清潔劑和丙酮多次洗滌后用蒸餾水洗 滌并滅菌。還必須人工將蓋玻片插入瓶中。此外,需要進行熒光免疫染色 時,該過程甚至變得更復雜和耗時。而且必須棄去快速培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基 并使用特殊的鑷子人工除去蓋玻片、空氣干燥并固定于顯微鏡的載玻片 (使用真空油脂)。由于操作的疏忽,或者無意地翻轉并將顛倒的單層固
定于顯微鏡的載玻片有可能使蓋玻片破裂,因此蓋玻片的去除是令人厭煩 的。如果接種的細胞也生長在蓋玻片底部上,由此造成蓋玻片固定于所述 瓶并使得蓋玻片難以去除的話,那么可能會引起另 一個不利因素
(complication)。事實上,與常規(guī)管法一樣,使用快速培養(yǎng)法不可能每 個樣本使用2個或3個以上的管,這可歸因于管堆積(即,每周40個樣 本每天會產生500個快速培養(yǎng)瓶)。此外,為了覆蓋13 mm的圓形蓋玻 片,熒光免疫染色需要大量的單克隆抗體。
96孔板法是僅在受限制的情況下用于恢復生長于相同細胞系的病毒 的另 一種方法。例如,該池接種LLC-MK2細胞系時,副流感病毒還有流 感病毒的恢復是可能的。96孔板法具有多種優(yōu)勢,因為用特定的樣本進 行被接種細胞系的接種時操作相對容易。此外,可以在同一板上接種大量 的樣本并且經由離心的促進作用也是可能的。而且,96孔板法僅需要少 量的培養(yǎng)基(為0.3 ml,而不是快速培養(yǎng)法中使用的1-1.5 ml);可以使 用抗原抗體技術確證結果并且該方法還能夠容易地"讀出"所監(jiān)控的CPE。
然而,96孔板法也有其不利之處。其必須將整個板用于抗原抗體才全 測,這通常很難實現(xiàn)以及必須在同一天使用整個板,甚至當樣本的數(shù)目小 于整塊板所需的樣本數(shù)目時也必須使用整個板。這就意味著每天必須使用 一套新的不同的板。這就不利地導致了下述情況即檢測一經完成,在結 果錯誤或者延長接種期后就無剩余的細胞可以用于重復所述過程。而且, 每塊板通常只可使用 一種或兩種不同的細胞系并且需將相同類型的樣本 接種于板上。
如澳大利亞創(chuàng)新專利第2001100242號中所描述的單孔法(Single well methodology)緩解了與以上描述的常規(guī)方法相關的問題,并且提供了一 種用于進行病毒診斷的備選的、有效和經濟的方法。該專利的全部公開內 容在此完整引入作為參考。
當扁平底部型池用于診斷測定的場合時,已知其具有某種優(yōu)勢。特別 地,所述扁平底部型池與所述圓形或彎曲型池相比提供了更為精確的分 析。但是,簡單的扁平底部型池也具有不利之處,其中在該池的底部趨向 于形成彎液面(meniscus),從而使接觸該池底部的溶液呈不均勻地分布。
鑒于此,發(fā)明人研究了一種解決這種問題的如下所述的扁平底部型池。
發(fā)明內容
因此,本發(fā)明的第一個方面提供了在測定中使用的扁平底部型池
(flat-based well),所述池包括:
主室,所述主室具有容納液體樣品的開口 ,側壁從所述開口和室底部 延伸;和
副室,所述副室由所述主室的所述室底部延伸,并適于容納預定量的 液體樣品,其中所述副室具有扁平(flat)的底部。
這種布置方式有利地確保了放置在所述副室中的液體樣品不會從所 述主室的側壁形成向上的彎液面。相反,放置在所述副室中的液體樣品可 以保持由所述副室朝著所述主室延伸的凸起表面和/或保持由所述副室延
伸入所述主室的凸起表面。這種布置方式還確保存留任何液體樣品的底面 均為扁平型,從而提供如先前在上文中描述的更為精確的分析。
在本發(fā)明的另 一個實施方案中提供了池單元,其包括一個或多個依據 本發(fā)明的單個扁平底部型池。
在本發(fā)明的又一實施方案中,提供了一種進行測定的方法,所述方法 包括使用依據本發(fā)明的單個扁平底部型池或使用依據本發(fā)明的池單元。本發(fā)明的又一方面提供一種檢測病毒的方法,所述方法包括下述步
驟
提供接種有預先選擇的細胞系的如此處所描述的一個或多個依據本 發(fā)明的單個扁平底部型的池;
