專利名稱：：干固體分段發(fā)酵方法干固體分段發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0001本發(fā)明提供在發(fā)酵工藝中從可發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)最終產(chǎn)物，例如醇(比如乙醇)和含可溶物的干谷物酒糟(distillersdrygrainsolubles,DDGS)的方法。
背景技術(shù)：
：0002由于各種原因，包括持續(xù)且增加的對(duì)有限的石油供應(yīng)的依賴性，以及乙醇產(chǎn)品是可再生能源的事實(shí)，從農(nóng)作物中生產(chǎn)作為燃料來源的乙醇的商業(yè)生存能力已經(jīng)重新引起世界范圍內(nèi)的興趣。0003酒精發(fā)酵生產(chǎn)方法，特別是乙醇生產(chǎn)方法的一般特征在于濕磨或干磨方法。關(guān)于這些方法的綜述，可參考Bothast等，2005,」;;/.MfcraWo/.說0化c/7"0/.67:19-25禾卩THEALCOHOLTEXTBOOK,3rdEd(K.A.Jacques等Eds)1999NottinghamUniversityPress,UK。0004一般而言，濕磨法包括一系列的浸泡(浸漬)步驟以軟化谷物，其中可溶淀粉被移走，接著是回收胚芽、纖維(糠)和麩質(zhì)(蛋白質(zhì))。通過干燥、化學(xué)和/或酶處理，進(jìn)一步加工剩余的淀粉。然后該淀粉用于酒精產(chǎn)品、高果糖玉米漿或商品純度級(jí)的淀粉。0005一般而言，干谷物碾磨法包括許多基本步驟，其包括碾碎、蒸煮、液化、糖化、發(fā)酵和固液分離，以生產(chǎn)酒精和其它聯(lián)產(chǎn)物。一般地，所有谷物，例如玉米谷物，被碾磨成細(xì)顆粒大小，然后在漿槽內(nèi)與液體混合。此漿液在蒸汽加壓鍋內(nèi)與液化酶(例如a-淀粉酶)受到高溫處理，以將谷物中的淀粉溶解并水解成糊精?；旌衔锉焕鋮s，并進(jìn)一步用糖化酶(例如葡糖淀粉酶)處理以生產(chǎn)可發(fā)酵葡萄糖。然后含有葡萄糖的醪液(mash)在產(chǎn)生乙醇的微生物的存在下發(fā)酵大約24到120小時(shí)。將醪液中的固體從液相中分離出來，得到乙醇和有用的聯(lián)產(chǎn)物如酒糟(圖IA)。0006對(duì)上面的發(fā)酵方法已經(jīng)進(jìn)行了改進(jìn)，是通過將糖化步驟和發(fā)酵步驟結(jié)合在一個(gè)工藝中實(shí)施的，該工藝被稱作同時(shí)糖化與發(fā)酵或同時(shí)糖化、酵母繁殖和發(fā)酵。這些改進(jìn)的發(fā)酵方法具有優(yōu)于前面所描述的干磨發(fā)酵或甚至濕磨發(fā)酵法的優(yōu)勢，因?yàn)樵诎l(fā)酵罐內(nèi)沒有發(fā)展顯著的糖濃度，從而避免了糖對(duì)酵母生長的抑制。此外，由于缺乏容易利用的葡萄糖，細(xì)菌的生長得以減少。通過采用同時(shí)糖化和發(fā)酵的方法，可導(dǎo)致增加的乙醇產(chǎn)量。0007近來，已經(jīng)引進(jìn)這樣的發(fā)酵方法，其消除了蒸煮步驟，或者其減少了在高溫下處理谷物的需要。這些無蒸煮或低溫發(fā)酵方法包括碾磨谷物和將磨碎的谷物與液體組合形成漿液，其然后與一種或多種粒狀淀粉水解酶和任選的酵母混合，以生產(chǎn)乙醇和其它聯(lián)產(chǎn)物(USP4，514，496，WO04/081193和WO04/080923)(圖1B)。0008盡管使用磨碎谷物的漿液與粒狀淀粉水解酶的組合的無蒸煮或低溫發(fā)酵方法提供了優(yōu)于以前方法的某些改進(jìn)，但是本發(fā)明的干固體分段發(fā)酵方法提供生產(chǎn)酒精和其它最終產(chǎn)物的進(jìn)一步的優(yōu)勢。這些優(yōu)勢中的一些包括，但不限于a)去除了漿槽或進(jìn)料槽，其包含含有進(jìn)料到糖化容器中的粒狀淀粉的基質(zhì)；b)降低了含有無菌粒狀淀粉的基質(zhì)發(fā)酵中的潛在微生物污染，原因在于去掉了糖化和發(fā)酵之前的漿液步驟；c)改善了混合，加快了基質(zhì)的水化作用，以及改善了碳的轉(zhuǎn)化效率，這是由于初始發(fā)酵的起始醪液中干固體百分比(％DS)較低；d)在發(fā)酵操作期間總的高固體裝載；e)在殘留淀粉水平的存在下相等或更高的乙醇濃度，所述殘留淀粉水平在含有粒狀淀粉的基質(zhì)的其它無蒸煮或低溫發(fā)酵方法中可能更高，這些方法不經(jīng)歷千固體分段；f)可選地去掉酵母種繁殖槽；g)減輕發(fā)酵期間酵母的壓力；h)能處理研磨得很細(xì)的基質(zhì)，這將會(huì)降低殘留淀粉的量，但不會(huì)不利地導(dǎo)致發(fā)酵容器內(nèi)醪液的粘度增加；和i)酶與可發(fā)酵基質(zhì)的比例增加，這增強(qiáng)淀粉的水解。發(fā)明概述0009第一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)最終產(chǎn)物的干固體分段發(fā)酵方法，該方法包括初始發(fā)酵步驟，其包括在pH為3.0到7.0、溫度為5。C到65。C下，將第一可發(fā)酵基質(zhì)與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物在發(fā)酵容器內(nèi)結(jié)合2到40小時(shí)，得到發(fā)酵液，以及裝載步驟，其包括向含有發(fā)酵液的容器內(nèi)添加第二可發(fā)酵基質(zhì)，并允許在pH為3.0到7.0、溫度為20。C到65。C下繼續(xù)發(fā)酵足夠時(shí)間期間，以生產(chǎn)最終產(chǎn)物，其中發(fā)酵液的干固體百分比(％DS)隨時(shí)間增加。0010在該方面的一些實(shí)施方式中，第一可發(fā)酵基質(zhì)和第二可發(fā)酵基質(zhì)是相同的，和在其它實(shí)施方式中，第一可發(fā)酵基質(zhì)和第二可發(fā)酵基質(zhì)是不同的。在進(jìn)一歩的實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)是固體可發(fā)酵基質(zhì)，和在另外的實(shí)施方式中，固體可發(fā)酵基質(zhì)是干的磨碎的谷物。在該方面的其它實(shí)施方式中，初始DS為0到40%DS，而累積DS在10到55%之間。在該方面進(jìn)一步的實(shí)施方式中，裝載歩驟包括以1至20%的增量添加干固體(drysolid，DS)。在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述一種或多種淀粉水解酶選自葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、粒狀淀粉水解酶和其組合。在又一實(shí)施方式中，最終產(chǎn)物是酒精，而發(fā)酵生物是酵母。0011第二方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)酒精的干固體分段發(fā)酵方法，該方法包括初始發(fā)酵步驟，其包括在pH為3.0到6.0、溫度為5'C到65'C下，將可發(fā)酵基質(zhì)、一種或多種水解酶和發(fā)酵生物在發(fā)酵容器內(nèi)結(jié)合2到40小時(shí)，得到發(fā)酵液，以及裝載步驟，其包括向含有發(fā)酵液的容器內(nèi)添加固體可發(fā)酵基質(zhì)，并允許在pH為3.0至1」6.0、溫度為20'C到55'C下繼續(xù)發(fā)酵足夠時(shí)間期間，以生產(chǎn)酒精，其中發(fā)酵液的干固體百分比(％DS)隨時(shí)間增加。0012第三方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)乙醇的干固體分段發(fā)酵方法，該方法包括初始發(fā)酵步驟，其包括直接向發(fā)酵容器中加入固體可發(fā)酵基質(zhì)，在pH為3.0到6.5、溫度為20'C到55'C下，將固體可發(fā)酵基質(zhì)與酵母以及與選自葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、粒狀淀粉水解酶和其組合的一種或多種淀粉水解酶，在發(fā)酵容器內(nèi)結(jié)合2到40小時(shí)，得到發(fā)酵液，以及裝載步驟，其包括向含有發(fā)酵液的容器內(nèi)直接加入固體可發(fā)酵基質(zhì)，允許在pH3.0到6.5、溫度2(TC到55'C下繼續(xù)發(fā)酵足夠時(shí)間期間，以生產(chǎn)乙醇，其中發(fā)酵液的千固體百分比(％DS)隨時(shí)間增加。在該方面的一些實(shí)施方式中，所述固體可發(fā)酵基質(zhì)是干的磨碎的谷物。在該方面進(jìn)一步的實(shí)施方式中，在裝載步驟過程中，向發(fā)酵容器中添加附加量的所述一種或多種淀粉水解酶和/或酵母。0013第四方面，本發(fā)明涉及一種在用于生產(chǎn)酒精的發(fā)酵液中增加累積干固體(DS)的方法，其包括采用本發(fā)明所包括的干固體分段發(fā)酵方法。0014第五方面，本發(fā)明涉及降低可發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵期間的細(xì)菌污染的方法。該方面的一個(gè)實(shí)施方式包括在本發(fā)明所包括的干固體分段發(fā)酵工藝過程中，向發(fā)酵容器中直接加入固體可發(fā)酵基質(zhì)，例如干的磨碎的谷類。0015圖1A、1B和1C是圖解酒精發(fā)酵生產(chǎn)工藝的總示意圖表。0016圖1A闡明了傳統(tǒng)的干磨酒精發(fā)酵工藝，其包括在糖化和發(fā)酵之前使含粒狀淀粉的基質(zhì)漿液經(jīng)歷高溫液化步驟；0017圖IB闡明了無-蒸煮干磨酒精發(fā)酵工藝，其包括在同時(shí)糖化和發(fā)酵工藝中，在低于基質(zhì)的粒狀淀粉膠凝溫度的溫度下，將含粒狀淀粉的基質(zhì)漿液與粒狀淀粉水解酶結(jié)合；和0018圖1C闡明了本發(fā)明所包括的干固體分段發(fā)酵工藝的實(shí)施方式，其包括在初始發(fā)酵步驟和裝載步驟過程中，向糖化和發(fā)酵容器中直接加入干的磨碎的谷物，其中去掉了包括含粒狀淀粉的谷物的含水混合物的漿槽。0019圖2闡明了在初始發(fā)酵步驟開始15小時(shí)之后，在裝載步驟中，以l小時(shí)的間隔，加入干燥、固態(tài)、磨碎的玉米，共計(jì)10小時(shí)，在初始干固體(DS)為7%、10%和15%時(shí)，來自玉米的酒精隨時(shí)間(小時(shí))的回收率(％(v/v))，其中累積DS為30。/。，以及，一麗一代表初始7。/。DS;—命一代表初始10%DS;_X—代表初始15。/。DS,和一A—代表在發(fā)酵開始時(shí)加入的基線30WDS。可參考實(shí)施例3。0020圖3提供具有粒狀淀粉水解(GSH)活性的灰腐質(zhì)霉嗜熱變種(//w"z/co/agn'^a、w://7trwo/t/ea)的葡糖淀粉酶的成熟氨基酸序列(SEQIDNO:1)。0021圖4提供具有粒狀淀粉水解(GSH)活性的泡盛曲霉河內(nèi)變種C4j/erg///^mvawoA7'vwfewac//)的葡糖淀粉酶的成熟氨基酸序列(SEQIDNO:2)。0022圖5提供具有粒狀淀粉水解(GSH)活性的河內(nèi)曲霉04^wg///^bwacW)的a-淀粉酶的成熟氨基酸序列(SEQIDNO:3)。發(fā)明詳述0023除非本發(fā)明另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一名普通技術(shù)人員一般理解的相同的含義。0024盡管與本發(fā)明所述的那些相似或等價(jià)的任何方法和材料均可以應(yīng)用在本發(fā)明的實(shí)施或?qū)嶒?yàn)中，但是優(yōu)選的方法和材料被描述。0025本發(fā)明現(xiàn)在僅用下面的定義和實(shí)施例通過參考的方式予以詳細(xì)描述。本發(fā)明所提及的所有專利和出版物，包括在這些專利和出版物中所公開的所有序列，被清楚地并入作為參考。定義0026短語"干固體分段"指的是發(fā)酵方法中包括初始發(fā)酵步驟和裝載步驟在內(nèi)的至少兩個(gè)步驟。0027"初始發(fā)酵步驟"指的是在適合開始發(fā)酵的條件下，在發(fā)酵容器內(nèi)將可發(fā)酵基質(zhì)與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物相結(jié)合。0028"裝載步驟"指的是初始發(fā)酵步驟之后，向包括一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物的發(fā)酵容器中加入可發(fā)酵基質(zhì)，以及可發(fā)酵基質(zhì)的繼續(xù)發(fā)酵。0029術(shù)語"發(fā)酵"指的是有機(jī)物質(zhì)通過微生物的酶分解和厭氧分解，以產(chǎn)生更簡單的有機(jī)化合物。盡管發(fā)酵在厭氧條件下發(fā)生，但并不意味著該術(shù)語僅限于嚴(yán)格的厭氧條件，因?yàn)榘l(fā)酵在氧存在下也發(fā)生。0030短i吾"同時(shí)糖f七禾卩發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation,SSF)"指的是生產(chǎn)最終產(chǎn)物的工藝，其中發(fā)酵生物，例如產(chǎn)生乙醇的微生物，和至少一種酶，例如糖化酶，在同一容器中，在同一個(gè)工藝中被結(jié)合。