專利名稱：一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(Stem cell)是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，根據(jù)其發(fā)育階段不同，分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。成體干細(xì)胞廣泛存在于骨髓、神經(jīng)、肌肉、表皮、腸、肝等組織或器官。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為成體干細(xì)胞只可向其定居的組織類型分化，而不能分化成其它組織類型的細(xì)胞。但近年來(lái)研究表明，成體干細(xì)胞在一定條件下可分化為與其所在組織不同的其它類型的細(xì)胞，成體干細(xì)胞的這種可塑性，稱為跨越分化。這一潛能的發(fā)現(xiàn)，大大拓寬了其在臨床醫(yī)學(xué)治療上的應(yīng)用前景，如鑒于成體干細(xì)胞的跨越分化潛能，利用定向誘導(dǎo)分化技術(shù)，可以將來(lái)源于不同組織的成體干細(xì)胞分化成所需組織的細(xì)胞，如利用造血干細(xì)胞，不僅能重建患者的造血及免疫功能，還能在患者體內(nèi)分化成各種成熟的非造血組織細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等，這些細(xì)胞可以有機(jī)地整合到相應(yīng)的組織和器官中，修復(fù)或替換患者喪失功能或受損的組織和器官。
慢性肝炎、肝硬化、門(mén)靜脈高壓病、原發(fā)性肝癌、遺傳性及代謝性肝臟疾病等諸多難治性肝病已成為全世界共同面臨的棘手問(wèn)題，我國(guó)每年因肝病死亡的患者約50萬(wàn)人。當(dāng)前，對(duì)于肝功能衰竭(如肝壞死、肝硬化等)和肝臟相關(guān)的遺傳性疾病的治療主要依賴于原位肝移植，但供體肝來(lái)源嚴(yán)重不足和移植排斥等問(wèn)題限制了這一治療手段的廣泛開(kāi)展。肝細(xì)胞移植和生物人工肝作為肝移植的輔助方式，可以部分緩解上述問(wèn)題，但其來(lái)源細(xì)胞同樣也面臨著存活期短，特別是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，肝功能逐漸降低等問(wèn)題，因此，尋找合適的肝細(xì)胞來(lái)源已成為一個(gè)十分緊迫的課題。而利用成體干細(xì)胞跨越分化為肝細(xì)胞無(wú)疑是解決這一問(wèn)題的一個(gè)有效途徑，因此這方面的研究也成為當(dāng)前干細(xì)胞以及肝病細(xì)胞治療的研究熱點(diǎn)之一。
先前，成體干細(xì)胞跨越分化為肝細(xì)胞的研究主要集中在肝源性干細(xì)胞(如卵圓細(xì)胞、成肝細(xì)胞)和骨髓源干細(xì)胞。而最近研究表明，一直被丟棄的臍帶血造血干細(xì)胞能在體內(nèi)分化為肝細(xì)胞。將人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞注入NOD/SCID小鼠中，利用熒光原位雜交技術(shù)，分析小鼠肝內(nèi)的人源細(xì)胞DNA，發(fā)現(xiàn)臍帶血細(xì)胞能整合入小鼠肝中并分化為成熟肝細(xì)胞。同樣，將轉(zhuǎn)有GFP質(zhì)粒的人臍血CD34+Lin-細(xì)胞植入發(fā)育至45～55天的胎羊中，結(jié)果在胎羊肝臟中檢測(cè)到了表達(dá)人肝細(xì)胞特征抗原、白蛋白、肝細(xì)胞核因子及GFP的細(xì)胞，DNA定量分析發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞沒(méi)有與胎羊肝細(xì)胞發(fā)生融合。此外，將人臍帶血中分離的CD34+CD38-CD7-造血干細(xì)胞移植入免疫缺陷小鼠肝損傷模型，在移植的一個(gè)月后用CCl4誘導(dǎo)肝損傷，結(jié)果在移植了臍帶血造血干細(xì)胞的小鼠肝中檢測(cè)到人特異的白蛋白mRNA，并在小鼠血清中檢測(cè)到人白蛋白，而在未移植的損傷小鼠或者移植了造血干細(xì)胞的未損傷小鼠中均未檢測(cè)到人白蛋白的表達(dá)。另外，一些體外實(shí)驗(yàn)也證明臍帶血來(lái)源的干細(xì)胞能在特定細(xì)胞因子的組合誘導(dǎo)下分化為肝細(xì)胞，目前已報(bào)道的細(xì)胞因子組合包括FGF-1、FGF-2、SCF、LIF、HGF和OSM等，在這些因子的誘導(dǎo)下，臍帶血干細(xì)胞在21天后開(kāi)始表達(dá)CK19、白蛋白和CK18等肝細(xì)胞特異性標(biāo)志。最近，有人采用HGF、Dex、ITS和OSM組合，成功誘導(dǎo)了人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為肝細(xì)胞。但目前的誘導(dǎo)體系普遍采用了5～7種細(xì)胞因子，方法較為復(fù)雜。本發(fā)明則建立了一種三因子誘導(dǎo)體系，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)體系，為今后利用臍帶血干細(xì)胞跨越分化肝細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞種子細(xì)胞來(lái)源及相關(guān)臨床應(yīng)用，打下了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法。通過(guò)對(duì)肝臟分化發(fā)育過(guò)程的分析研究，經(jīng)過(guò)不同的組合比較實(shí)驗(yàn)，得到一種比已有報(bào)道更為優(yōu)化、簡(jiǎn)單方便的方法。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的(1)以人臍帶血為原料，分離單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞；(2)利用三種細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞；(3)分化細(xì)胞的鑒定。