將待分析的樣本接種于一個或多個池;以及
在所述一個或多個池中對一種或多種預先選^^的病毒進行檢驗。
在本發(fā)明另外的實施方案中,提供了一種檢測病毒的方法,所述方法 包括下述步驟
提供接種有適用于接種病毒的細胞系的如此處所描述的依據本發(fā)明
的單個扁平底部型的池;
對樣本進行特異性預處理以便獲得可能含有待;險測病毒的樣品;
用所述樣品接種所述細胞系; 培養(yǎng)接種的細胞系;
將所述接種的細胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復培養(yǎng)基,所述病毒 恢復培養(yǎng)基包括添加有至少一種激素和至少一種酶的細胞培養(yǎng)基;
培養(yǎng)所述接種的細胞系;以及 分析所述接種的細胞系中存在的病毒。
在本發(fā)明的又一實施方案中,提供了依據本發(fā)明的單個扁平底部型池 或池單元在一全測中的用途。
測方法中的用途,所述方法包括下述步驟
提供接種有預先選擇的細胞系的如此處所描述的一個或多個依據本 發(fā)明的單個扁平底部型的池;
將待分析的樣本接種于一個或多個池;以及 在所述一個或多個池中對一種或多種預先選_^的病毒進行檢驗。
在本發(fā)明的又一實施方案中,提供了依據本發(fā)明的單個扁平底部型池 在病毒檢測方法中的用途,所述方法包括下述步驟
提供接種有適用于接種病毒的細胞系的如此處所描述的依據本發(fā)明 的單個扁平底部型的池;
對樣本進行特異性預處理以便獲得可能含有待;險測病毒的樣品;
用所述樣品接種所述細胞系;
培養(yǎng)接種的細胞系;
將樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復培養(yǎng)基,所述病毒恢復培養(yǎng)基包括添加 有至少一種激素和至少一種酶的細胞培養(yǎng)基;
培養(yǎng)所述接種的細胞系;并
分析所述接種的細胞系中存在的病毒。 附圖簡述在非限制性附圖中示出本發(fā)明的實施方案,其中
圖1是闡釋了池的透視圖的圖示;圖2是闡釋了池的部分側視圖的圖示;圖3是闡釋了池的仰視圖的圖示;以及圖4是典型的12x8排列的池構型的圖示。發(fā)明詳述主室和副室可以采用任何適宜的形式,只要所述副室由所述主室的室 底部延伸。單個扁平底部型的池可以采用任何適宜的形式,只要容納樣本 的池的底部為扁平型(flat)。例如,該池可以具有圓形、方形、三角形或六 角形的橫截面。此外,該池沿著其高度的橫截面可以是一致的??蛇x地, 該池可以是朝向其頂端或其底端的錐形。應理解的是該池是使用標準的材 料(如用于常規(guī)的微量滴定托盤裝置(micro titre tray assemblies )的材料) 和通過標準的技術形成的。優(yōu)選地,所述主室具有正方形的橫截面并且所述副室具有圓形的橫截 面。在此實施方案中,所述副室的圓形側面(circular side )的弧優(yōu)選地延 伸至所述主室每一個側面(side)的邊緣。這可根據更好地示出此特征的 附圖進行理解。通常,所述副室可以容納總量約為30 pi的預定體積,以使所述副室 中的液體樣品形成液滴(droplet),所述液滴有利地具有,人所述副室的開口 延伸的凸起表面;并且進一步使貫穿副室的液體的深度基本上不變,從而 消除所述液體樣品放置在池中并沿該池的側壁形成向上的彎液面的不利 之處。優(yōu)選地,所述主室與所述副室的高度比為10:1,而所述主室與所述副
室的寬度比在2:1和1:1之間。在優(yōu)選的實施方案中,所述池的高度為11 mm,其中包括10 mm高的主室和1 mm深的副室。所述池的寬度通常為 8mm,并且具有約為lmm的壁厚度,而所述副室的內部寬度約為6 mm。 因此,所述主室通常允許容納約360 pl的體積而所述副室通常允許容納約 28.3 (il的體積。假設將該池用于池單元,則這種特定的實施方案可以同等地^是供多種 優(yōu)勢,其中將許多池連接在一起并且不單獨使用。因此,根據本發(fā)明的備 選實施方案提供了包括一個以上的依據本發(fā)明的池的池單元。