專(zhuān)利名稱(chēng)：適用于淡豆豉純種發(fā)酵的枯草芽孢桿菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物發(fā)酵菌株的確定，特別是適用于淡豆豉純種發(fā)酵的枯草芽孢桿菌菌株。
背景技術(shù)：
淡豆豉是我國(guó)特產(chǎn)的以大豆為原料的發(fā)酵類(lèi)中藥，根據(jù)我國(guó)歷代醫(yī)書(shū)，其主要功能為解表、除煩、宣發(fā)郁熱，用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠。現(xiàn)代研究表明，其還具有降血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、體外抗肝癌細(xì)胞的作用。目前，由于淡豆豉的生產(chǎn)還是靠自然發(fā)酵，因而存在多種問(wèn)題1、來(lái)自于原料、器具及自然環(huán)境中的多種微生物會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)，那些最適合于食品底物和生產(chǎn)條件的微生物會(huì)快速生長(zhǎng)并漸漸成為優(yōu)勢(shì)菌種，因此發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌種往往會(huì)因生產(chǎn)條件的差異存在可變性，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和功能品質(zhì)的不一致性；2、更糟的是，該優(yōu)勢(shì)菌種可能并不適合發(fā)酵生產(chǎn)淡豆豉，造成發(fā)酵的失敗，使得發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性差。3、有些污染菌可能還是病原菌，如黃曲霉的某些菌株會(huì)產(chǎn)生引起人、畜肝臟致癌的黃曲霉毒素，給食品安全帶來(lái)影響。因此，有必要找到適合淡豆豉生產(chǎn)的發(fā)酵菌株，采用純種發(fā)酵來(lái)改變當(dāng)前這種不利的局面，對(duì)發(fā)酵進(jìn)行科學(xué)化管理，提高其競(jìng)爭(zhēng)力，發(fā)揚(yáng)我國(guó)傳統(tǒng)中藥。
本發(fā)明的目的就是提供一種適用于淡豆豉純種發(fā)酵的菌株，以改變現(xiàn)有淡豆豉生產(chǎn)技術(shù)存在的上述問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種適于淡豆豉生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌菌株，由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC No.1863。菌株命名為DANDC1，菌株的16srDNA部分序列如本發(fā)明的序列表所示SEQID DANDC1。
本發(fā)明提供的適于淡豆豉生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌菌株來(lái)源于下述方法以淡豆豉為原料，采用常規(guī)梯度稀釋法，接種于KMB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時(shí)，挑選出菌落形態(tài)不同的數(shù)量占優(yōu)的兩種菌株進(jìn)行劃線分離純化，得到純培養(yǎng)物，分別命名為DANDC1、DANDC2。經(jīng)革蘭氏染色、芽孢染色、接觸酶實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)都為陽(yáng)性，證實(shí)其符合芽孢桿菌屬的特征。再通過(guò)提取細(xì)菌總DNA，根據(jù)芽孢桿菌16srDNA的保守序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到各菌株的16srDNA，經(jīng)純化后用自動(dòng)核酸測(cè)序儀測(cè)定16srDNA序列的組成，將測(cè)序結(jié)果與genebank中的序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定其為枯草芽孢桿菌。用這兩種菌株進(jìn)行了淡豆豉的試制研究，結(jié)果表明產(chǎn)品表面黑色、皺縮不平，斷面棕黑色，質(zhì)柔軟，氣香，味微甘。經(jīng)1％吲哚醌∶醋酸(10∶1)的混合溶液檢驗(yàn)顯紫紅色，1％硫酸銅溶液與40％氫氧化鉀溶液檢驗(yàn)無(wú)紫紅色出現(xiàn)。以上特征都符合《中國(guó)藥典》對(duì)淡豆豉的要求。
菌種保藏方法如下用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨5g、酵母粉2.5g、氯化鈉5g、500ml蒸餾水、pH值7.5左右)37℃150rpm培養(yǎng)過(guò)夜，添加無(wú)菌甘油并使其終濃度為20％左右，放于-70℃保藏。
菌種保藏菌種分類(lèi)命名枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；保藏日期2006年11月10日；保藏單位名稱(chēng)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC；保藏編號(hào)NO.1863。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明為驗(yàn)證以上枯草芽孢桿菌DANDC1用于淡豆豉工藝的生產(chǎn)效果，用其作為制曲菌種，以大豆為主料，桑葉、青蒿為輔料來(lái)生產(chǎn)淡豆豉，具體工藝路線如下(1)大豆的浸泡和蒸煮取桑葉、青蒿各100克加水2500克煎煮，過(guò)濾，煎液拌入1000克洗凈的大豆中，待吸盡后，0.1MPa高壓蒸煮40分鐘。
(2)種子液的制備采用KMB液體培養(yǎng)基，無(wú)菌條件下接入枯草芽孢桿菌DANDC1菌種，搖床150rpm培養(yǎng)18小時(shí)后根據(jù)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)，用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋成含活菌數(shù)107個(gè)/毫升的種子液。
(3)接種制曲和后酵按蒸煮大豆∶種子液＝100∶1(w/v)的量接種后，在37℃放置48小時(shí)，洗曲，再于密閉容器中45℃放置7天，取出干燥。
本產(chǎn)品表面黑色、皺縮不平，斷面棕黑色，質(zhì)柔軟，氣香，味微甘。經(jīng)1％吲哚醌∶醋酸(10∶1)的混合溶液檢驗(yàn)顯紫紅色，1％硫酸銅溶液與40％氫氧化鉀溶液檢驗(yàn)無(wú)紫紅色出現(xiàn)。本發(fā)明的有益效果是(1)為淡豆豉生產(chǎn)的制曲工藝提供了純種菌，有利于提高發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性，保證發(fā)酵產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和功能品質(zhì)的一致性。
(2)減少了發(fā)酵過(guò)程中病原微生物的侵入，有利于提高發(fā)酵產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全。
本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌菌株DANDC1的16srDNA部分序列如以下序列表所示序列表SEQID DANDC1gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 60ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcaaac 120ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 180aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 240gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 300acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 360gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaaccag 420aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 480ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 540gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 600ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 660ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 720ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 780ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 840ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 900gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 960gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1080actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1140cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1200ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1260ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320caccgcccgt gcaca 133權(quán)利要求
1.適用于淡豆豉純種發(fā)酵的枯草芽孢桿菌菌株，其特征在于所述菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC No.1863，菌株的16srDNA序列組成如SEQIDDANDC1所述。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物發(fā)酵菌株。提供了一種適于淡豆豉生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌菌株。該菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCCNo.1863，菌株命名為DANDC1，菌株的16srDNA部分序列如本發(fā)明的序列表所示SEQIDDANDC1。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌菌株來(lái)源于以淡豆豉為原料的篩選。采用本發(fā)明的菌株可提高淡豆豉發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性和發(fā)酵產(chǎn)品的安全性，確保發(fā)酵產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和功能品質(zhì)的一致和減少病原微生物的侵入。
文檔編號(hào)C12N15/31GK1986775SQ200610155430
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月25日
發(fā)明者李鐸, 馮鳳琴, 沈立榮, 李華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)