所述的步驟(1)主要通過(guò)將臍帶血(原料)稀釋，得到稀釋液后用密度梯度離心技術(shù)，制備單個(gè)核細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步通過(guò)免疫磁珠分離得到CD34+細(xì)胞。
所述的臍帶血(原料)稀釋度為臍帶血∶PBS＝1∶2。
所述的步驟(2)中三種細(xì)胞因子為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF-4)和抑瘤素(OSM)。
所述的三種細(xì)胞因子的加入量肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子為20ng/ml、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4為10ng/ml和抑瘤素為10ng/ml。
所述的步驟(3)中分化細(xì)胞的鑒定包括形態(tài)學(xué)觀察、高碘酸-希夫反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞糖原合成、蘇木素細(xì)胞核染色。
所述的步驟(3)中分化細(xì)胞的鑒定包括形態(tài)學(xué)觀察、肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)分析、肝細(xì)胞特異蛋白免疫熒光檢測(cè)、高碘酸-希夫反應(yīng)(PAS)檢測(cè)細(xì)胞糖原合成、蘇木素細(xì)胞核染色。
由于采用了以上成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、構(gòu)成簡(jiǎn)單，只需要三種細(xì)胞因子20ng/ml HGF、10ng/mlFGF-4和10ng/ml OSM的IMDM培養(yǎng)液誘導(dǎo)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞，通過(guò)體外誘導(dǎo)臍帶血干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，得到有糖原合成能力，顯示雙核的多邊形肝細(xì)胞樣細(xì)胞；2、效果明確，形態(tài)學(xué)觀察、高碘酸-希夫反應(yīng)(PAS)檢測(cè)細(xì)胞糖原合成和蘇木素細(xì)胞核染色鑒定分化細(xì)胞，都表明本發(fā)明的體系能夠誘導(dǎo)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞跨越分化為肝細(xì)胞，分化率達(dá)到了60％-70％；3、實(shí)用有效，經(jīng)誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞有合成糖元等功能性，有應(yīng)用于肝病細(xì)胞治療的潛在價(jià)值。該誘導(dǎo)體系能夠達(dá)到理想的體外誘導(dǎo)效果，并且構(gòu)成簡(jiǎn)單、實(shí)用，是肝細(xì)胞跨越分化研究和應(yīng)用的新方法，為人類臍帶血干細(xì)胞跨越分化肝細(xì)胞的研究提供重要證據(jù)和實(shí)用方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1三種細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的方法為將采集的臍帶血用PBS以1∶2稀釋，以5∶3的比例將臍帶血稀釋液小心加到1.077g/ml的Ficoll上，2200rpm，離心25分鐘，收集中間白膜層細(xì)胞，1500rpm，離心10分鐘，棄上清，得到臍帶血單個(gè)核細(xì)胞。用含有10％NBS的IMDM培養(yǎng)液懸浮，置細(xì)胞瓶中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
調(diào)整細(xì)胞密度，按2×105/cm2密度接種一次性塑料細(xì)胞瓶或孔板，在含10％NBS的IMDM培養(yǎng)液中添加20ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4和10ng/ml OSM。72hours后首次換液，棄去沒(méi)有貼壁的細(xì)胞，每周兩次換液，共培養(yǎng)21天。
誘導(dǎo)分化細(xì)胞鑒定1.形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞分化過(guò)程中，每天在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