例如,池單 元可以是96或48孔板構型或者是澳大利亞創(chuàng)新專利第2001100242號中 所描述的單元。應為本領域技術人員理解的是,在需要將池插入板中的 一些測定方法 的場合中,該池可以設置有促進該池與其有待插入的孔板接合的裝置。例 如,該池可以為如上所述的錐形,以便在孔板的貯槽(receptacle)中提供 摩擦配合??蛇x地,該池可以設置有與其待插入的板的!i!i槽配套使用的肋 (rib)或凹痕(indentation)或凹才曹(groove)。在某些例子中,所述池在分析期間或搬運板的過程中可能從孔板脫 落。同樣地,在優(yōu)選的實施方案中,該池包括某種形式的標識,比如彩色 的編碼或標記。例如,該池可以具有指明其在斧反上位置(欄和排)的標記。為了有助于分析,該池還可以包括設置有標記刻度的扁平底部。例如,(crosshair)。因此,對四個部分之一的分析可以^是供對于整個扁平底部 分析有用的數(shù)據。應理解的是將扁平底部分成任何數(shù)目可適用于此目的。本發(fā)明的池具有相當廣泛的用途。泛泛地說,本發(fā)明的池可用于測定。 本領域技術人員應理解此類纟全測包括,但不限于酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、細菌細胞培養(yǎng)、PCR擴增技術、蛋白結晶技術、抗病毒易感 性測試和化學物質及藥物篩選技術。例如在一個實施方案中,本發(fā)明的池 可用于病毒診斷測定。如此處所用,對測定的參考應理解為對任何使用微量滴定池的常規(guī)實 驗技術的參考。
因此,本發(fā)明的第二個方面提供了一種檢測病毒的方法,所述方法包括下述步驟4是供接種有預先選擇的細胞系的如此處所描述的一個或多個依據本 發(fā)明的單個扁平底部型的池;將4寺分析的樣本接種于一個或多個池;并在所述一個或多個池中對一種或多種預先選擇的病毒進行檢- 驗。在本發(fā)明的一個實施方案中,提供了一種施行測定的方法,所述方法 使用如此處所描述的一個或多個依據本發(fā)明的單個扁平底部型池。該測定 優(yōu)選地為病毒診斷測定。在本發(fā)明的又一實施方案中,提供了一種檢測病毒的方法,所述方法 包括下述步驟提供接種有適用于接種病毒的細胞系的如此處所描述的依據本發(fā)明的單個扁平底部型池;對樣本進行特異性預處理以便獲得可能含有待檢測病毒的樣品;將所述樣品接種于所述細胞系;培養(yǎng)接種的細胞系;將所述接種的細胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復培養(yǎng)基,所述病毒 恢復培養(yǎng)基包括添加有至少 一種激素和至少 一種酶的細胞培養(yǎng)基;培養(yǎng)所述接種的細胞系;并分析所述接種的細胞系中存在的病毒。應理解的是,樣品培養(yǎng)基在此方法中通常為已接種有樣品的維持培養(yǎng) 基(maintenance media)。如此處所用,術語"單個扁平底部型的池"包括在其范圍內的、具有 任何4黃截面形狀的單個池,只要容納樣本的池的底部是扁平的。在本發(fā)明上下文的病毒診斷方面,單個扁平底部型池的使用經由采用 標準技術(比如倒置熒光顯微鏡法或光學顯微鏡法)確保了病毒的檢驗, 并提供了與檢驗如位于具有圓形或稍;微彎曲底部的池底部中的樣品相比
更為精確的結果??梢蕴峁┮呀浗臃N有預先選擇的細胞系的單個扁平底部型池,所述預 先選擇的細胞系將根據特定病毒或待分析病毒對于生長和分離的適應性而進行測定。例如,LLC-MK2細胞系適用于副流感病毒的檢測,MDCK 可用于流感病毒,HEP-2適用于呼吸道合胞病毒(RSV)以及MRC-5適 用于細胞巨化病毒(CMV)、單純皰滲病毒(HSV)、腸道病毒和鼻病 毒的檢測。本領域技術人員可以選擇適合給定病毒生長和分離的細胞系。應承認的是此處描述的接種的單個扁平底部型池可以適合在所選才奪 的測定中以即刻使用的形式提供(即,隨時使用的形式)。本領域沖支術人 員應理解的是,在隨時使用的形式中,預先選擇的細胞系通常具有約 80-卯%的融合率。