專(zhuān)利名稱(chēng)：：樹(shù)狀細(xì)胞組合物和方法才對(duì)狀細(xì)力包組合物和方法發(fā)明背景許多的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明樹(shù)狀細(xì)胞疫苗的安全性，超過(guò)1000名患者接受了樹(shù)狀細(xì)胞疫苗而沒(méi)有出現(xiàn)與該療法相關(guān)的嚴(yán)重不良事件，以及在一半的患者中沒(méi)有出現(xiàn)臨床反應(yīng)(Ridgeway(2003)CancerInvest21:873-8%)。用于制備樹(shù)狀細(xì)胞(DC)的常規(guī)方法是從個(gè)體收集外周血單核細(xì)胞(PBMC),然后將占PBMC小比例的單核細(xì)胞分化成DC。離后不久就應(yīng)當(dāng)冰凍或培養(yǎng)單核細(xì)胞。因此，在以前的臨床試馬會(huì)中，樹(shù)狀細(xì)胞疫苗由單核細(xì)胞組成，PBMC或單核細(xì)胞可在約37°C中培養(yǎng)，或在從患者收集后幾小時(shí)中進(jìn)行冷凍。然而，由于該方法需要培養(yǎng)或冷凍新分離的PBMC或單核細(xì)胞，在實(shí)際的生產(chǎn)條件中限制了處理的疫苗的廣泛應(yīng)用。PBMC分化成DC,耗時(shí)約一周，并需要GMP設(shè)備和熟練技術(shù)人員。因此，提供在或接近可從患者獲得PBMC的每個(gè)臨床現(xiàn)場(chǎng)以用于生產(chǎn)DC疫苗的設(shè)備和人員，成本是過(guò)高的。商業(yè)上生產(chǎn)DC疫苗的可行模式是提供一種或較少數(shù)量的可從患者PBMC或在臨床現(xiàn)場(chǎng)收集的單核細(xì)胞以制備DC疫苗的設(shè)備，然后運(yùn)輸?shù)缴a(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)。然而，所述模式不能應(yīng)用于目前需要新鮮的PBMC或單核細(xì)胞的DC生產(chǎn)方法。冷凍新鮮的單核細(xì)胞需要在收集現(xiàn)場(chǎng)分離白細(xì)胞后的額外操作，因此并不是理想的選擇。因此，需要研制在運(yùn)輸?shù)缴a(chǎn)設(shè)備期間使用已經(jīng)保存的PBMC或單核細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)DC疫苗的方法。本發(fā)明滿足了這種需要，同時(shí)還提供另外的優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明筒述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了從分離自個(gè)體并在1-34°C保存6-96小時(shí)周期的單核細(xì)胞中制備樹(shù)狀細(xì)胞和樹(shù)狀細(xì)胞疫苗的方法。這種從保存的單核細(xì)胞制備DC的能力，提供了單核細(xì)胞更多的加工適應(yīng)性，并便于單核細(xì)胞從收集現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)輸?shù)缴a(chǎn)設(shè)備。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了從保存的胞。例如，與從新鮮單核細(xì)胞制備的樹(shù)狀細(xì)胞相比，從保存的單核細(xì)胞制備的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，提高了共刺激分子(例如CD80、CD83和CD86)的水平，以及提高了MHC-I類(lèi)和MHC-III類(lèi)分子的水平。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于從單核細(xì)胞制備樹(shù)狀細(xì)胞的方法，包才舌a.提供從分離自個(gè)體起已在1°C-34°C溫育6至％小時(shí)周期的單核細(xì)胞；和.b.誘導(dǎo)所述單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)分離白細(xì)胞以收集包含單核細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞(PBMC),獲得單核細(xì)胞。優(yōu)選地，通過(guò)用培養(yǎng)基接觸單核細(xì)胞以誘導(dǎo)分化，其中培養(yǎng)基包含可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞的有效量成分，例如但不限于GM-CSF;GM-CSF和IL-4;GM-CSF和IL-13;GM-CSF和IL-15;和IFNoc。然后使未成熟樹(shù)狀細(xì)胞進(jìn)行發(fā)育，以生產(chǎn)成熟樹(shù)狀細(xì)胞。通過(guò)本發(fā)明方法制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞，表型不同于現(xiàn)有技術(shù)的成細(xì)胞中ALOX15RNA對(duì)肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDHRNA的比值小于1.0。與在從新鮮單核細(xì)胞制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞中的ALOX15對(duì)肌動(dòng)蛋白或GAPDHRNA的比值相比，該比值是降低的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中細(xì)胞中的CD52RNA對(duì)肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDH的穩(wěn)定狀態(tài)比值大于1.0。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中細(xì)胞中的TLR1RNA、TLR2RNA、IL誦1PRNA或CD69RNA對(duì)肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDH的穩(wěn)定狀態(tài)比值大于1.0。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞的組合物，其中與從新鮮單核細(xì)胞制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞相比，本發(fā)明的成熟樹(shù)狀細(xì)胞提高了CD80、CD83、CD86、MHC-I類(lèi)分子或MHC-II類(lèi)分子中的一種或多種的水平。另外，本發(fā)明提供成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，所述樹(shù)狀細(xì)胞的ALOX15RNA、CD52RNA、TLR1RNA、TLR2RNA、IL-1(3RNA或CD69RNA的穩(wěn)定狀態(tài)7jC平發(fā)生改變。通過(guò)本發(fā)明方法制備的樹(shù)狀細(xì)胞，特別適合于制備疫苗。因此，同時(shí)提供相關(guān)的樹(shù)狀細(xì)胞組合物和疫苗。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗是個(gè)體自體同源的。優(yōu)選地，樹(shù)狀細(xì)胞疫苗負(fù)載了來(lái)自于個(gè)體中的癌細(xì)胞或病原體的抗原。令人驚訝地是，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溶化后在DMSO的存在下，用DMSO冷凍的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗是穩(wěn)定的。因此，本發(fā)明提供使用抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞以用于制備治療或預(yù)防癌癥或病原體傳染病的冷凍藥物，其中藥物包含至少2%的DMSO,并且剛一溶化就可進(jìn)行施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供接種個(gè)體的方法，包括a.解凍包含至少2%DMSO的冷凍樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，和b.在施用前，不改變細(xì)胞對(duì)DMSO的比例，以將解凍疫苗施用給個(gè)體。DMSO的濃度優(yōu)選是約10%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是體外分化于單核細(xì)胞，并在>5%DMSO的存在下冷凍以及解凍后，能體外存活至少24小時(shí)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在>10%DMSO的存在下進(jìn)行冷凍和解凍后，抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞能體外存活至少24小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含約5-15%DMSO的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，其中所述疫苗用于施用給個(gè)體。附圖簡(jiǎn)述圖1:用于調(diào)節(jié)單核細(xì)胞(如，分離白細(xì)胞的產(chǎn)物)運(yùn)輸溫度的優(yōu)選運(yùn)輸容器和包裝材料的簡(jiǎn)圖。圖2:RNA轉(zhuǎn)染的DC提供功能共刺激載體。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixedlymphocytereaction,MLR)分析中，測(cè)試DC刺激從PBMC生產(chǎn)INF-y的能力。將從3種不同供體制備的解凍DC,與預(yù)先來(lái)自各個(gè)供體的冷凍PBMC進(jìn)行匹配。使用作為讀數(shù)器的ELISPOT(INF-y)，測(cè)試所有匹配方式的組合。第1柱、第4柱和第7柱代表與自體PBMC匹配的DC。第2柱、第3柱、第5柱、第6柱、第8柱、和第9柱代表與非自體PBMC匹配的DC。第10-12柱僅僅代表代表PBMC對(duì)照。圖3:對(duì)于混合細(xì)胞因子的成熟DC與來(lái)自相同供體的未成熟DC，比較刺激從自體T細(xì)胞生產(chǎn)Thl細(xì)胞因子的能力。用編碼流感基質(zhì)蛋白的RNA轉(zhuǎn)染這兩種DC群體，并用于刺激來(lái)自自體PBMC的流感特異記憶性CTL。顯示ELISPOT分析的結(jié)果(#斑點(diǎn)/孔與輸入PBMC有關(guān))。下列順序顯示四個(gè)柱形的各組通過(guò)未成熟DC，從流感特異T記憶性細(xì)胞得到的IFNy產(chǎn)物；通過(guò)成熟C，從流感特異T記憶性細(xì)胞得到的IFNy產(chǎn)物；通過(guò)未成熟DC,從流感特異T記憶性細(xì)胞得到的IL-2產(chǎn)物；以及通過(guò)成熟DC，從流感特異T記憶性細(xì)胞得到的IL-2產(chǎn)物。圖4:對(duì)通過(guò)從2個(gè)不同健康供體獲得的日齡PBMC所制備的兩個(gè)RNA負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞制品中的各兩個(gè)小管，進(jìn)行解凍。將每個(gè)供體的一個(gè)小管迅速在同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Alio-MLR)分析中進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)在通過(guò)相同方法進(jìn)4亍分析之前，使每個(gè)制品的第二個(gè)小管置于室溫40分鐘。用于該實(shí)驗(yàn)的PBMC，包括來(lái)自每個(gè)供體的自體細(xì)胞和來(lái)自與以上兩者無(wú)關(guān)的供體的PBMC的第三種樣品。用于該分析的讀數(shù)器是ELISPOT(INF-y)。圖5:根據(jù)DC刺激與降低流感mRNA轉(zhuǎn)染濃度有關(guān)的自體PBMC的記憶性流感特異反應(yīng)，評(píng)價(jià)DC預(yù)先冷凍對(duì)解凍后的函數(shù)。分析的讀出器是ELISPOT(INF-力。圖6:通過(guò)使用編碼GFP的RNA電穿孔后，GFP表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)。未轉(zhuǎn)染(虛線)。圖7:細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色使用通過(guò)編碼GFP(負(fù)調(diào)節(jié)，左欄)或CMVpp65(右欄)的RNA轉(zhuǎn)染的DC進(jìn)行刺激后，CD4和CD8T細(xì)胞上的IL-2/IFN-y。圖8:使用通過(guò)編碼GFP(負(fù)調(diào)節(jié)，左欄)或CMVpp65(右欄)的RNA轉(zhuǎn)染的DC進(jìn)行刺激后，在CD4和CD8T細(xì)胞中稀釋CSFE。圖9:從分離白細(xì)胞的日齡產(chǎn)物所制備的6日齡未成熟樹(shù)狀細(xì)胞(iDCs)的表型。圖10:從分離白細(xì)胞的日齡產(chǎn)物所制備的7日齡成熟樹(shù)狀細(xì)胞(mDCs)的表型。發(fā)明詳述貫穿本說(shuō)明書(shū)的各種出版物、專(zhuān)利和公開(kāi)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)作為相同引用的參考文獻(xiàn)。因此，這些出版物、專(zhuān)利和公開(kāi)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容作為參考而被引入本說(shuō)明書(shū)中，以更充分地描述適合本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)水平。除非另外指出，實(shí)施本發(fā)明所使用的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)方法(包括重組技術(shù))，均屬于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的范圍內(nèi)。所述方法已在文獻(xiàn)中得到充分說(shuō)明。參見(jiàn)例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版(1989);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人編著(1987));theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);PCR:APracticalApproach(M.MacPherson等人。IRLPressatOxfordUniversityPress(1991));PCR2:APracticalApproach(M丄MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor編著，(1995));Antibodies,ALaboratoryManual(Harlow和Lane編著(1988));UsingAntibodies,ALaboratoryManual(Harlow和Lane編著(1999));以及AnimalCellCulture(R丄Freshney編著(1987))。定乂如本文中所用的，某些術(shù)語(yǔ)具有下列規(guī)定的含義。如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中所用的，除非上下文另外清楚的限定，單數(shù)形式"一"、"一個(gè)"和"該"包括復(fù)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。例如，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"包括多個(gè)細(xì)胞及其混合物。術(shù)語(yǔ)"抗原"是本領(lǐng)域中充分理解的，包括免疫原性的物質(zhì)(即免疫原)以及抗原性表位?？梢岳斫獾氖强深A(yù)見(jiàn)本發(fā)明使用任何抗原，因此包括但不限于自身抗原(無(wú)論是正常或疾病相關(guān)的)、傳染性抗原(如，微生物抗原、病毒抗原，等等)、或其它外源抗原(如，食品成分、花粉，等等)。術(shù)語(yǔ)"抗原"或替換物、或"免疫原"，施加于多于一種免疫原的集合，使得可同時(shí)調(diào)控對(duì)多種免疫原的免疫反應(yīng)。而且，該術(shù)語(yǔ)包括免疫原或抗原的任何各種不同的制劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原來(lái)自于癌細(xì)胞或病原體。優(yōu)選地，癌細(xì)胞是腎癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞或黑素瘤細(xì)胞。優(yōu)選的病原體是HIV和HCV。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原以分離自或衍生于癌細(xì)胞或病原體的RNA形式，被呈遞于抗原呈遞細(xì)胞(APC)。"衍生于"包括但不限于包含融合無(wú)關(guān)或相關(guān)序列的天然存在的序列的重組變體。在共同未決的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/525,076和PCT/US/05053271(其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考)中，？〉開(kāi)了適于從任何細(xì)胞(如，癌細(xì)胞或病原體細(xì)胞)提取的RNA的RT-PCR方法以及體外轉(zhuǎn)錄方法。術(shù)語(yǔ)"癌"指細(xì)胞的異常形態(tài)，它可展現(xiàn)相對(duì)的自發(fā)增長(zhǎng)，以致癌細(xì)胞展現(xiàn)以明顯失去細(xì)胞增殖控制為特征的畸形生長(zhǎng)表型。癌細(xì)胞可以是良性的或惡性的。在各種實(shí)施方案中，癌侵害膀胱、血液、月畝、乳、結(jié)腸、消化道、肺、子宮、胰腺、前列腺或皮膚的細(xì)胞。如本文中所用的癌細(xì)胞定義，不僅包括原發(fā)癌細(xì)胞，而且包括衍生于癌細(xì)胞的任何細(xì)胞。這包括衍生于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞和離體培養(yǎng)物以及細(xì)胞系。癌包括但不限于，實(shí)體胂瘤、液體腫瘤、血癌、腎細(xì)胞癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、睪丸癌、膀胱癌、卵巢癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、白血病、骨髓癌、淋巴瘤、肝癌、腺瘤、肉瘤、癌瘤、胚細(xì)胞瘤，等等。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)"包括，，用于限定包含所述要素、但并不排除其它要素的組合物和方法。當(dāng)用于限定組合物和方法時(shí)，"基本上由...組成"表示用于組合的、排除其它要素的任何重要基本物。因此，基本上由本文所規(guī)定的要素組成的組合物，不排除來(lái)自分離和純化方法的痕量污染物以及藥學(xué)上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖鹽水、防腐劑等等。"由...組成"表示為了施用本發(fā)明組合物而排除其它組分的微量元素和基本方法步驟以外。根據(jù)這些變化術(shù)語(yǔ)的每個(gè)具體定義，都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文中所用的，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"指對(duì)細(xì)胞發(fā)揮各種效應(yīng)(例如，誘導(dǎo)生長(zhǎng)或增殖)的許多因子中的任何一個(gè)。在實(shí)施本發(fā)明中，;(IL-2)、'干;田胞因子(SCF)、白細(xì)胞介素-3(IL-3^白細(xì)胞介素-4(IL-4;、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-ll(IL-ll)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、白細(xì)胞介素-15(IL-15)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素-1(3(IL-l卩)、千擾素-y(IFN力、腫瘤壞死因子-ot(TNFa)、前列腺素E2(PGE2)、MIP-ll、白血病抑制因子(LIF)、c試劑盒配體、血小板生成素(TPO)以及flt3配體。細(xì)胞因子是可從一些供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)得到的，例如，Genzyme(Framingham,MA)、Genentech(SouthSanFrancisco,CA)、Amgen(ThousandOaks,CA)、R&DSystems(Minneapolis,MN)以及Immunex(Seattle,WA)。盡管沒(méi)有一直明確指出，但可以期望，與野生型或純術(shù)語(yǔ)"i對(duì)狀細(xì)胞(DC)"指在各種^淋巴和非淋巴組織中發(fā)現(xiàn)的形態(tài)學(xué)相似的細(xì)胞類(lèi)型的不同群體(Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9:271-296)。樹(shù)狀細(xì)胞組成生物體中最有效的和最優(yōu)選的APC。樹(shù)狀細(xì)胞可分化于單核細(xì)胞，并具有單核細(xì)胞的明顯表型。例如，在樹(shù)狀細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特殊分化標(biāo)記CD14抗原，但單核細(xì)胞具有該標(biāo)記。顯然，成熟DC可提供T細(xì)胞激活和增殖所需的所有信號(hào)。此外，成熟樹(shù)狀細(xì)胞不是吞噬細(xì)胞，然而單核細(xì)胞和未成熟樹(shù)狀細(xì)胞是明顯的吞噬細(xì)胞。