專利名稱：一種擴(kuò)增微粒體環(huán)氧化物水解酶基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增微粒體環(huán)氧化物水解酶基因的方法，屬于分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
COPD是一常見呼吸系統(tǒng)疾病，其患病率及病死率正在逐年上升。據(jù)研究預(yù)計(jì)，2020年COPD患病率和死亡率將上升至全球疾病死亡率的第四位。但是至今在臨床上仍然沒有研究出一種能有效預(yù)防和根治COPD的方法，其主要原因在于對(duì)于COPD的發(fā)病機(jī)制尚不明。
近十年中，COPD疾病的發(fā)病機(jī)制主要集中在蛋白酶/抗蛋白酶和氧化酶/抗氧化酶的研究上。α1-抗胰蛋白酶是目前唯一研究證實(shí)的與COPD疾病有關(guān)的抗蛋白水解酶。在COPD分子基因研究上，近年對(duì)于氧化抑制酶基因的研究較多，如谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶，微粒體環(huán)氧化物水解酶，血紅素氧化酶，細(xì)胞色素P450酶。但是，在先前研究過(guò)程中多數(shù)采用的是PCR-RFLP方法，使用的分子生物學(xué)技術(shù)手段單一，而且其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步證實(shí)，結(jié)果欠準(zhǔn)確，以至于在我們的研究中發(fā)現(xiàn)了先前研究的一些可疑之處。特別是在mEPHexon3基因多態(tài)性的研究上，因?yàn)镻CR-RFLP方法在先前的有些研究中尚存在爭(zhēng)議，故我們采用的是直接測(cè)序法，得出的結(jié)果更準(zhǔn)確，而且最后經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析能被我們所發(fā)現(xiàn)的公式證實(shí)。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，國(guó)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明內(nèi)容相同文獻(xiàn)的公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快捷、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果更準(zhǔn)確的擴(kuò)增微粒體環(huán)氧化物水解酶基因的方法。
本發(fā)明選擇在GenBank上發(fā)表的索引號(hào)分別是U06657、U06658的mEPH酶外顯子3、4的編碼基因；利用DNAman生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物mEPH exon3上游引物5’-GAA ACT GCC TTG CCA CTC-3’下游引物5’-CCT GCC TAG CTC TAA AGA TG-3’；
mEPH exon4上游引物5’-ACA TCC ACT TCA TCC ACG T-3’下游引物5’-ATG CCT CTG AGA AGC CAT-3’；擴(kuò)增片段為mEPH exon3上游引物(62bp...79bp)；下游引物(556bp...575bp)；mEPH exon4上游引物(49bp...512bp)；下游引物(685bp...702bp)。
以COPD吸煙患者和健康吸煙者的mEPH酶基因組DNA作為模板，利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到蛋白酶編碼基因的保守序列。本發(fā)明擴(kuò)增得到的mEPH酶蛋白酶基因多態(tài)性與COPD的易感性有關(guān)，且攜帶mEPH慢/很慢活性基因型的個(gè)體更易感COPD。由于mEPH酶是參與COPD發(fā)病機(jī)制中的重要抗氧化酶，因此本發(fā)明得到的基因可指導(dǎo)易感COPD人群避免從事一些接觸煤灰、粉塵等的工作，從而減少COPD的發(fā)病率，提高COPD的防治水平。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的1、參照標(biāo)準(zhǔn)的苯酚/氯仿方法從血液中提取總DNAa.取150μl全血加入450μl STE緩沖液(30mM Tris-HCL，200mM EDTA，50mMNaCl，pH 8.0)和終濃度分別為1％的SDS 50μl和200μg/ml的蛋白酶K 30μl；b.充分混勻后置56℃溫箱中消化24小時(shí)至澄清；c.取出樣本后，先將樣本離心十余秒鐘，再加入等體積的水飽和酚(700μl)，放入混勻器內(nèi)緩慢混勻24小時(shí)；d.取出樣本后，將樣本放入離心器以6000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的Eppendorf管中；e.加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1；即苯酚350μl，氯仿∶異戊醇350μl)混合液緩慢混勻抽提20分鐘，6000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的Eppendorf管中；f.加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1；劑量同上)抽提10分鐘，6000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的Eppendorf管中；g.加入等體積的異丙醇(700μl)沉淀DNA，-20℃過(guò)夜放置；h.取出樣本后，將樣本放入離心器以6000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后，棄上清；i.加入800μl 70％乙醇洗滌，10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后，棄上清；j.重復(fù)一次；