還應理解的是,這樣預先選擇的細胞系的保存穩(wěn)定性 將取決于所提供的特定細胞系。胞。例如,-f旦不限于以任何方式進4于的細胞冷凍過程,所述細胞可以在單貯存培養(yǎng)基。在此步驟之后,細胞可以經受冷卻過程并最終于-70-80°C 貯存。貯存培養(yǎng)基可以含有或者可以不含冷凍保護劑??杉尤胭A存培養(yǎng)基 的冷凍保護劑不受特殊限制且可以包括DMSO和/或血清。本領域4支術人 員應該熟悉適宜的冷凍保護劑及其用途。并不是所有的細胞系都可以經過 冷凍過程存活下來而且本領域4支術人員應了解哪種細胞系適用于和不適 用于此目的。應認識到以冷凍形式提供的細胞系隨后應經受適當?shù)慕鈨鲞^程并且 將貯存培養(yǎng)基替換為病毒恢復培養(yǎng)基。本領域技術人員應理解的是細胞一 經解凍,隨后在如此處所述的本發(fā)明的方法中使用之前,通常生長至 80-卯%的融合率。對接受試驗的"接種"有細胞系的扁平底部型池的參考應理解為對于在供病毒診斷測定使用之前預先接種有預先選^r的細胞系的池的參考??蛇x地,接種的池實際上可以在供病毒診斷測定使用后再進行接種。池的接 種步驟可以包括下述子步驟將稀釋的預先選擇的細胞系沉積在池中的生 長培養(yǎng)基上,在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞直至細胞達到約80-90%的融合率 并將生長培養(yǎng)基替換為維持培養(yǎng)基。應理解的是,將直接用于特定病毒生長和分離的多個池進行比較時, 每個池中的培養(yǎng)基的體積應該是相同的。在某些實施方案中,將多個池接種有預先選擇的細胞系以便提供多孔 排列,例如用于96孔板的常規(guī)12x8排列,或者用于48孔板的6x8排列。 可選地,如果期望更大的排列,可以提供諸如14x8的排列。所提供的池 的數(shù)目不受特殊限制。應理解的是如果提供了這樣的排列,則通常再次才艮 據待檢測的病毒而將不同的細胞接種于該排列的不同的欄。密封件以使其能夠進行運輸并防止污染和蒸發(fā)。例如,在多個池的情況下, 該密封件可以呈蓋子的形式,其安裝在多個池的全部排列的上方,如標準 的48或96孔板蓋子。可選地,在單個扁平底部型池的情況下,該密封件 可以采用適合密封單個池的蓋子的形式。在另外的備選情況下,該密封件 可以為適宜的密封膜。還應理解的是,如此處所描述的不管是用于多個池的蓋子或者是用于 依據本發(fā)明的單個扁平底部型池的蓋子均可包括有助于使用的標記。例 如,所述蓋子可以包括表示其中含有的細胞系的符號或字母。將待分析的樣本接種于 一種或多種細胞的步驟依據已知的過程而進 行。例如,該步驟通常包括從有待接種的每個池中除去適當量的維持培養(yǎng) 基,并使通常約為200-300 pl量的樣本上清液沉積入每個池中。然后將該 池進行離心/培養(yǎng),例如根據所使用的離心機類型在35。C下以4000 rpm離 心50-60分鐘。由離心機取下后,可以通過例如真空吸引術從池中除去接種物并替換 為適宜的維持培養(yǎng)基或病毒恢復培養(yǎng)基。所述病毒恢復培養(yǎng)基優(yōu)選包括添 加有激素和酶的細胞培養(yǎng)基。如此處所用,術語"待分析的樣本,,包括從受試者獲得的樣品樣本,
所述樣品樣本可能受到病毒感染或未受到病毒感染。因此,樣品可以含有可檢測的病毒或者無病毒。適宜的樣品可以由下述物質獲得唾液、血清、 尿、排泄物、腦脊液(CSF)、呼吸液,如支氣管肺泡灌洗液與鼻咽吸出 物、和諸如來自嘴、鼻腔、咽喉、皮膚和生殖器的化驗樣本??梢酝ㄟ^使 用與細胞系和病毒相容的適宜介質進行稀釋來制備使用的樣品樣本。受試者可以是任何可受病毒感染的動物物種。例如,受試者可以是禽 類、魚或哺乳動物。在某些實施方案中,受試者為哺乳動物。適宜的哺乳 動物包括養(yǎng)殖動物,如綿羊、牛、豬、鹿等等;伴侶動物,如狗、貓、兔、 豚鼠等等;實驗動物,如小鼠、大鼠、猴等等;圈養(yǎng)動物,如動物園和人 類圈養(yǎng)的動物。優(yōu)選的哺乳動物為人類。在其他的實施方案中,受試者可 以是禽類,特別是養(yǎng)殖的禽類,如雞和火雞。