通過(guò)胞吞作用、吞噬作用、巨胞飲作用(macropinocytosis)或吸附胞飲作用以及受體介導(dǎo)的抗原攝入，未成熟DC能夠捕獲抗原，并是表型CD80-或CD801ow、CD83-或CD831ow、CD861ow,以及具有高細(xì)胞內(nèi)濃度的MHC-II類(lèi)分子。成熟DC具有菌膜形態(tài)、低能力的胞吞作用，與未成熟DC相比，其表型是CD80high、CD83high、CDMhigh。優(yōu)選地，成熟DC分泌IL-12p70多肽或蛋白，和/或顯著分泌水平下降的IL-10(每百萬(wàn)DC0至S00pg/ml)。在從未成熟DC誘導(dǎo)DC成熟后直至36小時(shí)，通過(guò)培養(yǎng)上清的ELISA,測(cè)定IL-10和IL-12水平。參見(jiàn)，WierdaW.G.等(2000)Blood96:2917;AjdaryS等(2000)InfectionandImmunity68:1760;Banchereau,口Steinman(1998)Nature392:245。"有效量，，是足以發(fā)揮有益或期望結(jié)果的量。以一次或多次給藥、應(yīng)用或劑量中，進(jìn)行施用有效量。如本文中所用的，"表達(dá)"指將核酸轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或mRNA翻譯成肽、多肽、或蛋白的過(guò)程。如果多核苷酸來(lái)源于合適真核生宿主的基因組DNA,表達(dá)則包括mRNA剪接。表達(dá)所需要的調(diào)控元件，包括結(jié)合RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列和用于核糖體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄起始序列。例如，細(xì)菌表達(dá)載體或表達(dá)盒包含啟動(dòng)子(如，乳糖啟動(dòng)子)和用于轉(zhuǎn)錄起始的Shine-Dalgarno序列以及起始密碼子AUG(Sambrook等(1989)上文)。類(lèi)似的，真核表達(dá)載體或表達(dá)盒通常包含RNA聚合酶II的異源或同源啟動(dòng)子、Kozak序列、起始密碼子AUG、用于核糖體分離的終止密碼子以及下游聚腺苷酸化信號(hào)。所述載體可通過(guò)商業(yè)上購(gòu)買(mǎi)獲得，或通過(guò)本領(lǐng)域中已知方法所述序列進(jìn)行合成。術(shù)語(yǔ)"遺傳修飾"表示含有和/或表達(dá)可依次修飾細(xì)胞或其子代的基因型或表型的外源基因或核酸序列。換句話說(shuō)，指細(xì)胞內(nèi)源核苷酸的任何添加、缺失或斷裂。術(shù)語(yǔ)"分離，，表示從細(xì)胞等組分進(jìn)行分開(kāi)，其中多核普酸、肽、多肽蛋白、或其片段通常與性質(zhì)是相關(guān)的。例如，至于多核苷酸，分離的多核苷酸是從通常結(jié)合在染色體中的5'和3'序列所分離的片段。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗體或其片段，不需要進(jìn)行"分離"，以區(qū)別其天然存在的配對(duì)物。另外，"濃縮的"、"分離的"或"稀釋的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗體或其片段，可不同于其天然存在的配對(duì)物，因?yàn)槊矿w積分子的濃度或數(shù)量大于其"濃縮的"或小于"分離的"天然存在的配對(duì)物。不同于天然存在的配對(duì)物的一級(jí)序列或例如糖基化模式的多核苷酸、肽、多肽、蛋白、抗體或其片段，不必以其分離形式進(jìn)行存在，因?yàn)橥ㄟ^(guò)一級(jí)序列或者通過(guò)另一種特征例如糖基化模式，可從天然存在的配對(duì)物區(qū)分它們。盡管未明確指明本發(fā)明中公開(kāi)的各個(gè)部適條件下的以上所有實(shí)施方案。因此，通過(guò)分離的天然存在的多核苷酸的單個(gè)實(shí)施方案，提供非天然存在的多核苷酸。通過(guò)從天然存在的、分離自天然生成的真核細(xì)胞的蛋白的單個(gè)實(shí)施方案，提供細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白。從通常在體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的或取自于體內(nèi)的位置分離單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)收集的白細(xì)胞是"分離的"，并且體外從單核細(xì)胞分化的樹(shù)狀細(xì)胞是"分離的"。術(shù)語(yǔ)"主要組織相容性復(fù)合體"或"MHC"指編碼可將抗原呈遞給T細(xì)胞并用于快速移植排斥所需要的細(xì)胞表面分子的基因復(fù)合體。在人類(lèi)中，MHC亦稱(chēng)"人類(lèi)白細(xì)胞抗原，，或"HLA"復(fù)合體。MHC編碼的蛋白被稱(chēng)為"MHC分子"，并被分成I類(lèi)和II類(lèi)MHC分子。I類(lèi)MHC分子包括膜異形二聚蛋白，該蛋白由與(32-微球蛋白非共價(jià)結(jié)合的MHC中編碼的OC鏈組成。幾乎所有的有核細(xì)胞都能表達(dá)I類(lèi)MHC分子，并且證實(shí)這些分子在抗原呈遞于CD8+T細(xì)胞中發(fā)揮作用。I類(lèi)分子包括人類(lèi)中的HLA-A、HLA-B以及HLA-C。II類(lèi)MHC分子還包括由非共價(jià)結(jié)合的oc鏈和P鏈組成的膜異形二聚化蛋白。已知II類(lèi)MHC分子在CD4+T細(xì)胞和在人類(lèi)中包括HLA-DP、DQ以及DR中發(fā)揮作用。術(shù)語(yǔ)單核細(xì)胞，是能分化成對(duì)GM-CSF和IL-4應(yīng)答的未成熟樹(shù)狀細(xì)胞的CD14+外周血單核細(xì)胞。如本文中所用的"病原體"，指引起任何疾病的生物體或病毒，及其減毒的衍生物。"藥物組合物"包括活性劑(例如抗原負(fù)載的DC)與惰性或活化載體的組合，以制備適于體外、體內(nèi)或離體(exvivo)診斷或治療使用的組合物。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"，包括任何標(biāo)準(zhǔn)藥物載體，例如熱滅活血清，添加10%DMSO、5%葡萄糖、磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水和乳化液(例如油/水或水/油乳化液)以及各種濕潤(rùn)劑。組合物還包括佐劑、穩(wěn)定劑以及防腐劑。載體、穩(wěn)定劑以及佐劑的實(shí)例，參見(jiàn)Remington'sPharm.Sci.l8thEd.(MackPubl.Co.,Easton(1990))。可交換使用術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"和"核酸分子"，以指代任意長(zhǎng)度的核苷酸的聚合形式。核酸包括脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它們的類(lèi)似物。核苷酸具有任意的三維結(jié)構(gòu)，并可實(shí)施任何已知或未知的功能。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"，包括，例如，單鏈/雙鏈以及三鏈螺旋分子、基因或基因片段、外顯子、內(nèi)含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重組核酸、支鏈核酸、質(zhì)粒、載體、任意序列的分離DNA、任意序列的分離RNA、核酸探針以及引物。除了天然核酸分子之外，本發(fā)明的核酸分子還包括修飾的核酸分子。使用術(shù)語(yǔ)"肽"的主要含義，指兩種或多種氨基酸亞基、氨基酸類(lèi)似物或多肽模擬物的化合物。亞基通過(guò)肽鍵連結(jié)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞基通過(guò)其它鍵，如酯鍵、醚鍵等等進(jìn)行連結(jié)。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"氨基酸"，指任一的天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D型與L型旋光異構(gòu)體、氨基酸類(lèi)似物以及多肽模擬物。如果肽鏈很短，三個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽通常被稱(chēng)為寡肽。如果肽鏈很長(zhǎng)，肽通常被稱(chēng)為多肽或蛋白質(zhì)。如本文中所用的"個(gè)體"指哺乳動(dòng)物，包括但不限于人及其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物、狗以及貓。優(yōu)選地，個(gè)體是人。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)從患者收集單核細(xì)胞后，通過(guò)保存于1°C-34。C約6至96小時(shí)的單核細(xì)胞，可制備未成熟樹(shù)狀細(xì)胞、成熟樹(shù)狀細(xì)胞以及抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞。這些結(jié)果是令人驚訝的，因?yàn)橥ǔＵJ(rèn)為關(guān)鍵在于從新分離的單核細(xì)胞而不是從已在周?chē)鷾囟认卤４嫦喈?dāng)長(zhǎng)時(shí)間的單核細(xì)胞中制備樹(shù)狀細(xì)胞。而且，通過(guò)培養(yǎng)收集自患者后6小時(shí)內(nèi)的單核細(xì)胞、或通過(guò)冷凍收集后不久的PBMC并保存PBMC以用于隨后的解凍和培養(yǎng)單核細(xì)胞，制備用于本發(fā)明之前所實(shí)施臨床試驗(yàn)的單核細(xì)胞衍生的DC疫苗。本發(fā)明人不僅發(fā)現(xiàn)能夠從在1°C-34°C下保存約6至96小時(shí)的單核細(xì)胞制備樹(shù)狀細(xì)胞和樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，而且還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)該方法所制備的樹(shù)狀細(xì)胞，表型優(yōu)于從新鮮單核細(xì)胞所制備的樹(shù)狀細(xì)胞。制備方法和通過(guò)這些方法所制備的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗的特征，特別與疫苗效價(jià)、遍及廣泛地區(qū)的成功的商品化以及便利地施用有關(guān)。首先，與通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)方法所制備的DC相比，使用本發(fā)明方法所制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞，表達(dá)更高水平的CD80、CD83以及CD86共刺激分子，以及更高水平的MHC-I類(lèi)和MHC-II類(lèi)分子，其中這些都表現(xiàn)出DC成熟性和效價(jià)。另外，本發(fā)明的成熟DC以抗原特異方式，能從記憶性T細(xì)胞誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)物。其次，在收集患者PBMC的每個(gè)現(xiàn)場(chǎng)附近建立樹(shù)狀細(xì)胞的生產(chǎn)能力，在商業(yè)上是不可行的。因此，自體樹(shù)狀細(xì)胞疫苗的有效普遍的商品化，依賴(lài)于將PBMC或分離自PBMC的單核細(xì)胞運(yùn)輸?shù)接糜诜只晌闯墒旌统墒鞓?shù)狀細(xì)胞以及疫苗制品的集中生產(chǎn)設(shè)備的能力。然而，在本發(fā)明之前，一般認(rèn)為在從患者移出后不久，應(yīng)當(dāng)冷凍或培養(yǎng)PBMC。通過(guò)允許加工已被過(guò)夜運(yùn)輸或更久運(yùn)送的PBMC或分離自PBMC的單核細(xì)胞，本發(fā)明方法解決了該問(wèn)題。再者，在施用給患者之前，通常將抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞在DMSO中冷凍并保存直至解凍、洗滌以及重懸浮在無(wú)DMSO的藥學(xué)上可接受的載體中。預(yù)先的DC疫苗臨床試驗(yàn)包括洗滌步驟，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為DMSO對(duì)凍融或解凍DC會(huì)有不利影響。令人驚訝地是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了DMSO對(duì)樹(shù)狀細(xì)胞沒(méi)有明顯的不利影響。因此，在施用之前，不必洗滌和重懸浮解凍的DC疫苗。忽略這個(gè)步驟，將提高施用簡(jiǎn)易性，并減少由于額外操作帶來(lái)的對(duì)DC的污染風(fēng)險(xiǎn)和副作用。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于從單核細(xì)胞制備樹(shù)狀細(xì)胞的方法，包"l舌a.提供從分離自個(gè)體起已在1。C-34°C溫育6至96小時(shí)周期的單核纟田月包；和b.誘導(dǎo)溫育的單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。如本文中所用的"單核細(xì)胞"，指具有分化成樹(shù)狀細(xì)胞的能力的CD14+白細(xì)胞。單核細(xì)胞可來(lái)自任意的哺乳動(dòng)物，并優(yōu)選是人單核細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如作為分離白細(xì)胞的產(chǎn)物，提供單核細(xì)胞連同其它的外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從PBMC富集或直接從周?chē)悍蛛x單核細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知了分離單核細(xì)胞或含有單核細(xì)胞的PBMC的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)分離白細(xì)胞，收集單核細(xì)胞連同其它的PBMC。分離白細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)在醫(yī)院、診所、醫(yī)生辦公室等進(jìn)行分離白細(xì)胞，從個(gè)體中收集包含單核細(xì)胞的PBMC。白細(xì)胞分離術(shù)是通過(guò)除去個(gè)體血液的白細(xì)胞、并然后將剩余物輸回個(gè)體的方法。白細(xì)胞分離術(shù)的產(chǎn)物通常是富集PBMC的血份，其具有低水平的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板的雜質(zhì)。用于實(shí)施白細(xì)胞分離術(shù)的方法和儀器是本領(lǐng)域中熟知的。例如，參見(jiàn)白細(xì)胞分離術(shù)的詳細(xì)信息gambrobct.com/Products—&—Services/。分離白細(xì)月包的4義器實(shí)例包4舌由GAMBROBCT制造的COBESpectra,和由BaxterFenwal制造的CS3000Plus血細(xì)胞分離才幾。在1。C-34。C溫育期之中或之后，從血液或血份(如，PBMC)富集單核細(xì)胞。如本文中所用的，"富集單核細(xì)胞"表示提高單核細(xì)胞對(duì)存在于該方法起始中的其它細(xì)胞類(lèi)型的比例的方法。用于從PBMC、血液或其它iM分中富集單核細(xì)胞的方法，是本領(lǐng)域4支術(shù)人員已知的，包括但不限于淘析、FACS、淘選、磁力分選、低密度Ficoll梯度離心等等。優(yōu)選地，通過(guò)淘析，從PBMC富集單核細(xì)胞。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，通過(guò)選擇在細(xì)胞培養(yǎng)中粘附塑料的單核細(xì)胞，在6-96小時(shí)溫育期后從PBMC富集單核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)免疫磁性篩選以富集單核細(xì)胞。免疫磁性篩選可正選擇結(jié)合單核細(xì)胞，或負(fù)選擇結(jié)合非單核細(xì)胞的細(xì)胞(如，T細(xì)胞、B細(xì)胞等等)。一旦從個(gè)體分離，將單核細(xì)胞從分離自個(gè)體起在1°C-34°C下溫育6至96小時(shí)周期。如本文中所用的，從個(gè)體分離單核細(xì)胞或含有單核細(xì)胞的PBMC的時(shí)間，指完成從個(gè)體中移出該細(xì)胞的過(guò)程的時(shí)間。例如，如果從患者分離PBMC超過(guò)四小時(shí)白細(xì)胞分離術(shù)的時(shí)程，分離時(shí)間則是從分離白細(xì)胞終點(diǎn)起至收集PBMC的時(shí)間。優(yōu)選地，在3。C-34。C下、或4°C-32°C下或5°C-30°C下、更優(yōu)選地在6。C-28。C下、更優(yōu)選在6°C-27°C下、8°C-26°C下或約14°C-24°C下，溫育單核細(xì)胞6至96小時(shí)。優(yōu)選的下溫度范圍是6。C、7。C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C和14°C。優(yōu)選的上溫度范圍是20°C、21。C、22。C、23。C、24。C、25。C、26°C、27°C、280C、29。C、30°C、31°C、32°C、33。C和34。C。優(yōu)選地，溫育期是8至72小時(shí)，更優(yōu)選10至48小時(shí)，甚至更優(yōu)選12至24小時(shí)以及最優(yōu)選15至22小時(shí)。其它優(yōu)選的溫育時(shí)間范圍包括8至48小時(shí)、10至30小時(shí)、26至72小時(shí)以及48至80小時(shí)。優(yōu)選的溫育時(shí)間下限選自6、7、8、10、12、14、16、20、22、24、26、28、30、36以及48小時(shí)。優(yōu)選的溫育時(shí)間上限選自24、26、28、30、36、48、60、72、84以及96小時(shí)。在1。C-M。C溫育期，將任意形式的單核細(xì)胞(如，血液中的單核細(xì)胞、血份、PBMC、純化單核細(xì)胞等等)從臨床現(xiàn)場(chǎng)運(yùn)輸?shù)綐?shù)狀細(xì)胞生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)。優(yōu)選地，將單核細(xì)胞在調(diào)溫容器中進(jìn)行運(yùn)輸。在溫育期間，將單核細(xì)胞溫度維持在1°C-34。C中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，在恒溫箱中或在1°C-34°C的室內(nèi)中溫育單核細(xì)胞。優(yōu)選地，在溫育期間，將單核細(xì)胞進(jìn)行一些移動(dòng)(間歇的或連續(xù)的)。移動(dòng)是與運(yùn)輸相關(guān)的移動(dòng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在溫育期間，可輕柔搖動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞。不希望受到理論的限制，人們認(rèn)為移動(dòng)可防止與沉淀壓實(shí)相關(guān)的細(xì)胞損傷。在1°C-34°C的6-96小時(shí)溫育期中，溫育但不培養(yǎng)單核細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"不培養(yǎng)"，表示在6至96小時(shí)溫育期中，在約36-38°C下，將單核細(xì)胞不在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基(包括但不限于，生理性合適濃度的培養(yǎng)基，例如RPMI、DMEM、X-VIVO15、AIM畫(huà)V、StemSpanH2000等等)中進(jìn)行培養(yǎng)。相反，將通過(guò)本發(fā)明方法加工的單核細(xì)胞在1°C-34°C下進(jìn)行溫育，優(yōu)選在血液或血份(如，血清、血漿、分離白細(xì)胞的產(chǎn)物(如，PBMC)、血沉棕黃層等等)鹽水或生物學(xué)緩沖液例如磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)中進(jìn)行溫育。最優(yōu)選地，在1°C-34°C下，將含有單核細(xì)胞的分離白細(xì)胞的產(chǎn)物在分離白細(xì)胞收集容器(如，血液收集袋)中進(jìn)行溫育。在開(kāi)始階段或在溫育期間，當(dāng)將分離白細(xì)胞的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入另一個(gè)容器時(shí)，優(yōu)選避免會(huì)增加污染可能性的不必要的轉(zhuǎn)移。在1°C-34°C下溫育6-96小時(shí)之中或之后，在分化步驟之前可富集單核細(xì)胞。只要在1°C-34°C下進(jìn)行操作，就在溫育期間實(shí)施對(duì)單核細(xì)胞或PBMC的操作。具體地說(shuō)，在溫育期間，還可純化PBMC或從PBMC富集單核細(xì)胞。所述操作包括但不限于，離心、淘析、切向流過(guò)濾、Ficoll密度梯度、稀釋Ficoll密度梯度離心、稀釋Percoll密度梯度離心、抗體淘選、磁細(xì)胞分選、陽(yáng)性或陰性免疫磁性選擇等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫育期之后，通過(guò)在容器(優(yōu)選塑料容器)中培養(yǎng)和選擇粘附的單核細(xì)胞，從PBMC富集單核細(xì)胞。在1°C-34°C下溫育約6至96小時(shí)周期和進(jìn)一步富集單核細(xì)胞的任選步驟之后，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。典型的，將單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞，然后未成熟樹(shù)狀細(xì)胞成熟為成熟樹(shù)狀細(xì)胞。