專利名稱：：具有提高的貯存穩(wěn)定性的治療用病毒制劑的制作方法具有提高的貯存穩(wěn)定性的治療用病毒制劑相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)請(qǐng)求2005年3月1日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/656,883的利益，將該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及治療用病毒制劑，且更具體地說，本發(fā)明涉及包含一種或多種穩(wěn)定劑，包括含水共溶劑，可逆衣殼內(nèi)蛋白酶抑制劑和/或溫和還原劑的治療用病毒制劑。技術(shù)背景打算應(yīng)用于人體治療應(yīng)用的病毒粒子必須維持其結(jié)構(gòu)完整性以便保持生物活性。然而，在一段延長的時(shí)間內(nèi)病毒載體制劑的貯存可能導(dǎo)致生物活性下降。一般在允許貯存一段延長的時(shí)間的緩沖液中配制目前的病毒治療劑。然而，必須在相對(duì)低溫下維持和運(yùn)送這類制劑以便維持其生物活性?；钚詥适ǔ０l(fā)生在貯存過程中。在相對(duì)低溫下1^存和運(yùn)送可用于將滴度的降低減小到最低限度，不過，其對(duì)于病毒治療劑在缺乏在適當(dāng)條件下貯存該病毒的設(shè)備的臨床環(huán)境中使用的成本和能力來說舉足輕重。許多已知的病毒，包括用作治療性病毒栽體的那些病毒包括外衣殼(即腺病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒)。為了在細(xì)胞進(jìn)入過程中允許外衣殼脫殼，大部分衣殼蛋白與相鄰衣殼蛋白非共價(jià)結(jié)合。這些非共價(jià)相互作用的強(qiáng)度足以維持在胞外介質(zhì)中衣殼裝配狀態(tài)一段有效的時(shí)間，但在某些生物條件(即低pH、因受體結(jié)合導(dǎo)致的特異性構(gòu)象改變、酶促降解等)下不夠穩(wěn)定。這使得它們?cè)诟腥具^程中解裝配。使衣殼蛋白-蛋白結(jié)合保持穩(wěn)定的試劑可應(yīng)用于治療性病毒產(chǎn)品制劑。已知腺病毒與衣殼內(nèi)病毒編碼的蛋白酶裝配。腺病毒脫殼為導(dǎo)致病毒DNA釋放入核和病毒衣殼解離的逐步過程。已經(jīng)證實(shí)位于衣殼內(nèi)部的半胱氨酸蛋白酶L3/p23抑制劑阻斷蛋白VI的降解，表明需要L3/p23蛋白酶在進(jìn)入前裝配病毒，而且使進(jìn)入的病毒解離。其它病毒也可以依賴于衣殼內(nèi)蛋白酶作為其生活周期的一部分。引起配制病毒中蛋白酶活化的事件可以導(dǎo)致配制病毒的降解，從而導(dǎo)致不穩(wěn)定性和失活。因此，對(duì)用于治療應(yīng)用的在商業(yè)上合理的條件下展示出最低程度的降解和貯存穩(wěn)定性的病毒載體制劑存在需求。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及生產(chǎn)和貯存來自培養(yǎng)細(xì)月包的病毒，包括，但不限于腺病毒的改善的方法。該生產(chǎn)方法提供了導(dǎo)致病毒穩(wěn)定性改善和貯存過程中滴度下降減少的新的制劑。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及貯存加工后的病毒的制劑。該制劑可以在冷凍和非冷凍條件下且特別是在室溫下保持病毒活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，通過抑制蛋白VI的降解來實(shí)現(xiàn)這一目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的制劑包含一種或多種含水共溶劑、可逆病毒編碼蛋白酶抑制劑和防止病毒成分特異性降解的溫和還原劑或其它試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的制劑包含腺病毒載體、ARCA緩沖液和選自丙二醇、DMS0、PEG、蔗糖、甘油和四氫呋喃聚乙二醇醚的含水共溶劑，其中該制劑展示出在2'C-30。C下高于缺乏所述含水共溶劑的制劑的穩(wěn)定性。所述的含水共溶劑可以為濃度約為3-20%的丙二醇；濃度約為5-20°/。的四氫呋喃聚乙二醇醚；總濃度，即10%,20%,30%，40%，50%或60%的蔗糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的制劑包含依賴于適于進(jìn)入細(xì)胞的病毒編碼的衣殼內(nèi)蛋白酶的腺病毒載體和可逆蛋白酶抑制劑，其中該制劑展示出在2°C-30x:下高于缺乏所述可逆蛋白酶抑制劑的制劑的穩(wěn)定性。所述的可逆蛋白酶抑制劑可以為濃度約為0.5-2.0%或50-200mM的硫代甘油；濃度約為10-100mM的二曱基硫醚；濃度約為20-100mM，優(yōu)選50mM的二硫蘇糖醇(DTT);濃度為至少1%或150mM的半胱氨酸；谷胱甘肽；和甲硫氨酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于貯存腺病毒栽體的制劑，其包括含水共溶劑和可逆蛋白酶抑制劑(如上所述)。優(yōu)選該制劑在5。C或3(TC下貯存時(shí)展示出高于不添加含水共溶劑和/或可逆蛋白酶抑制劑的制劑的穩(wěn)定性。附圖筒述附圖1A和1B為表示對(duì)于貯存在5'C下的Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml),10wt.%PEG制劑(附圖1A)和貯存在25°C下的Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml),ARCA制劑(附圖1B)而言作為貯存時(shí)間的函數(shù)的陰離子交換(AE)HPLC保留時(shí)間變化的示意圖。附圖2A為表示對(duì)于貯存在25。C下的在ARCA緩沖液中的Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)制劑而言作為貯存時(shí)間的函數(shù)的AE-HPLC色i普?qǐng)D峰的保留時(shí)間改變(ART)的示意圖，所述的色譜圖峰代表完整衣殼病毒體(ICV)和空五鄰體病毒體(PVV)。附圖2B為表示作為附圖2A中所述的腺病毒制劑的貯存時(shí)間的函數(shù)的起始完整衣殼病毒體(ICV)和空五鄰體病毒體(PVV)的百分比的示意圖。附圖2C為表示作為附圖2A中所述的腺病毒制劑的貯存時(shí)間的函數(shù)的起始完整衣殼病毒體(ICV)、病毒體粒子(VP)(ICV+PVV)和GM-CSF分泌的百分比的示意圖。附圖3為表示保留時(shí)間的制劑依賴性變化的作為貯存在5'C下的各種Ad/GM-CSF(2xlO'2vp/ml)腺病毒制劑的貯存時(shí)間的函數(shù)的RT(分鐘)改變的示意圖。附圖"和化為例示腺病毒蛋白降解的反相(RP)HPLC圖，其中附圖4A為在0時(shí)lx1012vp/ml的Ad/GM-CSF的ARCA溶液的圖且附圖4B為在15C下貯存12個(gè)月后相同腺病毒溶液的圖。附圖5A為表示作為Ad/GM-CSF(1.2xl012vp/ml)在顯示出各種共溶劑(O.75M)的作用的ARMWG(IOmMTris，25raMNaCl,2.5%甘油，pH8)中的制劑連同ARCA對(duì)照制劑在30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體(ICV。)百分比的示意圖。附圖5B為表示作為Ad/GM-CSF(1.2xl012vp/ml)在顯示出各種添加劑(12。/。重量)的作用的ARMWG(IOmMTris，25mMNaCl，2.5%甘油，pH8)中的制劑與ARCA對(duì)照品在30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體(ICV。)百分比的示意圖。附圖6為表示作為CG7060腺病毒(2xl012vp/ml)在顯示出各種濃度的蔗糖添加劑的作用的ARCA中的制劑在5。C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體(ICV。)百分比的示意圖。附圖7為L3/p23蛋白酶結(jié)構(gòu)的圖示說明。附圖8A為表示作為Ad/GM-CSF在使用和不使用NEM預(yù)處理的情況下在ARCA緩沖液中的溶液在30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體(ICV。)百分比和GM-CSF分泌率(GSR)的示意圖。附圖8B為表示作為Ad/GM-CSF在使用和不使用NEM預(yù)處理的情況分比的示意圖。附圖9A為表示作為Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)在顯示出DTT單獨(dú)預(yù)處理或依次至NEM預(yù)處理的作用的ARCA緩沖液中的制劑在30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體(ICVo)百分比的示意圖。附圖9B為表示作為Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)在包括15或50mM體(ICV。)百分比的示意圖。附圖9C為表示作為Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)在使用和不使用5mM二酰胺(N，N，N'，N'-四甲基偶氮二羧酰胺)預(yù)處理的情況下在ARCA緩沖液中的制劑在25'C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體(ICV。)