獲得適用于病毒檢測的樣品于聲波降解法和離心法。如此處所用,術語"病毒恢復培養(yǎng)基(virus recovery medium),,或 "病毒恢復培養(yǎng)基(vims recovery media),,指用于病毒生長和分離的培 養(yǎng)基(medium)或培養(yǎng)基(media)。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)配有激素和酶的細胞 培養(yǎng)基可通過下述情況有利地優(yōu)化(optimises)病毒恢復將細胞系保持 在最大的敏感性以及幫助病毒連接于細胞壁且在某種情況下,縮短獲得結 果所需的時間。酶。在某些實施方案中,術語"酶"指蛋白水解酶。在這些實施方案中, 酶優(yōu)選絲氨酸或天冬氨酸蛋白酶。示例性的酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶或 胃蛋白酶。在優(yōu)選的實施方案中,酶為胰蛋白酶。加至細胞培養(yǎng)基的激素并無限制并且本領域:技術人員可以確定合適 的激素。在某些實施方案中,術語"激素"指皮質類固醇,優(yōu)選糖皮質激 素。更優(yōu)選地,激素選自地塞米松、氫化可的+>、醋酸可的松、潑尼*>、 氳化潑尼松、甲基氫化潑尼松、倍他米松、氟羥潑尼松龍、倍氯米+>、醋 酸氟氫可的+>、醋酸脫氧皮質酮(DOCA)和醛固酮。在優(yōu)選的實施方案 中,激素為地塞米松。激素可以是合成的或者是天然形成的。 雖然激素和酶的組合是最優(yōu)選的實施方案,但是可選地,發(fā)現(xiàn)DMSO (二曱基亞砜)和DEAE (右旋糖普)也是有用的。加至培養(yǎng)基的酶的量優(yōu)選在1-5 !ig/ml范圍內,并且優(yōu)選約2.5 fig/ml。 培養(yǎng)基中激素的濃度優(yōu)選在10"M-1(^M范圍內并且優(yōu)選約10-SM。但是, 在優(yōu)選地塞米松和胰蛋白酶的情況下,發(fā)現(xiàn)添加有約2.5 lig/ml胰蛋白酶 和濃度約為1(T5M的地塞米松的細胞培養(yǎng)基得到了最佳結果。因此,本發(fā)明特定實施方案的方法采用了包括細胞培養(yǎng)基的病毒恢復 培養(yǎng)基,所述細胞培養(yǎng)基添加有2.5嗎/ml的胰蛋白酶和濃度為10-5]\4的 地塞米松??梢砸罁景l(fā)明使用的細胞培養(yǎng)基無特殊的限制。例如,這些細胞培 養(yǎng)基可以包括培養(yǎng)基199、 DMEM、 RPMI-1640或MEM-EAGLE。然而, 如同易于公認的,存在大量可以有助于細胞生長和本領域技術人員可以容 易獲得的不同的培養(yǎng)基。但是,根據優(yōu)選的實施方案,細胞培養(yǎng)基為 MEM-EAGLE。細胞培養(yǎng)基可以添加支持細胞和病毒生長的添加劑,并且此類添加劑 為本領域技術人員已知。已知特定的細胞系和/或病毒可能需要用于最佳 生長和發(fā)育的特異性添加劑。示例性的添加劑包括L-谷氨酸、氨基酸、 抗生素、血清、Hanks平衡鹽、如D-葡萄糖的糖類、無機鹽、維生素、苯 基紅、如HEPES的緩沖液以及如Tween 80的表面活性劑。以上描述的病毒恢復培養(yǎng)基可以在用于鑒別病毒的常規(guī)診斷過程中 使用,所述常規(guī)診斷的例子如常規(guī)的管法和快速培養(yǎng)法??蛇x地,病毒恢 復培養(yǎng)基可以在此處描述的本發(fā)明的方法中使用。在本發(fā)明的方法中使用的病毒恢復培養(yǎng)基可以用于多種不同病毒的 恢復,所述病毒適用于細胞培養(yǎng)。本領域技術人員應意識到此類病毒包括, 但不限于呼吸道病毒、副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A,B(Inf A,B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AD)、鼻病毒(RH)、細 胞巨化病毒(CMV)以及來自腸道病毒(ENT)的病毒,所述腸道病毒 由埃可病毒、科沙奇病毒、腸道病毒與脊髓灰質炎病毒組成;還有非呼吸 道病毒,所述非呼吸道病毒的例子有,但不限于單純皰滲病毒(HSV)1,2、