用于將單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞和用于樹(shù)狀細(xì)胞成熟的各種方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在包含可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成未成熟或成熟樹(shù)狀細(xì)胞的組合物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)單核細(xì)胞。誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞的組合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述組合物包括但不限于，GM-CSF+IL-4;GM-CSF+IL-13;GM-CSF+IL-15;IFNoc;以及GM-CSF+TNFa。誘導(dǎo)分化的組合物優(yōu)選是GM-CSF+IL-4。GM-CSF和IL-4的濃度范圍在每細(xì)胞因子約400至2000U/ml。優(yōu)選地，GM-CSF和IL-4的濃度是每細(xì)胞因子500至1000單位/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，在單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞期間，將單核細(xì)胞接觸GM-CSF和IL-4約4-7天，最優(yōu)選地約5-6天。單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞之后，未成熟樹(shù)狀細(xì)胞可成熟為在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)接觸包含GM-CSF、IL-4、成熟混合物(PGE2、TNFoc、IL-6和IL-ip)的培養(yǎng)基，使未成熟樹(shù)狀細(xì)胞得以成熟。例如參見(jiàn)，Jonuliet等人(1997)EurJImmunol27:3135-3142，其內(nèi)容通過(guò)引用作為參考。在替代的成熟方法中，用包含IFN-y的第一信號(hào)、隨后用包含CD40L的第二信號(hào)來(lái)指示未成熟樹(shù)狀細(xì)胞。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選地在GM-CSF和IL-4的存在下，將未成熟樹(shù)狀細(xì)胞接觸PGE2、IFN-y以及CD40L。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樹(shù)狀細(xì)胞中的重組CD40LmRNA的翻譯可影響與CD40L的4妄觸。優(yōu)選地，通過(guò)編碼CD40L的mRNA或其活性片段，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染樹(shù)狀細(xì)胞。最優(yōu)選地，優(yōu)選在GM-CSF和IL-4的存在下，將未成熟樹(shù)狀細(xì)胞接觸PGE2、TNFa以及IFNy，以生產(chǎn)成熟樹(shù)狀細(xì)胞。通過(guò)使用編碼CD40L的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染、優(yōu)選瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，可進(jìn)一步增進(jìn)樹(shù)狀細(xì)胞的成熟。優(yōu)選地，使用編碼CD40L的RNA和/或編碼一種或多種目的抗原或表位的RNA,轉(zhuǎn)染樹(shù)狀細(xì)胞。在美國(guó)申請(qǐng)11/246,387中描述了上述成熟方法，其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，樹(shù)狀細(xì)胞負(fù)載一種或多種抗原?？乖?fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞作為疫苗，并用于體外刺激T細(xì)胞?？蓪⒖乖?fù)載進(jìn)未成熟或成熟樹(shù)狀細(xì)胞。如果將抗原負(fù)載進(jìn)入未成熟樹(shù)狀細(xì)胞，那么通過(guò)負(fù)載本身的方法、或通過(guò)本文中所述其它成熟方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的替代的成熟方法，可使得未成熟樹(shù)狀細(xì)胞成熟。抗原可負(fù)載成抗原自身(如，蛋白、肽、表位、細(xì)胞裂解物、病毒粒子等等)，或負(fù)載成編碼抗原的核酸。優(yōu)選地，將抗原負(fù)載成編碼抗原的核酸。更優(yōu)選地，核酸是RNA,最優(yōu)選是mRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用編碼CD40L的mRNA,共轉(zhuǎn)染編碼一種或多種抗原的mRNA。優(yōu)選地，抗原是個(gè)體自體的，并用于制備施用給個(gè)體的抗原負(fù)載的自體DC疫苗。使用肽和蛋白抗原、細(xì)胞、細(xì)胞或組織裂解物、病毒或病毒粒子、核酸等等，用于負(fù)載樹(shù)狀細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)^f吏用核酸、優(yōu)選mRNA進(jìn)^亍電穿孔樹(shù)狀細(xì)胞(成熟的或未成熟的)，來(lái)負(fù)載抗原。優(yōu)選地，使用約0.25至4微克RNA/10M對(duì)狀細(xì)胞、最優(yōu)選使用約2貼RNA/10M對(duì)狀細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染樹(shù)狀細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，每次轉(zhuǎn)染使用1微克腫瘤RNA/百萬(wàn)DC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，每106樹(shù)狀細(xì)胞，使用0.25至1.0pg的四種RNA中的一種，其中所述四種RNA編碼來(lái)自病原體(如，HIV)的四種分離的抗原?？乖梢允侨我鈦?lái)源。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗原或抗原是個(gè)體自體的。術(shù)語(yǔ)"個(gè)體自體的"指抗原是從個(gè)體中獲得的或衍生的。作為非限制性實(shí)例，抗原可來(lái)自從個(gè)體中獲得的癌細(xì)胞或胂瘤組織。以癌細(xì)胞、癌細(xì)胞或組織的裂解物、癌細(xì)胞或組織的提取物、癌細(xì)胞或組織的純化或克隆成分、總RNA或總mRNA、或從所述細(xì)胞或組織選出的RNA或mRNA的形式，無(wú)論是存在于提取物中、或是純化的、擴(kuò)增的、體外翻譯等等的形式，可將癌癥抗原負(fù)載進(jìn)入樹(shù)狀生抗原。本發(fā)明方法可特別用于治療或預(yù)防癌癥和病原體傳染病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌是腎細(xì)胞癌、黑素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌或前列腺癌。術(shù)語(yǔ)病原體指病原學(xué)所涉及的任意病毒或生物體及其減毒衍生物。所述病原體包括但不限于，細(xì)菌、原蟲(chóng)、真菌和病毒病原體，例如螺旋桿菌(//￡/化'0^"￡。如幽門(mén)螺桿菌(/ze/,'co^"er/^/on)、沙門(mén)氏菌(S"/mowe〃")、痢疾桿菌(57nge〃a)、腸桿菌、彎曲菌(G3w/7少/o/^"er),各種分枝桿菌(myco6a"en力)，例如麻風(fēng)分枝桿菌(A^yco6""en力m/e/rae)、炭疽一干菌(S"d〃W5aw/7zracw)、鼠疫耶爾森氏菌(Ters7"/a/7e5/7s)、土4立弗朗西其斤菌(Fra/7C&e〃a化/are"w'力、布魯一干菌(Brwce〃(357ec/'es)、鉤端螺旋體菌(丄e/^cw//raz力&rraga似)、葡萄球菌(5V"尸/^/occwa、)(如，金黃色葡萄球菌S.沖炎菌(C/oW/7'c/wm)、白色念J朱菌(Ca"J/(i"a/Zn'ca/w)、癡原蟲(chóng)(尸/aywo6/Zwm)、牙'H十曼原、蟲(chóng)(丄e^/zwam'a)、4,蟲(chóng)(7>_y/(3c^owa)、人類(lèi)免疫缺陷性病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、人嗜淋巴細(xì)胞病毒(HTLV)、皰滲病毒(如，1型單純皰疹病毒、2型單純皰滲病毒、冠形病毒、水痘帶狀皰滲病毒以及Epstein-Barr病毒(EBV))、乳頭狀瘤病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、麻滲病毒、腮腺炎病毒以及風(fēng)滲病毒。優(yōu)選病原體是病毒病原體，更優(yōu)選是逆轉(zhuǎn)錄病原體，以及最優(yōu)選是HIV或HCV。無(wú)論是成熟的或未成熟的、是抗原負(fù)載或非抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞，都可在包含防凍劑的組合物中進(jìn)行冷凍。許多防凍劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。防凍劑的實(shí)例包括但不限于，二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙醇、甲醇乙酰胺、單乙酸甘油酯、丙烷二元醇、聚乙二醇、乙二醇、異-丁四醇、D-核醣醇、D-木密醇、D-山梨糖醇、D-乳糖、異-肌醇、氯化膽堿、氨基酸、白蛋白(優(yōu)選人血清白蛋白)、聚烯吡酮、葡聚糖、蔗糖、Ficoll、無(wú)機(jī)鹽以及羥乙基淀粉。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，防凍劑是DMSO。優(yōu)選地，DMSO濃度是2-20%,更優(yōu)選是5-"%。以及最優(yōu)選是約10%。此外，冷凍培養(yǎng)基含有一種或多種碳水化合物衍生的多羥基化合物，例如葡萄糖、葡萄糖、蔗糖等等，濃度優(yōu)選為2-30%,更優(yōu)選為5-10%，最優(yōu)選為5%葡萄糖。用于冷凍樹(shù)狀細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20(M0253574，其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。優(yōu)選地，防凍劑是二曱亞石風(fēng)(DMSO)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DMSO濃度是5%至20%。最優(yōu)選地，組合物中的DMSO濃度是約10%。令人驚訝地是，在5%-20%DMSO的存在下進(jìn)行冷凍并解凍后，通過(guò)本發(fā)明方法所制備的樹(shù)狀細(xì)胞和樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，解凍后能體外存活至少24小時(shí)。由于本發(fā)明的抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞能抗DMSO,因此在施用樹(shù)狀細(xì)胞疫苗之前不必洗滌細(xì)胞。因此，本發(fā)明解凍的樹(shù)狀低污染風(fēng)險(xiǎn)并避免:損傷樹(shù)狀細(xì)胞的進(jìn)一步操作。因此:、在二個(gè)i施方案中，本發(fā)明提供用于施用抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗的方法，包括對(duì)包含至少2%至20%DMSO的冷凍樹(shù)狀細(xì)胞疫苗進(jìn)行解凍，和施用前不改變樹(shù)狀細(xì)胞對(duì)DMSO的比例下將疫苗施用于個(gè)體。優(yōu)選地，疫苗中的DMSO濃度是約5-20%,更優(yōu)選是10%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用裝載抗原的樹(shù)狀細(xì)胞以用于制備治療或預(yù)防癌癥或病原體傳染病的冷凍藥物，其中藥物包含至少2%的DMSO,并且剛一溶化就可進(jìn)行施用。本發(fā)明方法提供生產(chǎn)具有功能增強(qiáng)的和水平提高的成熟標(biāo)記的新的樹(shù)狀細(xì)胞。例如，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中與從新鮮單核細(xì)胞制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞相比，本發(fā)明的成熟樹(shù)狀細(xì)胞提高了CD80、CD83、CD86、MHC-I類(lèi)分子或MHC-II類(lèi)分子中的一種或多種的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中樹(shù)狀細(xì)胞可引起從記憶性T細(xì)胞生產(chǎn)抗原特異IL-2。用于測(cè)量IL-2的方法是本領(lǐng)域中已知的。在圖10.35(Immunobiology,第6版,Eds.Janeway等,GarlandSciencePublishing,NewYork,NY,2005)中公開(kāi)了記憶性T細(xì)胞特有的并可區(qū)別于其它T細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞表面標(biāo)記和其它分子的表達(dá)；其內(nèi)容在此通過(guò)引用作為參考。例如，記憶性T細(xì)胞表達(dá)高水平的CD44、CD45RO、CD45RA、Bcl-2、IFNy、CD127和Ly6C，表達(dá)中等水平的CD122和CXCR4，以及表達(dá)低水平的FasL和陰性的CD69和CD25。如本文所述，穩(wěn)定狀態(tài)RNA水平的微陣列分析，顯示與從新鮮單核細(xì)胞制備的樹(shù)狀細(xì)胞相比，在從日齡老單核細(xì)胞制備的樹(shù)狀細(xì)胞之間的不同基因表達(dá)。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中ALOX15RNA對(duì)細(xì)胞中的任一的(3-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDH的穩(wěn)定狀態(tài)比值小于1.0。優(yōu)選地，比值在0.2至0.7之間，更優(yōu)選地在0.4至0.5之間，以及最優(yōu)選地約0.45。胞，其中細(xì)胞中的CD52RNA對(duì)(3-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDH的穩(wěn)定狀態(tài)比值大于1.0。優(yōu)選地，比值在1.2至5.0之間，更優(yōu)選在1.5至2.2之間、或在1.8至1.9之間，以及最優(yōu)選地比值是1.86。還在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中細(xì)胞中的TLR1RNA、TLR2RNA、IL-1卩RNA或CD69RNA對(duì)肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDH的穩(wěn)定狀態(tài)比值大于1.0。優(yōu)選比值在0.2至0.9之間，更優(yōu)選在0.5至0.8之間。使用SEQIDNOs:2-12所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人ALOX15mRNA(SEQIDNO:l)及其等位變體。使用SEQIDNOs:14-24所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人IL-1pmRNA(SEQIDNO:13)及其等位變體。使用SEQIDNOs:26-36所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人TLR1mRNA(SEQIDNO:25)及其等位變體。使用SEQIDNOs:38-48所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人TLR2mRNA(SEQIDNO:37)及其等位變體。使用SEQIDNOs:50-60所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人CD69mRNA(SEQIDNO:49)及其等位變體。使用SEQIDNOs:62-77所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人CD52mRNA(SEQIDNO:61)及其等位變體。使用SEQIDNOs:79-98所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人GAPDHmRNA(SEQIDNO:78)及其等位變體。使用SEQIDNOs:100-119所示的Affymetrix探針，檢測(cè)人卩-肌動(dòng)蛋白mRNA(SEQIDNO:99)及其等位變體。通過(guò)微陣列，優(yōu)選使用Affymetrix人基因組U133Plus2.0陣列，檢測(cè)RNA穩(wěn)定狀態(tài)的表達(dá)水平?；蛘?，使用上文所列的基因特異探針，進(jìn)行雜交。優(yōu)選地，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(Genechip⑧ExpressionAnalysisTechnicalManual,2004),從樹(shù)狀細(xì)胞提取的RNA樣品可用于人基因組U133Plus2.0陣列(AffymetnxSantaClara,加利福尼亞州)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶，3微克的總RNA標(biāo)準(zhǔn)品和GenechipPoly-ARNAControlKit(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞州)可轉(zhuǎn)錄第一條cDNA鏈。合成第二條cDNA鏈后，隨即體外轉(zhuǎn)錄以用于線性擴(kuò)增各個(gè)轉(zhuǎn)錄物和摻入生物素化CTP和UTP。將cRNA產(chǎn)物破碎成約100核苷酸的片段，并將其在微陣列上雜交16小時(shí)。然后，將微陣列在低嚴(yán)謹(jǐn)條件(6xSSPE)和高嚴(yán)謹(jǐn)條件(lOOmMMES,0.1MNaCl)下進(jìn)行洗滌，并用鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行染色。通過(guò)添加生物素化的抗鏈霉親和素和額外等分量的鏈霉親和素-藻紅蛋白染料，以擴(kuò)增焚光。在570nm激發(fā)后，將GenechipScanner3000(Affymetrix,SantaClara,加利福尼亞州)用于收集3jum分辨率的熒光信號(hào)。對(duì)于各個(gè)目的微陣列特征，計(jì)算兩個(gè)連續(xù)掃描的平均信號(hào)。用GenechipOperatingSoftwarevl.l(Affymetrix,SantaClara,力口利福尼亞)，分析掃描圖像。優(yōu)選地，將Poly-ARNA對(duì)照試劑盒(Affymetrix,SantaClam,加利福尼亞)中包含的4種對(duì)照RNA的高線性相關(guān)(R2>0.95)，確認(rèn)作為有效標(biāo)記過(guò)程的對(duì)照。將所有基因或僅僅目的基因(如,ALOX15、IL-1卩、TLR1、TLR2、CD69和/或CD52,以及(3-肌動(dòng)蛋白和/或GAPDH)的曲線數(shù)據(jù)，輸入計(jì)算機(jī)程序GeneSpring,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。通過(guò)用于Affymetrix陣列的GeneSprmgTM所建議的標(biāo)準(zhǔn)方法，以正常步驟實(shí)施三個(gè)步驟。1)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(將所有小于0.01的值設(shè)定為0.01);2)將第50百分位數(shù)正態(tài)化。3)將中值正態(tài)化。通過(guò)區(qū)分目的mRNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)(即GAPDH或卩-肌動(dòng)蛋白mRNA的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá))，然后可測(cè)定目的mRNA(ALOX15、IL-1|3、TLR2、CD69或CD52mRNA)對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)GAPDH或卩-肌動(dòng)蛋白mRNA的比值。本發(fā)明的抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞可作為治療或預(yù)防疾病的疫苗，或激活可用于治療的T細(xì)胞。例如，抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞可用于引起對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。它們可作為預(yù)防將來(lái)的傳染病或疾病的疫苗，或作為激活免疫系統(tǒng)以治療正發(fā)生的疾病的疫苗，例如但不限于，病原體感染或癌癥。可將抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞與合適載體(例如生理緩沖液或其它注射液)一起配制成疫苗或藥物組合物。以足夠引起免疫反應(yīng)的治療有效量，進(jìn)4于施用疫苗或藥物組合物。優(yōu)選地，用可衍生樹(shù)狀細(xì)胞的個(gè)體自體抗原負(fù)載樹(shù)狀細(xì)胞，并施用于相同個(gè)體。例如，參見(jiàn)，美國(guó)5,853,719(其內(nèi)容通過(guò)引用作為參考)，描述了抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞和特別是RNA負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞的制品和用途?