百分比的示意圖。附圖IO為表示作為Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)在包括各種L3/p23蛋白酶抑制劑或溫和還原劑的ARCA緩沖液中的制劑在30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體(ICV。)百分比的示意圖。附圖11為表示作為Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)在包括選擇的L3/p23蛋白酶抑制劑或溫和還原劑的ARCA中的制劑在30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)的蛋白VI(VI。)百分比的示意圖，其中預(yù)先證實(shí)選擇的L3/p23蛋白酶抑制劑或溫和還原劑導(dǎo)致在30。C下完整衣殼病毒體(ICV。)百分比得以維持一定時(shí)間。詳細(xì)描述定義除非另作陳述，否則在實(shí)施本發(fā)明的方面中使用屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員技能范圍內(nèi)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)技術(shù)。除非另作陳述，否則，本文所用的所有術(shù)語均具有與所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員所知的相同的含義，并且實(shí)施本發(fā)明將使用化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的常規(guī)4支術(shù)。在描述本發(fā)明的過程中，使用下列術(shù)語并且指定如下所述定義它們。術(shù)語"載體"、"多核苷酸載體"、"多核苷酸載體構(gòu)建體"、"核酸載體構(gòu)建體"和"載體構(gòu)建體"在本文中可互換使用，意指如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的用于基因轉(zhuǎn)移的任何核酸構(gòu)建體。本文所用的術(shù)語"病毒載體"按照其公認(rèn)的含義使用。它指的是包括至少一種病毒來源的元件并且可以包裝入病毒載體粒子的核酸載體構(gòu)建體。病毒載體粒子可以用于在體外或體內(nèi)將DNA、RNA或其它核酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞的目的。本文所用的術(shù)語"病毒"、"病毒粒子"、"栽體粒子"、"病毒栽體粒子"和"病毒體"可以互換使用并且廣義上被理解為意指在例如將本發(fā)明病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入合適的細(xì)胞或細(xì)胞系以便產(chǎn)生感染粒子時(shí)形成的感染性病毒粒子。本發(fā)明的病毒粒子可以用于在體外或體內(nèi)將核酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞的目的。本發(fā)明中〗吏用的載體可以任選編碼選擇標(biāo)記。本文所用的術(shù)語"腺病毒"和"腺病毒粒子"(可互換使用)意指可以被分類為腺病毒的任何和所有病毒，包括感染人或動(dòng)物的任何腺病毒，包括所有類群、亞型和血清型。因此，除非另作陳述，否則本文所用的"腺病毒"和"腺病毒粒子"和重組形式。這類腺病毒可以為野生型或可以按照本領(lǐng)域中公知的各種方式或如本文披露的加以修飾。這類修飾包括修飾包裝在粒子中的腺病毒基因組以便形成感染性病毒。這類修飾包括本領(lǐng)域中已知的缺失，諸如Ela,Elb，E2a,E2b，E3或E4編碼區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)的缺失。"復(fù)制"和"增殖"可以互換使用并且意指病毒載體再生或增殖的能力。這些術(shù)語為本領(lǐng)域眾所周知的。就本發(fā)明的目的而言，復(fù)制包括腺病毒蛋白的產(chǎn)生并且一般涉及腺病毒的再生?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中和本文所述的標(biāo)準(zhǔn)測定方法，諸如病毒產(chǎn)率測定、裂解測定或噬菌斑測定來測定復(fù)制。"復(fù)制"和"增殖"包括病毒生產(chǎn)過程中直接或間接涉及的任何活動(dòng)，包括，但不限于病毒基因表達(dá)；病毒蛋白、核酸或其它成分的產(chǎn)生；病毒成分包裝成完整病毒；和細(xì)胞裂解。本文提及核酸分子時(shí)所用的術(shù)語"重組"指的是使用重組DNA技術(shù)共同連接成子代核酸分子的核酸分子的組合。在提及病毒、細(xì)胞和生物體時(shí)，本文所用的術(shù)語"重組的"、"轉(zhuǎn)化的"和"轉(zhuǎn)基因的"指的是已胞或生物體。就導(dǎo)入異源核酸分子而言，可以穩(wěn)定地將核酸分子整合體外分子可以自我復(fù)制。應(yīng)理解重組病毒、細(xì)胞和生物體不僅包括轉(zhuǎn)化過程的終產(chǎn)物，而且包括其重組的子代。"非轉(zhuǎn)化的"、"非轉(zhuǎn)基因的"或"非重組的"宿主指的是不含異源核酸分子的野生型病毒、細(xì)胞或生物體。本文所用的術(shù)語"復(fù)制型"意指優(yōu)先在某些類型的細(xì)胞或組織中復(fù)制，但在其它類型中復(fù)制程度較低或根本不復(fù)制的栽體和病毒粒子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，載體為在腫瘤細(xì)胞或異常增殖組織，諸如實(shí)體瘤和其它贅生物中選擇性復(fù)制的復(fù)制型腺病毒載體和/或粒子。它們包括在美國專利US5，677，178、US5，698，443、US5，871，726、US5，801，029、US5，998,205和US6，432，700和PCT/>開文獻(xiàn)WO95/19434、WO98/39465、WO98/39467、WO98/39466、WO99/06576、WO98/39464和WO00/15820中披露的病毒。這類病毒可以被稱作"溶瘤病毒"或"溶瘤載體"并且可以被視為"溶細(xì)胞的"或"致細(xì)胞病變的"并且對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行"選擇性細(xì)胞溶解"。術(shù)語"復(fù)制條件病毒"、"優(yōu)先復(fù)制病毒"、"特異性復(fù)制病毒"和"選擇性復(fù)制病毒"為可互換使用并且為優(yōu)先在某些類型的細(xì)胞或組織中復(fù)制，但在其它類型細(xì)胞或組織中復(fù)制程度較低或根本不復(fù)制的復(fù)制型病毒載體和粒子的術(shù)語。"宿主細(xì)胞"包括可以為或已經(jīng)為用于實(shí)施本發(fā)明的病毒載體受體的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單宿主細(xì)胞的子代，并且該子代因天然、偶然或故意突變和/或改變而可以不一定(在形態(tài)上或在總DNA互補(bǔ)物上)與原始親代細(xì)胞完全相同。本文所涉及的宿主細(xì)胞包括使用病毒載體在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。術(shù)語"病毒允許的"意指病毒或病毒載體能夠在宿主細(xì)胞系的細(xì)胞環(huán)境內(nèi)完成整個(gè)胞內(nèi)生活周期。術(shù)語"藥學(xué)上或藥理學(xué)上可接受的"指的是如果合適，在對(duì)動(dòng)物或人給予時(shí)不會(huì)產(chǎn)生不良、過敏或其它不需要的反應(yīng)的分子本體和組合物。本文所用的"藥學(xué)上可接受的載體"包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗微生物劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這類介質(zhì)和試劑在藥物活性物質(zhì)中的應(yīng)用為本領(lǐng)域眾所周知的。除任何常用介質(zhì)或試劑與活性組分不相容以外，其在治療組合物中的應(yīng)用受到關(guān)注。還可以將補(bǔ)充的活性組分摻入組合物中。本文所用的"穩(wěn)定劑"指的是用于提高制劑中病毒或病毒粒子的穩(wěn);定性或維持其生物活性的成分?？梢曰谄鹗纪暾職げ《倔w的百分比(。/JCV。)、起始蛋白VI的百分比WVI。)、根據(jù)每ml中病毒粒子(VP/mL)的感染滴度測定的穩(wěn)定性；六鄰體FACS、GM-CSF分泌水平等來確定提高的病毒穩(wěn)定性。本文所用的術(shù)語"含水共溶劑"指的是與水易混溶的小有機(jī)分子，,諸如丙二醇、甘油縮曱醛、DMSO、低分子量聚乙二醇(PEG)、濃度高于5wt.。/。的蔗糖、甘油和四氫呋喃聚乙二醇醚。本文所用的術(shù)語"可逆衣殼內(nèi)蛋白酶抑制劑"指的是衣殼化病毒編碼的L3/p23半胱氨酸蛋白酶的可逆抑制劑?？梢云?可逆衣殼內(nèi)蛋白酶抑制劑"作用的化合物的實(shí)例包括硫代甘油、半胱氨酸、谷胱甘肽、;二硫蘇糖醇(DTT)、甲硫氨酸和二甲基硫醚。本文所用的術(shù)語"溫和還原劑"一般指的是硫代或巰基化合物，諸如硫醇類和硫醚類。本文所用的術(shù)語"ARCA"指的是用于包含約5°/。蔗糖、1%甘氨酸、lmMMgCl2和10mMTris+0.05%聚山梨醇酯80(也稱作"Tween80")'的病毒制劑的緩沖液。