0031術(shù)語"糖化"指的是不能直接利用的多糖向單糖或低聚糖的酶轉(zhuǎn)化，以便發(fā)酵轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。0032術(shù)語"可發(fā)酵基質(zhì)"指的是兩種碳基質(zhì)，其能被酶促轉(zhuǎn)化為一種可發(fā)酵糖和多種可發(fā)酵糖。0033術(shù)語"碳基質(zhì)"指的是含有植物基材料的纖維素、半纖維素和/或淀粉。0034術(shù)語"固體可發(fā)酵基質(zhì)"指的是植物基可發(fā)酵基質(zhì)，其基本上不含外加水或其它水成液。0035術(shù)語"干的磨碎的谷物"指的是這樣的固體可發(fā)酵基質(zhì)，其是磨碎的谷物，其基于干重的含濕量大約在2%和25%之間。0036短語"固體可發(fā)酵基質(zhì)的直接進(jìn)料"或"直接加入固體可發(fā)酵基質(zhì)"指的是將固體可發(fā)酵基質(zhì)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵容器中，而不是首先在漿槽或存ft槽或類似容器內(nèi)與水溶液結(jié)合。在一些實(shí)施方式中，直接進(jìn)料是將固體可發(fā)酵基質(zhì)轉(zhuǎn)移到發(fā)酵容器中而不加入外加的水成液，以及在其它實(shí)施方式中，直接進(jìn)料包括將固體可發(fā)酵基質(zhì)與水成液相混合的管線內(nèi)(in-line)加料方式。0037"可發(fā)酵糖"指的是單糖或二糖，其可以在發(fā)酵工藝中被與該可發(fā)酵糖接觸的微生物轉(zhuǎn)化而生產(chǎn)最終產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵性糖被微生物代謝，而在其它實(shí)施方式中，通過微生物的酶的表達(dá)和/或分泌實(shí)現(xiàn)了可發(fā)酵糖期望的轉(zhuǎn)化。0038如本文所使用，"單糖"指的是聚合物的單體單元，例如淀粉，其中聚合度(DP)為l(例如，葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖)。0039如本文所使用，"二糖"指的是任何化合物，其包括兩個(gè)共價(jià)鍵連接的單糖單元(DP2)。該術(shù)語包括，但不限于如蔗糖、乳糖和麥芽糖這樣的化合物。0040如本文所使用，DP〉3意指聚合度大于3的聚合物。0041如本文所使用，"低聚糖"指的是具有以糖苷鍵連接的2-10個(gè)單糖單元的任何化合物。0042如本文所使用，"多糖"指的是具有以直鏈或支鏈連接的多個(gè)單糖單元的任何化合物。在一些實(shí)施方式中，該術(shù)語是指含有成百或成千個(gè)單糖單元的長鏈。多糖典型的例子是淀粉、纖維素和糖原。0043如本文所使用，術(shù)語"淀粉"指的是包括植物的復(fù)雜多糖碳水化合物的任何材料，其包括式(C6Hu)05)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任何數(shù)字。0044術(shù)語"粒狀淀粉"指的是生(未蒸煮的)淀粉，例如還沒有經(jīng)歷膠凝作用的粒狀淀粉。0045術(shù)語"纖維素"指的是任何含有纖維素的材料。特別地，該術(shù)語是指式(C6Hu)05)x的葡萄糖(纖維二糖)的聚合物，其中X可以是任何數(shù)字。0046如本文所使用，術(shù)語"干固體含量(drysolidscontent,DS)"指的是基于干重的以百分比(％)計(jì)的漿液的總固體。0047術(shù)語"累積DS"指的是在發(fā)酵工藝中的時(shí)間期間內(nèi)加入的總e/。DS。0048術(shù)語"初始DS"指的是發(fā)酵工藝開始時(shí)發(fā)酵介質(zhì)或發(fā)酵液中的。/。DS。在一個(gè)實(shí)施方式中，初始DS是指在本發(fā)明的干固體分段發(fā)酵方法的初始發(fā)酵步驟開始時(shí)發(fā)酵介質(zhì)中的。/。DS。0049短語"發(fā)酵液的干固體百分比(％DS)隨時(shí)間增加"指的是累積DS，其大于初始DS，原因在于在裝載步驟中可發(fā)酵基質(zhì)的加入。該增加可以通過可發(fā)酵基質(zhì)遞增的、連續(xù)的或一次性的加入來實(shí)現(xiàn)。0050術(shù)語"漿液"指的是含有不溶性固體(例如粒狀淀粉)的含水混合物。0051術(shù)語"醪液(mash)"指的是在發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)中所使用的液體形式的可發(fā)酵基質(zhì)的混合物，并且被用于指發(fā)酵的任何階段，從可發(fā)酵基質(zhì)與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物的初始混合直到發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)完成。有時(shí)術(shù)語"醪液"、"漿液"、"發(fā)酵液"、"發(fā)酵介質(zhì)"和"飲料(beer)"這些術(shù)語可交換使用。在一些實(shí)施方式中，術(shù)語發(fā)酵液是指發(fā)酵介質(zhì)，其包括發(fā)酵生物(fermentingorganism)。0052術(shù)語"磨碎(milling)"指的是谷物分解成更小的顆粒。在一些實(shí)施方式中，這個(gè)術(shù)語與碾碎(grinding)交互使用。0053術(shù)語"干磨法(drymilling)"指的是干燥的整粒谷物的碾磨，其中谷物的小部分，例如胚芽和糠，還沒有被特意去除。0054如本文所使用，術(shù)語"干谷物酒糟(distillersdriedgrain,DDG)"和"帶可溶物的干谷物酒糟(distillersdriedgrainwithsolubles,DDGS)"指的是谷類發(fā)酵方法中的有用的聯(lián)產(chǎn)物。0055術(shù)語"殘留淀粉"指的是含淀粉的可發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵之后在組合物中留下的殘余淀粉(可溶的和不溶的)。0056術(shù)語"糖化酶"和"淀粉水解酶"指的是任何能將淀粉轉(zhuǎn)化成單糖或低聚糖的酶。0057術(shù)語"葡糖淀粉酶"指的是酶中的淀粉葡糖甘酶類別(例如，E.C.3.2丄3、葡糖淀粉酶、1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶(1.4-alpha-D-glucanglucohydrolase))。這些是外部作用酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉的非還原性端部釋放葡糖基殘基。所述酶也水解a-l,6和a-l，3鍵，盡管是以比a-1,4鍵慢得多的速度。0058術(shù)語"粒狀淀粉水解(GSH)酶"和"具有粒狀淀粉水解(GSH)活性的酶"指的是具有水解顆粒形式的淀粉能力的酶。0059術(shù)語"淀粉水解"指的是借助水分子加入的糖苷鍵的切割。0060術(shù)語"a-淀粉酶(例如E.C.類3.2丄1)"指的是催化a-l,4糖苷鍵水解的酶。這些酶也被予以描述，如那些影響含有1,4-a連接的D-糖苷單元的多糖中的1，4-a-糖苷鍵的外水解或內(nèi)水解的酶。用于描述這些酶的另一個(gè)術(shù)語是"糖原酶"。0061術(shù)語"膠凝"的意指通過蒸煮淀粉溶解而形成粘性懸浮液。0062術(shù)語"膠凝溫度"指的是含淀粉的基質(zhì)膠凝開始的最低溫度。膠凝的精確溫度取決于特定的淀粉，而且可以取決于如植物種類及環(huán)境和生長條件之類的因素而變化。0063術(shù)語"低于膠凝溫度"指的是低于開始凝膠的溫度的溫度。0064術(shù)語"液化"指的是淀粉轉(zhuǎn)化中的階段，其中膠凝化淀粉水解而產(chǎn)生低分子量的可溶性糊精。0065術(shù)語"稀酒糟(thin-stillage)"指的是所形成的發(fā)酵液體部分，其含有溶解的物質(zhì)和懸浮的細(xì)粒，并且其是從發(fā)酵所產(chǎn)生的固體部分分離出來的。0066術(shù)語"容器"包括但不限于槽、桶、瓶子、燒瓶、袋、生物反應(yīng)器及類似物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該術(shù)語是指適合于進(jìn)行本發(fā)明涉及的糖化和/或發(fā)酵工藝的任何貯器。0067術(shù)語"最終產(chǎn)物"指的是從可發(fā)酵基質(zhì)被酶轉(zhuǎn)化的任何碳源衍生產(chǎn)物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，最終產(chǎn)物是酒精，例如乙醇。0068如本文所使用，術(shù)語"發(fā)酵生物"指的是適宜用在發(fā)酵中用于直接或間接生產(chǎn)最終產(chǎn)物的的任何微生物或細(xì)胞。0069如本文所使用，術(shù)語"乙醇生產(chǎn)者(ethanolproducer)"或"生產(chǎn)乙醇的微生物"指的是能從單糖或低聚糖中生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵生物。0070術(shù)語"抗壞血酸中間體(ascorbicacidintermediate,ASA)"是指下列化合物中的任何一個(gè)D-葡糖酸酯、2-酮-D-葡糖酸酯(2-keto-D-gluconate，2KDG)、2,5-二酮-D-葡糖酸酯(2，5-keto-D-gluconate，2,5-DKG)、2-酮-L-葡糖酸(2-keto-L-gulonicacid,2KLG)、異抗壞血酸(erythorbicacid,EA)和抗壞血酸(ascorbicacid，ASA)。0071如本文所使用，"抗壞血酸中間體生產(chǎn)者"指的是能從單糖中生產(chǎn)ASA中間體的發(fā)酵生物。0072如本文所使用，"甘油生產(chǎn)者"指的是能從單糖中生產(chǎn)甘油的發(fā)酵生物。0073如本文所使用，"二醇生產(chǎn)者"指的是能利用甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的發(fā)酵生物。0074術(shù)語"衍生的"包括術(shù)語"來源于"、"得到"、"從……中可得的"和"從……中分離的"，而且在如本文所使用的一些實(shí)施方式中，是指核苷酸序列所編碼的多肽是從該核苷酸天然存在的或該核苷酸被插入其中的細(xì)胞中產(chǎn)生的。0075術(shù)語"異源蛋白質(zhì)"指的是并非天然存在于宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語"同源蛋白質(zhì)"指的是在宿主細(xì)胞中天然存在的蛋白質(zhì)或多肽。0076術(shù)語"酶轉(zhuǎn)化"一般指的是在酶的作用下基質(zhì)的改性。如本文所使用，該術(shù)語也指通過酶的作用可發(fā)酵基質(zhì)的改性，例如含粒狀淀粉的基質(zhì)。0077如本文所使用，術(shù)語"回收"、"分離"、"分開"指的是從與其天然相連的至少一個(gè)成分中去除的化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸。0078如本文所使用，術(shù)語"比活性"是指酶單位，定義為在特定條件下每單位時(shí)間通過酶制劑轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的基質(zhì)的摩爾數(shù)。比活性表達(dá)為單位(U)/mg蛋白質(zhì)。0079如本文所使用，"酶單位"是指在實(shí)驗(yàn)特定條件下每分鐘生產(chǎn)1微摩爾產(chǎn)物的酶數(shù)量。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語"葡糖淀粉酶活性單位(glucoamylaseactivityunit，GAU)"定義為在60。C和pH4.2的實(shí)驗(yàn)條件下，每小時(shí)從可溶淀粉基質(zhì)(4%DS)生產(chǎn)lg葡萄糖所需的酶的數(shù)量。0080術(shù)語"產(chǎn)量"指的是采用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的最終產(chǎn)物的數(shù)量。在一些實(shí)施方式中，該術(shù)語是指最終產(chǎn)物的體積，和在其它實(shí)施方式中，該術(shù)語是指最終產(chǎn)物的濃度。0081術(shù)語"DE"或"葡萄糖當(dāng)量"是用于測量總的還原糖濃度的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，基于干重以D-葡萄糖計(jì)算。未水解的粒狀淀粉的DE基本上為O和D-葡萄糖的DE為100。0082術(shù)語"糖漿"是指含有可溶性碳水化合物的含水組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，糖漿是含有葡萄糖的漿液。0083如本文所使用，術(shù)語"包含(comprising)"及其同源詞是以其包括的意思使用的；也就是，等價(jià)于術(shù)語"包括(including)"及其對(duì)應(yīng)的同源詞。0084"一個(gè)(a)"、"一個(gè)(an)"和"所述(the)"包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文明確地另外規(guī)定。0085數(shù)字范圍包括定義該范圍的數(shù)字。