水痘帶狀皰滲病毒(vzv)、風滲、腮腺炎、麻瘆、輪狀病毒和多瘤病毒。在本發(fā)明的方法中,可以使用已知的條件將接種的細胞與有待分析的樣本進行培養(yǎng)。例如,可以將接種的細胞在37。C培養(yǎng)一段時間以使細胞 感染病毒,所述時間如45-90分鐘,特別是60分鐘??梢栽谂囵B(yǎng)箱中施 行培養(yǎng)或者可以使用離心法施行培養(yǎng)??梢允褂帽绢I域已知的常規(guī);險測方法來檢測病毒,所述常規(guī)檢測方法 諸如免疫檢測技術、常用的分子技術;所述免疫檢測技術的例子有免疫熒 光法、染色、CPE的顯像,所述常用的分子技術的例子有多聚酶鏈式反應 (PCR)、逆轉錄酶PCR (RT-PCR)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。為了制備用于考察的池,依據常規(guī)的方法學通常采用多次洗滌步驟。例如,通常除去維持培養(yǎng)基并將細胞在池中進行空氣干燥。然后可以將該池充滿例如冷的曱醇-丙酮混合物(l:2的比例)并在-25。C固定15分鐘。在除去混合物后,該池可以再次進行空氣千燥。隨后可以根據有待檢測的病毒將特異性的單克隆抗體加入每個池中,并根據需要將該池進行培養(yǎng)。然后可以棄去所述單克隆抗體并再次洗滌該池。該過程可以使用二抗重 智久o在最終的空氣干燥后,將1-2滴熒光封固劑加入池中并檢查熒光的強 度(contents )。現(xiàn)在參考示出本發(fā)明實施方案的附圖。參考圖1,有待依據本發(fā)明使用的特定優(yōu)選實施方案的扁平底部型池 10包括橫截面為方形的主室11和一黃截面為圓形的副室12。所述副室12 乂人所述主室11的室底部13延伸。這樣,所述副室的開口 14由所述主室 的室底部13界定。所述副室12的外壁15的弧形延伸至所述主室11的每 個壁16的外側(圖3最佳地示出)。主室11的一個壁16包括凹槽17,所述凹槽17用于容納有待將池10 放入的孔板(未顯示)的協(xié)同操作部分。這就使得池10牢固地鎖入板中 并解決了與池10由所述一反脫離相關的問題。副室12具有預先確定的體積,從而使其能夠容納液體樣品并使該液
體樣品有利地形成具有凸起表面的液滴,所述凸起表面自副室的開口 14延伸。這與置于池中并由該池的側壁形成向上的彎液面的液體樣品相比, 確保了穿過副室的液體的深度基本上不變。而在所對比的那樣情況下,形 成彎液面的池各面上的液體深度基本上大于彎液面最低點處的池中部的 液體深度。優(yōu)選地,池的高度X為llmm,其中包括主室的10mm高度Y和副 室的lmm深度Z。該池的整個寬度W通常為8 mm,并且具有約為1 mm 的壁厚T。因此,內部寬度Wi約為6mm。主室通常界定約360 pl的體積 而副室通常界定約28.3 ^的體積。圖4示例性地展示典型的12x8孔板構型(即2x6x8)的一個例子, 包括待檢測病毒的列表、相關的細胞系和每種細胞系的除去天數(shù)。該板由 96個依據本發(fā)明的單個扁平底部型池組成。如圖4所示,該板可以按照以下順序接種不同的細胞系1-3欄 LLC-MK24、 5欄 MDCK6欄 Hep27欄 A5498欄 RK139-12欄 MRC-5以此模式設置的板將允許選擇諸如下述的病毒,但不限于呼吸道病 毒副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A,B (InfA,B) 、 RSV、腺 病毒(AD)、鼻病毒(RH)、細胞巨化病毒(CMV)和來自腸道病毒(ENT) 的病毒,所述腸道病毒由??刹《?Eco)、科沙奇病毒(cox)、腸道病 毒(Ent)與脊髓灰質炎病毒(Polio )組成;以及但不限于非呼吸道病毒—— 單純皰瘆病毒(HSV) 1,2與水痘帶狀皰滲病毒(VZV)。