；蛘?，可使用計(jì)劃接受DC療法的受體的非自體抗原，以負(fù)載樹(shù)狀細(xì)胞。所述抗原的實(shí)例包括但不限于已知的治療靶的抗原，例如端粒酶、前列腺特異抗原，及其它胂瘤標(biāo)記物，或來(lái)自病原體的已^口^元原。收集單核細(xì)胞或包含單核細(xì)胞的PBMC的方法用于收集單核細(xì)胞的包含單核細(xì)胞的PBMC的各種方法，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，參見(jiàn)，詳細(xì)說(shuō)明了用于PBMC收集和淘析單核細(xì)胞純化的白細(xì)胞分離術(shù)的gambrobct.com/Products—&—Services/。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,在GambroBCTCOBESpectra(GambroBCT,Lakewood,CO)上使用AutoPBSC(AutomatedPeripheralBloodStemCell)程序,在單個(gè)無(wú)菌的一次性、一次使用的細(xì)胞成份袋中，收集分離白細(xì)胞產(chǎn)物和血漿。在一個(gè)分離白細(xì)胞的替換方法中，通過(guò)在肝素注射器中收集血液、用PBS稀釋、在Histopaque1077(Sigma)上分層、離心以及在4妄觸面上復(fù)性PBMC,以獲得PBMC。參見(jiàn)Woodheadetal.(2000)InternationalImmunol12:1051-1061。收集、純化或分級(jí)PBMC的其它方法，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。在收集分離白細(xì)胞產(chǎn)物或其它血液產(chǎn)物后，將其中包含的單核細(xì)胞在1-34°C下溫育6-96小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在袋中收集分離白細(xì)胞的產(chǎn)物，然后將其轉(zhuǎn)移到能維持1-34°C、優(yōu)選約6-28°C、最優(yōu)選8-26°C的溫度監(jiān)控運(yùn)輸容器中的疫苗制備設(shè)備中。例如在美國(guó)專(zhuān)利4，102807中公開(kāi)的有助于防止溫度變化的膠袋(gdpack)，可被歸入運(yùn)輸容器范疇中。例如，可在絕熱集裝箱(如，ThermoSafemodelE65聚氨酯泡沫絕熱集裝箱)中運(yùn)輸單核細(xì)胞，并用如圖1所示的ThermoSafeU-tek膠袋和膠墊進(jìn)行包裝。例如，在圖1所示的包裝過(guò)程中，將可調(diào)節(jié)-l。C的16ozU-tek膠袋平放在E65容器底部。將兩個(gè)16ozU-tek膠墊(-l。C)重疊并放在第一層膠墊和E65容器的矮容器壁之間。然后將兩個(gè)16ozU-tek膠(調(diào)節(jié)+18。C)幾乎垂直放置在先前的膠墊上。將ThermoSafeINF3000運(yùn)輸容器放置在膠之間。將分離白細(xì)胞的袋放在密封的內(nèi)袋(STP711)中。將記錄內(nèi)袋溫度的裝置用于監(jiān)測(cè)運(yùn)輸溫度。一個(gè)所述裝置是ThermoSafeDataLogger。將內(nèi)袋置于密封的外袋(STP710)中，然后將該袋放入INF3000容器中。將16ozU-tek膠(+18。C)置于用牛皮纟氏(Kraftp叩er)套上的封閉INF300容器的頂部，然后塞上4"泡沫塞。然后用膠帶封口盒子，以備運(yùn)輸。在1-34°C的溫育期之中或之后，可進(jìn)一步處理或純化分離白細(xì)胞的產(chǎn)物，例如室溫下在50ml錐形管中進(jìn)行Fico11密度梯度離心，以分離和濃縮包含樹(shù)狀細(xì)胞前體(單核細(xì)胞)的單核細(xì)胞組分。優(yōu)選地，在通過(guò)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行多個(gè)洗滌步驟后，可測(cè)定細(xì)胞濃度和細(xì)力包存活力。貧菜卓^"細(xì)應(yīng)用于富集單核細(xì)胞的方法，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括但不限于密度梯度離心(如，稀釋Ficoll密度梯度離心、稀釋Percoll密度梯度離心等等)、淘析、附著塑料、切向流過(guò)濾、熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、免疫細(xì)胞分離法(抗體淘選以選擇單核細(xì)胞或除去非單核細(xì)胞(如，白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞，等等)、差異裂解、磁細(xì)胞分選等等)、在包被有塑料微載體珠的塑料培養(yǎng)袋中培養(yǎng)，等等。參見(jiàn)，例如，O'Doherty等(1993)JExpMed178:1067-1076;Young等(1990)JExpMedl71:1315-1332;Freudenthal等(1990)PNAS87:7698-7702;Bemhard等(1995)CancerRes55:1099-1104;Caux等(1992)Nature360:258-261;Read等(2003)"EvaluationofaClosedAutomatedSystemtoIsolatePeripheralBloodMonocytesforDendriticDell(DC)Immunotherapy",NinthannualmeetingoftheISCT;Mu等(2003)ScandJImmunol58:578-586;Maffei等(2000)Transfusion40:1419-1420;mitenyibiotec.com;Meyer-Wentrup等(2003)JHematotherStemCellResl2:289_2";以及WO2004/000444,其內(nèi)容在此引用作為參考。例如，通過(guò)正選擇(CD14+細(xì)胞)或通過(guò)負(fù)選擇(即，除去非單核細(xì)胞的細(xì)胞；如，CD3+、CD19+和CD2+細(xì)胞)，磁細(xì)胞分選可用于富集單核細(xì)胞。優(yōu)選地，通過(guò)淘析(分離來(lái)自個(gè)體白細(xì)胞分離物的單核細(xì)胞的自動(dòng)方法)，從白細(xì)胞分離的產(chǎn)物富集單核細(xì)胞。分離白細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域中已知的。例如，在GambroBCTElutraTM細(xì)胞分離系統(tǒng)(GambroBCT,Lakewood,CO)上實(shí)施淘析。通過(guò)將1000ml的5%人白蛋白血清(HSA)加入4LHank'平衡鹽溶液(HBSS)袋中，以制備淘析緩沖液。根據(jù)制造商的方法，通過(guò)淘析來(lái)分級(jí)細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將制造商(Gambro)方法的改良法用于淘析，其中最終的旋轉(zhuǎn)出組分是第四餾份而不是第五餾份。對(duì)單核細(xì)胞餾份實(shí)施CBC與差異分析，以鑒定純度和回收率。或者，通過(guò)免疫分型法與CD14,評(píng)價(jià)單核細(xì)胞純度。然后，將富集的單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞，或冷凍和保存以便后用。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞冷凍在25ml或50ml的冷凍袋中。冷凍袋的實(shí)例包括Cryocyte冷凍袋、Origen冷凍袋(Cryostore)和Pall頂冷凍袋。優(yōu)選地，各個(gè)冷凍袋含有15ml培養(yǎng)基(如，AIMV、x隱VIVO、RPMI,等等)，其中具有直至3x109細(xì)胞和約10-12%的DMSO和10-20%熱滅活的過(guò)濾血漿、終濃度約107至507mg/L的CaCl2，以及終濃度約44至241mg/L的MgS04。使用控制速度的水箱冷凍細(xì)胞，然后冷凍保存。在替代的實(shí)施方案中，PBMC溫育和Ficoll密度梯度純化之后，將PBMC重懸浮于八1]^々@培養(yǎng)基中，并以每瓶2.0xl()S細(xì)胞接種T"0cn^燒瓶。在獲得不足數(shù)量的PBMC的事件中，可冷凍PBMC并與第二次分離白細(xì)胞匯集。在"。C、5%C02、75%濕度的條件下，通過(guò)在無(wú)菌組織培養(yǎng)塑料燒瓶中附著1至2小時(shí)，從單核細(xì)胞群體中選擇單核細(xì)胞。除去未附著的和半附著的細(xì)胞。將PBS加入燒瓶，以除去剩余的未附著細(xì)胞、半附著細(xì)胞以及剩余的培養(yǎng)基。剩余的附著細(xì)胞是主要的單核細(xì)胞，代表富集的單核細(xì)胞群體。卓裙細(xì)應(yīng)為VA成詢7乂'細(xì)^好才法用于單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞的各種方法，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。參見(jiàn)，U.S.6,607,722,WO97/29182;Romani等(1994)J.Exp.Med.180:83-93;Sallusto和La腿vecchia(1994)J.Exp.Med.179:1109等，和Reddy等(1997)Blood90:3640-3646;其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。這些方法的多數(shù)包括在細(xì)胞因子的存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞因子可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。用于單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞的替代方法的實(shí)例包括但不限于暴露于物理干擾下(如，剪切)，在通過(guò)細(xì)胞DNA成分能制備光加成產(chǎn)物的光敏劑的存在下進(jìn)行照射，和/或用DNA粘合劑治療，隨后與疾病效應(yīng)劑一起溫育，例如微生物、真菌、病毒以及惡性細(xì)胞。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6力O7,722，其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。的組合物的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，將單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。用于培養(yǎng)單核細(xì)胞、未成熟和成熟樹(shù)狀細(xì)胞的合適培養(yǎng)基，包括但不限于AIM-V、X-VIVO-15、RPMI、DMEM等等。誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞的組合物是本領(lǐng)域中已知的，包括但不限于添加IL-4的GM-CSF、添加IL-13的GM畫(huà)CSF、以及IFNa。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在GM-CSF和IL-4的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，將富集的單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。(參見(jiàn)，例如WO97/29182;Salhisto和La歸vecchia(1994)J.ExpMed.179:1109;以及Romani等(1994)J.Exp.Med.180:83-93)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，優(yōu)選以lxl()6細(xì)胞/ml的濃度，將富集的單核細(xì)胞在AIMV培養(yǎng)基、x-VIV015培養(yǎng)基或其它合適培養(yǎng)基中，在800U/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的存在下和37。C、5%C〇2、>75%濕度的條件下進(jìn)行培養(yǎng)約4-7天、優(yōu)選6天，以使得單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞?？烧{(diào)整細(xì)胞因子濃度。例如，GM-CSF濃度優(yōu)選是500至1500U/ml、更優(yōu)選是700至1000U/ml、最優(yōu)選是800U/ml。IL-4濃度優(yōu)選是400-1500U/ml、更優(yōu)選是450至1000U/ml、最優(yōu)選是500U/ml。IL-13或IL-15可用于代替IL-4，或者除其之外還含有IL-4。IFNa可用于代替添加了IL-4、IL-13或IL-15的GM-CSF。當(dāng)單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞時(shí)，它們逐漸失去CD14的表達(dá)，并獲得和未成熟狀態(tài)中的樹(shù)狀細(xì)胞表型一致的CD80表達(dá)。f細(xì)y^成'熟力成勿/S^才法未成熟樹(shù)狀細(xì)胞成熟為成熟樹(shù)狀細(xì)胞的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括但不限于，抗原攝入和/或接觸可誘導(dǎo)成熟的組合物?；?PBMC條件培養(yǎng)基:固定金黃葡萄球菌(^ansorbin'TM);脂多糖(LPS);其它菌細(xì)胞產(chǎn)物，例如單磷酸脂A(MPL)、脂胞壁酸等等；磷酸膽石咸；鈣離子載體；佛波酯例如PMA;熱休克蛋白；核苷酸，例如ATP等等；脂肽；Toll樣受體4;適于Toll樣受體的人造配體；雙鏈RNA，例如poly-I:C等等；免疫激活DNA序列；成熟混合物(TNF-a、IL-6、IL-1卩和PGE2);GM-CSF、IL-4和成熟混合物(TNFot、IL-6、IL-1卩以及PGE2)、GM-CSF、IL-4、PGE2和IFNy序列信號(hào)，其后是CD40L信號(hào)；等等。參見(jiàn)，例如Cisco等(2004)JImmunol172:7162-7168;Jonlmt等(1997)EurJImmunol27:3135-3142;美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)20040203143;PCT申請(qǐng)PCT/US2005/036304和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)11/246,387,其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，將含有TNFouIL-6、IL-ip和PGE2的成熟混合物，加入未成熟樹(shù)狀細(xì)胞的培養(yǎng)中。然后，將細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)(約12小時(shí)或更久)，以產(chǎn)生成熟樹(shù)狀細(xì)胞。在一個(gè)替代的實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)使用編碼CD40L的mRNA、或任選使用編碼一種或多種抗原的mRNA進(jìn)行電穿孔，以轉(zhuǎn)染未成熟樹(shù)狀細(xì)胞，然后在IFNy和任選PGE2的存在下過(guò)夜培養(yǎng)(約12小時(shí)或更久)，以生產(chǎn)成熟樹(shù)狀細(xì)胞。人CD40LcDNA和蛋白分別如SEQIDNO:120和SEQIDNO:121所示。其它CD40L的mRNA是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將AIMV培養(yǎng)基中的成熟制劑直接加給未成熟DC，達(dá)到TNF-a(10ng/ml)、IFN-Y(1000U/ml)以及PGE2(1Mg/ml)的終濃度。然后，將細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)(約12小時(shí)或更久)，以產(chǎn)生成熟樹(shù)狀細(xì)胞。任選地，通過(guò)細(xì)胞接觸被加入培養(yǎng)基中的或更優(yōu)選在細(xì)月包中表達(dá)的CD40配體(CD40L),可進(jìn)一步促進(jìn)成熟。CD40L是組成型表達(dá)或瞬時(shí)表達(dá)。優(yōu)選地，使用編碼CD40L的mRNA,任選地使用編碼一種或多種目的抗原的mRNA,轉(zhuǎn)染成熟樹(shù)狀細(xì)胞。我#將任意抗原負(fù)載到未成熟或成熟樹(shù)狀細(xì)胞中。然后處理抗原，并通過(guò)成熟DC進(jìn)行呈現(xiàn)?？乖瓕?shí)例包括但不限于，病毒粒子、細(xì)菌或其它病原體、蛋白及其片段、多肽、病原體裂解物、病原體提取物、病原體核酸、癌細(xì)胞、癌細(xì)胞蛋白及其片段、癌細(xì)胞裂解物、癌細(xì)胞提取物以及癌細(xì)胞核酸?？乖翘烊淮嬖诘?，或通過(guò)化學(xué)合成或重組進(jìn)4亍制備。使用本領(lǐng)域中已知的方法，以多肽、蛋白或核酸的形式，將抗原呈遞給細(xì)胞。以"天然"形式進(jìn)行呈遞抗原，其中在制備抗原或誘導(dǎo)其進(jìn)入所面對(duì)樹(shù)狀細(xì)胞的環(huán)境中沒(méi)有出現(xiàn)人為干涉?；蛘呋蛄硗?，抗原包括粗制品，例如在常規(guī)的過(guò)敏注射(allergyshot)或腫瘤裂解物中，通常進(jìn)行施用的類(lèi)型?；蛘呖乖腔旧霞兓模缰辽偌s90%純度。例如，抗原是通過(guò)蛋白裂解分離的蛋白所產(chǎn)生的肽?？衫萌魏胃鞣N裂解試劑，包括但不限于，胃蛋白酶、溴化氰、胰蛋白酶、胰凝肽，或進(jìn)行重組表達(dá)。另外，使用重組方法以產(chǎn)生編碼目的肽的核酸，并在期望條件下表達(dá)肽?；蛘?，可純化編碼核酸的抗原，或從細(xì)胞、組織或病毒書(shū)f生該抗原。方案中,'、i元原是修飾:原"，、因?yàn)榭乖過(guò)基本上相同于天然2在的抗原的結(jié)構(gòu)，但包含與天然存在的化合物的精確結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)變化。例如，當(dāng)天然存在的抗原是蛋白或多肽抗原時(shí)，與蛋白或多肽抗原相比，修飾抗原具有不同于天然存在的抗原的、以一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代或缺失形式的氨基酸序列，和/或包括不同于天然存在的抗原中所對(duì)應(yīng)氨基酸的、通過(guò)插入、取代或缺失一個(gè)或多個(gè)共價(jià)連接于氨基酸的化學(xué)部分的氨基酸。在一個(gè)方面中，天然存在的和修飾的抗原共有至少5個(gè)氨基酸(即至少75%同一性)的至少一個(gè)區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，在比較兩條氨基酸序列以測(cè)定它們同一性程度中，相同氨基酸延伸段(即，至少兩個(gè)區(qū))的間距不必總是精確保守的。在至少5個(gè)氨基酸的至少一個(gè)區(qū)的氨基酸序列中，天然存在的和修飾的蛋白或多肽抗原顯示至少約80%同一性，或者更多是85%、90%、95%,或大于99%同一性。經(jīng)常，更多的氨基酸序列的長(zhǎng)區(qū)域(如，10、20、50、或100或多個(gè)氨基酸)可用于顯示稱(chēng)為同一性程度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以編碼抗原的多核苷酸或基因施用抗原，使得基因表達(dá)引起在單個(gè)處理過(guò)的(當(dāng)體內(nèi)施用時(shí))或細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(當(dāng)體外施用時(shí))中產(chǎn)生抗原。用于生成包括表達(dá)基因或mRNA的核酸的方法，和用于將所述核酸導(dǎo)入可產(chǎn)生由表達(dá)基因編碼的任何蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，是本領(lǐng)域中已知的，并在下文進(jìn)行簡(jiǎn)要描述。優(yōu)選地，以mRNA形式進(jìn)4亍施用抗原。將/人細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞、病原體細(xì)月包或病原體感染的細(xì)胞)獲得的RNA或mRNA直接負(fù)載到樹(shù)狀細(xì)胞中?；蛘?，在負(fù)載之前擴(kuò)增RNA或mRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用含有有義啟動(dòng)子的引物，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增總mRNA或耙mRNA，以構(gòu)建cDNA表達(dá)構(gòu)建體。然后，將從表達(dá)構(gòu)建體體外轉(zhuǎn)錄的RNA，用于負(fù)載細(xì)胞。用于分離、擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄RNA并將RNA或其它核酸負(fù)載到樹(shù)狀細(xì)胞中的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，參見(jiàn)，PCT/US04/39539和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/522,310,其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗原是一個(gè)或多個(gè)HIV蛋白或其片段。作為非限制性實(shí)例，來(lái)自HIV感染者的血漿可作為HIVRNA的分離來(lái)源。在一個(gè)實(shí)施方案中，離心部分血漿、收集上清，并使用0.22jiim過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，以及保存在-20。C，直至用于制備樹(shù)狀細(xì)胞疫苗。通過(guò)RT-PCR,擴(kuò)增血漿中的HIVRNA并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以提供用于負(fù)載到樹(shù)狀細(xì)胞中的、足夠數(shù)量的擴(kuò)增HIVRNA。