0086本文所提供的標(biāo)題并不是對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓绞降南薅ǎ淇梢酝ㄟ^參考發(fā)明書整體上來理解。原材料可發(fā)酵基質(zhì)0087對(duì)本發(fā)明有用的可發(fā)酵基質(zhì)包括碳基質(zhì)，例如含有纖維素和淀粉的植物基材料，以及糖類。合適的植物包括但不限于小麥、玉米、黑麥、高粱、水稻、粟、大麥、木薯、木薯淀粉、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗、和豆類，例如大豆和豌豆。植物的任何部分可以用作可發(fā)酵基質(zhì)，包括但不限于植物部分，例如葉、莖、外殼、莢、塊莖、玉米芯、谷粒和類似物。在一些實(shí)施方式中，基本上整個(gè)植物都可以使用，例如，全部的玉米秸稈都可以使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，整粒谷物被用作可發(fā)酵基質(zhì)。優(yōu)選的整粒谷物包括玉米、小麥、黑麥、大麥和高粱(買羅高粱(milo))。此外，雜交玉米，其已經(jīng)被開發(fā)來增加乙醇產(chǎn)量，也應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。這些雜交品種特征可能在于高的總可發(fā)酵淀粉和/或高的可提取淀粉。另外，可發(fā)酵糧谷基質(zhì)在發(fā)酵之前可以被分解成多個(gè)部分，包括纖維、胚乳和/或胚芽。分解植物材料例如玉米和小麥的方法在本領(lǐng)域是已知的。0088在一些實(shí)施方案中，含有粒狀淀粉的可發(fā)酵基質(zhì)可以是來自淀粉精制工藝的高精制生淀粉或原料。許多淀粉是商業(yè)可得的。例如，玉米淀粉可從Cerestar、Sigma和Katayama化學(xué)工業(yè)公司(日本)得到；小麥淀粉可從Sigma得到；甘薯淀粉可從Wako純化學(xué)工業(yè)公司(日本)得到；馬鈴薯淀粉可從Nakaari化學(xué)制藥公司(日本)得到。0089本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)制備在本發(fā)明所包括的方法中使用的植物基質(zhì)和尤其谷物的可利用方法很清楚。在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)可以采用諸如磨碎的方法制備。特別地，碾磨整粒谷物的方法是已知的，而且包括使用錘磨機(jī)和軋制機(jī)。0090在本發(fā)明方法的一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)尤其是谷物被碾磨成細(xì)顆粒大小，以使至少80%、至少85%、至少90%和至少95%的可發(fā)酵基質(zhì)將通過0.5mm的篩子GO目數(shù))。在其它實(shí)施方式中，谷物被磨成粗顆粒大小，以使50%以下、40%以下、30%以下和20n/。以下磨碎的谷物將通過0.5mm的篩子。0091盡管在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的可發(fā)酵基質(zhì)是包含粒狀淀粉的植物或植物部分，但是在其它的實(shí)施方式中，可溶形式的淀粉被用作可發(fā)酵基質(zhì)?？扇苄问降牡矸郯稍偕系奈刺峒兓旌衔?，例如玉米糖漿、糖蜜(例如甜菜或甘蔗)、大麥芽、糖類代用品、高果糖玉米糖漿和轉(zhuǎn)化糖。0092在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)是可溶性糖，例如單糖和/或二糖。單糖包括己糖，例如葡萄糖、甘露糖、艾杜糖和半乳糖，而且包括戊糖，例如核糖、木糖和阿拉伯糖。二糖包括蔗糖、乳糖、麥芽糖和纖維二糖。在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵糖是葡萄糖、果糖、蔗糖或其組合。0093在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)包括酒糟(stiUage)，其是非發(fā)酵固體和水的混合物，是從醪液中去除酒精之后的剩余物。此外，酒糟的液體部分，被稱為稀酒糟，可用作可發(fā)酵基質(zhì)。0094其它可發(fā)酵基質(zhì)包括農(nóng)業(yè)居住用材料和木素纖維素材料，例如玉米秸稈、begasses、木材、木片、木槳和鋸屑。紙質(zhì)廢物例子包括但不限于任何類型的廢棄紙(例如，影印紙、筆記本紙)、報(bào)紙、紙板和雜志。淀粉水解酶葡糖淀粉酶0095葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2丄3)可以來自細(xì)菌、植物和真菌來源的異源或內(nèi)源蛋白質(zhì)表達(dá)。應(yīng)用在本發(fā)明的組合物和方法中的優(yōu)選葡糖淀粉酶是由幾種絲狀真菌和酵母菌株產(chǎn)生的。特別地，曲霉屬和木霉屬的菌株分泌的葡糖淀粉酶在商業(yè)上是很重要的。合適的葡糖淀粉酶包括天然存在的野生型葡糖淀粉酶以及葡糖淀粉酶變種和基因工程突變型葡糖淀粉酶。下面的葡糖淀粉酶是可以應(yīng)用在本發(fā)明所包括的方法中的葡糖淀粉酶的非限定實(shí)施例。黑曲霉(As77《g///^"/ge。Gl和G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)EM^OJ3:1097-1102;WO92/00381,WO00/04136禾nUSP6,352,851);泡盛曲霉(」印"g///^"viwwon〕葡糖淀粉酶(WO84/02921);米曲霉(A/wrg〃/船o,yzoe)葡糖淀粉酶(Hata等，(1991)^g〃'cS/o/.Ozem.55:941-949)和Ape/'g/Z/wi's/"7wwam!'葡糖淀粉酶(參見Chen等，(1996)Prot.Eng.9:499-505;Chen等(1995)8:575-582;和Chen等，(1994)腸由w./302:275-281)。0096葡糖淀粉酶也可以從下列菌株獲得籃狀菌(ra/w0m_yC")的菌株，例如來自埃默森籃狀菌(7:eweraom)、Z/^c"to""5、杜邦籃狀菌(Uwpo"〃)、嗜熱籃狀菌f/;e膽沖7w)(WO99/28488;USPNo.RE:532,153;USPNo.4，587.215)那些;根霉屬(脂o戸)的菌株，例如雪白根霉"/麗)和米根霉(/.Ow"e);毛霉屬(M"cor)的菌株和腐質(zhì)霉(//ww/'co/t7)的菌株，例如灰色腐質(zhì)露(//.gn:ve")(參見Boela/.，(1984)￡MBO./.3:1097-1102;WO92/00381;WO00/04136;Chen"(1996)iVw.9:499-505;Taylor""/..(1978)C",.6o/y^ra,e61:301-308;USPat.No.4,514,496;USPat.No.4,092,434;禾IJJensen第(1988)Can./M'croWo/.34:218-223)。其它應(yīng)用于本發(fā)明中的葡糖淀粉酶包括那些從羅耳阿太菌(A/;e/,'",'o訴")得到的酶及其變體(WO04/111218)。0097商業(yè)使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如可以從黑曲霉(商品名DISTILLASE、OPTIDEXL-400和GZYMEG9904X，來自GenencorInternationalInc.)或根霉屬某種(商品名CU.CONC，來自日本ShinNihonChemicals)產(chǎn)生。還有商品消化酶，來自曰本AmanoOharmaceuticals，商品名為GLUCZYME(Takahashi等，(1985)J.Biochem.98:663-671)。另外的酶包括根霉屬某種的三種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3),即"Glucl"(MW74,000)、"Gluc2"(MW58,600)禾口"Gluc3"(MW61,400)。酶制劑GC480(GenencorInternationalInc.)也在本發(fā)明中得到應(yīng)用。a-淀粉酶-0098在本發(fā)明所包括的一些實(shí)施方式中，a-淀粉酶是具有E.C.編號(hào)的微生物酶，E.C.3.2丄1-3和特別地E.C.3.2丄1。在一些實(shí)施方式中，a-淀粉酶是耐熱細(xì)菌a-淀粉酶。在其它實(shí)施方式中，a-淀粉酶是耐酸a-淀粉酶。合適的a-淀粉酶可以是天然存在的以及重組和突變型a-淀粉酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，a-淀粉酶衍生自芽孢桿菌屬種類。優(yōu)選的芽孢桿菌屬種類包括枯草芽孢桿菌(及swW/!'s)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(5.Wewo^ew70^,7^)、緩慢芽孢桿菌(及/e"http://")、地衣芽孢桿菌(5.//c/je—/bm^)、凝結(jié)芽孢桿菌(Rcoagw/朋s)和解淀粉芽孢桿菌(及(USP5，093，257;USP5,763,385;USP5,824,532;USP5,958.739;USP6,008,026.USP6,361,809;USP6，867,031;WO96/23874;WO96/39528和WO05/001064)。特別優(yōu)選的a-淀粉酶衍生自芽孢桿菌屬菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌(及,s'/eora//7m;o;/w7ws)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)和地衣芽孢桿菌(及/7'c/w"^w;〃、)。也可參考具有ATCC39709、ATCC11945、ATCC6598、ATCC6634、ATCC8480、ATCC9945A和NCIB8059的菌株。0099在本發(fā)明的組合物和方法中考慮使用的商業(yè)可得的a-淀粉酶包括SPEZYMEAA;SPEZYMEFRED;SPEZYMEETHYL;GZYMEG997(Ge謹(jǐn)corInternationalInc.)和TERMAMYL120-L、LC、SC和SUPRA(NovozymesBiotech)。0100除細(xì)菌a-淀粉酶之外，真菌a-淀粉酶也考慮應(yīng)用在本發(fā)明的發(fā)酵方法中。合適的真菌a-淀粉酶衍生自曲霉菌屬，如米曲霉和黑曲霉(例如FUNGAMYL和CLARASEL)。粒狀淀粉7K解酶(Glanularstarchhydrolyzingenzymes,GSHEs)-0101GSHEs能水解粒狀(生)淀粉，而且這些酶已經(jīng)從真菌、細(xì)菌和植物細(xì)胞中回收，例如芽孢桿菌屬某種。a"7/""p.)、青霉屬某種(尸em'"7/!'訓(xùn)、腐質(zhì)霉屬某種(//wm/ra/",甲.)、木霉屬某種(7Wc/w6fen"a平)、曲霉屬某種"印"g/〃^印.)、毛霉屬某種(MwcoA"平)和根霉屬某種(/^&o;w印.)。在一個(gè)實(shí)施方式中，具有GSH活性的一組特別的酶包括具有葡糖淀粉酶活性和/或a-淀粉酶活性的酶(參見Tosi等,(1993)Can.J.Microbiol.39:846-855)。米根霉粒狀淀粉水解酶已經(jīng)在Ashikari寧，(1986)^gr/c所o/.C7w附.50:957-964禾卩USP4，863，864中予以描述?；腋|(zhì)霉粒狀淀粉水解酶已經(jīng)在AUison#"，(1992)O/rrGe"e/.21:225-229和EuropeanPatentNo.171218中予以描述。泡盛曲霉河內(nèi)變種粒狀淀粉水解酶已經(jīng)在Hayashida箏,(1989)爿gn'c.C/ww53:923-929中予以描述。s/2,Voww，"'的粒狀淀粉水解酶已經(jīng)在Shibuya箏(1990)^r/'c.別o/.54:1905-1914中予以描述。0102在一個(gè)實(shí)施方式中，GSHE可具有葡糖淀粉酶活性且衍生自灰腐質(zhì)霉菌株，特別是灰腐質(zhì)霉嗜熱變種菌株(參見USP4,618,579)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，灰腐質(zhì)霉嗜熱變種是在真菌宿主細(xì)胞、特別地木露屬宿主細(xì)胞如里氏木導(dǎo)(:rr化w/)宿主細(xì)胞中已經(jīng)被異源表達(dá)的菌株。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的腐質(zhì)霉酶與SEQIDNO:l的氨基酸序列具有至少85%、卯％、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。0103在另一個(gè)實(shí)施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，而且衍生自泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河內(nèi)變種菌株。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，泡盛曲霉河內(nèi)變種是在真菌宿主細(xì)胞中已經(jīng)被異源表達(dá)的菌株，例如曲霉屬或木霉屬宿主細(xì)胞，以及尤其是里氏木霉宿主細(xì)胞。在-些優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的泡盛曲霉河內(nèi)變種酶與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。