專利名稱：用于提高多能干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞的3維支架的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成或動(dòng)物來(lái)源的3維(3D)生物支架作為基體用于提高h(yuǎn)PS (人類多能干細(xì)胞)的生長(zhǎng)和分化的應(yīng)用；這些支架適合與現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室塑料器皿一起使用。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用hPS細(xì)胞接種單獨(dú)的或具有各種生物基質(zhì)涂層的這些支架，以提高所述hPS細(xì)胞分化成肝細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞類型。本發(fā)明還涉及將部分分化的肝細(xì)胞祖細(xì)胞接種到支架上，以進(jìn)一步分化成更成熟的肝細(xì)胞類型。
背景技術(shù)：
哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)多年來(lái)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法已被改善和標(biāo)準(zhǔn)化，并且允許細(xì)胞生長(zhǎng)、擴(kuò)增和分化所需要的條件已被充分確定。細(xì)胞可以在無(wú)菌塑料表面例如聚苯乙烯上常規(guī)培養(yǎng)，所述塑料表面往往與基質(zhì)涂層一起使用，所述基質(zhì)涂層被設(shè)計(jì)成更接近地重現(xiàn)細(xì)胞會(huì)正常生長(zhǎng)的體內(nèi)環(huán)境。在胚胎干細(xì)胞的情況下，往往需要飼養(yǎng)細(xì)胞層例如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞層來(lái)為營(yíng)養(yǎng)和支持所述細(xì)胞的·增殖提供更好的基體。典型地，哺乳動(dòng)物細(xì)胞被培養(yǎng)在通常含有添加劑例如胎牛血清的支持性培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基除了向細(xì)胞提供各種激素和生長(zhǎng)因子之外，還含有同樣有助于復(fù)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的理想微環(huán)境的許多細(xì)胞基質(zhì)組分。當(dāng)前，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)具有各種各樣的下游應(yīng)用，包括它們?cè)诨A(chǔ)研究中的應(yīng)用、它們?cè)谒幬锖投纠韺W(xué)分析中的應(yīng)用和它們?cè)诋a(chǎn)生正確折疊的重組哺乳動(dòng)物蛋白中的應(yīng)用。最近，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)已被進(jìn)一步開發(fā)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，由此獲取組織例如皮膚真皮層并將其增殖一定的時(shí)間段，以便生成更大量的組織以供臨床外科用，例如修復(fù)外傷性損傷之后的傷口或修復(fù)患病的內(nèi)臟器官?？墒?，從原代來(lái)源獲得的細(xì)胞在它們進(jìn)一步增殖的能力方面往往非常有限，并需要復(fù)雜的生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方和生長(zhǎng)條件來(lái)進(jìn)行成功培養(yǎng)。由于免疫排斥的問(wèn)題，它們?cè)谠偕t(yī)學(xué)中的應(yīng)用也有限。最近，在旨在越過(guò)這些障礙的胚胎干細(xì)胞研究領(lǐng)域中有許多進(jìn)展。這種多能干細(xì)胞不僅能夠幾乎無(wú)限地增殖，它們還具有分化成構(gòu)成完全發(fā)育的生物體的每種細(xì)胞和組織類型的能力。因此，多能干細(xì)胞在開發(fā)新藥的試驗(yàn)中可能是重要的工具，并且因?yàn)樗鼈兊墓?yīng)實(shí)際上是無(wú)限的，因此它們提供了更廉價(jià)并且可變性較少的來(lái)源。3D生物支架多能干細(xì)胞分化中的主要挑戰(zhàn)之一是控制分化，使得始終產(chǎn)生成熟、功能完全的細(xì)胞類型而不是部分分化、不成熟的前體細(xì)胞或各種細(xì)胞類型的高度異質(zhì)性混合物。使多能干細(xì)胞分化的最簡(jiǎn)單方式是在2D塑料基體上，但不幸的是，這往往產(chǎn)生缺乏成熟細(xì)胞類型的特征性表型的分化細(xì)胞。