在另外的實施例中,6x8孔板的構形可以由按下述順序接種的細胞系 組成1-3欄 A 5494-6欄 MRC-5這可允許例如以下病毒的檢測,例子有CMV、 HSV1,2、 VZV、 AD以及來自腸道病毒屬的那些病毒。最后,14x8孔的構形允許最終用于病原體的;f企測,所述病原體如PI 1,2,3,4、 InfA,B、 RSV、 AD、 RH、 ENT(Echo、 cox、 Ent、 Polio) 、 HSV 1,2、 VZV、風滲、腮腺炎、麻滲、輪狀病毒、多瘤病毒以及其他使用合 適的細胞系的病原體病毒。由于池的獨立的性質,可以根據適用于正在討論的特定病毒4企測的時 間表來選4奪除去的細胞系。特別地,取A排進行舉例,如果期望檢測PI 1 -4, 則在第二天除去池A1至A3。同樣地,如果期望檢測Inf A,B,則在第二 天除去池A4和A5。然而,如果需要檢測腸病毒,則隨后在合適的天數(shù) (1-3)除去池All。單個池的獨特性質使得這種選擇除去和病毒^r測更 加容易進行?,F(xiàn)在參考使用本發(fā)明一個方面的試劑盒所可能采取的特定的過程,,使用真空滅菌的玻璃巴斯德吸管從有待接種的所有池中吸出培養(yǎng)基。 在大的細長容器中處置巴斯德吸管是方便有利的。使用 一次性吸管使孔板的合適數(shù)目的池接種有約每池150-200 )il的樣 本。剩余的樣本在-7(TC保存。然后將蓋重新放置在板上并于板中接種的 池上方記錄日期。然后將板在數(shù)字天平上稱重并使用平衡板和平衡卡進行平衡直到所 有的板等重(+/- 0.5g)并且能夠在離心機中平衡。離心機在約37。C下 并以3500 rpm運行60 min。然后^f吏用真空滅菌的巴斯德吸管分別/人每個 池中吸出樣本,并且將每個池填滿病毒恢復培養(yǎng)基BAC,其中每個樣本 均使用干凈的一次性吸管。隨后在最后的樣本接種后通過將板小心地;故入C02培養(yǎng)箱并在37°C 培養(yǎng)長達七天來使樣品在37。C的C02培養(yǎng)箱(5% )中的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)。通過使用特異性的單克隆抗體,可以有利地將熒光免疫染色用于單個
池中特定病毒的4企測。通常,隨后的過程如下使用真空吸引器從合適的池中除去培養(yǎng)基并使用專用的鑷子從該板除去所述池并轉移入不同的支架。然后將這些物體空氣干燥3分鐘。之后 將300 ^的冷丙酮和甲醇的混合物(2:1 )加至每個池并允許在-20。C固定 15分鐘。隨后棄去固定液并將樣品再次空氣干燥2-3分鐘。接著往每個池 中加入特異性的單克隆抗體( 一抗)并將蓋有蓋子的板置入適當?shù)奈恢弥校?且將樣品在37。C培養(yǎng)30分鐘。然后從培養(yǎng)箱中移出樣品并且分別往池中 添加磷酸鹽緩沖液(PBS)。隨后棄去PBS。此過程重復四次以上。再次 將樣品空氣干燥3分鐘,之后往每個池中加入對所述單抗具有特異性的二 抗。該步驟后,再次進行樣品的培養(yǎng),繼之使用如上所述的PBS重復處 理且最后使用雙蒸水洗滌。然后加入少量(l滴)專門制備的封固劑并在 熒光顯微鏡下觀察結果。也可以采用一步熒光免疫染色法。除非上下文另有要求,否則遍及本說明書和隨后的權利要求的詞匯 "包括(comprise )"及其變體如"包括(comprises ),,和"包括(comprising ),, 應理解為包含所規(guī)定的整體或整體組合或步驟而不排除任何其他的整體 或整體組合或步驟。本領域技術人員應理解,除了專門描述的之外,可以對本文描述的本 發(fā)明進行變化和改進。應該理解的是本發(fā)明包括所有這樣的變化和改進。 本發(fā)明還包括在說明書中分別涉及或標明的或者共同涉及或標明的所有 步驟、特征、組合物和化合物,以及任意兩種或多種所述步驟或特征的任 意組合和全部組合。
權利要求
1.一種適合在測定中使用的單個扁平底部型的池,所述池包括(i)主室,所述主室具有容納液體樣品的開口;側壁從所述開口和室底部延伸;和(ii)副室,所述副室從所述主室的所述室底部延伸,并適于容納預定量的所述液體樣品,其中所述副室具有扁平的底部。