0104在另一個(gè)實(shí)施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，而且衍生自根霉屬菌株，例如雪白根霉或米根霉。衍生自Koji菌株雪白根霉的酶以商品名"CUCONC"銷售，或者來自根霉的酶以商品名GLUZYME銷售。0105具有葡糖淀粉酶活性的另一有用的GSHE是SPIRIZYMEPlus(NovozymesA/S)，其也包括酸性真菌淀粉酶活性。0106在另一個(gè)實(shí)施方式中，GSHE可以具有a-淀粉酶活性，而且衍生自曲霉菌株，例如菌株泡盛曲霉、黑曲霉、米曲霉或河內(nèi)曲霉的菌株，特別是河內(nèi)曲霉的菌株。0107在優(yōu)選的實(shí)施方式中，河內(nèi)曲霉是在真菌宿主細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)被異源表達(dá)的菌株，例如木霉屬或曲霉屬宿主細(xì)胞，特別是雪白木霉宿主細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的河內(nèi)曲霉的酶與SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少85%、卯％、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。0108在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的酶是雜交酶，例如，一種這樣的雜交酶，其含有a-淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域——如黑曲霉a-淀粉酶、米曲霉ci-淀粉酶或河內(nèi)曲霉a-淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域，和不同的真菌a-淀粉酶或葡糖淀粉酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如河內(nèi)曲霉和灰腐質(zhì)霉的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其它的實(shí)施方式中，具有GSH活性的雜交酶可以包括葡萄淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域——如曲霉屬某禾中(/1/^^///15^)、籃狀菌屬某種(ra/ara附少c"^.)、蜀葵某禾中(X/Ae")、木霉屬某種(7Wc/w&mo取)或根霉屬某種(//^opzw取)的催化結(jié)構(gòu)域，和不同的葡糖淀粉酶或ci-淀粉酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一些具有GSH活性的雜交酶公開在WO05/003311,WO05/045018;Shibuya等，(1992)所Wc/.Z/"d化w56:1674—1675和Cornett等，(2003)尸,wto'"E叫"'"tw/wg16:521-520中。0109在一些實(shí)施方式中，在干固體分段發(fā)酵方法中所使用的GA或GSHE的量以GAU測量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將使用如在本文實(shí)驗(yàn)部分所描述的試驗(yàn)來測定GAU。此外，其它方法包括3，5-二硝基水楊酸溶液(3，5-dini加salicylicacid，DNS)方法(參見Goto等，(1994)Biosci.Biotechnol.Biochem.58:49-54)。在一些實(shí)施方式中，以GAU測得的葡糖淀粉酶在0.001與15.0GAU/gDS之間、在0.01與10GAU/gDS之間、在0.01與5.0GAU/gDS之間、在0.05與10.0GAU/gDS之間、在0.1與10.0GAU/gDS之間、在0.1與5.0GAU/gDS之間、在0.1與2.0GAU/gDS之間和在0.25與1.5GAU/gDS之間。0110在其它的實(shí)施方式中，在發(fā)酵方法中使用的a-淀粉酶的量為0.01至40SSU/gDS、在0.01與30.0SSU/gDS之間、在0.01與20SSU/gDS之間、在0.01與15.0SSU/gDS之間、在0.01與10SSU/gDS之間、在0.01與5.0SSU/gDS之間、在0.05與10.0SSU/gDS之間、在0.05與5.0SSU/gDS之間、在0.1與10.0SSU/gDS之間、在O.l與5.0SSU/gDS之間、在0.1與2.0SSU/gDS之間、在0.25與2.5SSU/gDS之間和在0.5與1.5SSU/gDS之間。0111在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，在混合組合物中提供了淀粉水解酶。特別有用的酶組合物包括具有a-淀粉酶活性的GSHE與葡糖淀粉酶的混合物。一個(gè)有用的組合物將包括具有0.1到10GAU/gDS的GA和具有0.01到15.0SSU的a-淀粉酶。特別有用的摻合物包括來自黑曲霉的GA如DISTILLSE和來自河內(nèi)曲霉的具有GSH活性的a-淀粉酶的組合物。另一有用的組合物包括GA和衍生自灰腐質(zhì)霉的具有GSH活性的葡糖淀粉酶。0112在一些實(shí)施方式中，在發(fā)酵中使用的具有a-淀粉酶活性(SSU)的GSHE與具有GA活性(GAU)的酶的比例將在15:1至1:15的范圍內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該比例(SSU與GAU)將在大約10:1至1:10、大約10:1至1:5、大約5:1至1:5、大約4:1至1:4、大約3:1至1:3、大約2:1至1:4和大約2:1至1:2的范圍內(nèi)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，SSU與GAU的比例將在大約4:1與2:1之間。次級(jí)酶0113次級(jí)酶可以被應(yīng)用在根據(jù)本發(fā)明的干固體分段發(fā)酵方法中，這些酶中的一些包括蛋白酶、P-淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、支鏈淀粉酶、木聚糖酶、e-葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶、果膠酶、木聚糖酶、脂肪酶、角質(zhì)酶(cutinase)和其組合。特別優(yōu)選的次級(jí)酶包括蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶和P-淀粉酶。0114合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細(xì)菌的蛋白酶，例如，酸性真菌蛋白酶，例如FERMENZYME以及GC106(GenencorInternationalInc.)。優(yōu)選的真菌蛋白酶衍生自曲霉屬(例如來自黑曲霉和米曲霉的蛋白酶)、毛霉屬(例如米黑毛霉(M""'ete/))、木霉屬、根霉屬和念珠菌(CamZ/tfe)的菌株。優(yōu)選的細(xì)菌蛋白酶衍生自芽孢桿菌屬的菌株，如液化淀粉芽孢桿菌。添加到發(fā)酵中的蛋白酶可以增加游離氨基氮的水平和增加酵母的代謝速度并進(jìn)一步提供更高的發(fā)酵效率。0115可以應(yīng)用在本發(fā)明的方法中的另一種酶包括e-淀粉酶(E.C.3.2丄2)。這些酶是外部作用的麥芽糖淀粉酶(exo-actingmaltogenicamylase),其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉和相關(guān)的葡萄糖聚合物中1,4-a-糖苷鍵的水解。商業(yè)上的e-淀粉酶可從GenencorInternationalInc.得到，而且例子包括SPEZYMEBBA和OPTIMALBBA。0116纖維素酶(E.C.3.2丄4)，例如內(nèi)切葡聚糖酶，可以應(yīng)用在本發(fā)明的干固體分段發(fā)酵方法中。纖維素酶的例子包括來自絲狀真菌如木霉菌、腐質(zhì)霉菌、鐮刀菌和曲霉菌的纖維素酶。商業(yè)纖維素酶以SPEZYMECP(GenencorInternationalInc.)禾卩CELLUZYME(NovozymesA/S)可得。0117在干固體分段發(fā)酵方法中可用的木聚糖酶可以來自細(xì)菌或真菌來源，例如曲霉菌、木霉菌、鏈孢菌(A^/ro^ora)和鐮刀菌(Awar/ww人商業(yè)制劑包括SPEZYMECP(GenencorInternationalInc.)和ULTRAFLOW(NovozymesA/S)。0118肌醇六磷酸酶的例子如(E.C.3丄3.8和3.1.3.26)包括PHYTASE(NovozymesA/S)。0119干固體分段發(fā)酵方法中所包括的這些酶的有效量可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。發(fā)酵生物0120取決于期望的最終產(chǎn)物，不同的發(fā)酵生物可以被用在干固體分段發(fā)酵方法中。這些發(fā)酵生物可以是野生型生物或修飾的生物(modifiedorganism)。例如，異源表達(dá)酶的修飾的生物，或者過量表達(dá)通常由野生型生物產(chǎn)生的酶的修飾的生物。發(fā)酵生物的優(yōu)選例子是產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenicmicroorganism)或產(chǎn)生乙醇的微生物，例如產(chǎn)乙醇細(xì)菌，其表達(dá)乙醇脫氫酶和丙酮酸酯(pyruvate)脫氫酶，而且其可以從運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zy附owomw.MoWfc)中得到(參見，例如USP5,000,000;USP5,028,539;USP5,424,202;USP5,514,583和USP5,554,520)。在另外的實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物表達(dá)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶、將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，木糖異構(gòu)酶被用于將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用能夠使戊糖和己糖發(fā)酵為乙醇的微生物。舉例來說，在一些實(shí)施方式中，微生物可以是天然的或非基因工程微生物，或者在其它實(shí)施方式中，微生物可以是重組微生物。舉例來說，在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選的發(fā)酵微生物包括來自芽孢桿菌屬、乳酸菌屬(丄fl"Wacv7/M)、大腸桿菌屬(￡.co/,')、歐文氏菌屬(五nWm'a)、泛菌屬(Pa"/oe")(例如擰檬泛菌(尸.c/加a))禾口克雷伯氏桿菌屬(火/A^//0)(例如產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(尺m7""7))的細(xì)菌菌株(參見，例如USP5,028,539、USP5,424,202和WO95/13362)。0121在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生乙醇的微生物是真菌微生物，例如酵母和特別是酵母菌(Saccteram^^)，例如釀酒酵母(S.cerev/w'ae)的菌株(USP4，316，956)。各種釀酒酵母是商業(yè)上可獲得的，而且這些釀酒酵母包括FALI(Fleischmann'sYeast)、SIPERSTART(AUtech)、FERMIOL(DSMSpecialties)、REDSTAR(Lesaffre)和安琪酒精酵母(Angelalcoholyeast)(AngelYeastCompany,中國)。0122在一些實(shí)施方式中，除了上面所描述的原材料之外，發(fā)酵介質(zhì)將含有補(bǔ)充物，包括但不限于微生素(例如生物素、葉酸、煙堿酸、核黃素)、輔因子和常量和微量營養(yǎng)物和鹽(例如(NH4)2S04;K2HP04;NaCl;MgS04;H3B03;ZnCl2;CaCl2)。工藝0123盡管在本發(fā)明的干固體分段發(fā)酵工藝與本領(lǐng)域已知方法之間可能存在多種表面相似之處，但是本發(fā)明提供了更全面的目標(biāo)，其體現(xiàn)在許多被認(rèn)為對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施來說是獨(dú)特的詳細(xì)特征。在一些實(shí)施方式中，這些特征顯著地包括直接將固體可發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)料到發(fā)酵容器內(nèi)，以低的初始DS——其低于累積DS，并且甚至可以是0%——開始初始發(fā)酵步驟，發(fā)酵進(jìn)行之后繼續(xù)在裝載步驟添加干固體，在裝載步驟期間通過進(jìn)料固體控制發(fā)酵，和在發(fā)酵生物對(duì)數(shù)生長階段通過添加可發(fā)酵基質(zhì)提高發(fā)酵效率。0124本文所包括的干固體分段發(fā)酵方法的主要工藝歩驟在一個(gè)實(shí)施方式中可以分成下面的步驟予以描述初始發(fā)酵步驟和裝載步驟。