所謂術(shù)語"個(gè)體"、"受試者"、"哺乳動(dòng)物受試者"或其語法上的等效物意指個(gè)體哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的制劑和方法;本文描述了在-20'C-室溫的溫度下貯存腺病毒載體制劑的各種穩(wěn)定化策略。已經(jīng)證實(shí)這些穩(wěn)定化策略可提供長期的物理化學(xué)穩(wěn)定性和在一段時(shí)間內(nèi)病毒感染性的維持或強(qiáng)化。制劑包括作為液體溶液或混懸液的可注射組合物；還可以制備適合于在注射前溶于或懸浮于液體中的固體形式。還可以使這些制劑乳化。用于此目的的典型組合物包含藥學(xué)上可接受的載體。例如，該組合物可以在每毫升磷酸鹽緩沖鹽水中包含約100mg的人血清白蛋白。其它藥學(xué)上可接受的栽體包括水溶液，無毒性賦形劑，包括鹽，防腐劑，緩沖液等。在制劑中可以包含防腐劑，包括抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體。根據(jù)病毒濃度、貯存溫度等調(diào)整在藥物組合物中各種成分的pH和確切濃度，并且這類調(diào)整為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢园凑毡景l(fā)明所需的貯存條件進(jìn)一步優(yōu)化制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特別是就為臨床應(yīng)用配制的病毒而言，以液體形式貯存樣品，優(yōu)選將其貯存在低溫下，通常低于約l(TC，更通常的是約5'C或低于5。C的溫度。就冷凍貯存，例如在-20。C或-80。C下冷凍貯存的樣品而言，合適的緩沖液如上所迷。一般以約1011-約2x10"個(gè)粒子/ml的病毒濃度貯存腺病毒制劑，其中在以濃縮程度較低的形式貯存時(shí)，顯然穩(wěn)定性較高。將本發(fā)明的藥物組合物配制成與其預(yù)期給藥途徑相容。給藥途徑的實(shí)例包括非腸道，例如靜脈內(nèi)、同位、真皮內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)、透皮(局部)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)粘膜、靜脈內(nèi)注射、口服(例如吸入)；和直腸給藥。一般將這類組合物作為包括生理學(xué)上可接受的載體、緩沖液或其它賦形劑的藥學(xué)上可接受的組合物給藥。就對(duì)腫瘤施用而言，考慮直接肺瘤內(nèi)注射、注射切除的肺瘤床、區(qū)域(即淋巴)或全身給藥。還需要在數(shù)小時(shí)或數(shù)天內(nèi)通過導(dǎo)管對(duì)疾病部位，例如腫瘤或腫瘤部位進(jìn)行連續(xù)灌流。有效量為足以實(shí)現(xiàn)有益或所需效果，包括臨床效果的量?？梢砸砸淮位蚨啻谓o藥給予有效量。就本發(fā)明的目的而言，腺病毒載體的有效量為足以緩解、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減緩或延遲疾病狀態(tài)進(jìn)展的量。根據(jù)個(gè)體的健康狀況、疾病的程度、給藥途徑、給藥劑量的次數(shù)和期望的目標(biāo)確定給予的量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，特別是就為臨床應(yīng)用配制的病毒而言，以液體形式貯存樣品，優(yōu)選將其貯存在低溫下，通常低于約IO'C，更通常的是低于約5'C。就這類情況而言，本文描述了腺病毒載體的液體制劑的各種穩(wěn)定化策略。已經(jīng)證實(shí)這些穩(wěn)定化策略可提供長期的物理化學(xué)穩(wěn)定性和在一定的時(shí)間內(nèi)病毒感染性的維持或強(qiáng)化。這些策略包括使用包含如下成分中的一種或多種的制劑(l)含水共溶劑；(例如丙二醇或甘油)作為促進(jìn)衣殼頂角蛋白(capsidvertexprotein)優(yōu)先水化的試劑；(2)衣殼化病毒編碼的L3/p23蛋白酶半胱氨酸蛋白酶的可逆抑制劑(例如硫醇類或硫醚類)；和(3)溫和的還原劑或其它防止病毒成分特異性降解的試劑。盡管不希望受到理論約束，但是提出的可逆L2/p23蛋白酶抑制劑的作用機(jī)理在于防止用作頂角黏合蛋白(vertexcementprotein)的蛋白VI消化(Greber等(1996);EMBOJ.15(8)),由此防止五鄰體復(fù)合物從衣殼頂角中解離。五鄰體復(fù)合物從病毒衣殼中解離使得病毒體在生物學(xué)上失活。因此，通過在腺病毒制劑中包含含水共溶劑、可逆病毒編碼的蛋白酶抑制劑或溫和的還原劑防止這種解離事件導(dǎo)致病毒感染性在一定的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。抑制劑的作用方式可以是直接抑制蛋白酶活性位點(diǎn)或通過經(jīng)蛋白酶和/或pVIc蛋白酶輔因子的遠(yuǎn)側(cè)區(qū)與抑制劑的相互作用對(duì)活性部位誘導(dǎo)構(gòu)象改變來間接抑制活性位點(diǎn)(Jones等(1"6);J.Gen.Vir.77，1821-1824)。在實(shí)施例和附帶數(shù)據(jù)中提供了有關(guān)蛋白酶抑制作用機(jī)理的證據(jù)。一類L3/p23抑制劑，即溫和的還原劑也用于通過清除氧化種類抑制衣殼蛋白，尤其是六鄰體的氧化?？寡趸瘎┮话?例如BHT和BHA)會(huì)防止衣殼蛋白氧化并且包含它們作為本發(fā)明的成分。共溶劑可以用于促進(jìn)頂角復(fù)合物表面的優(yōu)先水化(Gekko和Timasheff(1981)，Biochemistry20，4667-4676;Arakawa和Timasheff(1982)，Biochemistry21，6536-6544)，從而提高五鄰體從五鄰體外周六鄰體中和五鄰體外周六鄰體從小面六鄰體中解離的勢能。共溶劑表現(xiàn)出對(duì)核糖體復(fù)合物(Douzou(1986)，Cryobiology2、38-47)和對(duì)裝配的微管蛋白(Pittz和Timasheff(1978);Biochemistry17，615-623)提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。足夠高濃度的共溶劑，諸如蔗糖、甘油、甘油縮甲醛、丙二醇或四氫吹喃聚乙二醇醚也可以抑制L3/p23蛋白酶的活性位點(diǎn)且由此用作眾多已經(jīng)描述的抑制劑類穩(wěn)定劑。共溶劑的優(yōu)先水化作用可以用于降低頂角中的構(gòu)象改變速率，從而導(dǎo)致蛋白酶接觸蛋白VI或其它的頂角蛋白之間結(jié)合的"解鎖"。證實(shí)五鄰體-解離事件的觸發(fā)點(diǎn)為病毒體濃度依賴性的(如本文提供的數(shù)據(jù)所顯示的)提示共溶劑穩(wěn)定化的額外方法可能是因通過增加溶液的粘度降低了病毒體碰撞頻率所致。本發(fā)明的制劑應(yīng)用于穩(wěn)定包含病毒的粗或半純的加工中間體和病毒在液態(tài)下進(jìn)行的加工步驟并且由一系列步驟導(dǎo)致最終配制的產(chǎn)物過程中的原位穩(wěn)定。例如，可以在收集步驟時(shí)加入U(xiǎn)/p23蛋白酶抑制劑以便防止蛋白VI在下游加工過程中的消化，并且可以在色鐠洗脫和導(dǎo)致高區(qū)域病毒濃度的切向流過濾過程中使用中等到高濃度的病毒相容性共溶劑作為保護(hù)病毒滴度的手段。已經(jīng)進(jìn)行了許多研究來測試包含含水共溶劑、可逆病毒編碼的蛋白酶抑制劑和溫和的還原劑中的一種或多種的各種制劑，正如下文實(shí)施例部分中進(jìn)一步描述的。腺病毒載體本發(fā)明關(guān)注任何和所有的腺病毒血清型在構(gòu)建本發(fā)明制劑中的腺病毒載體和病毒粒子中的應(yīng)用。本發(fā)明可以使用的腺病毒儲(chǔ)備包括任何的腺病毒血清型。腺病毒血清型目前可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC，Manassas,VA)，并且本發(fā)明包括可得自任何來源的腺病毒的任何其它血清型。本發(fā)明可以使用的腺病毒可以來源于人或非人，諸如牛、豬、犬、猿猴、禽類。例如，腺病毒可以屬于亞型A(例如血清型l2、18、31)、亞型B(例如血清型3、7、11、14、16、21、34、35、50)、亞型C(例如血清型1、2、5、6)、亞型D(例如血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36、39、42、47、49、51)、亞型E(血清型4)、亞型F(血清型40、41)或任何其它的腺病毒血清型。人和動(dòng)物腺病毒的大量實(shí)例可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，例如可以在www,atcc.org/SearchCatalogs/CellBiology.cfm.上找到。本發(fā)明的腺病毒栽體包括無復(fù)制能力型(缺陷型)和復(fù)制型載體。無復(fù)制能力型載體在靶細(xì)胞中無法復(fù)制或以極低的水平復(fù)制，在本文中以Ad/GM-CSF載體為典型。在一個(gè)方面中，無復(fù)制能力型載體通常通過缺失或突變的部分或全部編碼區(qū)使Ela,Elb，E2a，E2b或E4中的至少一個(gè)編碼區(qū)失活。用于使這些載體增殖的方法為本領(lǐng)域眾所周知的。在另一個(gè)方面中，腺病毒栽體為復(fù)制型的。復(fù)制型栽體能夠在靶細(xì)胞中復(fù)制，在本文中以CG7060載體為典型。