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用逆轉(zhuǎn)錄酶、合適反應(yīng)緩沖液以及隨機(jī)六聚體或靶反向引物，將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為單鏈(ss)DNA。然后，在一級(jí)PCR反應(yīng)中，使用多重引物，通過(guò)PCR將單鏈cDNA擴(kuò)增成雙《連DNA。通過(guò)選擇互補(bǔ)于那些區(qū)域兩側(cè)的靶序列的特異引物，測(cè)定一級(jí)PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增區(qū)域的同一性。使用QIAquickPCR純化試劑盒，純化一級(jí)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，然后作為第二輪或嵌套式PCR擴(kuò)增中的模版。在這輪擴(kuò)增中，5'引物含有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(如，T7啟動(dòng)子)突出端，3'引物含有聚T片段(polyTstretche)的懸突。通過(guò)在巢式PCR循環(huán)中的突出端區(qū)域所導(dǎo)入的修飾，使得體外轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，并一運(yùn)送到樹(shù)狀細(xì)胞中就進(jìn)行有效翻^奪。使用QmgenRNeasy試劑盒，進(jìn)行純化體外轉(zhuǎn)錄的RNA,并將RNA在無(wú)核酸酶的水中進(jìn)行洗脫。如果需要，進(jìn)行乙醇沉淀以濃縮RNA。將RNA重懸浮在無(wú)核酸酶的水中，并通過(guò)0.8/0.2pm聚醚砜(PES)過(guò)濾器，然后分散到0.5ml安全鎖的聚丙烯管中，并負(fù)載到DC中或在^150。C下冷凍保護(hù)，直至轉(zhuǎn)染之前進(jìn)行解凍。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從一種或多種癌細(xì)胞提取RNA或mRNA。使用PCT/US04/39539中描述的方法，將RNA或mRNA直接負(fù)載到樹(shù)狀細(xì)胞中，或首先通過(guò)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增和體外轉(zhuǎn)錄。/W乂'勿/《^戎^,戎當(dāng)作為未成熟樹(shù)狀細(xì)胞、成熟樹(shù)狀細(xì)胞時(shí)，或在未成熟到成熟才對(duì)狀細(xì)胞的分化中，使用一種或多種抗原負(fù)載樹(shù)狀細(xì)胞。樹(shù)狀細(xì)胞能攝取抗原，例如蛋白、肽、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞裂解物等等。因此，僅僅通過(guò)用抗原或編碼抗原的核酸接觸樹(shù)狀細(xì)胞，可實(shí)施抗原負(fù)載。用于負(fù)載樹(shù)狀細(xì)胞的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于，核酸轉(zhuǎn)染、外來(lái)體、病毒載體、微顆粒輸送等等。例如，參見(jiàn)，Mitchell等(2000)CurrOpinMolTher2:176-181;Zitovogel等(1998)Nature4:594-600;Jenne等(2001)TrendsImmunol22:102-106，以及美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2005/0158856，其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。將一種或多種抗原直接負(fù)載到樹(shù)狀細(xì)胞中，或?qū)⒕幋a一種或多種抗原的核酸負(fù)載(轉(zhuǎn)染)到樹(shù)狀細(xì)胞中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用編碼一種或多種抗原的核酸來(lái)負(fù)載樹(shù)狀細(xì)胞。優(yōu)選地，核酸是mRNA。包括但不限于，被動(dòng)轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、^離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(如，DOTAP)、陽(yáng)離子肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔。參見(jiàn)Nair等(1998)NatBiotechnology16:364-369;VanTendeloo等(2001)Blood98:49-56;Saeboe-Larssen等(2002.)JImmunolMethods259:191-203'，Boczkowski等(2000)CancerRes60:1028-1034;Gilboa等ImmunolRev(2004)199:251-263;美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/583,579;和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)10/177,390，其內(nèi)容在此通過(guò)引用以作為參考。使用蛋白、多肽、肽、細(xì)胞或組織提取物或其它類(lèi)型的抗原，以負(fù)載樹(shù)狀細(xì)胞的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用一種或多種抗原負(fù)載未成熟樹(shù)狀細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，僅僅通過(guò)在培養(yǎng)基中與未成熟樹(shù)狀細(xì)胞一起溫育，負(fù)載肽、多肽和/或細(xì)胞或組織提取物。遞^《,/乙,戎在#，炎勿f厲子;遂合參^4熟44腐一#炎*/《在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)輕敲培養(yǎng)瓶以移動(dòng)細(xì)胞，來(lái)收集未成熟樹(shù)狀細(xì)胞。然后將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管。將PBS加入培養(yǎng)瓶，以除去加入錐形瓶中的剩余漂浮細(xì)胞和剩余培養(yǎng)基。一些未成熟樹(shù)狀細(xì)胞可繼續(xù)附著于燒瓶。通過(guò)加入PBS并在從2。C直至室溫的任何地方中溫育燒瓶，以促進(jìn)這些細(xì)胞的分離。在溫育末期，排干燒瓶并將移出的細(xì)胞加入錐形管中。然后沉淀所有細(xì)胞懸浮液，在PBS中洗滌并以0.5ml的4xl07/ml重懸浮在水冷ViaSpant，并置于冰上。用編碼抗原(組)的、2嗎/106細(xì)胞的mRNA混合DC,并置于4mm缺口電穿孔管中，在275-350V脈沖、100-300D和150pF,優(yōu)選在325V、200Q下進(jìn)行電穿孔。在電穿孔后，立刻在X-VIV015培養(yǎng)基中洗滌DC，并以lxl06/ml濃度重懸浮于補(bǔ)充了GM-CSF(800U/ml)、IL-4(500U/ml)和PGE2(l嗎/ml)、TNF-a(10ng/ml)、IL隱1卩(10ng/ml)以及IL詞6(100ng/ml)的X-VIV015中。然后，在37。C、5%C02、>75%濕度下，過(guò)夜溫育未成熟樹(shù)狀細(xì)胞，以生產(chǎn)穩(wěn)定的成熟樹(shù)狀細(xì)胞。然后在PBS中洗滌成熟樹(shù)狀細(xì)胞。遞^在#/乙遽/尹戎#,裁'，炎^遽/尹成,熟在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用CD40L和IFN-y成熟未成熟樹(shù)狀細(xì)胞。優(yōu)選地，通過(guò)如上所述電穿孔，用4jngCD40LmRNA/106細(xì)胞和編碼一種或多種抗原的mRNA(2^/106細(xì)胞)轉(zhuǎn)染未成熟DC,然后在補(bǔ)充了GM-CSF(800-1000U/ml)、IL-4(500-1000U/ml)、IFN畫(huà)y(500-1000U/ml)或TNF-oc(10ng/ml)和PGE2(ljig/ml)的X-VIV015中過(guò)夜培養(yǎng)，以生成穩(wěn)定的成熟樹(shù)狀細(xì)胞。與通過(guò)上述細(xì)胞因子混合法成熟的樹(shù)狀細(xì)胞相比，通過(guò)這種方法成熟的樹(shù)狀細(xì)胞，可分泌高水平的IL-12(T細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和最小限度的IL-IO。遞過(guò)^*應(yīng)，^戎通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，用抗原負(fù)載成熟樹(shù)狀細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，單核細(xì)胞開(kāi)始分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞后的第6天，將AIMV培養(yǎng)基中的成熟制劑直接加給未成熟DC,以獲得TNF-a(10ng/ml)、IFN^(1000U/ml)和PGE2(l|ig/ml)的終濃度。然后，過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生成熟樹(shù)狀細(xì)胞。然后收集DC,并用lpg編碼RNA的抗原和任選用4)igCD40LRNA/1()6細(xì)胞，進(jìn)4亍共電穿孔。電穿孔后，將細(xì)胞在補(bǔ)充了GM-CSF(800U/mL)和IL-4(500U/mL)的lxl()S細(xì)胞的AIMV培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)。然后制備用于施用給個(gè)體而無(wú)需冷凍的細(xì)胞，或者配制用于冷凍的細(xì)胞。為了冷凍，優(yōu)選在熱滅活的自體血漿、10%DMSO和5°/。葡萄糖中，以2xl0細(xì)胞/ml進(jìn)行制備細(xì)胞。使用總數(shù)為1.4><107細(xì)胞的0.7ml小管，以充滿冷凍管。然后，將小管在乙醇盒中于-85。C下冷凍至少4小時(shí)，并轉(zhuǎn)入冷凍冰箱中以備保存。然后，將冷凍的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗進(jìn)行解凍，并且無(wú)需洗滌或重新配制即施用纟會(huì)個(gè)體。^式'勿應(yīng)術(shù)'為、^fDC,以^定成熟在優(yōu)選的方法中，收集106DC，并重懸浮在冰PBS/1%FCS中。在96孔平板(BDBiosciences)中，使用lxlOV孔的DC,混合偶聯(lián)了MHC分子的特異抗體的藻紅蛋白(PE)或FITC，(HLA-ABC，HLA-DR)、共刺激分子(CD80,CD86)、成熟標(biāo)記(CD83)以及單核細(xì)胞標(biāo)記(CD14),并在4°C下溫育至少15分鐘。將同種型匹配抗體作為對(duì)照。徹底洗滌之后，使用FACScalibur流式細(xì)月包4義(BDBiosciences)和CellQuest軟件(BDBiosciences),實(shí)施萸光分析。的實(shí)施方案中，洗滌成熟樹(shù)狀細(xì)胞，并以4x107細(xì)胞/的濃度重懸浮在熱滅活血漿(優(yōu)選自體血漿)和10%葡萄糖中。然后，使用熱滅活血漿和20%DMSO按1:1稀釋細(xì)胞，以在熱滅活血漿中達(dá)到5°/。葡萄糖、1(P/。DMSO的終濃度。在適于冷凍保存的容器中，最終的靶填充成分是1.4xl(^細(xì)胞/0.7ml。然后，將樹(shù)狀細(xì)胞施用給患者或優(yōu)選在-85。C下進(jìn)行冷凍，和優(yōu)選在^150。C下保存在冷凍冰箱(優(yōu)選在干液氮水箱中，以預(yù)防污染)中。然后，將冷凍疫苗運(yùn)輸?shù)接糜谑┯没颊叩呐R床現(xiàn)場(chǎng)(優(yōu)選通過(guò)皮內(nèi)注射)。剛一解凍，無(wú)需進(jìn)一步處理就將疫苗直接施用給患者。其它用于施用的合適制劑，包括含有抗氧劑、緩沖液、抑菌劑和溶質(zhì)(使得制劑與計(jì)劃受體血液等滲)的等滲無(wú)菌注射水溶液，包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、保存劑、免疫激活劑、細(xì)胞因子和佐劑的無(wú)菌水性和非水性懸浮液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將成熟樹(shù)狀細(xì)胞以4xl07細(xì)胞/的終濃度重懸浮在熱滅活血漿的自體血漿和10%葡萄糖中。然后，使用熱滅活的自體血漿和20%DMSO的混合液，將這些細(xì)胞按1:1進(jìn)行稀釋?zhuān)栽诤?%葡萄糖和10%DMSO的熱滅活的自體血漿中達(dá)到終濃度2xl0"田胞/ml。在適于冷凍保存的容器中，最終的飽和制劑是1.4x107細(xì)胞/0.71！11。然后冷凍疫苗，并保存在^150。C的千液氮冰箱中。解凍之后，無(wú)需洗滌和重懸浮，疫苗可用于施用。通過(guò)各種方法，可施用樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，例如但不限于，注射(如，皮下注射、皮內(nèi)注射、靜脈注射、淋巴管灌注、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射、肌肉注射、腹腔內(nèi)注射)、連續(xù)灌輸、植入物的持續(xù)釋放等等。典型地，以每?jī)芍了闹苁┯肈C疫苗?？梢耘c生理可接受的載體、緩沖液、稀釋劑、佐劑、免疫調(diào)節(jié)劑等等一起施用樹(shù)狀細(xì)胞疫苗。優(yōu)選地，所施用的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗是患者自體的，或是HLA配型。施用于個(gè)體的細(xì)胞(如，激活T細(xì)胞或樹(shù)狀細(xì)胞)劑量，是在個(gè)體中隨時(shí)間有效實(shí)現(xiàn)期望的有益治療反應(yīng)、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、或抑制傳染病的有效量。優(yōu)選劑量是約107細(xì)胞。任選地加入生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，以通過(guò)本發(fā)明的DC或活化的T細(xì)胞用于治療。例如，任選地將細(xì)胞與佐劑或例如GM-CSF、IL-12或IL-2的細(xì)胞因子一起施用。#定友#,4'^#炎*應(yīng)成乂##的『勿應(yīng)的義的才法通過(guò)本發(fā)明方法可測(cè)定抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞或培養(yǎng)的T細(xì)胞的免疫原性，其中這些眾所周知的方法包括但不限于下列51Cr釋放裂解分析。比較抗原特異T細(xì)胞對(duì)肽沖擊的51Cr標(biāo)記靶的裂解。"更活性"組合物顯示與時(shí)間有關(guān)的更多的靶裂解。裂解動(dòng)力學(xué)和固定時(shí)點(diǎn)(如，4小時(shí))的裂解綜合指標(biāo)，可用于評(píng)價(jià)性能。Ware,CF等(1983)J.Immunol.131:1312。細(xì)胞因子釋放分析。T細(xì)胞一接觸修飾APC就分泌細(xì)胞因子的類(lèi)型和數(shù)量的分析，是功能活性的測(cè)量。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞因子生產(chǎn)的速率和總量的ELISA或ELISPOT分析，可測(cè)量細(xì)胞因子。Fujihashi,K.等(1993)J.Immunol.Meth.160:181;Tanquay，S.和Killion,JJ.(1994)LymphokineCytokineRes.13:259。體外T細(xì)胞培養(yǎng)。分析本發(fā)明組合物可引起來(lái)自正常供體的T細(xì)胞群體或患者衍生的PBMC的反應(yīng)的能力。在該系統(tǒng)中，測(cè)試所得T細(xì)胞的溶解活性、細(xì)胞因子釋放、多克隆性以及對(duì)抗原表位的雜交反應(yīng)。Parkhurst,MR等(1996)J.Immunol.157:2539。增殖分析。T細(xì)胞會(huì)擴(kuò)大對(duì)反應(yīng)組合物的響應(yīng)。例如，通過(guò)測(cè)量3H-胸腺嘧淀的攝入，可定量監(jiān)測(cè)增殖。Caruso,A等(1997)Cytometry27:71。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。通過(guò)與本發(fā)明組合物一起接種HLA轉(zhuǎn)基因小鼠并且測(cè)定誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的性質(zhì)和量度，可體內(nèi)評(píng)價(jià)免疫原性?；蛘撸ㄟ^(guò)人PBL的過(guò)繼轉(zhuǎn)移，hu-PBL-SCID鼠模型允許在小鼠中重建人免疫系統(tǒng)。如上文所述，可用組合物4妻種這些動(dòng)物，并分析免疫反應(yīng)，參見(jiàn)，Shirai,M等(1995)J.Immunol.154:2733;Mosier，D.E.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2443。靈長(zhǎng)類(lèi)模型?？衫梅侨遂`長(zhǎng)類(lèi)(黑猩猩)模型系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)HLA限制配體的體內(nèi)免疫原性。已經(jīng)證明黑猩猩與人MHC分子一起共有重疊的MHC-配體特異性，因此允許人們檢驗(yàn)HLA-限制配套的體內(nèi)的相對(duì)免疫原性。Bertoni,R.等(1998)J.Immunol.161:4447。監(jiān)測(cè)TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。由MHC-配體復(fù)合物引起的一些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(如，磷酸化)，是與有效的TCR嚙合有關(guān)的。這些事件的定性和定量分析已經(jīng)與組合物通過(guò)TCR嚙合來(lái)激活效應(yīng)細(xì)胞的相對(duì)能力有關(guān)。Salazar,E等(2000)Int.J.Cancer85:829;Isakov，N.等(1995)J.Exp.Med.181:375)。f#岸定^^€勿/《^方法可在一些任何結(jié)構(gòu)中，實(shí)施細(xì)胞分離或用于在細(xì)胞純化中檢測(cè)細(xì)月包的免疫測(cè)定，^口，參見(jiàn)，Maggio(編著)(1980)EnzymeImmunoassayCRCPress,BocaRaton,Fia;Tijan(1985)"PracticeandTheoryofEnzymeImmunoassays,"LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam;Harlow和Lane,supra;Chan(編著)(1987)Immunoassay:APracticalGuideAcademicPress,Orlando,FIa.;Price和Newman(編著)(1991)PrinciplesandPracticeofImmunoassaysStocktonPress,NY;以及Ngo(編著)(1988)Non-isotopicImmunoassaysPlenumPress,NY。通過(guò)所述FACS分析的流式細(xì)胞術(shù)，分離和鑒定細(xì)胞。各種流式細(xì)胞術(shù)是已知的。對(duì)于突光激活的流式細(xì)胞術(shù)的全面概述，例如參見(jiàn)，Abbas等(1991)CellularandMolecularimmunologyW.B.SaundersCompany,具體是第3章；和Kuby(1992)ImmunologyW.H.Freeman和Company,具體是第6章。如，可從BectonDickinson獲得FACS儀器?？捎糜跇?biāo)記細(xì)胞抗原的標(biāo)記試劑，包括但不限于，單克隆抗體、多克隆抗體、蛋白或其它聚合物，例如親和基質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì)。通過(guò)任何已知的方法，例如免疫印跡、蛋白質(zhì)印跡分析、；改射性示蹤或生物發(fā)光標(biāo)記、毛細(xì)管電泳或其它追蹤尺寸、電荷或親合力基礎(chǔ)的方法，進(jìn)4于一全測(cè)。實(shí)施例實(shí)施例1:從日齡分離白細(xì)胞制備樹(shù)狀細(xì)胞通過(guò)分離白細(xì)胞，從4個(gè)人供體收集外周血單核細(xì)胞(PBMC),并通過(guò)過(guò)夜輸送轉(zhuǎn)移到可保持8°C-26°C溫度的溫度監(jiān)控運(yùn)輸容器中的樹(shù)狀細(xì)胞生產(chǎn)設(shè)備.輸送當(dāng)天，在50ml錐形管中，將分離白細(xì)胞的產(chǎn)物在室溫(約19-22。C)下進(jìn)行Ficoll密度梯度離心(800xg)20分鐘，以分離和濃縮包含樹(shù)狀細(xì)胞前體(單核細(xì)胞)的單核細(xì)胞組分。在用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次之后，測(cè)定細(xì)胞濃度和細(xì)胞存活力。在第三次離心/用PBS洗滌步驟之后，將單核細(xì)胞重懸浮于StemSpanH2000培養(yǎng)基中，并以2.0xl08細(xì)胞/燒瓶接種在T150cm2燒瓶中。然后，在37。C、5%C02、>75%濕度下，通過(guò)附著在無(wú)菌組織培養(yǎng)塑料燒瓶，從單核細(xì)胞群體選出單核細(xì)胞。棄去非附著和半附著細(xì)胞(初級(jí)淋巴細(xì)胞)。將主要是單核細(xì)胞的剩余附著細(xì)胞，培養(yǎng)在含有GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)StemSpanTMH2000培養(yǎng)基中。