初始發(fā)酵步驟0125在初始發(fā)酵步驟的一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)在發(fā)酵容器中與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物相結(jié)合，從而開始初始發(fā)酵。0126盡管可發(fā)酵基質(zhì)可以是如在原材料描述中所公開的任何基質(zhì)，但是在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)是固體可發(fā)酵基質(zhì)，并且特別是干的磨碎的谷物，其已經(jīng)被磨成細(xì)顆粒大小(例如，其中至少90%的谷物可通過0.5mm目篩)，而在其它實(shí)施方式中，干谷物已經(jīng)被磨成粗顆粒大小或者根本沒有碾磨。0127在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)是己經(jīng)被濕磨或干磨和任選被分級(jí)的谷物。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)是可發(fā)酵糖。0128在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)在干固體分段發(fā)酵工藝之前可以被預(yù)處理。預(yù)處理可以包括下面的任何一種或組合預(yù)浸泡、稀酸處理、堿處理和酶處理。在一些實(shí)施方式中，預(yù)處理可以進(jìn)行30分鐘至24小時(shí)，也可以從30分鐘至12小時(shí)，也可以從30分鐘至8小時(shí)，也可以從30分鐘至4小時(shí)，以及優(yōu)選地從1小時(shí)至3小時(shí)以下。0129在一些傳統(tǒng)的工藝中，當(dāng)可發(fā)酵基質(zhì)是谷物或其它包括粒狀淀粉的基于植物的基質(zhì)時(shí)，該基質(zhì)被碾磨，與水成液混合，并貯存在漿槽或存貯槽中。包括含有粒狀淀粉的基質(zhì)的漿液被混合或攪拌，以防止由于槳液中固體的粘度而引起的漿槽的沉淀或堵塞。來自槽中的漿液然后被進(jìn)料到糖化槽內(nèi)。這些漿槽潛在地提供促進(jìn)微生物污染的環(huán)境。0130在本發(fā)明所包括的干固體分段發(fā)酵方法的一個(gè)實(shí)施方式中，固體可發(fā)酵基質(zhì)在漿槽或存貯槽內(nèi)或類似容器中與水成液的混合被去掉，因?yàn)楣腆w可發(fā)酵基質(zhì)被直接進(jìn)料到糖化/發(fā)酵(S/F)容器內(nèi)。在將基質(zhì)加入到S/F容器里之前，水或其它水成液可以與固體可發(fā)酵基質(zhì)結(jié)合，但是該加入是通過管線內(nèi)進(jìn)料方式完成的，例如通過將水成液加到固體可發(fā)酵基質(zhì)轉(zhuǎn)移管道中，如將可發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)料到S/F容器的管，或者通過將固體可發(fā)酵基質(zhì)送至混合基質(zhì)與水成液的泵，并將漿液進(jìn)料到S/F容器里。通過管線內(nèi)進(jìn)料方式添加水成液可以在固體可發(fā)酵基質(zhì)轉(zhuǎn)移到S/F容器期間任何時(shí)刻完成。在一些實(shí)施方式中，水成液將是水，而在本工藝的其它實(shí)施方式中，水成液將是稀酒糟(圖1C)。循環(huán)的稀酒糟，可以被加入到發(fā)酵工藝中，有時(shí)在本領(lǐng)域中被稱為逆流(backset)。0131在初始發(fā)酵步驟期間，可發(fā)酵基質(zhì)與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物的結(jié)合可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易確定的多種方式進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所有成分(原材料)加入到發(fā)酵容器中基本上是同時(shí)的。在其它實(shí)施方式中，水成液、一種或多種淀粉水解酶和酵母在發(fā)酵容器內(nèi)被混合，可發(fā)酵基質(zhì)，特別是固體可發(fā)酵基質(zhì)隨后被加入。在還有其它實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)首先在發(fā)酵容器內(nèi)與水成液混合，然后淀粉水解酶和酵母被加入到容器內(nèi)。盡管干固體分段發(fā)酵工藝的優(yōu)選實(shí)施方式是同時(shí)糖化和發(fā)酵工藝，但是在其它實(shí)施方式中，干固體分段發(fā)酵工藝可以包括分開的糖化容器和發(fā)酵容器。0132在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在初始發(fā)酵步驟期間沒有進(jìn)一步添加所述一種或多種淀粉水解酶或發(fā)酵生物。0133在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵在至少大約5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30。C、35°C、40°C、45°C、50°C、55。C、60°C、65°C、70。C和75。C的溫度下進(jìn)行，以及也可以在小于7(TC、小于65'C和小于6(TC的溫度下進(jìn)行。在其它實(shí)施方式中，該溫度將在大約5—65。C、大約10—65。C、大約20—65。C、大約20—6(TC、大約20—55。C、大約25—50。C、大約25—45°C、大約30—45。C、大約30—40'C和大約35—45'C之間。在所有的實(shí)施方式中，初始發(fā)酵的溫度將低于可發(fā)酵基質(zhì)中的粒狀淀粉的膠凝溫度。0134在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵在pH3.0與7.0之間、pH3.0與6.5之間、pH3.0與6.0之間、pH3.0與5.0之間、pH3.5與5.5之間、pH3.5與5.0之間和pH3.5與4.5之間的pH下進(jìn)行。依照本方法的任何發(fā)酵步驟所使用的精確溫度和pH取決于具體的可發(fā)酵基質(zhì)，并且進(jìn)一步可能取決于特定的植物品種、正在使用的酶和發(fā)酵生物。0135發(fā)酵生物經(jīng)歷不同的生長階段，包括停滯階段、對(duì)數(shù)階段、穩(wěn)定階段和死亡階段。停滯階段的長短可取決于營養(yǎng)、生長條件、溫度和接種密度而變化。停滯階段也可以取決于發(fā)酵生物如酵母是否適應(yīng)新環(huán)境或者是否是被直接加入發(fā)酵罐內(nèi)的。一般地，停滯階段是6到9小時(shí)。如果發(fā)酵生物如酵母可以保持在活性生長狀態(tài)，最終產(chǎn)物例如酒精，特別是乙醇的產(chǎn)量，可以增加，并且發(fā)酵時(shí)間可能降低。0136因此，在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵進(jìn)行的時(shí)間期間對(duì)應(yīng)于發(fā)酵生物的停滯階段。在其它實(shí)施方式中，初始發(fā)酵步驟進(jìn)行2到40小時(shí)之間的一段時(shí)間，也可以在2到30小時(shí)之間，也可以在2到25小時(shí)之間，也可以在5到20小時(shí)之間以及在2到15小時(shí)之間。在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵時(shí)間大于2、3、4、5、6、7、8、9、IO或15小時(shí)但小于36小時(shí)。0137在一些實(shí)施方式中，在初始發(fā)酵步驟中含有可發(fā)酵基質(zhì)的漿液的。/。DS(初始DS)將在0到45%之間、0到40%之間、2到30%之間、5到25%之間以及在一些實(shí)施方式中還在5到20%之間。在一些實(shí)施方式中，以及特別是，其中可發(fā)酵基質(zhì)是固體可發(fā)酵基質(zhì)，例如干的谷物，初始發(fā)酵醪液的干固體(DS)至少是2%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%、20%、22%和25%。在一些實(shí)施方式中，該醪液的DS為40%以下、30%以下、28%以下、26%以下、25%以下和24%以下。在其它實(shí)施方式中，DS在P/。和25。/。之間。0138盡管如在原材料部分所描述的任何數(shù)量的淀粉水解酶可以被用在干固體分段發(fā)酵工藝中，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，淀粉水解酶是葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、粒狀淀粉水解酶或其組合。特別優(yōu)選的酶組合物包括葡糖淀粉酶和具有粒狀淀粉水解活性的酶的組合。舉例來說，黑曲霉葡糖淀粉酶和河內(nèi)曲稀a-淀粉酶可以被使用。裝載步驟0139在干固體分段發(fā)酵方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，進(jìn)一步添加的可發(fā)酵基質(zhì)在裝載步驟被加入到與初始發(fā)酵步驟相同的發(fā)酵容器中。在一些實(shí)施方式中，該可發(fā)酵基質(zhì)與在初始發(fā)酵步驟中加入的可發(fā)酵基質(zhì)相同，而在其它實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)是不同的可發(fā)酵基質(zhì)。0140與初始發(fā)酵步驟相似，在一些實(shí)施方式中，固體可發(fā)酵基質(zhì)可以是谷物，其已經(jīng)被碾磨成細(xì)顆粒大小(例如，其中至少90%的谷物通過0.5mm網(wǎng)篩)，而在其它實(shí)施方式中，干谷物已經(jīng)被磨成粗顆粒大小或者根本沒研磨。0141在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵步驟的可發(fā)酵基質(zhì)是可溶性糖，例如糖蜜或葡萄糖糖漿，而裝載步驟的可發(fā)酵基質(zhì)是固體可發(fā)酵基質(zhì)，例如磨碎或未碾磨的谷物或其己分級(jí)的部分。當(dāng)初始發(fā)酵歩驟的可發(fā)酵基質(zhì)是可溶性糖并且裝載步驟的可發(fā)酵基質(zhì)是固體可發(fā)酵基質(zhì)，例如干谷物時(shí)，具有粒狀淀粉水解活性的酶將與該固體可發(fā)酵基質(zhì)一起被包括在發(fā)酵槽內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，不同的可發(fā)酵基質(zhì)可以在裝載步驟期間被加入到發(fā)酵容器內(nèi)。0142固體可發(fā)酵基質(zhì)可以與初始發(fā)酵步驟所描述的相同的方式，在裝載步驟期間被直接進(jìn)料到S/F容器內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，直接進(jìn)料將通過管線內(nèi)加料方式完成。0143在裝載階步驟期間，可發(fā)酵基質(zhì)的進(jìn)料可以是連續(xù)進(jìn)料、間歇進(jìn)料或一次性大量進(jìn)料，這基本上是在裝載歩驟開始的時(shí)候。間隔可以包括幾分鐘或幾小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)料間隔可以是每5、10、15、20或30分鐘。進(jìn)料也可以以每小時(shí)的間隔進(jìn)行，例如每l、2、3、4、5或10小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，在裝載步驟期間的進(jìn)料將持續(xù)在大約5到35小時(shí)之間的一段時(shí)間，也可以是大約5到25小時(shí)和5到20小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，在裝載步驟期間的進(jìn)料可以持續(xù)l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30小時(shí)或更多。進(jìn)料可以持續(xù)不同的時(shí)間期間，而且這可能取決于包括可發(fā)酵基質(zhì)在內(nèi)的許多因素。在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)的進(jìn)料將以與可發(fā)酵基質(zhì)轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物的速度相等或不同的速度進(jìn)行。0144在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵將進(jìn)行5到36小時(shí)以及裝載步驟的進(jìn)料將進(jìn)行10到20小時(shí)。第二可發(fā)酵基質(zhì)的添加可以在發(fā)酵生物的對(duì)數(shù)階段(活性生長階段)進(jìn)行。0145發(fā)酵液的干固體百分比(％DS)將隨時(shí)間增加，使得在一些實(shí)施方式中累積DS將在大約10到55%之間。在其它實(shí)施方式中，累積DS將在大約IO到50%、大約15到45%、大約20到40%、大約25到40%和大約10到20%之間。0146在一些實(shí)施方式中，盡管添加到發(fā)酵液中的累積DS將在大約10到55%之間，但是初始發(fā)酵介質(zhì)的DS將比發(fā)酵液累積DS的干固體少至少5y。