復(fù)制型病毒包括野生型病毒和經(jīng)改造以便在靶細(xì)胞中復(fù)制的病毒。它們包括復(fù)制特異性病毒。將復(fù)制特異性病毒設(shè)計(jì)成在一種類型細(xì)胞中與在另一種類型細(xì)胞中相比特異性或優(yōu)先復(fù)制。該術(shù)語還包括復(fù)制特異性腺病毒；即，優(yōu)先在某些類型的細(xì)胞或組織中復(fù)制，但在其它類型中復(fù)制程度較低或根本不復(fù)制的病毒。這類病毒有時(shí)稱作"溶細(xì)胞"或"致細(xì)胞病變"病毒(或載體)，且如果它們對(duì)贅生性細(xì)胞具有這類作用，那么稱作"溶瘤細(xì)胞"病毒(或載體)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體包括治療基因序列，例如細(xì)胞因子基因序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體和/或粒子在腫瘤細(xì)胞和/或異常增殖組織，諸如實(shí)體瘤和其它贅生物中選擇性復(fù)制。就在靶細(xì)胞中選擇性復(fù)制的腺病毒載體而言，已經(jīng)研發(fā)了特異性減毒的復(fù)制型病毒載體，對(duì)其而言，在癌細(xì)胞中選擇性復(fù)制優(yōu)先破壞那些細(xì)胞。優(yōu)先在某些細(xì)胞類型中復(fù)制(且由此破壞它們)的各種細(xì)胞特異性復(fù)制型腺病毒構(gòu)建體如下列文獻(xiàn)中所述例如W095/1"34、W096/17053、W098/39464、W098/39465、W098/39467、W098/39466、W099/06576、W099/25860、W000/15820、W000/46355、W002/067861、W002/06862、美國專利申請(qǐng)公開US20010053352和美國專利US5，698，443、US5，871，726、US5，998，205和US6，432，700。已經(jīng)i殳計(jì)了在腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的復(fù)制型腺病毒栽體。本發(fā)明典型的腺病毒載體包括，但不限于DNA、包嚢在腺病毒外殼中的DNA、包裝在另一種病毒或病毒樣形式(諸如單純皰滲和AAV)中的腺病毒DNA、包嚢在脂質(zhì)體中的腺病毒DNA、與聚賴氨酸復(fù)合的腺病毒DNA、與合成的聚陽離子分子復(fù)合、與轉(zhuǎn)鐵蛋白綴合或與諸如PEG這類化合物復(fù)合的腺病毒DNA，它們具有多種用途，包括，但不限于免疫"掩蔽"抗原性和/或增加病毒半衰期或用于與非病毒蛋白綴合。腺病毒載體粒子還可以包括對(duì)纖維蛋白的進(jìn)一步修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的腺病毒載體進(jìn)一步包含包括在粒子的衣殼蛋白中的靶向配體。就靶向腺病毒的實(shí)例而言，例如，參見W000/67576、W099/39734、US6，683，170、US6，555，368、US5，922，315、US5，543，328、US5，770，442和US5，846，782。此外，本發(fā)明的腺病毒載體還可以包含對(duì)其它病毒衣殼蛋白的修飾。這些突變的實(shí)例包括，但不限于那些描述在美國專利US5，731，190、US6，127，525和US5，922，315中的突變。其它修飾的腺病毒描述在美國專利US6，057，155、US5，543，328和US5，756,086中。用于產(chǎn)生表達(dá)插入序列的腺病毒載體的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)為本領(lǐng)域中已知的并且可得自商品來源，例如購自Clontech的AdenoX表達(dá)系統(tǒng)(PaloAlto，CA)(Clontechniques(2000年1月)p.1012)、均購自Qbiogene(Carlsbad,CA)的Ade麗ator腺病毒載體系統(tǒng)和AdEasy。病毒產(chǎn)生和純化用于產(chǎn)生本發(fā)明病毒制劑的宿主細(xì)胞能夠支持候選病毒的復(fù)制。如本文定義的"宿主細(xì)胞"包括可以被或已經(jīng)被病毒感染的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單宿主細(xì)胞的子代，并且該子代因天然、偶然或故意突變和/或改變而不一定與原始親代細(xì)胞完全相同(在形態(tài)上或在總DNA互補(bǔ)物上)。宿主細(xì)胞包括在體內(nèi)或體外用本發(fā)明的病毒載體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞來源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞并且優(yōu)選來源于靈長類細(xì)胞。盡管優(yōu)選各種靈長類細(xì)胞并且最優(yōu)選人體細(xì)胞，但是能夠支持病毒復(fù)制的任何類型的細(xì)胞在實(shí)施本發(fā)明中均是可接受的。用于實(shí)施本發(fā)明的細(xì)胞類型包括，但不限于非洲綠猴腎細(xì)胞抹系細(xì)胞、CH0細(xì)胞或?qū)λa(chǎn)生的病毒類型而言允許的任何真核細(xì)胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法，例如通過使一層未感染的細(xì)胞或用一種或多種輔助病毒感染的細(xì)胞與病毒粒子接觸，隨后孵育細(xì)胞并且確定病毒復(fù)制而對(duì)候選細(xì)胞系測試其支持病毒復(fù)制的能力。多種宿主細(xì)胞能夠支持腺病毒的復(fù)制。盡管優(yōu)選各種靈長類細(xì)胞并且最優(yōu)選人體細(xì)胞，但是能夠支持病毒復(fù)制的任何類型的細(xì)胞在實(shí)施本發(fā)明中均是可接受的。用于商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)腺病毒的優(yōu)選細(xì)胞系為如例如在美國申請(qǐng)順序號(hào)10/824796中所述的HeLa-S3細(xì)胞系。用于商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)腺病毒的另外優(yōu)選的細(xì)胞系為A549細(xì)胞、PERC6細(xì)胞和人293胚腎細(xì)胞，它們表達(dá)腺病毒EIA和EIB基因產(chǎn)物等。能夠適當(dāng)產(chǎn)生靶向腺病毒的細(xì)胞系包括人LNCaP(前列腺癌)、HBL-IOO(乳房上皮)、0VCAR-3(卵巢癌)等。細(xì)胞培養(yǎng)物通常使宿主細(xì)胞生長在灌流系統(tǒng)中，這能夠在細(xì)胞生長的同時(shí)維持pH、C02和02的良好培養(yǎng)環(huán)境。灌流能夠除去活性代謝物，同時(shí)提供營養(yǎng)物。適合于培養(yǎng)用于產(chǎn)生本發(fā)明病毒載體的細(xì)胞系的合適的培養(yǎng)基和條件為本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以使用任何合適的培養(yǎng)基，例如RPMI、DMEM等。培養(yǎng)基可以包含血清，例如胎牛血清或可以不含血清。進(jìn)入不含血清的懸浮培養(yǎng)的依賴貼壁細(xì)胞的血清斷絕適應(yīng)已經(jīng)用于生產(chǎn)重組蛋白和病毒疫苗，并且可以應(yīng)用于生產(chǎn)病毒載體。在某些實(shí)施方案中，它可以用于使用清除不需要的細(xì)胞生長的選擇系統(tǒng)。這一目的可以借助于使用編碼選擇標(biāo)記的載體持久轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或通過使用編碼選擇標(biāo)記的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染細(xì)胞系來實(shí)現(xiàn)。在任一種情況下，使用合適的藥物或選擇性化合物培養(yǎng)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞都會(huì)導(dǎo)致那些攜帶所述標(biāo)記的細(xì)胞的選擇性復(fù)制。攜帶所述標(biāo)記的細(xì)胞的選擇性復(fù)制意味著在有適當(dāng)類型和濃度的藥物或選擇性化合物存在下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞導(dǎo)致相對(duì)于不攜帶標(biāo)記的細(xì)胞攜帶標(biāo)記的細(xì)胞優(yōu)先或排他性復(fù)制。標(biāo)記的實(shí)例包括，但不限于分別在TK、HGPRT-或APRT-細(xì)胞中的HSV胸普激酶(TK)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和腺噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)基因。此外，抗代謝物抗性可以用作選擇賦予甲氨蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶(DHFR);賦予霉酚酸抗性的gpt;賦予氨基糖苷G418抗性的neo;和賦予潮霉素抗性的hph基因的基礎(chǔ)。