2.高碘酸-希夫反應(yīng)(PAS)檢測(cè)細(xì)胞糖原合成倒去培養(yǎng)液后，用PBS洗兩次，用95％酒精固定細(xì)胞10min，蒸餾水沖洗1min，再用1％過(guò)碘酸水溶液作用15min，蒸餾水沖洗1min后，加入Schiff試劑作用30min，中間每隔數(shù)分鐘進(jìn)行搖晃，亞硫酸水洗3遍，再用蒸餾水沖洗1min，相差顯微鏡下鏡檢。統(tǒng)計(jì)PAS糖原合成反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。
由上述兩種方法檢測(cè)后可分析得到細(xì)胞呈陽(yáng)性，即已具備肝細(xì)胞功能的物質(zhì)，但肝細(xì)胞分化率僅為62％。
3.蘇木素細(xì)胞核染色倒去培養(yǎng)液，用PBS沖洗兩次，95％酒精固定細(xì)胞10min，蘇木素染色10分鐘，自來(lái)水洗，稀鹽酸酒精分色數(shù)秒鐘，自來(lái)水浸洗1min，淡氨水中浸洗5min，使細(xì)胞核藍(lán)化。相差顯微鏡下鏡檢得細(xì)胞顯示雙核。
實(shí)施例2三種細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)臍帶血CD34+細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的方法為參考實(shí)施例1的方法獲得臍血單個(gè)核細(xì)胞，用600μl PBS懸浮，加入封閉液200μl，混勻，然后加入200μl帶有CD34+抗體的磁珠，混勻，6-12℃孵育30min，加入1ml PBS，1100rpm離心10min，完全去除上清，500μl PBS懸浮細(xì)胞，安裝好免疫磁珠分離系統(tǒng)(MACs)，用500μl PBS洗分離柱一次，加細(xì)胞懸液過(guò)柱，PBS洗三次，每次500μl，將分離柱移出磁場(chǎng)，加1ml PBS將細(xì)胞迅速吹出，離心收集CD34+細(xì)胞。用含有10％NBS的IMDM培養(yǎng)液懸浮，置細(xì)胞瓶中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
調(diào)整細(xì)胞密度，按2×105/cm2密度接種一次性塑料細(xì)胞瓶或孔板，在含10％NBS的IMDM培養(yǎng)液中添加20ng/ml HGF、10ng/ml FGF-4和10ng/ml OSM。72hours后首次換液，棄去沒(méi)有貼壁的細(xì)胞，每周兩次換液，共培養(yǎng)21天。
誘導(dǎo)分化細(xì)胞鑒定1.形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞分化過(guò)程中，每天在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
2.高碘酸-希夫反應(yīng)(PAS)檢測(cè)細(xì)胞糖原合成倒去培養(yǎng)液后，用PBS洗兩次，用95％酒精固定細(xì)胞10min，蒸餾水沖洗1min，再用1％過(guò)碘酸水溶液作用15min，蒸餾水沖洗1min后，加入Schiff試劑作用30min，中間每隔數(shù)分鐘進(jìn)行搖晃，亞硫酸水洗3遍，再用蒸餾水沖洗1min，相差顯微鏡下鏡檢、拍照。統(tǒng)計(jì)PAS糖原合成反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。
由上述兩種方法檢測(cè)后可分析得到細(xì)胞呈陽(yáng)性，即已具備肝細(xì)胞功能的物質(zhì)，且肝細(xì)胞分化率為70％。
3.蘇木素細(xì)胞核染色倒去培養(yǎng)液，用PBS沖洗兩次，95％酒精固定細(xì)胞10min，蘇木素染色10分鐘，自來(lái)水洗，稀鹽酸酒精分色數(shù)秒鐘，自來(lái)水浸洗1min，淡氨水中浸洗5min，使細(xì)胞核藍(lán)化。相差顯微鏡下鏡檢得細(xì)胞顯示雙核。
肝細(xì)胞特異基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)用Trizol試劑盒抽提總RNA，取總RNA 1μg，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄cDNA；再分別擴(kuò)增β-actin、AFP、CK19、CK18、ALB、TAT。10μlPCR反應(yīng)體系中Taq buffer(10×，含Mg2+)lμl、dNTP0.2μl、Taq酶0.2μl、引物各0.4μl、cDNA模板0.2μl、無(wú)菌蒸餾水7.6μl。PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5min后；94℃變性30s、退火30s、72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；再72℃延伸l0min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，可得出結(jié)論為培育21天后以具備肝細(xì)胞的功能，即人類臍帶血干細(xì)胞已跨越分化為肝細(xì)胞。
肝細(xì)胞特異蛋白的免疫熒光法檢測(cè)倒去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，每次5min，4％多聚甲醛(PH 7.2)室溫固定15min，用槍吸干多聚甲醛后加入甲醇(-20℃預(yù)冷)，在-20℃作用20min，倒去甲醇，自然風(fēng)干，加入5％正常山羊血清封閉(PBS稀釋)，室溫處理20min，PBS洗一次，分別加入AFP、CK19、CK18或ALB的單克隆抗體作為一抗(均按1∶100稀釋在含1.5％正常封閉血清的PBS中)，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5min，再加入對(duì)應(yīng)的FITC和TRITC標(biāo)記的二抗(均按1∶100稀釋在含1.5％正常封閉血清的PBS中)，37℃孵育45min，PBS洗滌3次，每次5min，，加入DAPI工作液，室溫孵育10min，PBS反復(fù)洗滌后，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察肝細(xì)胞分化情況。