這部分是由于不能復(fù)現(xiàn)干細(xì)胞在正常胚胎發(fā)生期間所經(jīng)受的條件，正常胚胎發(fā)生過(guò)程與2D培養(yǎng)物的不同之處在于它當(dāng)然是在3維中發(fā)生的。研究人員試圖解決這個(gè)問(wèn)題的一種方式是開發(fā)新的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，所述新的3D培養(yǎng)系統(tǒng)旨在更忠實(shí)地復(fù)現(xiàn)細(xì)胞在胚胎發(fā)生期間所經(jīng)受的一些條件并讓它們以更天然的方式分化。特別是，這樣的3D系統(tǒng)允許細(xì)胞在更大的程度上彼此相互作用，并允許開發(fā)比利用2D細(xì)胞培養(yǎng)觀察到的任何物體更類似于功能性器官的復(fù)雜的多細(xì)胞聚集體。
3D系統(tǒng)依賴于生物活性支架的存在，細(xì)胞可以接種并可以粘著在所述支架上。這樣的支架必須有助于引導(dǎo)細(xì)胞以所需的3D構(gòu)造生長(zhǎng)和增殖，并且也可能需要提供幫助細(xì)胞形成所需結(jié)構(gòu)的某些分子信號(hào)。生物支架的另一個(gè)重要要求是它們是可放大的，以便組織生長(zhǎng)和細(xì)胞分化可以在更大、更經(jīng)濟(jì)的規(guī)模上進(jìn)行。支架可以由各種材料構(gòu)成，正確的支架選擇在引導(dǎo)接種到其上的任何細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化中可能是關(guān)鍵的。例如，支架通常由安排成多孔海綿形式的聚合材料構(gòu)成。于是，接種到這種支架中的細(xì)胞可以通過(guò)支架內(nèi)部相互連接的管道和通道網(wǎng)絡(luò)在所述支架的孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部粘著和生長(zhǎng)，當(dāng)選擇適合的支架時(shí)，孔徑是重要的考慮因素。生體活性劑例如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組分，在沉積到支架表面上時(shí)，也可以用來(lái)增強(qiáng)支架功能，以容許更好的細(xì)胞粘著。最終的結(jié)果是為細(xì)胞提供一種體外環(huán)境，使細(xì)胞可以在其中更切實(shí)可行地并且以更接近地類似于它們正常的體內(nèi)家園的方式進(jìn)行相互作用。在幾種培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞極性和組織的組織化。例如，當(dāng)用第二層膠原蛋白進(jìn)一步覆蓋培養(yǎng)在平的膠原蛋白層上的單層原代肝細(xì)胞時(shí)，即所謂的夾心培養(yǎng)，與常規(guī)2D培養(yǎng)物的肝細(xì)胞相比，所述細(xì)胞顯示出形態(tài)和功能改善(Dunn，J.等，1991)。所述覆蓋層導(dǎo)致細(xì)胞保持肌動(dòng)蛋白絲與體內(nèi)狀態(tài)相似，與此相反，在2D對(duì)照培養(yǎng)中看到異常的應(yīng)激纖維形成(Berthiaume，F(xiàn).等，1996)。生理更相關(guān)的細(xì)胞骨架組織化和隨后的細(xì)胞極性與形狀可能引起肝功能性提高，但是后來(lái)認(rèn)為，夾心培養(yǎng)的有益效應(yīng)主要起因于改善的細(xì)胞-細(xì)胞接觸而不是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的接觸(Hamilton, G.等,2001)。膠原蛋白支架也已被用于將胚胎干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞。Baharvand和同事發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)2D中分化的細(xì)胞相比，肝細(xì)胞樣細(xì)胞在膠原蛋白支架內(nèi)部的分化改善了形態(tài)特征、基因表達(dá)模式和代謝活性(Baharvand, H.等，2006 )。藻酸鹽提供了多孔非粘著 性3D支架，支持肝細(xì)胞聚集形成強(qiáng)烈的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致肝功能改善(Dvir-Ginzberg, M.等,2003)。藻酸鹽基質(zhì)中的環(huán)境還支持新生大鼠肝細(xì)胞的分化(Dvir-Ginzberg, M.等,2008)和 HepG2 成熟(Elkayam, T.等,2006)為更成熟的功能性表型。