進(jìn)入不含血清的懸浮培養(yǎng)的依賴貼壁細(xì)胞的血清斷絕適應(yīng)已經(jīng)用于使用293細(xì)胞(Wi11iamsburgBioProcessingConference,Nov.18-21，1996;W098/22588)和A549細(xì)胞(Morris等，WilliamsburgBioProcessingConference,Nov.18-21，1996)生產(chǎn)重組蛋白(Berg等，BioTechniques,14:972-978，1993)和病毒疫苗(Perrin等，Vaccine,13:1244-1250，1995;Gilbert)。可以使某些依賴貼壁細(xì)胞適應(yīng)混懸液培養(yǎng)，這可以有利于商業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)。本發(fā)明可以依賴于生物反應(yīng)器技術(shù)在生產(chǎn)病毒中的應(yīng)用。使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中生長允許以商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)能夠被用于本發(fā)明方法和制劑中的病毒載體感染的細(xì)胞。通過在灌流條件下運(yùn)轉(zhuǎn)該系統(tǒng)并且將改進(jìn)的方案應(yīng)用于純化，本發(fā)明提供了易于規(guī)?；a(chǎn)足夠量的商業(yè)上有用的病毒載體的策略。生物反應(yīng)器已經(jīng)廣泛用于由混懸液和貼壁依賴動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)生物產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^使用多種裝置，例如纖維圓盤、細(xì)孔旋轉(zhuǎn)過濾器、空心纖維或平板膜濾器、沉降管等截留細(xì)胞而將新鮮培養(yǎng)基灌流過培養(yǎng)物。簡單的灌流過程存在培養(yǎng)基的流入及細(xì)胞和產(chǎn)物的流出。以預(yù)定和恒定速率使培養(yǎng)基進(jìn)入反應(yīng)器，所述的預(yù)定和恒定速率以低于細(xì)胞的最大比生長速率的值維持培養(yǎng)物的稀釋率。在生產(chǎn)病毒的過程中，通過使宿主細(xì)胞在允許攝取病毒的生理?xiàng)l件下接觸病毒用病毒感染該細(xì)胞。可以以高感染復(fù)數(shù)(M0I)感染細(xì)胞以便優(yōu)化產(chǎn)率。宿主細(xì)胞復(fù)制病毒，可以在感染后2-5天時(shí)收集它們。細(xì)胞裂解物病毒生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵步驟是在裂解細(xì)胞膜時(shí)病毒從宿主細(xì)胞中釋放。裂解細(xì)胞的傳統(tǒng)方法，諸如機(jī)械攪拌(例如高壓擠壓、固體剪切、液體剪切或聲處理)和冷凍-融化循環(huán)可以破壞病毒并且常常導(dǎo)致生物活性病毒產(chǎn)物的產(chǎn)率較低。另一種裂解方法為洗滌劑裂解，它一般依賴于向感染的細(xì)胞中添加終濃度約為0.5%-2.5重量/體積的非離子洗滌劑。常用的非離子洗滌劑包括TritonTM家族的洗滌劑(例如TritonTMX-15;TritonTMX-35;TritonTMX-45;TritonTMX-100;TritonTMX-102;TritonTMX-114;TritonTMX-165，所有這些多相洗滌劑均具有與芳族環(huán)連接的8-碳支鏈)；屬于非變性、非離子脂肪酸的聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯類家族的TweenTM洗滌劑；和為膽酸的磺基甜菜堿衍生物的兩性離子洗滌劑CHAPS。然而，這類非離子洗滌劑也可能對(duì)病毒有破壞性?？梢允占⑶沂褂冒环N或多種已知與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合并且有助于其增溶的非離子型表面活性劑的裂解試劑裂解病毒感染的細(xì)胞(例如，參見Taylor等，BiochimBiophysActa.1612:65-75，2003;Santoni等，Proteomics，3:249-253，2003;和Hazard等，ArchBiochemBiophys.407:117-124,2002)。這類非離子型表面活性劑可以導(dǎo)致在純化過程中對(duì)病毒的破壞程度較低并且提高貯存過程中的穩(wěn)定性。在裂解試劑中的非離子型表面活性劑優(yōu)選帶有親水性和親脂性兩部分。非離子型表面活性劑的實(shí)例包括，但不限于烷基取代的單-、二-和多糖類；環(huán)烷基取代的單-、二-和多糖類烷基醇；聚氧乙烯醚類；二烷基-甘油類；及其異構(gòu)體。帶有親脂性取代基的任何單-、二-和多糖均可以用作本發(fā)明裂解試劑中的非離子型表面活性劑。典型的二糖化合物包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、異麥芽糖、海藻糖和纖維二糖。親脂性取代基優(yōu)選包含烷基或鏈烯基。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，親脂性取代基為鏈烷酸殘基。親脂性取代基可以為線性的(例如直鏈正-烷烴或烯烴)或非線性的(例如環(huán)狀或支鏈烷烴或烯烴)。親脂性取代基還可以為鏈烷酸殘基。親脂性取代基的長度可以改變以便達(dá)到理想的親水-親油平衡。優(yōu)選的非離子型表面活性劑包括烷基取代的單糖類、烷基取代的二糖類、烷基取代的多糖類、環(huán)烷基取代的單糖類、環(huán)烷基取代的二糖類、環(huán)烷基取代的多糖類烷基醇、聚氧乙烯醚類、二烷基-甘油類及其異構(gòu)體，諸如正-十二烷基-b-D-麥芽糖苷、正-十二烷基-b-D-麥芽糖苷、正-十二烷基-b-L-麥芽糖苷、正-十二烷基-b-L-麥芽糖苷、6-環(huán)己基己基-b-D-麥芽糖苷、6-環(huán)己基己基-b-D-麥芽糖苷、6-環(huán)己基己基-b-L-麥芽糖苷、6-環(huán)己基己基-b-L-麥芽糖苷、6-環(huán)己基己基-b-D-麥芽糖苷、蔗糖單月桂酸酯、正-十三烷基-b-D-麥芽糖苷、正-十三烷基-b-D-麥芽糖苷、正-十三烷基-b-L-麥芽糖苷、正-十三烷基-b-L-麥芽糖苷、正-十四烷基-b-D-麥芽糖苷、正-十四烷基-b-D-麥芽糖苷、正-十四烷基-b-L-麥芽糖苷、正-十四烷基-b-L-麥芽糖苷和聚乙二醇單十二醚，正如在美國專利申請(qǐng)順序號(hào)10/743813和60/631434中進(jìn)一步所述的。使裂解劑與細(xì)胞接觸足以裂解細(xì)胞并且從系統(tǒng)中除去額外的貼壁細(xì)胞的一段時(shí)間。在這類系統(tǒng)中，在純化病毒之前，一般澄清粗的病毒裂解物，即除去膜碎片。通過使用深度濾器進(jìn)行澄清，所述的濾器由具有一定孔隙度的非吸收材料的填充柱組成，使得在不丟失病毒粒子的情況下截留較大的膜碎片。基于粒子的機(jī)械保留、吸收特性、pH值、表面質(zhì)量、濾器的厚度和強(qiáng)度選擇深度濾器?？缮藤彽闹w合并了幾種類型的濾器，例如聚丙烯、玻璃濾器、硝基纖維素等。病毒純化用于從細(xì)胞裂解物中分離感染性病毒的技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可以通過密度梯度離心或色^瞽法分離病毒(例如，參見美國專利US6,194，191和US6，689，600)。才艮據(jù)待分離的病毒載體的種類和本領(lǐng)域中公知的信息使用適于離心的合適的密度條件。為了使病毒的純化成為可規(guī)模化的過程，優(yōu)選釆用諸如色譜法等方法，在不經(jīng)過離心的情況下，此方法可從細(xì)胞裂解物中除去細(xì)胞碎片。在標(biāo)準(zhǔn)過程中，在過濾柱上通過離子交換色i普法，從澄清細(xì)胞裂解物中分離病毒粒子，此過程的大量實(shí)例是本領(lǐng)域中已知的。在病毒純化中可以使用市場上可以獲得的各種各樣的色i普材料?？捎玫闹С只|(zhì)包括但不限于聚合物質(zhì)，諸如纖維素或硅膠型樹脂或膜，或者交聯(lián)多糖(例如瓊脂糖)或其他樹脂。色譜材料還可以包含各種附著于可用于分離生物分子的基質(zhì)上的官能團(tuán)或活性基團(tuán)。這樣，可應(yīng)用結(jié)合于支持基質(zhì)上的親和基團(tuán)純化病毒，病毒與這些基團(tuán)通過各種非共價(jià)機(jī)制相互作用，隨后將它們除去。優(yōu)選的分離方法包括離子交換(尤其是陰離子交換)。其他特異性親和基團(tuán)包括肝素和與支持基質(zhì)結(jié)合的病毒特異性抗體。選擇病毒純化中的親和基團(tuán)所要考慮的是該病毒與所選的親和基團(tuán)相互作用的親合力，以及從中除去的容易程度，同時(shí)又不破壞病毒粒子的生物學(xué)功能/傳染性。典型的聚合物質(zhì)包括產(chǎn)品HeparinSepharoseHighPerformance(Pharmacia);大孑L幾碌灰石,諸^口Macro—PrepCeramicHydroxyapatite(Bio-Rad，Richmond,CA);以及cellufinesulfate(Amicon)?？捎糜诩兓《镜挠H和配體包括附著于適宜樹脂的抗病毒抗體，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？刹捎帽绢I(lǐng)域中已知的各種功能部分來進(jìn)行陰離子交換色謙法，所述功能部分包括但不限于DEAE(二乙氨乙基)、QAE(季氨乙基)和Q(季銨)?？墒惯@些功能部分附著于任何適宜的樹脂，包括纖維素和硅樹脂。