、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%和至少90%。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠容易地計(jì)算在干固體分段發(fā)酵工藝中加入的可發(fā)酵基質(zhì)的數(shù)量，從而得到特定百分比的DS。0147在其它實(shí)施方式中，當(dāng)接近50%、60%、70%、80%、90%的DS被轉(zhuǎn)化成可溶固體時(shí)，在裝載步驟中將會(huì)進(jìn)行可發(fā)酵基質(zhì)的另一批進(jìn)料。0148盡管期望在一些實(shí)施方式中裝載步驟將不需要發(fā)酵生物的附加接種物或另外的淀粉水解酶，但是某些實(shí)施方式將包括接種物如酵母和/或淀粉水解酶的添加。另外，在一些實(shí)施方式中，附加的酵母接種物可以在裝載步驟開始之后，例如，在5到40小時(shí)之間、在10到40小時(shí)之間、在12到30小時(shí)之間或在15到24小時(shí)之間加入。0149裝載步驟可以在如上所述的初始發(fā)酵步驟的溫度和pH下進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，該溫度和pH將基本上與初始發(fā)酵步驟的溫度和pH相同，而在其它實(shí)施方式中，該溫度和pH可以不同于初始發(fā)酵步驟。例如，在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵步驟的溫度可以在25'C到40'C之間或在30'C到5(TC之間，而裝載步驟的溫度可以以1°C、2'C、3t:、4°C、5'C、6'C、7'C、8'C、9'C或l(TC的增量降低。在一些實(shí)施方式中，初始發(fā)酵步驟的溫度將在35'C到4(TC之間，而裝載歩驟的溫度將在25'C到35'C之間。0150對(duì)于依照干固體分段發(fā)酵方法可以使用的可發(fā)酵基質(zhì)中的許多淀粉來說，通常的淀粉膠凝溫度范圍包括大麥(52到59°C)、小麥(58到64°C)、黑麥(57到7(TC)、玉米(62到72°C)、高直鏈淀粉玉米(67到8CTC)、水稻(68到77°C)、高粱(68到77°C)、馬鈴薯(58到68°C)、木薯淀粉(59到69°C)和甘薯(58至l」72'C)(J丄M.Swinkelspg32-38,在STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY,EdsVanBeynum等，(1985)MarcelDekkerLie.NewYork禾口TheAlcoholTextbook3rdED。關(guān)于飲料、燃料和工業(yè)酒精業(yè)的參考，EdsJacques等,(1999)NottinghamUniversityPress,UK)。根據(jù)此處的本發(fā)明，發(fā)酵將在低于包含在可發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)的淀粉的淀粉膠凝溫度的溫度下進(jìn)行。0151在一些實(shí)施方式中，干固體分段方法的總發(fā)酵時(shí)間將是大約24到168小時(shí)、24到144小時(shí)、24到108小時(shí)、24至lj96小時(shí)、36至lj96小時(shí)、36到72小時(shí)和48至lj72小時(shí)。0152在干固體分段方法中來自可發(fā)酵基質(zhì)的葡萄糖的收率(總的溶解的干固體的百分比)可以是至少大約60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%和98%。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡萄糖是連續(xù)生產(chǎn)的，而且在本方法中，基本上所有的葡萄糖被用來生產(chǎn)最終產(chǎn)物，例如乙醇。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，來自干固體分段發(fā)酵工藝的最終醪液將包括1.0%以下、0.8%以下、0.5%以下、0.2%以下、0.15%以下、0.1%以下和0.05%以下的DP-1(w/v)。0153盡管優(yōu)選的最終產(chǎn)物是酒精和特別是乙醇，其它的最終產(chǎn)物也可以得到，而且這些最終產(chǎn)物包括但不限于甘油、ASA中間體、1,3-丙二醇、酶、抗菌劑、有機(jī)酸、氨基酸和抗生素。0154在一些實(shí)施方式中，乙醇的收率按體積計(jì)將大于8%、10%、12%、14%、16%、18%和20%。在其它實(shí)施方式中，最終乙醇收率的至少50%、60%、70%、80%在前20、22、24、26、28或30小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生。在某些實(shí)施方式中，乙醇的收率將大于16%，并且最終乙醇的至少50%將在前20小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生。根據(jù)千固體分段發(fā)酵方法得到的乙醇可以被用作燃料乙醇、飲料乙醇或工業(yè)乙醇。0155在干固體分段發(fā)酵結(jié)束時(shí)的醪液可以包括0到30%的殘余淀粉。在一些實(shí)施方式中，醪液可以包括至少1%、2%、4%、6%、8%、10%、12%但30%以下、20%以下和15%以下的殘余淀粉。0156在一些實(shí)施方式中，在基本上相同的發(fā)酵條件下，例如發(fā)酵基質(zhì)、pH、溫度、發(fā)酵時(shí)間及類似條件，當(dāng)與其它無蒸煮或低溫發(fā)酵方法相比時(shí)，干固體分段發(fā)酵方法將具有更高的碳轉(zhuǎn)化效率。碳轉(zhuǎn)化效率可以被定義為可發(fā)酵基質(zhì)中的碳直接轉(zhuǎn)化成最終產(chǎn)物如酒精、而沒有將碳作為副產(chǎn)物釋放的轉(zhuǎn)化率增加。在一些實(shí)施方式中，與在基本相同的條件下、使用同樣原材料的無蒸煮發(fā)酵方法相比，當(dāng)使用干固體分段發(fā)酵方法時(shí)，碳轉(zhuǎn)化效率的增加將至少是2%、至少5%、至少7%、至少10%、至少15%和至少20%。在一些實(shí)施方式中，增加的碳轉(zhuǎn)化效率體現(xiàn)在發(fā)酵結(jié)束時(shí)更高的殘余淀粉水平，其產(chǎn)生與被比較的方法大體相同數(shù)量的乙醇。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，可發(fā)酵基質(zhì)將是谷物，例如玉米、小麥、大麥或黑麥。0157在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本方法所產(chǎn)生的最終產(chǎn)物將從發(fā)酵介質(zhì)中被分離和/或純化。分離和純化的方法是已知的，例如，通過使介質(zhì)經(jīng)歷萃取、蒸餾和柱層析。在一些實(shí)施方式中，最終產(chǎn)物直接通過使該介質(zhì)經(jīng)過高壓液相色譜(HPLC)分析而被鑒定。0158在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，醪液例如可以通過離心成為液相和固相而被分離，并回收最終產(chǎn)物如酒精和固體。酒精可以通過諸如蒸餾和分子篩脫水或超濾的方法回收。0159發(fā)酵剩余的殘余物，被稱為酒糟也可以回收，并且再循環(huán)用于裝載步驟中的酒糟的成分或所述酒糟可以被分成可溶餾分或不溶餾分。0160當(dāng)酒糟通過例如離心或篩分成可溶餾分和不可溶餾分而被分離時(shí)，這些餾分可被用來制造可溶酒糟(distillers'solubles)或可溶干酒糟(distillers'driedsolubles)或者混合在一起制造含可溶物的谷物干酒糟(distillers'driedgrainplussolubles，DDGS)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常熟悉形成DDGS和谷物酒糟的工藝。然后，DDGS例如可以被用于動(dòng)物詞料配方中。0161在一些實(shí)施方式中，干固體分段發(fā)酵方法將產(chǎn)生含有30%以下、20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、2%以下和r/。以下殘余淀粉的DDGS。在一些實(shí)施方式中，從根據(jù)本發(fā)明的本方法中得到的DDGS將具有更高的殘余淀粉含量，和在其它實(shí)施方式中，與現(xiàn)有技術(shù)方法制備的DDGS相比，將含有更低的殘余淀粉含量。從干固體分段方法中得到的DDGS可用在動(dòng)物飼料中。此外，從發(fā)酵回收的殘余淀粉可以被用作可發(fā)酵基質(zhì)。0162對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在閱讀了本公開內(nèi)容之后，本說明書和實(shí)施例的各種其它實(shí)施例和改進(jìn)將是顯而易見的，而不背離本發(fā)明的精神和范圍，這意味著所有的這些實(shí)施例或改進(jìn)將被包括在所附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。實(shí)驗(yàn)0163提供下面的實(shí)施例，以便說明和進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式和方面，而且不應(yīng)被解釋為對(duì)其范圍的限制。確實(shí)，期望這些教導(dǎo)將在進(jìn)一步優(yōu)化本文所描述的工藝系統(tǒng)中起作用。0164在本公開內(nèi)容和接下來的實(shí)驗(yàn)部分，用到了下面的縮寫GA(葡糖淀粉酶)；AkAA(具有GSH活性的河內(nèi)曲霉a-淀粉酶；SEQIDNO:3);AnGA/AkAA(具有GSH活性的酶摻合物，其包括黑曲霉葡糖淀粉酶和河內(nèi)曲霉a-淀粉酶)；Wt%(重量百分比)；°C(攝氏度)；rpm(每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù))；H20(水)；dH20(去離子水)；dlH20(去離子水，Milli-Q過濾)；aa(氨基酸)；bp(堿基對(duì))；kb(—千個(gè)堿基對(duì))；kD(千道爾頓)；g或者gm(克)；嗎(微克)；mg(毫克)；pi(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；(微摩爾)；U(單位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘(minute/minutes));hr(s)(小時(shí)(hour/hours));DO(溶解的氧);鄰苯二甲酸鹽緩沖液(鄰苯二甲酸鈉水溶液，20mM,pH5.0);w/v(重量與體積之比)；w/w(重量與重量之比)；v/v(體積與體積之比)；Genencor(GenencorInternational,Inc.,PaloAlto,CA);DDGS(含可溶物的干谷物酒糟，DistilleriesDryGrainplusSolids);MT(公噸);和EtOH(乙醇)。0165以下實(shí)驗(yàn)和方法在下面提供的實(shí)施例中被使用0166葡糖淀粉酶的活性采用公知的試驗(yàn)測定，其基于葡糖淀粉酶可催化對(duì)硝基苯-a-D-批喃葡糖苷(p-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside，PNPG)生成葡糖淀粉酶和對(duì)硝基苯酚的能力。在堿性pH下，該硝基苯酚形成黃色物質(zhì)，其與葡糖淀粉酶的活性成比例，在400nm處測定，并且與經(jīng)測定作為GAU的酶標(biāo)準(zhǔn)比較。0167一個(gè)"葡糖淀粉酶活性單位(GlucoamyaseActivityUnit)"(GAU)被定義為在pH4.2和60'C下產(chǎn)生1gm還原糖的酶的量，計(jì)算為每小時(shí)來自可溶淀粉基質(zhì)(4%DS)的葡萄糖。0168a-淀粉酶活性的測定是基于在pH4.5和50'C下，可溶性馬鈴薯淀粉基質(zhì)(4%DS)被一等分酶樣品水解的程度。還原糖的含量是采用在Miller,G.L.(1959)Anal.Chem.31:426-428中所述的DNS方法測定的。一個(gè)酶活性單位(SSU，可溶淀粉單位(solublestarchunit))相當(dāng)于在特定溫育條件下每分鐘所釋放lmg葡萄糖的還原能力。0169總淀粉含量的測定用酶-酶淀粉液化和糖化方法測定總淀粉含量。在典型的分析中，在100ml的Kohlraucsh燒瓶內(nèi)放入2g干樣品，并且加入45ml的pH為7.0的MOPS緩沖液。將該漿液充分?jǐn)嚢?0min。1.0ml的SPEZYMEFRED(以l:50稀釋在水中)被加入并且加熱，煮沸3-5min。將該燒瓶放在高壓滅菌器內(nèi)，在12rC下保持15min。高壓滅菌處理之后，將該燒瓶放置在95'C的水浴中，加入1ml的以1:50稀釋的SPEZYMEFRED并且溫育45min。pH調(diào)整到pH4.2，溫度降到6(TC。接著加入20mlpH為4.2的乙酸鹽緩沖液。通過加入1.0ml的以1:100稀釋的OPTIDEXL-400(來自GenencorInternationalInc.的葡糖淀粉酶)進(jìn)行糖化，且在60'C下繼續(xù)溫育18小時(shí)。通過在95'C下加熱10min終止此酶反應(yīng)?？偟奶浅煞掷闷咸烟亲鳛闃?biāo)準(zhǔn)通過HPLC分析進(jìn)行測定。