2. 根據權利要求1所述的單個扁平底部型的池,其中所述主室具有 方形的橫截面而所述副室具有圓形的橫截面。
3. 根據權利要求1或2所述的單個扁平底部型的池,其中所述池設 置有促進與其內插入所述池的孔;i^接合的裝置。
4. 根據權利要求3所述的單個扁平底部型的池,其中所述池是錐形 以便在所述孔板的貯槽中提供摩擦配合。
5. 根據權利要求3所述的單個扁平底部型的池,其中所述池設置有 與所述孔板的所述貯槽配合使用的肋或凹痕或凹槽。
6. 根據權利要求1-5任一項所述的單個扁平底部型的池,其中所述池 包^fe標識形式。
7. 根據權利要求6所述的單個扁平底部型的池,其中所述扁平的底 部設置有適用于輔助分析的標記刻度。
8. 根據權利要求l-7任一項所述的單個扁平底部型的池,其接種有在 病毒恢復培養(yǎng)基中的預先選擇的細胞系,所述接種的池提供用于冷凍或者 隨時可使用。
9. 一種池單元,其包括一個以上的如權利要求l-8任一項所述的單個 扁平底部型的池。
10. —種施行測定的方法,所述方法包括使用如權利要求l-8任一項 所述的單個扁平底部型的池或者使用如權利要求9所述的池單元。
11. 一種檢測病毒的方法,所述方法包括下述步驟 (i )提供接種有預先選"^的細胞系的一個或多個如權利要求1-8任一 項所述的單個扁平底部型的池;(ii) 將待分析的樣本接種于一個或多個池;以及(iii) 在所述一個或多個池中對一種或多種預先選擇的病毒進行檢驗。
12. —種檢測病毒的方法,所述方法包括下述步驟(i )提供接種有適用于接種病毒的細胞系的如權利要求1-8任一項所 述的單個扁平底部型的池;(ii )對樣本進行特異性預處理以便獲得可能含有待檢測病毒的樣品;(iii) 將所述樣品接種于所述細胞系;(iv) 培養(yǎng)所接種的細胞系;(v) 將所接種的細胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復培養(yǎng)基,所述 病毒恢復培養(yǎng)基包括添加有至少一種激素和至少一種酶的細胞培養(yǎng)基;(vi) 培養(yǎng)第(v)步所得的所述接種的細胞系;以及(vii) 分析第(vi)步所得的所述細胞系中存在的病毒。
13. 根據權利要求l-8任一項所述的單個扁平底部型的池或者根據權 利要求9所述的池單元在測定中的用途。
14. 根據權利要求l-8任一項所述的單個扁平底部型的池在病毒檢測 方法中的用途,所述方法包括下述步驟(i )提供接種有預先選擇的細胞系的一個或多個如權利要求1-8任一 項所述的單個扁平底部型的池;(ii) 將待分析的樣本接種于一個或多個池;以及(iii) 在所述一個或多個池中對一種或多種預先選擇的病毒進行檢驗。
15. 根據權利要求l-9任一項所述的單個扁平底部型的池在病毒檢測 方法中的用途,所述方法包括下述步驟(i )提供接種有適用于接種病毒的細胞系的如權利要求1-8任一項所 述的單個扁平底部型的池;(ii )對樣本進行特異性預處理以便獲得可能含有待檢測病毒的樣品;(iii) 將所述樣品接種于所述細胞系;(iv) 培養(yǎng)所接種的細胞系;(v) 將所接種的細胞系的樣品培養(yǎng)基替換為病毒恢復培養(yǎng)基,所述 病毒恢復培養(yǎng)基包括添加有至少一種激素和至少一種酶的細胞培養(yǎng)基;(vi) 培養(yǎng)第(v)步所得的所述接種的細胞系;以及(vii) 分析第(vi)步所得的所述細胞系中存在的病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適于病毒診斷方法使用的單個扁平底部型的池。更具體地說,該池具有與彎曲的底部相對的平面或扁平的底部。本發(fā)明還涉及采用這種單個池的病毒診斷方法。在該方法的一個實施方案中,采用了添加有激素和酶的專門研制的組織培養(yǎng)基。
文檔編號C12M1/18GK101163787SQ200680013020
公開日2008年4月16日 申請日期2006年3月10日 優(yōu)先權日2005年3月10日
發(fā)明者羅伯特·亞歷山大 申請人:羅伯特·亞歷山大