將這些細(xì)胞在3"C、5%C02、>75%濕度下溫育6天，以使得單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞。通過(guò)輕柔輕敲以移動(dòng)細(xì)胞，收集大量的未成熟樹(shù)狀細(xì)胞群體。然后將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管。將額外的PBS加入燒瓶以除去剩余的懸浮細(xì)胞和剩余的培養(yǎng)基，并將PBS加入錐形管中的細(xì)胞懸浮液中。通過(guò)加入PBS，并在2_8°C下將燒瓶溫育約10分鐘，完全分離剩余的附著細(xì)胞。當(dāng)溫育這些細(xì)胞時(shí)，離心錐形管中的細(xì)胞懸浮液，并將細(xì)胞沉淀重懸浮在PBS中。溫育末期，輕拍燒瓶，將內(nèi)含物加入錐形管中的細(xì)胞懸浮液。沉淀所有細(xì)胞懸浮液，并重懸浮在PBS中，根據(jù)細(xì)胞濃度細(xì)胞存活力和免疫分型而除去樣品。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，檢查下列四種細(xì)胞標(biāo)記組單核細(xì)胞系標(biāo)記(CD3、CD14、CD19以及CD56)、樹(shù)狀細(xì)胞存在的指示物(CD11c)、抗原呈遞細(xì)胞標(biāo)記(HLA-DR)以及成熟樹(shù)狀細(xì)胞標(biāo)記(CD83)。富集的未成熟樹(shù)狀細(xì)胞制品，表達(dá)不顯著水平的CD83系標(biāo)記，和表達(dá)高水平的CDllc和HLA-DR。使用OPTI-MEM⑧還原性血清培養(yǎng)基(GIBCC)TM)和HEPES緩沖液、L-谷氨酰胺而非酚紅，將未成熟樹(shù)狀細(xì)胞洗滌一次。然后，^吏用擴(kuò)增腫瘤RNA,通過(guò)以每106樹(shù)狀細(xì)胞約2|agRNA的比例進(jìn)行電穿孔，轉(zhuǎn)染樹(shù)狀細(xì)胞。在含有600(il的細(xì)胞懸浮液(含5xlCT細(xì)胞/ml)的4mm缺口管中，以500V、500ps的脈沖實(shí)施電穿孔。電穿孔后，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T150燒瓶中，該燒瓶含有補(bǔ)充了IL-4(500U/ml)和GM-CSF(800U/ml)的StemSpanH200()TM培養(yǎng)基。在37。C、5%C02、>75%濕度下，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溫育2-3小時(shí)，以使得細(xì)胞從電穿孔復(fù)蘇。在37。C、5%C02、>%濕度下，將未成熟的電穿孔樹(shù)狀細(xì)胞在補(bǔ)充了IL-4(500U/ml)和GM-CSF(800U/ml)以及成熟混合物(5ng/ml的IL隱lj3、150ng/ml的IL-6、5ng/ml的TNF-a以及l(fā)昭/ml的PGE》的StemSpanHM00TM培養(yǎng)基中，進(jìn)行成熟20-24小時(shí)。使用1%HSA，將所有細(xì)胞因子以及PGE2在PBS中重建或稀釋(就PGE2而論)。在稀釋步驟之前，在乙醇中重建PGE2。然后，在加入細(xì)胞消化液(無(wú)胰蛋白酶)之前，用PBS洗滌成熟樹(shù)狀細(xì)胞，然后用PBS洗滌三次以除去細(xì)胞消化液。根據(jù)細(xì)胞濃度、存活力和免疫分型，收集樣品。表1所示比較未成熟和成熟樹(shù)狀細(xì)胞的免疫分型。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>以2xl0"田胞/ml的終濃度，將轉(zhuǎn)染的成熟樹(shù)狀細(xì)胞懸浮在自體血漿中。然后，用80%血漿和20%DMSO的混合液，按l:1稀釋細(xì)胞，以在90%血漿和10%DMSO中達(dá)到終濃度3><106或lxlO"田胞，然后使用控速冷凍法將其冷凍在低溫管中，并保存在S-150。C下。實(shí)施例2:從日齡分離白細(xì)胞的產(chǎn)物所制備的樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，在10%DMSO中解凍后至少2小時(shí)保持有活力。將如實(shí)施例1所述制備的冷凍樹(shù)狀細(xì)胞疫苗在37°C下解凍，并在20-25°C或2-8。C下保持2小時(shí)。解凍后，在30分鐘間隔瞬時(shí)測(cè)定存活力，直至兩小時(shí)。解凍后，在37°C時(shí)的瞬時(shí)存活力是92%。結(jié)果如表2所示，證實(shí)疫苗可在10%DMSO中解凍并保存至少兩小時(shí)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>實(shí)施例3:從患者分離單核細(xì)胞并將單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞室溫下，通過(guò)在臨床現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行分離白細(xì)胞從患者或志愿者收集外周血單核細(xì)胞和血漿。將分離白細(xì)胞的產(chǎn)物(PBMC)和血清，在可維持6-28°C溫度范圍的溫度調(diào)節(jié)容器中進(jìn)行過(guò)夜運(yùn)輸。分離白細(xì)胞的第二天，室溫下通過(guò)Ficoll密度梯度離心，在50ml錐形管中純化PBMC，以分離和濃縮包含單核細(xì)胞(樹(shù)狀細(xì)胞前體)和白細(xì)胞的單核細(xì)胞組分。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，幾次洗滌單核細(xì)胞，并測(cè)定細(xì)胞濃度。在最終離心/用PBS洗滌的步驟后，將單核細(xì)胞重懸浮在AIM-V培養(yǎng)基中，并以2.0xl()S細(xì)胞每瓶播種在T150cm2中。然后，在37°C、5%C02、》75%濕度的條件下，通過(guò)在無(wú)菌組織培養(yǎng)塑料燒瓶中附著1至2小時(shí)，從單核細(xì)胞群體中選擇單核細(xì)胞。通過(guò)用PBS輕柔洗滌，除去非附著和半附著細(xì)胞。將主要是單核細(xì)胞的剩余附著細(xì)胞，培養(yǎng)在含有1000U/mlGM-CSF和1000U/mlIL-4的X-VIVO15培養(yǎng)基中。將細(xì)胞在37。C、5%C02、>75%濕度的條件下溫育6天，使得單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞。體外培養(yǎng)之后，通過(guò)輕敲燒瓶以移動(dòng)細(xì)胞，收集豐富的未成熟樹(shù)狀細(xì)胞群體。將懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管。將PBS加入燒瓶以除去剩余的懸浮細(xì)胞和剩余的培養(yǎng)基，然后將PBS加入相同錐形管中的細(xì)胞懸浮液中。在2-8。C下，通過(guò)在PBS中溫育，促進(jìn)剩余的附著未成熟樹(shù)狀細(xì)胞的分離。溫育末期，輕拍燒瓶，將內(nèi)含物加入相同錐形管中的細(xì)胞懸浮液。然后沉淀所有細(xì)胞懸浮液，并重懸浮在PBS中，除去樣品以測(cè)定細(xì)胞濃度。洗滌未成熟樹(shù)狀細(xì)胞，重懸浮在ViaSpan中，并用2|tig抗原編碼mRNA/10M對(duì)狀細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在含有0.4ml細(xì)胞懸浮液(含4xl0"田胞/ml)的4mm缺口管中，以300V、IOOQ和150)nF的脈沖實(shí)施電穿孔。在電穿孔后，用X-VIV015培養(yǎng)基洗滌轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、離心，并重懸浮在補(bǔ)充了GM-CSF(800U/ml)、IL-4(500U/ml)、IL-1卩(10ng/ml)、IL畫(huà)6(150ng/ml)、TNF-a(10ng/ml)、和PGE2(lpg/ml)的X-VIV015(無(wú)血清)中。在37。C、5%C02、>75%濕度的條件下，過(guò)夜溫育細(xì)胞以促進(jìn)成熟。將轉(zhuǎn)染的成熟樹(shù)狀細(xì)胞以4x107細(xì)胞/的終濃度重懸浮在熱滅活血漿的自體血漿和10%葡萄糖中。使用20%DMSO的混合液，按1:1稀釋細(xì)胞，以在含有10%DMSO和5%葡萄糖的熱滅活的自體血漿中達(dá)到終濃度2xl(^細(xì)胞/ml，然后在"0。C下冷凍在無(wú)菌低溫管中。實(shí)施例4:在6-28。C下，從過(guò)夜溫育的單核細(xì)胞所制備的樹(shù)狀細(xì)胞的物理和功能特征該實(shí)施例的數(shù)據(jù)證實(shí)了從日齡清血(apheresis)產(chǎn)物制備RNA轉(zhuǎn)染的樹(shù)狀細(xì)胞的功能和可行性。通過(guò)實(shí)施例3中描述的方法，制備樹(shù)狀細(xì)胞。下列數(shù)據(jù)顯示，以合適產(chǎn)率從單日齡的清血產(chǎn)物可重復(fù)地制備樹(shù)狀細(xì)胞，并且所得的細(xì)胞是(l)展現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的成熟表型，(2)可有效地被RNA轉(zhuǎn)染，以及(3)用進(jìn)行冷凍保存，并具有解凍后高存活力。DC的免疫表型.成熟DC的大量特征在于最終的細(xì)胞制品中應(yīng)當(dāng)存在或沒(méi)有分子標(biāo)記的FACS染色。HLA-DR、CD83、CD86、CD80、CDla和CD209顯示高表達(dá)，CD14、CD56、CD19以及CD3顯示低表達(dá)。表3(下文)顯示從獲得自不同健康供體的PBMC中制備樹(shù)狀細(xì)胞疫苗的11個(gè)連續(xù)過(guò)程中所編輯的結(jié)果(陽(yáng)性細(xì)胞百分比的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差)。表3:從日齡單核細(xì)胞所制備的DC中，表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>這些數(shù)據(jù)與顯微照片(未顯示)一起說(shuō)明通過(guò)本發(fā)明方法條件所制備的DC，展現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的DC表型和形態(tài)。進(jìn)一步地，比較低的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示該方法的可復(fù)現(xiàn)性。,量、《f和存活力。樹(shù)狀細(xì)胞方法經(jīng)過(guò)了完全測(cè)試，并顯示可重復(fù)產(chǎn)生高質(zhì)量RNA轉(zhuǎn)染的成熟樹(shù)狀細(xì)胞。表4顯示使用作為抗原有效負(fù)載的所有擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞系RNA和作為載體的正常供體樹(shù)狀細(xì)胞，11次疫苗試驗(yàn)的結(jié)果。表4:在11次一致試驗(yàn)中產(chǎn)生的DC疫苗產(chǎn)物的試驗(yàn)結(jié)果概要<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>4這CCW7的成熟iW」脊^Z)C遷移。評(píng)價(jià)除了上述成熟DC標(biāo)記之外的負(fù)責(zé)體內(nèi)DC的淋巴節(jié)遷移的CCR7表達(dá)。在該研究中，將FACS分析和CCR7特異抗體用于檢查解凍的RNA轉(zhuǎn)染的DC,其中所述DC使用工業(yè)規(guī)模的GMP方法進(jìn)行制備(一致試驗(yàn)3、4、6、7、8和10)。結(jié)果如表5所示表5:CCR7+樹(shù)狀細(xì)胞的百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>除了證實(shí)遷移后CCR7對(duì)DC的物理存在之外，通過(guò)使用膠原凝膠基質(zhì)自發(fā)的遷移分析，還證實(shí)DC具有遷移能力，這表明表達(dá)的CCR7也是有功能的(數(shù)據(jù)未公開(kāi))。脊染/w」的dc炎供《處^W邀4'伴。上述實(shí)驗(yàn)顯示，所制備的DC表達(dá)所有的關(guān)鍵共刺激標(biāo)記，而以下實(shí)驗(yàn)說(shuō)明這些分子具有功能的。對(duì)于這個(gè)目的，使用從3種不同供體和來(lái)自各個(gè)供體的預(yù)先冷凍的PBMC中所制備的解凍DC，測(cè)定DC刺激由異?；旌狭馨图?xì)胞(MLR)分析中產(chǎn)生的千擾素Y(IFN-y)的能力。期望結(jié)果是DC不會(huì)刺激由各自的HLA-匹配的自體PBMC所產(chǎn)生的INF-y,但當(dāng)與非自體PBMC混合時(shí)，DC會(huì)進(jìn)行刺激。使用作為讀數(shù)器的ELISPOT(INF-力，測(cè)試所有匹配方式的組合。數(shù)據(jù)如圖2所示。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正如預(yù)期的，只有錯(cuò)配的DC/PBMC組合引起產(chǎn)生INF-y，這是需要功能性MHC和共刺激分子的表達(dá)的性質(zhì)。成,熟z)c^|^##的衫^。在該實(shí)驗(yàn)中，用于使轉(zhuǎn)染后DC成熟和預(yù)冷凍的細(xì)胞因子混合物，含有TNF-a、IL-ip、IL-6和PGE2。為了說(shuō)明成熟DC優(yōu)于未成熟DC，測(cè)定兩種群體的細(xì)胞(來(lái)自相同供體)刺激自體T細(xì)胞產(chǎn)生TH1細(xì)胞因子的能力。用編碼流感基質(zhì)蛋白的RNA轉(zhuǎn)染這兩種DC群體，并用于刺激來(lái)自自體PBMC的流感特異記憶性CTL。以下圖3顯示ELISPOT分析的結(jié)果(#斑點(diǎn)/孔與輸入PBMC有關(guān))。觀測(cè)在未成熟和成熟DC之間的引起從流感特異記憶性t細(xì)胞產(chǎn)生inf-y的非統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，僅僅成熟dc會(huì)引起從這些細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。IL-2誘導(dǎo)被認(rèn)為是非常重要的，因?yàn)?l)誘導(dǎo)的IL-2分泌物可維持自分泌抗原特異性CTL的增殖，和；(2)最近顯示，少量生產(chǎn)的INF-y和IL-2與在HIV患者中和最新研究中增長(zhǎng)的死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，缺乏INF-y或IL-2的分泌物會(huì)導(dǎo)致削弱了T細(xì)胞功能，并無(wú)法維持中樞記憶性反應(yīng)(centmlmemoryresponse)。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，不圖解表示負(fù)調(diào)節(jié)。從PBMC(即，無(wú)DC)單獨(dú)觀測(cè)的斑點(diǎn)的平均數(shù)是9.7(INF-y)和1.3(IL-2)。使用由3個(gè)獨(dú)立供體的PBMC所制備的疫苗，重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，結(jié)果在性質(zhì)上是相同的。因此，與未成熟DC相比成熟DC具有額外的和更優(yōu)越的功能。/^M4脊染^席劣^的DC^€潛定#。當(dāng)臨床方案規(guī)定為剛一解凍就立即注射樹(shù)狀細(xì)胞疫苗時(shí)，意外事故可引發(fā)推遲施用。為了說(shuō)明DC會(huì)保持活力和功能的，如果解凍但不進(jìn)行立即注射，則實(shí)施下列實(shí)驗(yàn)。將相當(dāng)于2種不同健康供體的2種樹(shù)狀細(xì)胞制品中每種的兩管，進(jìn)行解凍。將每個(gè)供體的一個(gè)小管迅速在同種異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Alio-MLR)分析中進(jìn)^^測(cè)試，同時(shí)在通過(guò)相同方法進(jìn)4亍分析之前，使每個(gè)制品的第二個(gè)小管置于室溫40分鐘。用于該實(shí)驗(yàn)的PBMC,包括來(lái)自每個(gè)供體的自體細(xì)胞和來(lái)自與以上兩者無(wú)關(guān)的供體的PBMC的第三種樣品。用于該分析的讀出器是elispot(inf-y)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，并表明在一解凍就進(jìn)行分析的DC與在室溫下保持40分鐘的DC之間，功能上沒(méi)有明顯的差異。除了這項(xiàng)功能分析之外，通過(guò)臺(tái)盼染色排除法(trypandyeexclusion),測(cè)定解凍后和解凍后40分鐘的細(xì)胞存活力，并獲得相同結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。冷疾-席《不參喻DC#處。為了評(píng)價(jià)DC功能是否受到冷凍-解凍過(guò)程的反向影響，比較預(yù)先冷凍和解凍后的DC功能。根據(jù)DC刺激自體PBMC的記憶性流感特殊響應(yīng)的能力，以評(píng)價(jià)功能，其中所述流感特殊響應(yīng)與降低用于轉(zhuǎn)染的流感mRNA濃度有關(guān)。分析的讀出器是ELISPOT(INF-y)。在這次分析中，結(jié)果如以下圖5所示，表明冷凍-解凍過(guò)程對(duì)DC功能沒(méi)有影響?；旌螱FPmRNA的恒定量(0.5)iig),以監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染率。冷凍24小時(shí)后，將解凍后的樣品進(jìn)行解凍。炎^7m7M^g,/乙Z)C^^蛋^4^t。作為第一步驟，我們?cè)u(píng)價(jià)使用mRNA轉(zhuǎn)染DC，是否導(dǎo)致編碼蛋白的mRNA的適量表達(dá)。為了制備DC，通過(guò)從健康志愿者中分離白細(xì)胞而獲得的PBMC(新鮮或冷凍的)，富集體外溫育2小時(shí)后附著在塑料燒瓶上的單核細(xì)胞。洗滌之后，將附著細(xì)胞在補(bǔ)充了重組粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(rGM-CS)和白細(xì)胞介素-4(rlL-4)的X-VIVO15培養(yǎng)基中，培養(yǎng)六天以生成未成熟DC(iDC)。然后，使用編碼病毒或?qū)φ盏鞍椎腞NA進(jìn)行電穿孔lDC(300、150nF、IOOQ)，并在補(bǔ)充了IL-1卩、IL-4、IL-6、GM-CSF、TNF-a和前列腺素E2(PGE2)的X-VIVO15培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成熟24小時(shí)。為了測(cè)試轉(zhuǎn)染后的蛋白表達(dá)，使用編碼綠色焚光蛋白(GFP)的RNA進(jìn)行電穿孔DC,并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量表達(dá)。如圖6所示，轉(zhuǎn)染后直至四天，從日齡單核細(xì)胞所制備成熟DC的大量組分，都表達(dá)高水平的GFP，這證實(shí)這種方法可有效地長(zhǎng)期促進(jìn)DC中的蛋白表達(dá)。其次，測(cè)定自體DC在來(lái)自CMV感染個(gè)體的PBMC中可誘導(dǎo)CD4和CD8T細(xì)胞反應(yīng)的能力，其中所述自體DC通過(guò)編碼CMVpp65蛋白的mRNA進(jìn)行電穿孔而被轉(zhuǎn)染。通過(guò)使用充分限定的、衍生于pp65蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)肽(immunodominantpeptide)以刺激來(lái)自一些供血者的PBMC,并測(cè)量IL-2/IFN-Y分泌物以及測(cè)量CD8和CD8T細(xì)胞中的細(xì)胞增殖，鑒定CMV感染的個(gè)體。檢測(cè)是陽(yáng)性CMV特異性T細(xì)胞反應(yīng)的個(gè)體，并選出知情同意后贊同進(jìn)行白細(xì)胞分離術(shù)的人員以進(jìn)一步研究。如上所述，從這些個(gè)體制備DC。然后，將通過(guò)編碼CMVpp65蛋白的RNA所轉(zhuǎn)染的成熟DC,與自體PBMC按1/40比例溫育16小時(shí)(ICS)或6天(增殖)。刺激后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，評(píng)價(jià)IL-2和IFN-y分泌物(圖7)和CMV特異性CD4和CD8T細(xì)胞的增殖(圖8)。通過(guò)CMVpp65RNA進(jìn)行電穿孔的DC,可誘導(dǎo)IFN-y和IL-2的高度表達(dá)，以及誘導(dǎo)來(lái)自CMV感染個(gè)體的CD8T細(xì)胞的增殖。然而，在CD4T細(xì)胞中所檢測(cè)的低水平細(xì)胞因子分泌物和增殖所示(圖7和圖8,下組)，這種方法可誘導(dǎo)CD4T細(xì)胞的最小限度的激活。實(shí)施例5:使用500U/ml或1000U/ml的IL-4,比較單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞洗滌來(lái)自在6-28。C下保持的日齡分離白細(xì)胞的PBMC,并以@~2xl0"燒瓶在AIM-V培養(yǎng)基中種植2小時(shí)的附著步驟。2小時(shí)后，除去非附著細(xì)胞，洗滌附著細(xì)胞并重懸浮在補(bǔ)充了1000U/mlGM-CSF和500U/ml或1000U/mlIL-4的X-VIVO15中，在37。C下溫育6天。另外，對(duì)于在補(bǔ)充了lOOOU/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的X-VFVO15中的培養(yǎng)，與培養(yǎng)6天而不改變培養(yǎng)基相比，比較在第3天改變培養(yǎng)基的效果。