在室溫下不經(jīng)過酶處理的、來自樣品的水萃取液的可溶淀粉水解產(chǎn)物被從總糖中扣除。0170殘余淀粉碘測試啤酒(發(fā)酵液)樣品在2ml的塑料離心管中離心。將上清夜輕輕倒出，并將含有顆粒狀物的離心管放在冰浴里。向顆粒狀物加入幾滴0.025N碘溶液(來自VWRCat.No.VW3207-1的0.1N的碘稀釋4倍)并將其混合。陽性(+)的淀粉顯示出從藍(lán)色到紫色的顏色范圍，而且顏色強(qiáng)度與淀粉的濃度成正比。陰性結(jié)果(-)保持淡黃色。0171蛋白質(zhì)總量分析樣品制劑中的總氮(N)是采用Kjddhal方法(AmericanAssoc.CerealChemists(AACC),(1983),Methods22B608thEd.StPaul,MN)測定的。蛋白質(zhì)的含量是以總氮的6.25倍計(jì)算的。乙醇和碳水化合物的測定0172樣品中的甲醇和碳水化合物成分是采用此處描述的HPLC方法測定的a)將1.5ml的Eppendorf離心管裝滿發(fā)酵啤酒并在冰上冷卻10min;b)該樣品管在Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)中離心1min;c)0.5ml上清液樣品被轉(zhuǎn)移到含有0.05mlKill溶液(1.1NH2S04)的測試管中，并使其靜置5min;d)向測試管中加入5.0ml水，然后通過0.45尼龍針頭濾器(NylonSyringeFilter)將其過濾到HPLC小瓶內(nèi)；禾口e)運(yùn)行HPLC。HPLC條件a)乙醇體系柱PhenomenexRezex有機(jī)酸柱(RHM-單糖)#00H0132-KO(相當(dāng)于Bio-Rad87H);柱溫60'C;流動(dòng)相0.01NH2SO4;流速0.6mL/min;檢測器RI;和注射體積20^L。b)碳水化合物體系柱PhenomenexRezex碳水化合物(RCM-單糖)#00H-0130-KO(相當(dāng)于Bio-Rad87H);柱溫70°C;流動(dòng)相NanopureDIH20;流速0.8mL/min;檢測器RI;注射體積10pL(3。/。DS材料)。0173柱基于糖的分子量進(jìn)行柱分離，糖被命名為DP1(單糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)；以及大于3的DP(聚合度大于3的低聚糖)。實(shí)施例l一分批發(fā)酵0174五百克(500g)細(xì)磨的玉米(濕度為14%,100%通過40網(wǎng)篩的顆粒大小，其相當(dāng)于0.420mm(ASTM)，含有40%淀粉含量的30%的脫脂胚芽，總淀粉含量為67%,中國黑龍江肇東CREthanol)被加入到2升的生物反應(yīng)器內(nèi)，該生物反應(yīng)器含有1.0升蒸餾水并且備有溫度和pH控制程序化系統(tǒng)。干尿素以1000ppm被加入。將pH用稀硫酸調(diào)整到pH4.5。混合均勻且溫度穩(wěn)定(30°C)之后，AnGA/AkAA以0.75GAU/gDS被加入，接著加入干酵母(0.8%Fali酵母，中國黑龍江阿城)和尿素(0.1%，中國無錫的無錫民豐)。發(fā)酵介質(zhì)被連續(xù)攪拌以避免磨碎玉米沉淀。在不同時(shí)間間隔對(duì)發(fā)酵液取樣，并離心。反應(yīng)產(chǎn)物的成分通過HPLC分析進(jìn)行測定。為了測定發(fā)酵效率，在72小時(shí)分析發(fā)酵液的殘余淀粉。0175表1<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>0176發(fā)酵液中乙醇的濃度隨著發(fā)酵時(shí)間增加，在72小時(shí)達(dá)到16.34%V/v。在72小時(shí)發(fā)酵液中殘余淀粉含量是10.71%。實(shí)施例2—裝載有干的磨碎玉米的干固體分段方法0177如上所述，進(jìn)行發(fā)酵，具有下列不同之處?；谧罱K的30。/。DS，生物反應(yīng)器內(nèi)初始被裝填15%DS的磨碎的玉米(發(fā)酵累積DS的一半)，0.75GAU/g的AnGA/AkAA。發(fā)酵在3(TC下進(jìn)行。在開始初始發(fā)酵之后大約22小時(shí)的時(shí)候開始，每隔一小時(shí)加入干的磨碎的玉米(15.4g)，持續(xù)16小時(shí)(總發(fā)酵時(shí)間=38小時(shí))。繼續(xù)發(fā)酵直到72小時(shí)。上清液中反應(yīng)產(chǎn)物的成分采用HPLC分析，而殘余淀粉在72小時(shí)被測定。0178表2<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>0179與實(shí)施例l類似，乙醇含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加。到72小時(shí)，乙醇含量為17.15%(v/v)，其高于實(shí)施例l。在72小時(shí)時(shí)，發(fā)酵液中殘余淀粉含量為11.1%。0180表1禾n2結(jié)果比較說明，采用實(shí)施例2的干玉米進(jìn)料的碳轉(zhuǎn)化效率得到提高。該結(jié)論得到在72小時(shí)時(shí)從干的磨碎玉米進(jìn)料中得到的更高乙醇百分比(17.16%對(duì)16.34%)支持，盡管殘余淀粉較高(11.1%對(duì)10.17%)。實(shí)施例3—裝載步驟中干的磨碎谷物的進(jìn)料以及初始DS的影響0181如上面實(shí)施例1中所述，進(jìn)行發(fā)酵，但是具有不同的初始DS。使用來自中國黑龍江肇東CREthanol的除胚芽的磨碎玉米，其100%通過40目篩。在2升的生物反應(yīng)器內(nèi)，基于含濕量816到830克磨碎的玉米(用SartoriusAGGottingenMA30-000V3測量)，與1400或1500克自來水混合，并加入基于該DS的0.1%的尿素。用26%的硫酸將漿液的pH調(diào)整到pH4.7?；?0%的最終DS，AnGA/AkAA以1.0GAU/gDS被加入。用0.8%DS的干安琪酵母(Angelyeast)(中國湖北安琪酵母股份有限公司)接種生物反應(yīng)器。在30°C，慢速攪拌下混合發(fā)酵介質(zhì)。初始DS被調(diào)整到7%、10%和15%?；谧罱K的30%DS，加入AnGA/AkAA。在15小時(shí)時(shí)開始，干固體磨碎的玉米每隔一小時(shí)被等量地直接加入到發(fā)酵罐內(nèi)，持續(xù)10小時(shí)。調(diào)整干固體玉米的加入重量，以達(dá)到30%的最終DS。發(fā)酵pH維持在pH4.7。在15、24、48和72小時(shí)取樣并用HPLC分析。在72小時(shí)測定來自發(fā)酵液樣品的殘余淀粉含量。0182表3A乙醇產(chǎn)量在0小時(shí)，總計(jì)30。/。DS干玉米基質(zhì)添加量<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0183表3B乙醇產(chǎn)量初始7%DS，累積30%DS，干玉米基質(zhì)在15到25小時(shí)進(jìn)料時(shí)間進(jìn)料<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0184表3C乙醇產(chǎn)量初始10%DS，累積30%DS，干玉米基質(zhì)在15到25小時(shí)進(jìn)料時(shí)間進(jìn)料<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>0185表3D乙醇產(chǎn)量初始15。/。DS，累積30。/。DS，干玉米基質(zhì)在15到25小時(shí)進(jìn)料<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>0186正如從表3A—3D所示，與30。/。DS對(duì)照相比，在干玉米基質(zhì)重復(fù)進(jìn)料的情況下，最終乙醇收率的穩(wěn)定增加是由于更高的初始DS。在72小時(shí)，對(duì)于30。/oDS，乙醇的。/ov/v為17.06(表3A);對(duì)于7。/oDS，為17.75(表3B);對(duì)于10。/。DS,為8.11(表3C);以及對(duì)于15。/。DS，為18.50(表3D)。也可參考圖2。實(shí)施例4一干固體的裝載和開始時(shí)間的影響0187如上面實(shí)施例1中所述，進(jìn)行發(fā)酵，其在初始發(fā)酵時(shí)間10和15小時(shí)之后的裝載步驟中采用不同的干谷物進(jìn)料開始時(shí)間。初始DS為10%。每隔一小時(shí)等量地加入干的磨碎玉米，在初始發(fā)酵為10小時(shí)的情況下持續(xù)15小時(shí)，或者在初始發(fā)酵為15小時(shí)的情況下持續(xù)10小時(shí)。發(fā)酵的最終累積DS為30%DS。在每種情況下，用26。/。的硫酸將發(fā)酵的pH調(diào)整到pH4.7。在總發(fā)酵時(shí)間的15、24、48和72小時(shí)的時(shí)候，對(duì)發(fā)酵液取樣并通過HPLC分析，并使用在72小時(shí)取樣的發(fā)酵液，測定殘余淀粉含量。0188表4A初始發(fā)酵時(shí)間為10小時(shí)且在裝載步驟中的進(jìn)料持續(xù)15小時(shí)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表4B初始發(fā)酵時(shí)間為15小時(shí)且在裝載步驟中的進(jìn)料持續(xù)10小時(shí)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>Ol卯如在表4A和4B中所顯示的結(jié)果說明了開始時(shí)間對(duì)酒精收率的影響。實(shí)施例5—干固體分段-不同谷物的干的磨碎進(jìn)料0191如上面實(shí)施例1所述，進(jìn)行發(fā)酵，使用不同谷物基質(zhì)。玉米、買羅高粱(milo)和小麥被使用1.5mm篩的實(shí)驗(yàn)室錘磨機(jī)3100(瑞典)加工。95%以上的磨碎材料通過30目篩。黑麥和大麥購買于AzureStandard(Dufer，OR)。谷物的含濕量用OHAUS，MB35Haolgen濕度平衡儀(NJ)測定。在發(fā)酵罐內(nèi)，180—183g(基于含濕量)磨碎谷物和950g水連同600mg尿素被混合在一起。該漿液的pH用6N硫酸調(diào)整到pH4.0。對(duì)于每種發(fā)酵，加入基于32%最終DS為1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA以及0.5Kgs/MT的GC106(GenencorlnternationalInc.)。如下加入其它次級(jí)酶對(duì)于小麥，0.1Kgs/MT的CELLEULASE2000L(GenencorInternationalInc.);對(duì)于大麥，0.5Kgs/MT的CELLEULASE2000L(GenencorInternationalInc.);以及對(duì)于黑麥，0.5Kgs/MT的OTIMASHBG(GenencorInternationalInc.)。用1.5克的干REDSTARETHANOLRED酵母(LesafireYeastCorp.,WI)接種發(fā)酵罐。在3(TC，慢速攪拌下不斷混合發(fā)酵介質(zhì)。在初始發(fā)酵開始14小時(shí)、20小時(shí)和24小時(shí)之后，以逐歩的方式加入干的磨碎谷物(每次122克)。在每種情況下，發(fā)酵的pH用6NH2S04或2NKOH調(diào)整到pH4.0。另一劑量的干酵母(1.5克)在24小時(shí)時(shí)加入到每個(gè)發(fā)酵中。在14、24、48和72小吋取樣并通過HPLC分析。如表5中所觀察到的，測試谷物所生產(chǎn)的乙醇百分比是變化的，而且該變化是每種谷物類型的淀粉含量的函數(shù)。例如，期望的是，72小時(shí)時(shí)來自小麥的％乙醇收率將小于72小時(shí)時(shí)來自玉米的乙醇收率。用72小時(shí)的發(fā)酵液樣品來測定殘余淀粉含量。0192表5—不同谷物基質(zhì)情況下，干固體分段發(fā)酵對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>實(shí)施例6—使用分級(jí)的玉米胚乳進(jìn)行的千固體分段發(fā)酵與分批發(fā)酵的比較0193從美國伊利諾伊大學(xué)(theUniversityofIllinois),采用己知方法，將#2YellowDent玉米分級(jí)，得到胚乳部分。胚乳/麩質(zhì)級(jí)部分被磨碎，并且得到一樣品，其中至少95%的樣品通過1.5mm的篩子(PertenLaboratoryMill3100，瑞典)。谷物的含濕量用OHAUS,MB35Halogen濕度平衡儀(NJ)測量。0194對(duì)于分批工藝，使用483克胚乳和1017克去離子水。對(duì)于干固體分段(Dss)工藝，使用161克胚乳和1017克去離子水。在進(jìn)入發(fā)酵14、20和24小時(shí)的時(shí)候，每個(gè)時(shí)間段向干固體分段樣品中加入107克胚乳，以得到30%的累積DS。pH用6NH2S04調(diào)整到4.0。樣品被放到30'C水浴中且使其平衡。向每個(gè)樣品中加入1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA、0.5Kgs/MT的GC106(Genencor)和1.5gREDSTARRED酵母(LesaffreYeastCorp.WI)。