例如，可使DEAE附著于柱中的各種樹脂，包括纖維素樹脂，諸如DEAE-MemSepTM(Millipore,Bedford,MA)、SartobindTl&>1丈劑(Sartorius，Edgewood，N.J.)和珪樹脂，i者3口ACTI-MOD(AmericanInternationalChemical,Natick，MA)。典型的樹脂還包括與二乙烯基苯珠交聯(lián)的聚苯乙烯，它可見于PharmaciaSourceQ,以及附著于高度交聯(lián)球形瓊脂糖珠的葡聚糖，它可見于PharmaciaQ-SepharoseXL。例如參見WO00/40702。在病毒純化中還可使用陽離子交換色譜法，包括但不限于使用下列色"^普柱，諸如SPMemSepTM(Millipore，Bedford,MA)，CMMemSepTM(Millipore，Bedford,MA)，F(xiàn)ractogelS03(EMSeparationTechnology,Gibbstown，NJ)和MacroprepS(BioRad，Melville,NY),以及基于肝素的樹脂。肝素ACTI-MOD柱體(AmericanInternationalChemicalInc.,Natick，MA)和P0R0S灌流色語介質(zhì)(BoehringerMannheim)代表另夕卜的實(shí)例。核酸酶處理可用核酸酶處理洗脫的病毒。與采后即刻處理相比，在色鐠法后用核酸酶處理可使所需核酸酶的量減到最少。在核酸酶處理后可以包括第二個(gè)色鐠步驟，以除去片段化DM和核酸酶。本領(lǐng)域中已知存在許多核酸酶，優(yōu)選的核酸酶包括一種或廣泛特異性內(nèi)切核酸酶的組合，例如酶分類3.1.27.5(胰核糖核酸酶)和3.1.31.1(微球菌核酸酶)等等。BenzonaseTM是一種基因工程酶，它既具有DNA酶活性，也具有RNA酶活性，它可特別用于病毒純化過程的這個(gè)步驟。BenzonaseTM快速水解核酸的能力使得該酶可用于降低細(xì)胞裂解物的粘度，并且可用于降低在純化期間核酸負(fù)載，因此可消除干擾并提高產(chǎn)率。一旦完全消化，則將存在于溶液中的游離核酸長度縮短到2至4個(gè)堿基的寡核苷酸。在核酸酶消化之后，可在離子交換濾器上使病毒運(yùn)行笫二次，此濾器可與第一種濾器相同或不同。過濾/滅菌可任選地通過常規(guī)方法，例如應(yīng)用中空纖維濃縮器將洗脫的病毒濃縮和滲濾。在供使用的終制劑中，可對(duì)純化病毒樣品進(jìn)行無菌過濾，例如可供臨床使用。適于達(dá)到此目的的多種濾器是本領(lǐng)域中已知的，例如硝基纖維素膜濾器、乙酸纖維素膜濾器、PVDF(改性聚偏二氟乙烯)膜濾器等。優(yōu)選PVDF膜濾器(例如MilliporeMillipak濾器)。通過用緩沖液對(duì)濾器進(jìn)行預(yù)洗滌可提高產(chǎn)率，此緩沖液例如為藥物上可接受的賦形劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)因病毒粘著于濾器使產(chǎn)率下降，而達(dá)到一定水平后使此粘著飽和。因此，加載更大量的粒子可提高產(chǎn)率，以便使丟失百分率最小化。根據(jù)純化程度、所用病毒載體的濃度等，對(duì)過濾滅菌的特定條件進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定。病毒表征確定濃縮或分離病毒的效價(jià)和純度的方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，通過測定允許細(xì)胞中病毒編碼蛋白的表達(dá)，可以確定病毒感染性的定量表征。典型地，用連續(xù)稀釋的病毒感染允許細(xì)胞，將其孵育一段時(shí)間(例如l-2天)，然后檢測病毒編碼基因的表達(dá)，該基因可以病毒基因(例如腺病毒的DNA結(jié)合蛋白)或由病毒攜帶的轉(zhuǎn)基因(例如P-半乳糖苷酶)。還可通過噬菌斑測定確定某些病毒，諸如腺病毒和牛痘病毒的感染性?？赏ㄟ^反相高效液相色譜法(RP-HPLC)確定病毒的純度。在色譜法過程中，完整病毒解離為其結(jié)構(gòu)成分，即六鄰體、五鄰體基質(zhì)(Pb)和纖維，產(chǎn)生一種特征性指紋，這種指紋可基于各種成分的完整性而改變。通過對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的定量還可測定病毒的濃度(例如參見Lehmberg等，JChromatogrBBiomedSciAppl.732:411-423，1999和Roitsch等，JChromatogrBBiomedSciAppl.，752:263-280，2001)。見表1。還可使用陰離子交換色譜法(AEX)確定病毒的純度、濃度和效價(jià)。此方法已被用于定量粗裂解物或高度純化樣品中的腺病毒粒子(Shab腦等，HumGenTher.，8:453-465，1997)。它可^皮用于評(píng)價(jià)廣泛動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)稀釋和濃縮樣品中的粒子。實(shí)施例不同腺病毒制劑的穩(wěn)定性用所選擇的血清型腺病毒感染培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞并通過離心收獲。將細(xì)胞粒狀沉淀再懸浮于裂解緩沖液中，并將其用下述不同緩沖液進(jìn)行配制。ARCA緩沖液包括5M蔗糖、1%甘氨酸、1mMMgCl2和10mMTris,加上0.05%聚山梨酯80(也稱為"Tween80")。將每種制劑通過0.2微米濾器進(jìn)行無菌過濾，將其裝入lml的玻璃小瓶中，用涂敷聚四氟乙烯的硅橡膠塞塞緊。將所述小瓶貯存在5'C、25匸或30'c下。在25t:或3or:下貯存視為在室溫下貯存。在所選擇的時(shí)間點(diǎn)，通過陰離子交換色鐠法、反相色譜法等方法對(duì)每種制劑的樣品進(jìn)行研究。AE-HPLC結(jié)果證實(shí)存在于單獨(dú)的ARCA緩沖液中的樣品峰型的變化大于存在于ARCA緩沖液成分加上含水共溶劑或者與溫和的還原劑或可逆蛋白酶抑制劑的組合中樣品峰型的變化。例如，參見附圖2A-C和附圖4A和B。使用AE-HPLC評(píng)價(jià)完整成分、六鄰體、五鄰體基質(zhì)(Pb)和纖維隨時(shí)間變化的百分率，貯存時(shí)間越長，完整五鄰體基質(zhì)和纖維的百分率明顯越低，而完整六鄰體百分率保持相對(duì)穩(wěn)定(例如表l)。例如，37。C下0時(shí)間點(diǎn)，含于GTS/ARMWG緩沖液中的Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)溶液的AE-HPLC色譜圖表明在6.113分鐘僅出現(xiàn)ICV的峰。在5&存中間時(shí)間點(diǎn)，在6.106和6.650分鐘出現(xiàn)兩個(gè)峰(一個(gè)是IVC的，一個(gè)是PVV的)，在隨后的j3i存時(shí)間點(diǎn)，在6.701分鐘時(shí)PVV的峰占優(yōu)勢。表1顯示，將Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)制劑貯存在37。C下的GTS/ARMWG緩沖液中時(shí)，隨著時(shí)間變化活病毒(如在大約6.1分鐘時(shí)的峰表明)轉(zhuǎn)變?yōu)榉歉腥拘圆《?如在大約6.7分鐘時(shí)的峰表明)。表l還顯示，具有0、0.4和0.7分鐘的保留時(shí)間改變的HPLC峰的組成表明活病毒之間的轉(zhuǎn)變(如由六鄰體、五鄰體基質(zhì)(Pb)和完整纖維含量所表明的)。無保留時(shí)間改變的峰與活病毒的高百分率和完整衣殼病毒體(ICV)的百分率相關(guān)，而具有0.7分鐘的保留時(shí)間改變的峰與非感染性病毒相關(guān)(如由空五鄰體病毒體或PVV所表明的)。表1六鄰體(RP)、五鄰體基質(zhì)(Pb)和完整纖維(WB)百分率的AE-HPLC評(píng)價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>與表1一致，附圖2A顯示，25。C下貯存于ARCA緩沖液中的1xl012vp/ml的Ad/GM-CSF制劑隨時(shí)間變化而降解，這樣使得完整衣殼病毒體(ICV)的百分率下降，這與空五鄰體病毒體(PVV)和GM-CSF分泌的增力口相一致。附圖2C顯示，GM-CSF分泌的逐漸減少與完整衣殼病毒體(ICV)百分率的下降相關(guān)，這表明ICV百分率表示Ad/GM-CSF病毒制劑影響GM-CSF分泌的能力。已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，評(píng)價(jià)了含水共溶劑對(duì)腺病毒制劑穩(wěn)定性的影響。如附圖3所示，包含20%PEG、20%甘油的制劑僅導(dǎo)致保留時(shí)間較小的變化，表明病毒穩(wěn)定性得到提高。對(duì)于完整衣殼病毒體百分率(。/。ICV。)作為ARMWG制劑(10mMTris、25mMNaCl、2.5%甘油，pH8)中Ad/GM-CSF(1.2xl012vp/ml)溶液30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行了另一些研究以便評(píng)價(jià)在0.75M(附圖5A)或12%重量(附圖5B)的濃度下不同穩(wěn)定添加劑的作用，并與ARCA對(duì)照進(jìn)行比較。由附圖5A和附圖5B可見，在30'C下貯存至少50天后，包含丙二醇或四氫呋喃聚乙二醇醚的制劑顯示出最大的穩(wěn)定性，而ARCA對(duì)照制劑顯示出最低的貯存穩(wěn)定性。