具體地說(shuō)，在第3天，除去培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞；用X-VIVO培養(yǎng)基輕柔洗滌燒瓶，以收集松軟的附著細(xì)胞；以及將培養(yǎng)基和洗滌物以1300rpm離心8分鐘，以沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞重懸浮在補(bǔ)充了lOOOU/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的新鮮X-VIVO15培養(yǎng)基中；將培養(yǎng)基和細(xì)胞回加到還含有附著細(xì)胞的燒瓶中；以及將燒瓶在37°C下進(jìn)一步溫育三天。分別收集用于電穿孔的所有燒瓶。在第6天，用2貼GFPmRNA/106細(xì)胞(20)tigGFPmRNA/5xl06細(xì)胞)轉(zhuǎn)染DC,重懸浮在補(bǔ)充了800U/mlGM-CSF和500U/mlIL-4的X-VIVO15中并以lxl06/ml進(jìn)4亍接種；以及用細(xì)胞因子混合物(TNFa-10ng/ml;IL-l卩-10ng/ml;IL-6-100ng/ml;PGE2-l|ag/ml)進(jìn)行成熟。在37。C、5%C02下過(guò)夜溫育DC。在第6天(未成熟DC;圖9)和轉(zhuǎn)染后24小時(shí)(成熟DC;圖IO)，進(jìn)行表型鑒定。表6A-C顯示，各個(gè)培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)染后立即和轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的產(chǎn)率(。/。Rec)和存活力(％V)。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>白蛋白血清(HSA,BaxterHealthcare,Westlake，CA)力口入4L的Hank'平衡鹽溶液(HBSS,CambrexBioScience,Walkersville,MD)袋中，以制備淘析緩沖液。將該淘析緩沖液加入等于清血(pheresis)體積的日齡清血產(chǎn)物中。用淘析緩沖液灌注Elutra細(xì)胞分離系統(tǒng)(GambroBCT,Lakewood,CO),并裝載清血產(chǎn)物。實(shí)施淘析過(guò)程之后，從轉(zhuǎn)出的組分收集單核細(xì)胞。冷凍保存單核細(xì)胞。解凍已冷凍陶析的單核細(xì)胞，然后在燒瓶中，以1百萬(wàn)細(xì)胞/ml在具有800U/mlGM畫(huà)CSF(BerlexLaboratories,Richmond,CA)和500U/mlIL-4(RDSystems,Minneapolis,MN)的X-VIVO15中，進(jìn)行分化5天以產(chǎn)生未成熟樹(shù)狀細(xì)胞(iDC)。收集iDC,并通過(guò)電穿孔法，用擴(kuò)增的RCC腫瘤RNA來(lái)負(fù)載抗原。用800U/mlGM-CSF、500U/mlIL-4以及成熟細(xì)胞因子(TNF-ouIL-1|3、IL-6以及PGE》來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，并在培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行收集。使用臺(tái)盼藍(lán)排除法，通過(guò)ViCell(BeckmanCoulterInc.,Fullerton，CA)測(cè)定成熟樹(shù)狀細(xì)胞(mDC)的細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活力。將所得的mDC進(jìn)行表型鑒定。燒瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞是99%CD83+和0.2%CD14+。在燒瓶中，所培養(yǎng)mDC的產(chǎn)量是34%的CD14+細(xì)胞。實(shí)施例7:比較通過(guò)新鮮細(xì)胞和通過(guò)日齡白細(xì)胞分離術(shù)所制備的DC的共刺激分子的表達(dá)在白細(xì)胞分離術(shù)分離的第3天，從3個(gè)健康人供體收集周?chē)?，并在收集?0分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移到蒙特利爾大學(xué)(UniversityofMontreal)。除去20ml白細(xì)胞分離物，并通過(guò)離心制備自體血漿。將白細(xì)胞分離物體積分成兩個(gè)相等部分。立即處理一部份，以生成"新鮮"單核細(xì)胞，而將第二部份以20ml等分量保存在5個(gè)50ml錐形管中，以產(chǎn)生來(lái)自"日齡清血法，，的細(xì)胞。將試管置于傾斜于震動(dòng)臺(tái)(rockingplatform)的盒中的塑料容器中，于16-20°C下保存24小時(shí)。溫育期后，使用Ficoll密度梯度，分離PBMC。使用Ficoll密度梯度，從新鮮和日齡清血產(chǎn)物，分離包含樹(shù)狀細(xì)胞前體(單核細(xì)胞)的單核細(xì)胞組分。在50錐形管中，在Ficoll上分層白細(xì)胞分離物，并在室溫下將管離心(800xg)20分鐘。在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)四次洗滌細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)以測(cè)定細(xì)胞濃度和細(xì)胞存活力。為了獲得高純度單核細(xì)胞群體，使用CD14微珠(Miltenyi)進(jìn)一步純化單核細(xì)胞組分。將1x109細(xì)胞重懸浮在8ml含有PBS、0.5%BSA以及2mMEDTA(Miltenyi緩沖液)的緩沖液中。將2ml的CD14微珠加入含有1x109細(xì)胞的各個(gè)50ml管，并在4。C下溫育15分鐘。在100ml相同緩沖液中洗滌細(xì)胞，以300xg離心并重懸浮在20mlMiltenyi緩沖液中。將細(xì)胞懸浮液施加到位于》茲場(chǎng)下的四個(gè)LS柱(MiltenyiQuadromaxTM)。F利用重力流而施加細(xì)胞后，用3mlMiltenyi緩沖液將柱洗滌三次。在沒(méi)有磁場(chǎng)下，用5mlMiltenyi緩沖液將單核細(xì)胞洗脫兩次，并以300xg離心10分鐘。使用特異于CD3、CD19、CD16、CD56、CD14以及CD209的抗體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定洗脫物和流過(guò)組分的純度。洗脫物組分包含88-98%單核細(xì)胞和小于2%的小細(xì)胞。非附著組分僅僅包含小百分率(2%)的單核細(xì)胞。在這時(shí)候，從一部分純化的單核細(xì)胞(50百萬(wàn))提取總RNA。為了制備成熟的分化DC，在37°C下，將50百萬(wàn)單核細(xì)胞在含有IL-4和GM-CSF的X-VIVO培養(yǎng)基的T150cm2燒瓶中接種5天。在第5天，將含有腫瘤壞死因子、干擾素y和前列腺素e2的細(xì)胞因子混合物(TIP)加入細(xì)胞中。收集培養(yǎng)第6天的細(xì)胞，并將此時(shí)的細(xì)胞命名為"TIP-DC"。通過(guò)輕敲燒瓶以移動(dòng)細(xì)胞，收集富含樹(shù)狀細(xì)胞的群體，用另外的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行洗滌，并通過(guò)在PBS中于2-8。C下溫育約10分鐘，來(lái)分離剩余的附著細(xì)胞。沉淀所有細(xì)胞懸浮液，并重懸浮在PBS中，分析細(xì)胞濃度、細(xì)胞存活力和免疫分型。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，檢查下列細(xì)胞標(biāo)記組單核細(xì)胞系標(biāo)記(CD3、CD14、CD19、CD16以及CD56)、樹(shù)狀細(xì)胞存在的指示物(CDllc、CDla和CD209)、抗原呈遞細(xì)胞標(biāo)記(HLA-II)、遷移標(biāo)記(CD38和CCR7)以及成熟樹(shù)狀細(xì)胞標(biāo)記(CD83和CD86)。將20百萬(wàn)TIP-DC重懸浮在600|iil的ViaSpan中，并用CD40LRNA以4|iigRNA/百萬(wàn)樹(shù)狀細(xì)胞的比例進(jìn)行電穿孔。在4mm缺口試管中，以300V、300ps的脈沖實(shí)施電穿孔。電穿孔后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有補(bǔ)充了IL-4和GM-CSF的X-VIVO培養(yǎng)基(無(wú)血清培養(yǎng)基)的T75燒瓶中。在3C、5%C02、>75%濕度下，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞溫育4小時(shí)，使得細(xì)胞從電穿孔復(fù)蘇。此后，使細(xì)胞進(jìn)一步成熟，并將其命名為"PME-CD40LDC"。從所生成的PME-CD40LDC的部分中，分離RNA。使用調(diào)速冷凍法(controlled-mtefreezing),將PME-CD40LDC冷凍在具有10。/。DMSO和90%自體血漿的冷凍管中，并保存在-85。C下。將如上所述制備的冷凍樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，在37。C下進(jìn)行解凍，并在20-25。C下保持30分鐘。解凍后，立即以10分鐘間隔測(cè)定存活力，直至30分鐘。使用特異于下列標(biāo)記的抗體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查解凍后的PME-CD40LDC:單核細(xì)胞系標(biāo)記(CD14)、樹(shù)狀細(xì)胞標(biāo)記(CD1lc、CDla和CD209)、抗原呈遞細(xì)胞標(biāo)記(HLA-II)、遷移標(biāo)記(CD38和CCR7)以及成熟樹(shù)狀細(xì)胞標(biāo)記(CD80、CD83和CD86)。結(jié)果來(lái)自三個(gè)供體的數(shù)據(jù)表明使用CD14微珠的正選擇，得到88-98%純度的單核細(xì)胞群體(表7)。小細(xì)胞污染的最大量是2%(表7)。在所有三個(gè)供體中，非附著(流動(dòng))組分含有直至2%單核細(xì)胞(大量細(xì)胞)(數(shù)據(jù)未公開(kāi))。因此，在非附著組分中沒(méi)有顯著的單核細(xì)胞損失。作為高CD3表達(dá)和低CD19、16或56標(biāo)記表達(dá)的證據(jù)，洗脫物中存在的小細(xì)胞群體污染，主要由T細(xì)胞組成。在新鮮和日齡白細(xì)胞分離物之間的洗脫物組分中，CD83、CD86、CD11C、HLA-I或HLA-II標(biāo)記的表達(dá)中沒(méi)有明顯的差異。表7:單核細(xì)胞匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>單核細(xì)胞在最初是很純的(90%),并且在分化過(guò)程中純度進(jìn)一步得到提高，例如在來(lái)自所有三個(gè)供體的TIP-DC中，大細(xì)胞百分率是98-99%,因此，小細(xì)胞百分率低于2%(數(shù)據(jù)未公開(kāi))。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析TIP-DC表型，顯示在由新鮮白細(xì)胞分離物和日齡白細(xì)胞分離物所生成的TIP-DC之間，CD83表達(dá)存在差異。陽(yáng)性細(xì)胞百分率涉及用于研究中的標(biāo)記的細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)目。在來(lái)自所有3個(gè)供體的、從新鮮白細(xì)胞分離物所制備的TIP-DC中，表達(dá)表面成熟標(biāo)記CD83的DC百分率，低于來(lái)自日齡白細(xì)胞分離物所制備的TIP-DC的表達(dá)率(表8)。在來(lái)自TIP-DC的任何其它標(biāo)記中，沒(méi)有其它差異，其中通過(guò)新鮮白細(xì)胞分離物和日齡白細(xì)胞分離物可產(chǎn)生TIP-DC。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>DGS轉(zhuǎn)染后4小時(shí)對(duì)于轉(zhuǎn)染后的DC(PME-CD40LDC),分析轉(zhuǎn)染后四小時(shí)內(nèi)CD154(CD40L)的表達(dá)。與通過(guò)新鮮白細(xì)胞分離物所生成的PME-CD40LDC相比，在轉(zhuǎn)染后l、2和4小時(shí)的供體中，來(lái)自日齡白細(xì)胞分離物的PME-CD40LDC表達(dá)更多的CD40L(表9)。在通過(guò)供體1和供體2中的新鮮分離物和日齡分離物所生成的PME-CD40LDC之間，平均熒光強(qiáng)度(MFI)也存在差異(表9)。解凍后的PME-CD40LDC解凍后，分析PME-CD40LDC對(duì)各種DC標(biāo)記的表達(dá)。在解凍后的、由新鮮白細(xì)胞分離物和日齡白細(xì)胞分離物所生成的PME-CD40LDC表型中，存在差異。與通過(guò)日齡白細(xì)胞分離物所制備的DC相比，在通過(guò)新鮮白細(xì)胞分離物所制備的PME-CD40LDC中，CD40L表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度更低。低于通過(guò)新鮮白細(xì)胞分離i所生成DC^的轉(zhuǎn)染率(表9)。"表9:PME-CD40LDC中的CD154表達(dá)匯總<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)量的陽(yáng)性細(xì)胞百分率，顯示在三個(gè)實(shí)例的兩個(gè)中，在通過(guò)白細(xì)胞分離物的日齡部分所生成的樹(shù)狀細(xì)胞中，更多的細(xì)胞被CD83抗體染色成陽(yáng)性(表IO)。<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>當(dāng)CD80、CD83和CD86的陽(yáng)性細(xì)胞百分率中的差異不一定高于通過(guò)日齡白細(xì)胞分離物(供體3，表10)所生成DC中的百分率時(shí)，在所有供體中，通過(guò)用特異抗體染色的日齡白細(xì)胞分離物所生成的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度是更高的。除了CD80、CD86和CD83之外，HLA-I和HLA-II顯示相同的結(jié)果(表11)。在成熟DC中，上調(diào)了與高蛋白水平表達(dá)/細(xì)胞和CD80、CD83、CD86、HLA-I以及HLA-II分子的表達(dá)相關(guān)的平均熒光強(qiáng)度信號(hào)。因此，這些細(xì)胞的表型反映了從所有三個(gè)供體中的日齡部分所獲得樹(shù)狀細(xì)胞的更多成熟狀態(tài)。這些變化反映DC的成熟狀態(tài)。將測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞百分率所獲得的數(shù)據(jù)聯(lián)合平均萸光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)，使得我們斷定從白細(xì)胞分離物的日齡部分所生成的細(xì)胞可展現(xiàn)更多的成熟表型。表11:解凍后PME-CD40LDC的MFI<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>實(shí)施例8:在新鮮與日齡單核細(xì)胞中的基因表達(dá)的^f效陣列分析，及從中制備的樹(shù)狀細(xì)胞才艮據(jù)制造商的i兌明書(shū)(GenechipExpressionAnalysisTechnicalManual,2004)，將如實(shí)施例8所述新鮮的和日齡的單核細(xì)胞(在分離白細(xì)胞后，已將單核細(xì)胞在16-20。C下溫育24小時(shí))的RNA樣品，以及從新鮮的和日齡的單核細(xì)胞所制備的DC的RNA,應(yīng)用于HumanGenomeU133Plus2.0陣歹'J(Affymetrix,SantaClara,力。利福尼亞)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶，將3孩i克的總RNA標(biāo)準(zhǔn)品和GenechipPoly-ARNAControlKit(Affymetrix,SantaClara,力口利福尼亞州)轉(zhuǎn)錄成第一條cDNA鏈。合成第二條cDNA鏈后，隨即體外轉(zhuǎn)錄以用于線性擴(kuò)增各個(gè)轉(zhuǎn)錄物和摻入生物素化CTP和UTP。將cRNA產(chǎn)物破碎成約100核苷酸的片段，并將其在微陣列上雜交16小時(shí)。然后，將微陣列在低嚴(yán)謹(jǐn)條件(6xSSPE)和高嚴(yán)謹(jǐn)條件(lOOmMMES,0.1MNaCl)下進(jìn)行洗滌，并用鏈霉親和素-藻紅蛋白進(jìn)行染色。通過(guò)添加生物素化的抗鏈霉親和素和額外等分量的鏈霉親和素-藻紅蛋白染料，以放大熒光。在"0nm激發(fā)后，將GenechipScanner3000(Affymetnx，SantaClara,加利福尼亞州)用于收集3)im分辨率的熒光信號(hào)。對(duì)于各個(gè)微陣列特征，計(jì)算兩個(gè)連續(xù)掃描的平均信號(hào)。用GenechipROperatingSoftwarevl.l(Affymetrix,SantaClara,力口利坤畐尼亞)，分析掃描圖^象。將Poly-ARNAControlKit(Affymetrix,SantaClam，加利福尼亞)中包含的4種對(duì)照RNA的高線性相關(guān)，確認(rèn)是保證標(biāo)記過(guò)程的成功。將所有性質(zhì)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)程序Genespring中，并根據(jù)樣品類(lèi)型(即單核細(xì)胞樣品對(duì)單核細(xì)胞，樹(shù)狀細(xì)胞樣品對(duì)樹(shù)狀細(xì)胞)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。4艮據(jù)用于Affymetrix陣列的GeneSpring所建議的標(biāo)準(zhǔn)方法，以正常步驟實(shí)施三個(gè)步驟。4)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換(將所有小于0.01的值設(shè)定為0.01);5)將第50百分位數(shù)正態(tài)化。6)將中值正態(tài)化。首先過(guò)濾具有空斑點(diǎn)的標(biāo)志的數(shù)據(jù)。然后，不使用隨機(jī)預(yù)測(cè)模型，通過(guò)置信水平范圍在p.05或p.l的單向方差分析(onewayanova),進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。然后，分析過(guò)濾基因(filteredgene)表的任一倍數(shù)變化、表達(dá)水平或置信度。使用正常水平的樣品或單個(gè)樣品，實(shí)施如上操作。在變量分析之前或之后，比較新鮮的和日齡的單核細(xì)胞或樹(shù)狀細(xì)胞中的表達(dá)水平。相互比較基因表，并在一些基因表中根據(jù)它們的可信度細(xì)胞中與從新鮮單核細(xì)胞所制備的樹(shù)狀細(xì)胞中的變化的RNA穩(wěn)定狀態(tài)水平的基因。表12B中列出了這些基因的說(shuō)明。表13A中列出了具有日齡單核細(xì)胞中與新鮮單核細(xì)胞中的變化的RNA穩(wěn)定狀態(tài)水平的基因。表13B中列出了這些基因的說(shuō)明。這些結(jié)果說(shuō)明新鮮單核細(xì)胞表型上不同于日齡單核細(xì)胞，而且從新鮮單核細(xì)胞所制備的樹(shù)狀細(xì)表12A:與從新鮮單核細(xì)胞所制備的樹(shù)狀細(xì)胞相比，具有從曰齡單核細(xì)胞所制備的樹(shù)狀細(xì)胞中的變化的RNA穩(wěn)定狀態(tài)水平的基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表12B:表12A中列出的基因說(shuō)明<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>PKIB蛋白激酶(cAMP依賴(lài)型的催化反應(yīng))抑制子P蛋白激酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)PTGER3前列腺素E受體3(亞型EP3)轉(zhuǎn)錄，DNA依賴(lài)型，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞死亡，G蛋白偶合受體蛋白信號(hào)途徑CAMTA1鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活蛋白1WNF受體信號(hào)途徑PLS3絲素蛋白(T同型)肌動(dòng)蛋白結(jié)合鈣離子結(jié)合肌動(dòng)蛋白結(jié)合TREM1在骨髓細(xì)胞1上表達(dá)的觸發(fā)受體體液免疫反應(yīng)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)耳關(guān)TMEPAIRNA誘導(dǎo)的跨膜前列腺和雄激素整合膜CHI3L1幾丁質(zhì)酶-3-樣l(軟骨糖蛋白-39)碳水化合物代謝幾丁質(zhì)分解表13A:與新鮮單核細(xì)胞相比，具有日齡單核細(xì)胞中的變化的RNA穩(wěn)定狀態(tài)水平的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>將表達(dá)兩個(gè)持家基因的樹(shù)狀細(xì)胞基因進(jìn)行進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化處理，其中所述持家基因在通過(guò)新鮮的和日齡的單核細(xì)胞所制備的DC之間是保持恒定的。將各個(gè)基因的平均表達(dá)量(標(biāo)準(zhǔn))除以GAPDH(甘油醛-3磷酸脫氫酶)或(3-肌動(dòng)蛋白的平均表達(dá)量(標(biāo)準(zhǔn))，以得到持家基因有關(guān)的表達(dá)比值。六種基因的結(jié)果如表14所示。"DCdo"指從日齡單核細(xì)胞所制備的DC。"DCf'指從新鮮單核細(xì)胞所制備的DC。表14:在通過(guò)日齡或新鮮的單核細(xì)胞所制備的DC中，某些RNA對(duì)GAPDH或P-肌動(dòng)蛋白的RNA穩(wěn)定狀態(tài)表達(dá)比值。