另外，當(dāng)將C3A肝細(xì)胞系作為球狀體在藻酸鹽中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，因?yàn)樵S多不同CYP的酶活性比在2D單層培養(yǎng)中增加，因此，C3A肝細(xì)胞系顯示出藥物代謝提高(Elkayam, T.等,2006)。最近,市場(chǎng)上已推出幾種用于提供3D支架以支持細(xì)胞培養(yǎng)的新產(chǎn)品，包括已被發(fā)現(xiàn)改善肝細(xì)胞培養(yǎng)條件的3D交織納米纖維支架(Wang, S.等,2008)。另夕卜，多孔聚苯乙烯支架提供了空間，能夠讓細(xì)胞生長(zhǎng)和分化并形成具有復(fù)雜的3D細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的層(Bokhari, M.等,2007a ;Bokhari, M等,2007b)。在這些支架中，HepG2響應(yīng)于生化試劑的方式遠(yuǎn)比在2D中培養(yǎng)的細(xì)胞更加類似于體內(nèi)組織的活性(Bokhari, M.等，2007a)。另外，小鼠ES細(xì)胞在灌流的聚氨酯泡沫中已作為球狀體成功地向肝細(xì)胞分化，目的在于通過(guò)組合生長(zhǎng)因子處理和多細(xì)胞球狀體形成來(lái)發(fā)展大量分化培養(yǎng)法(massdifferentiation culture method) (Matsumoto, K.等，2008)。肝細(xì)胞培養(yǎng)肝功能衰竭和終末期肝臟疾病在全世界造成為數(shù)巨大的死亡并且是醫(yī)療保健系統(tǒng)的主要負(fù)擔(dān)。肝臟移植仍然是最成功的治療?？墒?，這種方法的功效有限并且與許多并發(fā)癥例如感染或排斥關(guān)聯(lián)。肝臟移植還具有可利用的供體器官短缺的缺點(diǎn)，并且被治療的患者往往需要終身免疫抑制治療。通過(guò)減少對(duì)器官的需要，基于細(xì)胞的治療對(duì)于社會(huì)和患有這些嚴(yán)重疾病的個(gè)體都將是極為重要的。此外，肝臟是人體中代謝和解毒的中心，因此為了鑒定用于體外試驗(yàn)的功能性細(xì)胞類型的可靠來(lái)源，已經(jīng)進(jìn)行了大量的嘗試。不幸的是，目前可利用的任何細(xì)胞類型都不能真實(shí)反映肝臟的復(fù)雜性和功能。從hPS細(xì)胞生成肝細(xì)胞樣細(xì)胞的方法往往包括胚狀體的形成和/或基于添加細(xì)胞毒性化合物進(jìn)行早期選擇，所述肝細(xì)胞樣細(xì)胞可以進(jìn)一步分化成成熟肝細(xì)胞(Rambhat I a, L.等,2003)。這些選擇步驟,特別是胚狀體的形成,往往導(dǎo)致大量細(xì)胞損失并進(jìn)而導(dǎo)致效率低下。該方法是復(fù)雜的，大多數(shù)具有非常長(zhǎng)的世代時(shí)間并包括幾個(gè)耗時(shí)的步驟。因此，需要迅速和簡(jiǎn)單的方法用于形成源自于未分化的hBS細(xì)胞的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。以前用于獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞的嘗試，例如如US20030003573中所公布的，產(chǎn)生了與起始材料有關(guān)的低收率。此外，原代人類肝細(xì)胞的可利用性非常有限，并且還知道，所述細(xì)胞在用于體外應(yīng)用時(shí)迅速失去它們的正常表型和功能性質(zhì)。一種經(jīng)常使用的原代細(xì)胞替代物是轉(zhuǎn)而包含非常低水平(或完全缺乏)的代謝酶并且其他重要蛋白質(zhì)的分布與體內(nèi)天然肝細(xì)胞顯著不同的肝細(xì)胞系。因此，雖然已知肝臟代謝是物種特異性的并因此在預(yù)測(cè)所測(cè)試的物種以外的其他物種的肝臟代謝和毒性中產(chǎn)生困難，但許多試驗(yàn)仍然使用動(dòng)物材料來(lái)進(jìn)行。在藥物開發(fā)中，肝臟不良反應(yīng)仍然是最突出的副作用。因此早期預(yù)測(cè)發(fā)生人類肝臟毒性的傾向性在選擇化合物進(jìn)入臨床試驗(yàn)時(shí)具有至高的重要性。提高這方面的能力的嘗試必須解決可利用性問(wèn)題和模型建立這兩者，這為與引起人類肝臟不良損傷相符的復(fù)雜生物過(guò)程提供更好的覆蓋度。因此，迫切需要一種模型系統(tǒng)，所述模型系統(tǒng)模擬人類肝細(xì)胞，而且能夠在新藥或化學(xué)品的開發(fā)中預(yù)測(cè)候選分子的效應(yīng)。就可利用性和生理相關(guān)性這兩方面而言，hPS細(xì)胞可以擔(dān)任功能性人類肝細(xì)胞的理想的可再生來(lái)源。