監(jiān)測pH，需要時(shí)用4NKOH將pH調(diào)整到pH4.0。在14、24、38、46和70小時(shí)取樣并通過HPLC(PhenomenexRezex8u)分析。用72小時(shí)之后的發(fā)酵液來測定殘余淀粉含量。0195表6<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>0196如表6所示，在初始發(fā)酵期間，由于DS水平較高，分批方法的乙醇生產(chǎn)的速度較快，但是在發(fā)酵的后面階段，干固體分段發(fā)酵方法中乙醇生產(chǎn)的總體速度增加。此外，盡管干固體分段發(fā)酵方法中的％殘余淀粉比分批方法高(分別為6.9%相比于4.0%)，然而，干固體分段發(fā)酵方法中產(chǎn)生的乙醇百分比是18.78，相比而言，分批方法是19.38。這些值表明千固體分段發(fā)酵方法具有更高的碳轉(zhuǎn)化效率。實(shí)施例7—使用濕加工的谷物的干固體分段發(fā)酵0197碾磨#2YellowDent玉米樣品，使得至少95%的樣品通過1.5mm篩(PertenLaboratoryMill3100，瑞典)。谷物的含濕量用OHAUS，MB35Halogen濕度平衡儀(NJ)測量。初始發(fā)酵用750glO。/。DS的磨碎玉米引發(fā)。尿素(4000ppm)和5.0g干玉米浸漬液被加入到燒瓶內(nèi)，并且pH用6NH2S04調(diào)整到4.9。樣品被放到3(TC水浴中且使其平衡。為了開始發(fā)酵，向每個(gè)燒瓶中加入1.5gREDSTARRED酵母(LesaflieYeastCorp.WI)和1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA(Genencor)。初始發(fā)酵步驟8小時(shí)之后，來自濕加工系統(tǒng)的另外的750g淀粉漿(34.7%DS)以0.05mls/min的速度被連續(xù)地從蠕動(dòng)泵(Gilson，Minipuls3，ModelM312,法國)加入，直到樣品達(dá)到1500g的總量。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中監(jiān)控pH，如果需要，用4NKOH將其調(diào)整到4.0。在24、32、48、56和70小時(shí)取樣并通過HPLC(PlienomenexRezex8u)分析。用72小時(shí)之后的發(fā)酵液樣品來測定殘余淀粉含量。結(jié)果顯示在表7。0198表7<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>'實(shí)施例8—在干固體分段發(fā)酵和補(bǔ)料-分批發(fā)酵中應(yīng)用液化0199從生產(chǎn)的乙醇中得到液體，且用去離子水稀釋至28n/。DS，以得到一升的樣品。該樣品的pH用6NH2S04調(diào)整到pH4.5。該樣品被放到3(TC水浴中且使其平衡。向該樣品中加入3.0gREDSTARRED酵母(LesaffreYeastCorp.WI)和0.4GAU/gDS的DISTILLASEL-400(Genencor)以及7個(gè)分光光度法酸性蛋白酶單位(spectrophotometricacidproteaseunit,SAPU)的GC106/gDS(Genencor)。一個(gè)SAPU是在試驗(yàn)條件下每分鐘從酪蛋白底物中釋放一毫摩爾的酪氨酸的酶活性的量值。15小時(shí)后將該醪液分為4個(gè)重復(fù)處理，每個(gè)含有100g樣品。0200處理A在整個(gè)發(fā)酵中持續(xù)進(jìn)行而沒有另外的裝載步驟或另外加入酶或酵母。對(duì)于處理B，基于36。/。的累積DS，加入l.OGAU/gDS的AnGA/AkAA和0.3g酵母，但是不加入另外的可發(fā)酵基質(zhì)。對(duì)于處理C，除了1.0GAU/gDS的AnGA/AkAA和0.3g酵母之外，在15小時(shí)時(shí)間段時(shí)一次性加入15.4g磨碎玉米。對(duì)于處理D，在15、20和25小時(shí)，以5.1g的相等增量加入磨碎玉米，其總量為15.4g。磨碎玉米是用1.5mm篩和實(shí)驗(yàn)室錘磨機(jī)3100(瑞典)生產(chǎn)的。95%以上的磨碎玉米通過30目篩。谷物的含濕量用OHAUS，MB35Halogen濕度平衡儀(NJ)測量。對(duì)于處理C和D，累積DS為36%。0201在24、36、48和72小時(shí)對(duì)醪液樣品取樣，并通過HPLC(PhenomenexRezex8u)分析。用72小吋之后的醪液樣品來測定殘余淀粉含量。結(jié)果顯示在表8中。0202表8<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>0203在表8中報(bào)告的結(jié)果表明，干固體分段發(fā)酵方法具有更高的碳轉(zhuǎn)化效率。與處理A和B的13.29%和13.33%的乙醇產(chǎn)率相比，對(duì)于代表干固體分段方法的處理C和D而言，在72小時(shí)時(shí)的％乙醇分別為16.39%和16.34%。處理C和D的％殘余淀粉分別為12.33%和14.40%,而處理A和B的％殘余淀粉僅為1.86%和1.24%。權(quán)利要求1.一種用于生產(chǎn)酒精的干固體分段發(fā)酵方法，包括a)初始發(fā)酵步驟，其包括在3.0到6.0的pH、5℃到65℃的溫度下，將可發(fā)酵基質(zhì)、一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物在發(fā)酵容器內(nèi)結(jié)合2到40小時(shí)，并得到發(fā)酵液，和b)裝載步驟，其包括向所述容器內(nèi)加入固體可發(fā)酵基質(zhì)，并使其在3.0到6.0的pH、20℃到55℃的溫度下繼續(xù)發(fā)酵足夠的時(shí)間期間，以生產(chǎn)酒精，其中所述發(fā)酵液的干固體百分比(％DS)隨時(shí)間增加。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述可發(fā)酵基質(zhì)為固體可發(fā)酵基質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干固體分段發(fā)酵方法，進(jìn)一步包括將所述固體可發(fā)酵基質(zhì)直接加入所述發(fā)酵容器中。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述可發(fā)酵基質(zhì)為可發(fā)酵糖。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述固體可發(fā)酵基質(zhì)是選自玉米、黑麥、小麥、大麥、高粱或其組合的谷物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述谷物已經(jīng)被分級(jí)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中累積。/。DS在IO與55%之間。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述累積c/。DS在25與40W之間。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述初始發(fā)酵步驟的所述發(fā)酵液的。/。DS為0到45%。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述裝載步驟期間所加入的%DS在5到20小時(shí)的期間內(nèi)介于1與25%之間。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中在所述裝載步驟之前，所述初始發(fā)酵步驟持續(xù)至少5小時(shí)。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述最終產(chǎn)物是乙醇。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，進(jìn)一步包括回收所述酒精。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中乙醇的收率為至少10%。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述一種或多種淀粉水解酶選自葡糖淀粉酶、a-淀粉酶、具有粒狀淀粉水解活性的酶和它們的組合。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述一種或多種淀粉水解酶是葡糖淀粉酶。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述一種或多種淀粉水解酶是具有粒狀淀粉水解活性的酶。18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述一種或多種淀粉水解酶包括葡糖淀粉酶和粒狀淀粉水解酶的組合。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述一種或多種淀粉水解酶包括黑曲霉葡糖淀粉酶和具有粒狀淀粉水解活性的真菌a-淀粉酶的組合。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，進(jìn)一步包括將次級(jí)酶加入所述初始發(fā)酵步驟或裝載步驟。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述次級(jí)酶包括蛋白酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、纖維素酶或其組合。22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，進(jìn)一步包括從所述發(fā)酵液中回收聯(lián)產(chǎn)物。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述聯(lián)產(chǎn)物是干谷物酒糟或含可溶物的干谷物酒糟。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述含可溶物的干谷物酒糟具有20%以下的殘余淀粉含量。25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述方法共計(jì)進(jìn)行30到92小時(shí)。26.根據(jù)權(quán)利要求l所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述初始發(fā)酵步驟在3.5到5.5的pH、25'C到45'C的溫度下進(jìn)行2到IO小時(shí)，并且所述可發(fā)酵基質(zhì)是干的磨碎谷物，其在所述發(fā)酵容器內(nèi)與至少一種粒狀淀粉水解酶和酵母結(jié)合。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中初始發(fā)酵液的所述°/。DS在5%和20%之間，累積DS在25%和45%之間。28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的干固體分段發(fā)酵方法，進(jìn)一步包括將所述干的磨碎谷物直接加入所述發(fā)酵容器內(nèi)。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的干固體分段發(fā)酵方法，其中所述干的磨碎谷物是玉米、黑麥、小麥、大麥、高粱或其組合。30.—種用于生產(chǎn)最終產(chǎn)物的干固體分段發(fā)酵方法，包括a)初始發(fā)酵步驟，其包括在3.0到7.0的pH、5"C到65'C的溫度下，將第一可發(fā)酵基質(zhì)與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物在發(fā)酵容器內(nèi)結(jié)合2到40小時(shí)，并得到發(fā)酵液，和b)裝載步驟，其包括向含有所述發(fā)酵液的所述容器中加入第二固體可發(fā)酵基質(zhì)，并使其在3.0到7.0的pH、2(TC到65'C的溫度下繼續(xù)發(fā)酵足夠的時(shí)間期間，以生產(chǎn)最終產(chǎn)物，其中所述發(fā)酵液的干固體百分比(％DS)隨時(shí)間增加。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的干固體分段發(fā)酵方法，進(jìn)一步包括回收所述最終產(chǎn)物。全文摘要公開了干固體分段發(fā)酵方法，其用于生產(chǎn)最終產(chǎn)物，例如乙醇，所述方法包括初始發(fā)酵步驟，其包括將第一可發(fā)酵基質(zhì)與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物在發(fā)酵容器中結(jié)合，和裝載步驟，其包括向發(fā)酵容器中添加第二可發(fā)酵基質(zhì)，其中發(fā)酵液的干固體百分比(％DS)隨時(shí)間增加。文檔編號(hào)C12P7/14GK101155926SQ200680011530公開日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年6月5日優(yōu)先權(quán)日2005年6月14日發(fā)明者C·E·皮爾格林,G·段,G·肖塔尼,J·K·謝蒂申請(qǐng)人:金克克國際有限公司