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>迄今為止，使用表15所示的引物并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)，實(shí)施額外地檢驗(yàn)兩個(gè)候選基因的單核細(xì)胞中的差異表達(dá)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(Invitrogen,Carlsbad,加利福尼亞)，使用寡聚(dT)引物和用于RT-PCR的SuperscriptIIIFirst-strandSynthesisSystem,從各種總RNA(與用于GeneChip分析的相同)生成第一cDNA鏈。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(ABIPrism7900HTSequenceDetectionSystemUserGuide),使用ABIPrism⑧7900HTSequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,力口利福尼亞)以實(shí)施QPCR。將TaqManGeneExpressionAssays或CustomTaqManGeneExpression(AppliedBiosystems,Foster,加利福尼亞)作為T(mén)aqMan⑧探針。使用ABsoluteQPCRROXMix(ABgene，Surrey,英國(guó))，實(shí)施三次PCR反應(yīng)。使用如ABIPrism7700SequenceDetectionSystemUserBulletin#2(AppliedBiosystems,FosterCity,力卩利福尼亞)中所述相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，進(jìn)行相對(duì)cDNA濃度的定量。將Genechip分析中具有各種基因最大表達(dá)量的一種cDNA，用于生成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。顯示所有數(shù)據(jù)與內(nèi)部GAPDH的表達(dá)有關(guān)。證明在新鮮和日齡的單核細(xì)胞中的APAF-I和CDCA2效應(yīng)蛋白，相對(duì)于GAPDH分別減少了至少2.5倍和3倍。表15:引物<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>實(shí)施例10:比較通過(guò)從供體分離后在室溫下溫育23、48或71小時(shí)的PBMC所制備的一對(duì)狀細(xì)胞方法過(guò)夜運(yùn)輸后，接受來(lái)自兩個(gè)供體的"健康供體"白細(xì)胞分離產(chǎn)物。在如下所示的分離收集后的給定時(shí)間中，對(duì)用于生成DC的約三分之一的各種產(chǎn)物進(jìn)行加工。在進(jìn)行如下所述Ficoll-淋巴細(xì)胞分離液(Hist叩aque)密度梯度離心和附著步驟之前，將白細(xì)胞分離產(chǎn)物(即PBMC)在室溫下溫育23、48或71小時(shí)。室溫溫育期之后，測(cè)定PBMC的存活力和B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及NK細(xì)胞的百分比。結(jié)果如表16所示。表16:鑒定第O天培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)物<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>通過(guò)Ficoll-淋巴細(xì)胞分離液密度離心制備PBMC,并在PBS中于室溫洗滌四次。將2xl08PBMC重懸浮在30ml的AIM-V培養(yǎng)基(Invitrogen)中，并在37°C下使其附著于150cn^的塑料燒瓶。除去非附著細(xì)胞，將剩余細(xì)胞在補(bǔ)充了1000U/ml的GM-CSF(Leukine)和1000U/ml的IL-4(R&D系統(tǒng))的X-VIV015培養(yǎng)基中，于37。C、5%C02下培養(yǎng)5天。最初，通過(guò)添加TNF-a(10ng/ml)、IFN-Y(1000U/ml)和PGE2(l昭/ml)，使未成熟DC成熟。過(guò)夜培養(yǎng)后通過(guò)除去培養(yǎng)基并用冰PBS洗滌，以收集TIP-DC中間產(chǎn)物。鑒定TIP-DC表型，證實(shí)了細(xì)胞成熟種群的生成。為了生成抗原負(fù)載、使DC完全成熟，電穿孔TIP-DC:將細(xì)胞以4x107/ml濃度重懸浮在0.5ml的冰Viaspan中，并置于冰上。使用l貼/106細(xì)胞的擴(kuò)大總腫瘤腎細(xì)胞癌mRNA(作為編碼抗原的有效負(fù)載)，加上4嗎/106的CD40LmRNA,以混合DC，并置于4mm缺口的電穿孔管中，隨后使用BioradGenePulsarXcell系統(tǒng)進(jìn)行電穿孔。電穿孔后，立即將DC在X-VIVO15培養(yǎng)基中洗滌，最后以1x106/ml濃度重懸浮在補(bǔ)充了GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)的20mlX-VrV015中，并在低附著性T75燒瓶中于37°C培養(yǎng)4小時(shí)。使用如制造商所述硤化丙咬和CalTag計(jì)數(shù)微珠，測(cè)定細(xì)胞數(shù)和存活力。將Ficoll梯度離心后的PBMC樣品、第6天的TIP-DC、電穿孔和培養(yǎng)(PME-CD々0LDC)4小時(shí)后回收的DC，以及解凍后的最終產(chǎn)物，都進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活力分析。結(jié)果如表17所示。表17:PME-CD40LDC的生成中，DC的回收率和產(chǎn)量.<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>所有抗體都來(lái)自BDBiosciences,并根據(jù)制造商建議的稀釋度進(jìn)行使用。PBMC:使用CD19-PE、CD14-PE和CD3-PE中的各種，染色3xl()S細(xì)胞，或者通過(guò)在抗體中于4°C溫育30分鐘，來(lái)匹配同型偶聯(lián)的對(duì)照。溫育后，在冰1%FBS/PBS中3次洗滌染色細(xì)胞，并重懸浮PBS中，然后使用CellQuest軟件(BDBiosciences),通過(guò)FACScalibur流式細(xì)胞^義(BDBiosciences)進(jìn)行熒光分析。在纟果測(cè)前3分鐘，將-典化丙啶(l貼/ml)加入各個(gè)樣品，以作為用于指示存活力目的的著色劑。DC:將lx106細(xì)胞(TIP-DC和PME-CD40LDC)重懸浮在冰PBS/1%FBS中。使用lxl0V孔的DC,混合偶聯(lián)了MHC分子(HLA-ABC、HLA-DR)的特異抗體的PE或FITC、或者混合共刺激分子(CD80、CD86)、或混合成熟標(biāo)記(CD83)以及單核細(xì)胞標(biāo)記/DC系標(biāo)記(CD14、CD209),并在4°C下溫育至少l5分鐘。將同型匹配抗體作為對(duì)照。徹底洗滌后，將細(xì)胞進(jìn)4亍如上所述流式細(xì)月包術(shù)。如下所示測(cè)定月包內(nèi)CD40L:將2xl05的PME-CD40LDC重懸浮在250)ti1的Cytofix/Cytoperm溶液(BDBiosciences)中，并置于4°C最短10分鐘、最長(zhǎng)2小時(shí)。用2ml染色緩沖液(PBS、BSA、NaN3以及EDTA)兩次洗滌細(xì)胞，重懸浮在0.5ml染色緩沖液中并于4°C過(guò)夜保存。將細(xì)胞在2.0mlPerm/洗液(BDBiosciences)中重懸浮15分鐘，離心并重懸浮在lOOpl的Perm/洗液中。將20^1鼠抗人CD40LAPC或鼠IgGlAPC加入各個(gè)DC制品，并在黑暗中于4°C溫育30分鐘。用1ml的Perm/洗液兩次洗滌細(xì)胞，并在進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析之前重懸浮在染色緩沖液中。結(jié)果如表18所示。表18:中間TIP-DC和最終PME-CD40LDC產(chǎn)物的表型<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>應(yīng)當(dāng)理解的是，本文中描述的具體實(shí)施方案是用于舉例說(shuō)明而非限制本發(fā)明。各種實(shí)施方案可使用本發(fā)明的主要特征而不脫離本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)可或能確定使用許多不超過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)的、本文所述具體方法的等效方法。所述等效方法被認(rèn)為是落入本發(fā)明范圍內(nèi)，并被權(quán)利要求所覆蓋。說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)，可指導(dǎo)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技能水平。以達(dá)到與引入被具體和分別說(shuō)明的各種單個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)作為參考的相同程度，將所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)以及特別是其相關(guān)部分引入本文以作為參考。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)而不需要過(guò)多的實(shí)驗(yàn)，可獲得和實(shí)施本文中所公開(kāi)合物和/或方法。當(dāng)根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案來(lái)描迷本發(fā)明的組合物和方法時(shí)，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是可改變本文所述組合物和/或方法以及方法中的步驟或步驟順序，而不脫離本發(fā)明的原理、精神和范圍。更具體地說(shuō)，當(dāng)能達(dá)到相同或相似的結(jié)果時(shí)，化學(xué)和生理上都相關(guān)的一些試劑顯然可取代本文中所述試劑。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，如附屬權(quán)利要求所限定的，所有這些相似的替代方式和修飾，被認(rèn)為落在本發(fā)明的精神、范圍和原理中。表16中來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明，來(lái)自患者的分離白細(xì)胞產(chǎn)物，靜置直至72小時(shí)后可產(chǎn)生高活力的群體，并且在回收的白細(xì)胞亞組沒(méi)有顯著的偏差。盡管使用分離產(chǎn)物的DC總回收率在延長(zhǎng)的周期中的確下降(表17)，使用PBMC在每個(gè)時(shí)點(diǎn)接種燒瓶、并培養(yǎng)以生成成熟DC(TIP-DC),可獲得高頻率的活細(xì)胞。然而，通過(guò)用所有擴(kuò)增的腫瘤RNA和CD40LRNA,可生成用于進(jìn)一步加工的充足DC。最重要的，表17和表18表明從各種起始產(chǎn)物所生成的TIP-DC進(jìn)行了相同的電穿孔，并且和具有完全成熟為最終產(chǎn)物PME-CD40LDC的相同回收率。從該研究所生成的PME-CD40LDC，可制成"疫苗"，并可進(jìn)行冷凍和解凍而不出現(xiàn)DC制品的任何變質(zhì)?？傊占笾敝?2小時(shí)，分離白細(xì)胞產(chǎn)物是用于統(tǒng)一生產(chǎn)門(mén)診中所用DC疫苗的活性原料。權(quán)利要求1.一種用于從單核細(xì)胞制備樹(shù)狀細(xì)胞的方法，所述方法包括b.提供從分離自個(gè)體起已在1℃-34℃溫育約6至96小時(shí)周期的單核細(xì)胞；和；c.誘導(dǎo)所述單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。2.權(quán)利要求l中所述方法，其中單核細(xì)胞是人單核細(xì)胞。3.權(quán)利要求l中所述方法，其中溫育溫度是6。C-28。C。4.權(quán)利要求4中所述方法，其中溫育溫度是8°C-26°C。5.權(quán)利要求l中所述方法，其中溫育周期是8至48小時(shí)。6.權(quán)利要求5中所述方法，其中溫育周期是10至30小時(shí)。7.權(quán)利要求l中所述方法，其中溫育周期是26至72小時(shí)。8.權(quán)利要求l中所述方法，其中溫育周期是48至80小時(shí)。9.權(quán)利要求1中所述方法，其中通過(guò)將單核細(xì)胞接觸包含可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成未成熟樹(shù)狀細(xì)胞的有效量組合物的培養(yǎng)基，進(jìn)行誘導(dǎo)分化。10.權(quán)利要求9中所述方法，其中組合物是GM-CSF和IL-4;GM-CSF和IL-13;GM-CSF和IL-15;或IFNa。11.權(quán)利要求1中所述方法，其中在全部或部分的溫育周期中，單核細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞(PBMC)—起存在。12.權(quán)利要求11中所述方法，其中通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)，從個(gè)體分離PBMC。13.權(quán)利要求ll中所述方法，其中在溫育期之中或之后，從PBMC富集單核細(xì)胞。14.權(quán)利要求13中所述方法，其中通過(guò)淘析、稀釋Ficoll梯度離心、稀釋Percoll密度梯度離心或^t珠分選，從所述PBMC富集單核細(xì)胞。15.權(quán)利要求13中所述方法，其中通過(guò)使得單核細(xì)胞附著于塑料，在溫育期之后從PBMC富集單核細(xì)胞。16.權(quán)利要求9中所述方法，還包括使未成熟樹(shù)狀細(xì)胞成熟為成熟樹(shù)狀細(xì)胞的步驟。17.權(quán)利要求16中所述方法，還包括將一種或多種抗原負(fù)載到所述成熟樹(shù)狀細(xì)胞中。18.權(quán)利要求16中所述方法，其中步驟包括將未成熟樹(shù)狀細(xì)胞接觸PGE2、TNFa、IL-6和IL畫(huà)1卩。19.權(quán)利要求16中所述方法，其中所述步驟包括用IFN-Y標(biāo)志所述未成熟樹(shù)狀細(xì)胞，隨后用CD40L標(biāo)志樹(shù)狀細(xì)胞。20.權(quán)利要求19中所述方法，其中樹(shù)狀細(xì)胞中的重組CD40LmRNA的翻i,可影響所述標(biāo)志和CD40L。21.權(quán)利要求16中所述方法，其中所述步驟包括將未成熟樹(shù)狀細(xì)胞4妄觸PGE2、TNFa和IFNy,以產(chǎn)生成熟樹(shù)狀細(xì)胞。22.權(quán)利要求21中所述方法，還包括用編碼CD40L的RNA和/或編碼一種或多種抗原或目的表位的RNA,來(lái)轉(zhuǎn)染所述成熟樹(shù)狀細(xì)胞。23.權(quán)利要求22中所述方法，其中RNA編碼一種或多種癌細(xì)胞抗原。24.權(quán)利要求22中所述方法，其中RNA編碼一種或多種病原體抗原。25.權(quán)利要求1中所述方法，還包括將樹(shù)狀細(xì)胞負(fù)載一種或多種抗原，以生產(chǎn)抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞。26.權(quán)利要求25中所述方法，其中抗原是個(gè)體自體的。27.權(quán)利要求25中所述方法，其中通過(guò)用一種或多種編碼所述抗原的RNA轉(zhuǎn)染所述樹(shù)狀細(xì)胞，以負(fù)載所述抗原。28.權(quán)利要求27中所述方法，其中通過(guò)電穿孔，用RNA轉(zhuǎn)染樹(shù)狀細(xì)胞。29.權(quán)利要求27中所述方法，其中用約l-4貼RNA/10s樹(shù)狀細(xì)胞，來(lái)轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。30.權(quán)利要求25中所述方法，其中在進(jìn)行抗原負(fù)載時(shí)，所述樹(shù)狀細(xì)胞是未成熟的。31.權(quán)利要求30中所述方法，還包括使所述抗原負(fù)載的未成熟樹(shù)狀細(xì)胞成熟為抗原負(fù)載的成熟樹(shù)狀細(xì)胞。32.權(quán)利要求25中所述方法，其中抗原來(lái)自于或衍生于一種或多種癌細(xì)胞或病原體。33.權(quán)利要求32中所述方法，其中癌選自腎細(xì)胞癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌和胰腺癌。34.權(quán)利要求32中所述方法，其中所述病原體是HTV或HCV。35.—種將樹(shù)狀細(xì)胞疫苗施用給個(gè)體的方法，所述方法包括a)解凍包含了至少2%DMSO的冷凍樹(shù)狀細(xì)胞疫苗，和.b)在施用前，不改變細(xì)胞對(duì)DMSO的比值，將所述解凍疫苗施用給個(gè)體。36.權(quán)利要求44中所述方法，其中冷凍疫苗中的DMSO濃度是約10%。37.權(quán)利要求44中所述方法，其中通過(guò)權(quán)利要求16中的方法制備樹(shù)狀細(xì)胞。38.抗原負(fù)載的樹(shù)狀細(xì)胞在制備用于治療或預(yù)防癌癥或病原體感染的冷凍藥物中的用途，其中藥物包含至少2%DMSO，并且以備解凍就使用。39.^L利要求38中所述用途，其中藥物包含至少10%DMS〇。40.包含通過(guò)權(quán)利要求16中所述方法制備的樹(shù)狀細(xì)胞的組合物。41.權(quán)利要求40中所述組合物，其中樹(shù)狀細(xì)胞是抗原負(fù)載的。42.權(quán)利要求41中所述組合物，其中用編碼CD40L的mRNA轉(zhuǎn)染樹(shù)狀細(xì)胞。43.權(quán)利要求40中所述組合物，其中與從新鮮單核細(xì)胞制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞相比，成熟樹(shù)狀細(xì)胞提高了一種或多種CD80、CD83、CD86、MHC-I類(lèi)分子或MHC-II類(lèi)分子的水平。44.包含成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞的組合物，其中與從新鮮單核細(xì)胞所制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞相比，成熟樹(shù)狀細(xì)胞提高了一種或多種CD80、CD83、CD86、MHC-I類(lèi)分子或MHC-II類(lèi)分子的水平。45.^又利要求44中所述組合物，其中用編碼CD40L的mRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成熟樹(shù)狀細(xì)胞。46.成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中細(xì)胞中的ALOX15RNA對(duì)(3-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDHRNA的穩(wěn)定狀態(tài)比值小于1.0。47.權(quán)利要求46中所述樹(shù)狀細(xì)胞，其中比值是在0.2至0.7之間。48.權(quán)利要求47中所述樹(shù)狀細(xì)胞，其中比值是在0.4至0.5之間。49.成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中細(xì)胞中的CD52RNA對(duì)卩-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDH的穩(wěn)定狀態(tài)比值大于1.0。50.權(quán)利要求49中所述樹(shù)狀細(xì)胞，其中比值是在1.2至5.0之間。51.權(quán)利要求50中所述樹(shù)狀細(xì)胞，其中比值是在l.5至2.2之間。52.權(quán)利要求51中所述樹(shù)狀細(xì)胞，其中比值是在1.8至1.9之間。53.成熟單核細(xì)胞衍生的樹(shù)狀細(xì)胞，其中細(xì)胞中的TLR1RNA、TLR2RNA、IL-1卩RNA或CD69RNA對(duì)卩-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA或GAPDHRNA的穩(wěn)定狀態(tài)比值小于1.0。54.權(quán)利要求53中所述樹(shù)狀細(xì)胞，其中比值是在0.2至0.9之間。55.權(quán)利要求54中所述樹(shù)狀細(xì)胞，其中比值是在0.5至0.8之間。56.包含權(quán)利要求40-55任何一項(xiàng)所述組合物的疫苗。全文摘要提供用于從分離自個(gè)體起已在1℃-34℃下保持約6至96小時(shí)周期的單核細(xì)胞中生產(chǎn)樹(shù)狀細(xì)胞的方法。溫育期之后，然后誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化成樹(shù)狀細(xì)胞。與從分離自個(gè)體起已在1℃-34℃下沒(méi)有保持至少6小時(shí)的單核細(xì)胞中所制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞相比，通過(guò)本發(fā)明方法所制備的成熟樹(shù)狀細(xì)胞，提高了一種或多種CD80、CD83、CD86、MHC-I類(lèi)分子或MHC-II類(lèi)分子的水平。通過(guò)本發(fā)明方法所制備的樹(shù)狀細(xì)胞，可用于制備疫苗和刺激T細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N5/0784GK101155914SQ200680011380公開(kāi)日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年4月7日優(yōu)先權(quán)日2005年4月8日發(fā)明者I·切爾帕諾瓦,L·丁特曼,R·波格-卡利,T·莫內(nèi)史密斯申請(qǐng)人:阿戈斯治療公司;麒麟制藥株式會(huì)社