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)制定了許多穩(wěn)妥的方案，這些方案允許將hPS細(xì)胞、肝細(xì)胞前體細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞接種到3D生物支架上，以可再現(xiàn)地和可放大地產(chǎn)生具有成熟的形態(tài)和功能的肝細(xì)胞。本發(fā)明包括用于提高人類多能干細(xì)胞(hPS)分化成肝細(xì)胞祖細(xì)胞或肝細(xì)胞細(xì)胞類型的方法，其中所述hPS細(xì)胞初始被培養(yǎng)在2維培養(yǎng)表面上，然后轉(zhuǎn)移到一組定義的3D生物支架之一上用于進(jìn)一步分化和成熟。hPS細(xì)胞初始也可以在2維表面上部分分化成肝細(xì)胞祖細(xì)胞類型。隨后，將肝細(xì)胞祖細(xì)胞或hPS細(xì)胞接種到裸露的3維支架或已經(jīng)涂覆有基質(zhì)化合物的支架上，并進(jìn)一步培養(yǎng)。作為本發(fā)明的重要方面，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將hPS細(xì)胞在2D環(huán)境中初始生長(zhǎng)并任選初始分化，然后將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3D環(huán)境中，顯著增加了肝細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)和肝細(xì)胞相關(guān)酶的產(chǎn)生。定義在本文中使用時(shí)，“人類多能干細(xì)胞”(hPS)是指可以源自于任何來(lái)源并且在適合的條件下能夠產(chǎn)生源自于全部3個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的不同細(xì)胞類型的人類子代細(xì)胞的細(xì)胞。hPS細(xì)胞可以具有在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在組織培養(yǎng)中形成可識(shí)別的所有三個(gè)胚層的細(xì)胞的能力。人類多能干細(xì)胞的定義中包括各種類型的胚胎細(xì)胞，包括人類胚胎干(hES)細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Thomson, J.A.等(1998)，Heins, N.等(2004))，以及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(參見(jiàn)，例如Yu，J.等，(2007) ;Takahashi，K.等(2007))。本文中描述的各種方法和其他實(shí)施方式可能需要或利用來(lái)自各種來(lái)源的hPS細(xì)胞。例如，適合使用的hPS細(xì)胞可以從發(fā)育中的胚胎獲得。另外或可選地，合適的hPS細(xì)胞可以從建立的細(xì)胞系和/或人類誘導(dǎo)的多能干(hiPS)細(xì)胞獲得。在本文中使用時(shí)，“hiPS細(xì)胞”(也稱為“iPS”)是指人類誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在本文中使用時(shí)，“定型內(nèi)胚層(DE)”和定型內(nèi)胚層細(xì)胞(DE細(xì)胞)是指表現(xiàn)出例如但不限于定型內(nèi)胚層細(xì)胞典型的蛋白質(zhì)或基因表達(dá)和/形態(tài)的細(xì)胞，或者包含大量與定型內(nèi)胚層細(xì)胞類似的細(xì)胞的組合物。在本文中使用時(shí)，“肝前體細(xì)胞”或“肝祖細(xì)胞”是指表現(xiàn)出例如但不限于定型內(nèi)胚層細(xì)胞典型的蛋白質(zhì)或基因表達(dá)和/或形態(tài)的標(biāo)志物的細(xì)胞，或者包含大量與肝前體細(xì)胞或肝祖細(xì)胞的細(xì)胞類似的細(xì)胞的細(xì)胞組合物。在本文中使用時(shí)，“肝細(xì)胞”或“肝細(xì)胞樣細(xì)胞(HCLC)”用來(lái)表示表達(dá)至少一些成熟的肝臟標(biāo)志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和CYP2D6的細(xì)胞類型。在本文中使用時(shí)，“hESC-HEP”用來(lái)表示源自于人類胚胎干細(xì)胞并表達(dá)成熟的肝臟標(biāo)志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6 的