通過(guò)以上實(shí)施例表明本發(fā)明的體系能夠誘導(dǎo)臍帶血單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞跨越分化為肝細(xì)胞，且分化率達(dá)到60％-70％；該誘導(dǎo)體系能夠達(dá)到理想的體外誘導(dǎo)效果，并且構(gòu)成簡(jiǎn)單、實(shí)用。
權(quán)利要求
1.一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，其特征在于包括如下步驟(1)以人臍帶血為原料，分離單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞；(2)利用三種細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞；(3)分化細(xì)胞的鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述的一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，其特征在于所述的步驟(1)主要通過(guò)將原料稀釋得到稀釋液后制備單個(gè)核細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)免疫磁珠分離得CD34+細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求2所述的一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，其特征在于所述的原料的稀釋度為臍帶血∶PBS＝1∶2。
4.如權(quán)利要求1所述的一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，其特征在于所述的步驟(2)中三種細(xì)胞因子為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4和抑瘤素。
5.如權(quán)利要求4所述的一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，其特征在于所述的三種細(xì)胞因子的加入量肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子為20ng/ml、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4為10ng/ml和抑瘤素為10ng/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，其特征在于所述的步驟(3)中分化細(xì)胞的鑒定包括形態(tài)學(xué)觀察、高碘酸-希夫反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞糖原合成、蘇木素細(xì)胞核染色。
7.如權(quán)利要求1所述的一種成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，其特征在于所述的步驟(3)中分化細(xì)胞的鑒定包括形態(tài)學(xué)觀察、肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)分析、肝細(xì)胞特異蛋白免疫熒光檢測(cè)、高碘酸-希夫反應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞糖原合成、蘇木素細(xì)胞核染色。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的成體干細(xì)胞體外跨越分化肝細(xì)胞的方法，以人臍帶血為原料，制備單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞，通過(guò)采用肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF－4)和抑瘤素(OSM)三種細(xì)胞因子組合，體外誘導(dǎo)臍帶血干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，得到有糖原合成能力，顯示雙核的多邊形肝細(xì)胞樣細(xì)胞。該誘導(dǎo)體系能夠達(dá)到理想的體外誘導(dǎo)效果，并且構(gòu)成簡(jiǎn)單、實(shí)用，是肝細(xì)胞跨越分化研究和應(yīng)用的新方法，為人類臍帶血干細(xì)胞跨越分化肝細(xì)胞的研究提供重要證據(jù)和實(shí)用方法。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101033463SQ20061015535
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者董學(xué)君, 陳燁, 張國(guó)榮, 邵健忠, 項(xiàng)黎新 申請(qǐng)人:浙江省紹興市人民醫(yī)院, 浙江大學(xué)