k.將DNA樣品置于真空干燥器干燥3分鐘左右(視管中乙醇?xì)埩袅慷嗌龠m當(dāng)調(diào)整干燥時(shí)間)；l.加入適量TE(PH＝8.0)緩沖液溶解，置+4℃冰箱待用或保存于-20℃。
2、PCR擴(kuò)增a.PCR反應(yīng)所用的引物在本實(shí)驗(yàn)中，我們根據(jù)Primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)了引物mEPH酶并進(jìn)行擴(kuò)增。
引物序列如下mEPH exon3上游引物5’-GAA ACT GCC TTG CCA CTC-3’下游引物5’-CCT GCC TAG CTC TAA AGA TG-3’；mEPH exon4上游引物5’-ACA TCC ACT TCA TCC ACG T-3’下游引物5’-ATG CCT CTG AGA AGC CAT-3’。
擴(kuò)增片段為mEPH exon3上游引物(62bp...79bp)；下游引物(556bp...575bp)。
mEPH exon4上游引物(49bp...512bp)；下游引物(685bp...702bp)。
b.PCR擴(kuò)增體系PCR反應(yīng)體系20μl包括基因組DNA100ng，100ng引物(大連寶生物公司)，200mmol/LdNTP，1U TaqDNA聚合酶(二大連寶生物公司)。
c.PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為238bp。PCR產(chǎn)物用3％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每個(gè)樣品取2μl點(diǎn)入瓊脂糖凝膠孔中，進(jìn)行電泳。
3.應(yīng)用測(cè)序法分析mEPHexon3基因多態(tài)性
3.1PCR產(chǎn)物的回收1)首先配制2％的瓊脂糖凝膠，將檢測(cè)后剩余樣品全部點(diǎn)入點(diǎn)樣孔，100V電壓電泳半小時(shí)，直到目的片段完全分離。
2)在紫外線燈下將目的片段割下，放入1.5μl Eppendorf管中。
3)按1∶3比例加入溶膠液，放入55℃溫箱30分鐘，每2min顛倒混勻一次，使瓊脂糖完全融化。
4)加入1/3溶膠液體積的異丙醇，混勻，55℃溫浴1min。
5)將融化的瓊脂糖液移入吸附柱中，高速離心1min(12000rpm)，倒掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一收集管。
6)在吸附柱中加入450μl洗滌液，靜置5min，高速離心30min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管。
7)重復(fù)6)步，后再高速離心1min。
8)將吸附柱放入一干凈的1.5μl Eppendorf管中，在吸附膜中央加入20∽30μl的洗滌液，室溫下靜置5分鐘，高速離心1分鐘。
9)1.5％瓊脂糖檢測(cè)2μl回收產(chǎn)物，并估計(jì)片段的含量。
10)回收產(chǎn)物放入-20℃冰箱保存。
3.2DNA序列測(cè)定純化好的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序反應(yīng)后直接進(jìn)行測(cè)序。每條序列均經(jīng)過(guò)正反鏈雙次測(cè)定，以確保序列的準(zhǔn)確性。
3.2.1混合反應(yīng)物測(cè)序反應(yīng)采用PE公司的BigDyeTMTerminator Kit，在一個(gè)0.5ml管中，混合以下反應(yīng)物

3.2.2測(cè)序反應(yīng)將反應(yīng)管放入熱循環(huán)儀中，反應(yīng)條件嚴(yán)格按照廠家的建議進(jìn)行。
96℃30秒，50℃15秒，60℃4分鐘，25次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，把Eppendorf管放入冰中待用。
3.2.3純化測(cè)序產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物用異丙醇法進(jìn)行純化，去除未參與測(cè)序反應(yīng)的引物，ddNTP，dNTP和測(cè)序酶等試劑。具體操作步驟如下1)每管加入20μl 75％異丙醇，渦旋混勻，室溫放置20min，最高速(2000-3000xg)離心30min(離心機(jī)需要配置96孔板轉(zhuǎn)頭)。馬上倒置96孔板，下面放置吸水紙，50xg離心1min；如果是放了一段時(shí)間才去異丙醇，先將96孔板短暫離心一次，再倒置96孔板，50xg離心1min。
2)加入40μL 75％異丙醇，迅速渦旋混勻，最高速(2000-3000xg)離心10min；倒置96孔板，50xg離心1min；3)讓殘余的異丙醇在室溫?fù)]發(fā)干(或者PCR儀上設(shè)定96℃放置數(shù)秒)，加入20~30μL滅菌去離子水溶解DNA，渦旋混勻，500g瞬時(shí)離心；4)上樣電泳。
3.2.4自動(dòng)序列測(cè)定使用Applied Biosystems Inc.377全自動(dòng)DNA序列儀電泳并由機(jī)器自動(dòng)記錄序列數(shù)據(jù)。