基于作為Ad/GM-CSF(1.2xl012vp/ml)溶液30"C下貯存時(shí)間的函數(shù)的完整衣殼病毒體百分率(％ICV。)還評(píng)價(jià)了不同濃度的蔗糖對(duì)病毒穩(wěn)定性的影響。5%重量的蔗糖制劑是標(biāo)準(zhǔn)的ARCA制劑(由于ARCA含有5%重量的蔗糖這一事實(shí))。由附圖6可見，蔗糖濃度越高，腺病毒穩(wěn)定性越大。附圖5A、5B和6表明，將病毒貯存在單獨(dú)的ARCA中時(shí)所觀察到的ICV百分率的逐漸下降可以通過包含不同的含水共溶劑諸如丙二醇和四氫呋喃聚乙二醇醚來減少。進(jìn)行了大量的研究，試圖了解可逆蛋白酶抑制劑和/或溫和的還原劑有助于腺病毒制劑穩(wěn)定性的機(jī)理。為了闡明這種潛在的機(jī)理，在加入特定的制劑之前，對(duì)病毒粒子進(jìn)行了預(yù)處理。附圖7提供了L3/p23蛋白酶的結(jié)構(gòu)示意圖，它表明存在二硫鍵和游離巰基。在此描述預(yù)處理研究，僅為了舉例說明特定類型試劑的潛在作用機(jī)理，而并不是打算將其包括在本發(fā)明的制劑中。例如，NEM或N-乙基馬來酰亞胺是一種不可逆蛋白酶抑制劑，而二酰胺是一種氧化劑。這兩者均被用于證明概念研究，而不是要使其成為用于治療的組合物中的一種成分。DTT是一種還原劑，它可逆性地抑制二硫鍵以保持游離巰基，而且它構(gòu)成本發(fā)明的一個(gè)方面。附圖8A、8B和9A-9C表明，用NEM、DTT和二酰胺預(yù)處理，可使將病毒貯存在3(TC的ARCA緩沖液中時(shí)所觀察到的ICV百分率隨時(shí)間的下降最小化，這提示在將病毒制劑貯存在ARCA緩沖液中時(shí)，抑制病毒蛋白酶可能是提高病毒穩(wěn)定性的一種手段。對(duì)于ARCA中的Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)制劑，將在15和50mMDTT下的DTT預(yù)處理與沒有預(yù)處理的作用進(jìn)行了比較。完整衣殼病毒體UCV。)百分率作為30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)表明了含有50mMDTT制劑的穩(wěn)定性大于不含DTT的制劑和含有15mMDTT制劑的穩(wěn)定性(附圖9B)。附圖10和11顯示，初始完整衣殼病毒體百分率UICV。)和初始蛋白VI百分率(％VI。)分別作為含有不同的蛋白酶抑制劑的ARCA制劑中Ad/GM-CSF(lx1012vp/ml)制劑30。C下貯存時(shí)間的函數(shù)。結(jié)果表明含有50mMDTT、150mM半胱氨酸和15mM二甲基硫醚的制劑的穩(wěn)定性基于對(duì)初始完整衣殼病毒體百分率(°/。ICV。)和初始蛋白VI百分率(％VI。)兩者的分析結(jié)果。表2顯示，分別包含50mMDTT、150mM硫甘油和15mM二曱基疏醚的制劑的穩(wěn)定性也基于GM-CSF分泌，它作為3(TC下j^存時(shí)間的函數(shù)，并與不含蛋白酶抑制劑的ARCA制劑進(jìn)行比較。表2制劑穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>顯示了大量不同的制劑(表3中所列舉)，它們可提高Ad/GM-CSF病毒儲(chǔ)備物的穩(wěn)定性，這是通過作為30'C下貯存時(shí)間的函數(shù)的初始完整衣殼病毒體百分率(％ICV。)；作為3(TC下貯存時(shí)間的函數(shù)的初始蛋白VI百分率(％VI。)；以及初始GM-CSF分泌率(GSR)的百分率確定的。表4中提供了表3中列舉的每種制劑的穩(wěn)定性。表3制劑縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表4制劑穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表5舉例說明甚至在延長的貯存時(shí)間(約36.5個(gè)月)后Ad/GM-CSF(CG6444)制劑(50wt.%甘油，10mMTris，pH7.4)在-20'C下的長期穩(wěn)定性。表5配制于50%甘油、lOmMTris，pH7.4中并貯存于-2(TC下的CG6444的長期穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>進(jìn)行了許多其他的研究，評(píng)價(jià)了含水共溶劑對(duì)腺病毒制劑穩(wěn)定性的影響。使用許多不同的共溶劑制劑(表6中所列舉的)測試含1E12VP/mL的CG0070病毒儲(chǔ)備物，每種均顯示提高了CG0070病毒儲(chǔ)備物的穩(wěn)定性，此穩(wěn)定性為-20'C下貯存時(shí)間的函數(shù)，貯存時(shí)間長達(dá)16個(gè)月。表7中提供了對(duì)表6中列舉的每種制劑的滴度分析和穩(wěn)定性研究的結(jié)果。所測試的每種制劑均顯示出長達(dá)16個(gè)月的良好的穩(wěn)定性。表6所測試的制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表7滴度分析和穩(wěn)定性研究時(shí)間(月)069顛/^-鵬c贈(zèng)產(chǎn)》、浙/y尸/w/11,.16E+121.09E+121.23E+1221,.09E+121..05E+12106E+1231..12E+121.04E+121.16E+1241,.11E+121,.04E+121,.05E+1251,.18E+121,.03E+121,.00E+1261..12E+121,細(xì)+121,.02B+12^屑mj-^w;c的諒產(chǎn)分浙f初始^為、舉Jr2456-0.0140.0210.046-0.035-0.044-0.036-0.0170.0390.078-0.034■0.053-0.042-0.013-0.033-0.010-0.01S-0.033-0.013顛^p#浙f^y始^》、豐J121.25E+121.15E+121.13E+121.13E+121.07E+121.04E+12108%106%10.1%102%91%93%0.067-0.0340.092-0.049-0.020-0.0130.91.01.01.00.90.91.01.3E+H1.2E+111.3E+111.3E+111.2E+111.4E+1116U4E+121.03E+121.16E+129.74E+111.02E+121.06E+120.075-0.0560.108-0.071-0.037-0.038l響01.01.11.11.11.11.05.5E+!07.5E+103.6E+106,犯+105.8E+107.5E+10100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%NDND8.8E+10NDND9.0E+10NDND8.0E+10NDND1.6E+1〗NDKD9.3E+10NDND9.8E+10107%108%。/0%43159o59997888884M87599K8oo9S9S9894634719999009斧分、為化河獲l的肌歸屌.座776314789OG988oo444%49o2o6M898999s23456力R1于水必、為J91o11oo9Oj997o1*o、1*o,o,o，1,1s力j"Q.Jo一g94g4w99S931使用許多不同的共溶劑制劑(表8中所列舉的)對(duì)在5'C下貯存長達(dá)20個(gè)月的含1E12和2E12VP/mL的病毒儲(chǔ)備物進(jìn)行測試。與ARCA制劑相比，每種共溶劑制劑均顯示出病毒儲(chǔ)備物的穩(wěn)定性得到了提高。表9中提供了對(duì)表8中列舉的每種制劑的滴度分析和穩(wěn)定性研究的結(jié)果。所測試的每種制劑均顯示出長達(dá)20個(gè)月的良好的穩(wěn)定性，這是通過下列分析確定的yjCV-完整衣殼病毒體；[ICV]-O時(shí)間點(diǎn)的[VP];RT的變化、噬菌斑(VP/PFU)和GSR=針對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化的GM-CSF分泌率；其中a〉表示。/。[VP]。，它是沒有ICV存在的空五鄰體病毒體。表8所測試的制劑<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>ARCA-5。/。蔗糖，1°/。甘氨酸，10mMTris,lmM氯化鎂,RT-pH7.8;DMS-二曱基石充醚；P8(H聚山梨酯-80;P,Glyco卜丙二醇表9A配制于為1E12和2E12VP/mL的不同制劑中的并貯存于5。C(2-8。C)下的CG0070<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表9B配制于為1E12和2E12VP/mL的不同制劑中的并貯存于°C(2-8。C)下的CG0070<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>使用許多不同的二曱基硫醚和丙二醇共溶劑制劑(表10中所列舉的)對(duì)在5'C下貯存長達(dá)4個(gè)月的含4E12VP/mL的病毒儲(chǔ)備物進(jìn)行測試。與ARCA制劑相比，每種共溶劑制劑均顯示出病毒儲(chǔ)備物的穩(wěn)定性得到了提高。表ll中提供了對(duì)表10中列舉的每種制劑的滴度分析和穩(wěn)定性研究的結(jié)果。所測試的每種制劑均顯示出長達(dá)4個(gè)月的良好的穩(wěn)定性，這是通過下列分析確定的°/JCV=完整衣殼病毒體；[ICV]=O時(shí)間點(diǎn)的[VP];RT的變化、噬菌斑(VP/PFU)和GSR-針對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化的GM-CSF分泌率；其中a〉表示。