4應(yīng)用酶切法分析mEPHexon4基因多態(tài)性4.1酶切前混合反應(yīng)物酶切采用大連寶生物公司的RsaI酶，在一個(gè)0.5ml管中，混合以下反應(yīng)物

4.2酶切反應(yīng)將反應(yīng)管放入37℃溫箱，消化過(guò)夜。酶切片段經(jīng)3％瓊脂糖凝膠電泳后顯示。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有快捷、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果更準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明得到的基因可指導(dǎo)易感COPD人群避免從事一些接觸煤灰、粉塵等的工作，從而減少COPD的發(fā)病率，提高COPD的防治水平。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例1(本實(shí)施例的具體步驟同發(fā)明內(nèi)容部分所述)本發(fā)明以mEPH酶外顯子3的基因組DNA作為模板，首先用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到蛋白酶的保守基因序列，再利用測(cè)序、酶切技術(shù)擴(kuò)增未知的5′端基因序列，通過(guò)使用Applied Biosystems Inc.377全自動(dòng)DNA序列儀電泳并由機(jī)器自動(dòng)記錄序列數(shù)據(jù)或?qū)⒎磻?yīng)管放入37℃溫箱，消化過(guò)夜。酶切片段經(jīng)3％瓊脂糖凝膠電泳后顯示。
實(shí)施例2(本實(shí)施例的具體步驟同發(fā)明內(nèi)容部分所述)本發(fā)明以mEPH酶外顯子4的基因組DNA作為模板，首先用筒并引物擴(kuò)增得到蛋白酶的保守基因序列，再利用測(cè)序、酶切技術(shù)擴(kuò)增未知的5′端基因序列，通過(guò)使用Applied Biosystems Inc.377全自動(dòng)DNA序列儀電泳并由機(jī)器自動(dòng)記錄序列數(shù)據(jù)或?qū)⒎磻?yīng)管放入37℃溫箱，消化過(guò)夜。酶切片段經(jīng)3％瓊脂糖凝膠電泳后顯示。
Untitled mEPH3 and 4.ST25SEQUENCE LISTING<110>云南大學(xué)<120>一種擴(kuò)增微粒體環(huán)氧化物水解酶基因的方法<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>585<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
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1.一種擴(kuò)增微粒體環(huán)氧化物水解酶基因的方法，包括基因組DNA的提取、用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增片段測(cè)序及測(cè)序結(jié)果分析步驟，其特征在于本方法中所用引物由下列方法設(shè)計(jì)得到(1)選擇在GenBank上發(fā)表的索引號(hào)為U06657、U06658的mEPH酶外顯子3、4的編碼基因；(2)利用DNAman生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)并引物mEPH exon3上游引物5’-GAA ACT GCC TTG CCA CTC-3’下游引物5’-CCT GCC TAG CTC TAA AGA TG-3’；mEPH exon4上游引物5’-ACA TCC ACT TCA TCC ACG T-3’下游引物5’-ATG CCT CTG AGA AGC CAT-3’；擴(kuò)增片段為mEPH exon3上游引物(62bp...79bp)；下游引物(556bp...575bp)；mEPH exon4上游引物(49bp...512bp)；下游引物(685bp...702bp)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增微粒體環(huán)氧化物水解酶基因的方法，屬于分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明選擇在GenBank上發(fā)表的mEPH酶外顯子3、4的編碼基因，利用DNAman生物學(xué)軟件進(jìn)行同源性分析，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物。本發(fā)明以COPD吸煙患者和健康吸煙者的mEPH酶基因組DNA作為模板，利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到蛋白酶編碼基因的保守序列。本發(fā)明擴(kuò)增得到的mEPH酶蛋白酶基因多態(tài)性與COPD的易感性有關(guān)，且攜帶mEPH慢/很慢活性基因型的個(gè)體更易感COPD。由于mEPH酶是參與COPD發(fā)病機(jī)制中的重要抗氧化酶，因此本發(fā)明得到的基因可指導(dǎo)易感COPD人群避免從事一些接觸煤灰、粉塵等的工作，從而減少COPD的發(fā)病率，提高COPD的防治水平。本發(fā)明的方法具有快捷、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果更準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101037687SQ20061016380
公開日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者戴路明, 張亞平, 傅煒萍 申請(qǐng)人:云南大學(xué)