/。[VP]。，它是沒有ICV存在的空五鄰體病毒體。表10所測試的制劑#制劑滴度(VP/mL)T75-1ARCA-70。C4.3E+12T75-2ARCA4.1E+12T75-3ARCA+15mMDMS4.2E+12T75-9ARCA-P80-蔗糖+10%PropGo14.OE+12T75-10ARCA-P80-蔗糖+100/。PropGol+15mMDMS4.OE+12T75-11ARCA-P80-蔗糖+100/。PropGol+20mMMet4.OE+12T75-12ARCA-P80-蔗糖+50/。PropGol4.OE+12T75-13ARCA-P80-蔗糖+5。/。PropGol+15mMDMS4.OE+12T75-14ARCA-P80-蔗糖+50/0PropGol+20mMMet4.2E+12ARCA-5。/。蔗糖，1%甘氨酸，lOmMTris,ImM氯化鎂，RT-pH7.8;DMS-二甲基硫醚;P8(^聚山梨酯80;PropGol-丙二醇表11配制于為4E12VP/mL的不同制劑中的并貯存于5'C(2-8。C)下的CG0070<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>ICV=完整衣殼病毒體；[ICV]=0時(shí)間點(diǎn)的[VP];a〉表示。/。[VP]。，它是沒有ICV存在的空五鄰體病毒體；GSR=針對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)化的GM-CSF分泌率；ND=未檢測含ARCA和DMS的制劑中六鄰體穩(wěn)定性的提高進(jìn)行了研究以進(jìn)一步了解硫代化合物可逆性抑制腺病毒蛋白酶的機(jī)制。在這些研究中，將病毒制劑配制在加有DMS的ARCA緩沖液中。強(qiáng)制氧化實(shí)驗(yàn)顯示六鄰體優(yōu)先于蛋白VI被氧化，而且通過對(duì)GM-CSF分泌率的分析確定，六鄰體和蛋白VI的氧化不影響生物學(xué)功能。但是，將病毒貯存在3(TC的酶促活性溫度下時(shí)，顯示出作為時(shí)間函數(shù)的蛋白VI優(yōu)先于六鄰體的降解。在此研究中，如通過GM-CSF分析所確定的與生物學(xué)功能相關(guān)的降解經(jīng)向制劑中加入DMS受到抑制。在相關(guān)研究中顯示，增加DMS濃度(分別為15raM和150mM)與因氧化作用六鄰體變型較少相關(guān)，而且在ARCA制劑中包含15mMDMS在為期20個(gè)月的研究時(shí)間內(nèi)顯著抑制了六鄰體的氧化。盡管為了清楚地理解本發(fā)明，前面已經(jīng)通過說明和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可清楚地認(rèn)識(shí)到可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行某些改變和修改。本發(fā)明的各個(gè)方面是通過一系列實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)的，其中某些是通過隨后的非限制性實(shí)施例進(jìn)行描述的。因此，不應(yīng)當(dāng)將說明書和實(shí)施例認(rèn)作限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要^^詳細(xì)^己述。權(quán)利要求1.制劑，包含腺病毒載體、甘氨酸、MgCl2、Tris緩沖液和選自丙二醇、DMSO、PEG、蔗糖、甘油和四氫呋喃聚乙二醇醚的含水共溶劑，其中所述的制劑展示出在2℃-30℃下高于缺乏所述含水共溶劑的制劑的穩(wěn)定性。2.權(quán)利要求l所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為丙二醇。3.權(quán)利要求2所述的制劑，其中所述的丙二醇的存在濃度約為3-20%。4.權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為四氫呋喃聚乙二醇醚。5.權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述的四氫呋喃聚乙二醇醚的存在濃度約為5-20%。6.權(quán)利要求l所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為蔗糖。7.權(quán)利要求6所述的制劑，其中所述的蔗糖的存在總濃度為至少20%。8.權(quán)利要求l所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為甘油。9.權(quán)利要求8所述的制劑，其中所述的甘油的存在濃度約為10-50%。10.權(quán)利要求1所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在約5'C下。11.權(quán)利要求1所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在約室溫(15-30。C)下。12.制劑，包含依賴于適于進(jìn)入細(xì)胞的病毒編碼的衣殼內(nèi)蛋白酶的病毒載體和可逆蛋白酶抑制劑，其中所述的制劑展示出在2'C-30。C下高于缺乏所述可逆蛋白酶抑制劑的制劑的穩(wěn)定性。13.權(quán)利要求12所述的制劑，其中所述的病毒編碼的衣殼內(nèi)蛋白酶為腺病毒蛋白酶。14.權(quán)利要求13所述的制劑，其中所述的可逆蛋白酶抑制劑為L3/p23半胱氨酸蛋白酶抑制劑。15.權(quán)利要求14所述的制劑，其中所述的可逆蛋白酶抑制劑選自硫代化合物，包括硫代甘油、二曱基疏醚、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、谷胱甘肽和甲硫氨酸。16.制劑，包含腺病毒載體、甘氨酸、MgCh、Tris緩沖液和硫代化合物，其中所述的制劑展示出在2'C-30'C下高于缺乏所述硫代化合物的制劑的穩(wěn)定性。17.權(quán)利要求16所述的制劑，其中所述的硫代化合物為硫代甘油。18.權(quán)利要求17所述的制劑，其中所述的硫代甘油的存在濃度約為0.5-2.0%或約為50-200mM。19.權(quán)利要求16所述的制劑，其中所述的疏代化合物為二甲基硫醚。20.權(quán)利要求19所述的制劑，其中所述的二甲基硫醚的存在濃度約為10-100mM。21.權(quán)利要求16所述的制劑，其中所述的硫代化合物為DTT。22.權(quán)利要求21所述的制劑，其中所述的DTT的存在濃度約為20-100mM。23.權(quán)利要求22所述的制劑，其中所述的DTT的存在濃度為50mM。24.權(quán)利要求16所述的制劑，其中所述的硫代化合物為半胱氨酸。25.權(quán)利要求24所述的制劑，其中所述的半胱氨酸的存在濃度為至少1°/?；?50mM。26.權(quán)利要求12所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在5'C下。27.權(quán)利要求16所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在5。C下。28.權(quán)利要求12所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在室溫(15-30。C)下。29.權(quán)利要求16所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在室溫下。30.權(quán)利要求12的制劑，其中所述的制劑進(jìn)一步包含選自丙二醇、DMS0、PEG、蔗糖、甘油和四氫呋喃聚乙二醇醚的含水共溶劑。31.權(quán)利要求16的制劑，其中所述的制劑進(jìn)一步包含選自丙二醇、DMS0、PEG、蔗糖、甘油和四氫呋喃聚乙二醇醚的含水共溶劑。32.權(quán)利要求31所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為丙二醇。33.權(quán)利要求32所述的制劑，其中所述的丙二醇的存在濃度約為3-20%。34.權(quán)利要求31所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為四氫呋喃聚乙二醇醚。35.權(quán)利要求34所述的制劑，其中所述的四氫呋喃聚乙二醇醚的存在濃度約為5-20%。36.權(quán)利要求31所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為蔗糖。37.權(quán)利要求36所述的制劑，其中所述的蔗糖的存在總濃度為至少35%。38.權(quán)利要求31所述的制劑，其中所述的含水共溶劑為甘油。39.權(quán)利要求38所述的制劑，其中所述的甘油的存在濃度約為10-50%。40.權(quán)利要求31所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在5'C下。41.權(quán)利要求31所述的制劑，其中將所述的制劑貯存在室溫(15-30。C)下。全文摘要描述了具有提高的貯存穩(wěn)定性的治療用病毒制劑。該制劑包含病毒載體以及一種或多種含水共溶劑、可逆病毒編碼蛋白酶抑制劑和防止病毒成分特異性降解的溫和還原劑或其它試劑。文檔編號(hào)C12N15/63GK101163794SQ200680013299公開日2008年4月16日申請(qǐng)日期2006年2月28日優(yōu)先權(quán)日2005年3月1日發(fā)明者C·舒,D·弗雷申請(qǐng)人:細(xì)胞基因體系公司