細(xì)胞類型。在本文中使用時(shí)，“hiPS-HEP”用來(lái)表示源自于誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞并表達(dá)成熟的肝臟標(biāo)志物例如白蛋白、CYP3A 4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6的細(xì)胞類型。在本文中使用時(shí)，“無(wú)異源(Xeno-free)”是指細(xì)胞系或細(xì)胞材料從來(lái)沒(méi)有直接或間接暴露于非人類動(dòng)物來(lái)源的材料，例如細(xì)胞、組織和/或體液或其衍生物。在本文中使用時(shí)，“Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所包括的途徑，如例如Nejak-Bowen 和 Monga (2008)中所綜述的。在本文中使用時(shí)，HDAC抑制劑是指組蛋白去乙?；敢种苿?。在本文中使用時(shí)，“GSK抑制劑”是指抑制GSK(尤其是GSK3，包括GSK3a或GSK3 3 )的化合物。用于本發(fā)明的優(yōu)選GSK抑制劑的實(shí)例包括下列的一種或多種:BIO (2，Z, 3’ E)_6_ 溴靛紅 _3’ -肟(GSK3 抑制劑 IX)；BIO-丙酮肟(2’ Z, 3’ E)_6_溴靛紅_3’ -丙酮肟(GSK3抑制劑X)；(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-(2-苯基喹唑啉-4-基)胺(GSK3-抑制劑XIII);吡啶咔唑-環(huán)戊二烯釕復(fù)合物(GSK3抑制劑XV)；TDZD-8 4_ 芐基 _2_ 甲基-1, 2，4_ 噻二唑啉 _3，5_ 二酮(GSK3 β 抑制劑 I)；2-硫代(3-碘芐基)-5-(1-吡啶基)-[1，3，4]_噁二唑(GSK3 3抑制劑II)；0TDZT2, 4_ 二芐基_5_氧代噻二唑啉_3_硫酮(GSK3 β抑制劑III)；a -4- 二溴苯乙酮(GSK3 β 抑制劑 VII);AR-AO 14418 N-(4-甲氧基芐基)-N’- (5_ 硝基 _1，3_ 噻唑 _2_ 基)脲(GSK-3 β抑制劑VIII)；
3-(1-(3-羥丙基)-1H_吡咯并[2，3_b]卩比啶_3_基]_4_吡嗪_2_基-批咯-2，5- 二酮(GSK-3 β 抑制劑 XI);TffSI 19吡咯并嘧啶化合物(GSK3 β抑制劑XII);L803 H-KEAPPAPPQSpP-NH2 或其肉豆蘧?；问?GSK3 β 抑制劑 XIII);和2-氯-1-(4,5-二溴-噻吩-2-基)_乙酮(GSK3 3抑制劑VI);和氨基嘧啶CHIR99021。另外，許多無(wú)翅型蛋白或Wnt蛋白的功能與GSK抑制劑、特別是本發(fā)明的GSK抑制劑相似。因此，它們被歸入術(shù)語(yǔ)GSK抑制劑下?？梢杂糜诒景l(fā)明的不例性 fct 蛋白包括 Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wntl0、Wntl4、Wntl4b、Wntl5 和 Wntl6中的一種或多種，以及其他fct蛋白。優(yōu)選使用Wnt3a。此外，小分子可用于指導(dǎo)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同樣，對(duì)誘導(dǎo)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的GSK33阻斷劑或抑制劑可以用于調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以實(shí)現(xiàn)指導(dǎo)分化和成熟。可以在起動(dòng)之后較晚的階段或在誘導(dǎo)發(fā)生之前誘導(dǎo)fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在本文中使用時(shí)，“CYP”用來(lái)表示細(xì)胞色素P，更具體地是表示細(xì)胞色素P450，細(xì)胞色素P450是肝臟的主要I相代謝酶，由許多不同的同工酶組成，例如CYP1A1、CYP1A2、CYPlBU CYP2A6/2A7/2A13、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7 和 CYP7A1。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“GST”用來(lái)表示谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，其亞型的實(shí)例是GSTAl-UGST Ml-1 和 GST Pl-10 在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“UGT”用來(lái)表示尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，它是催化葡萄糖醛酸化活性的一組肝臟酶。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞色素P450還原酶”(亦稱CPR)用來(lái)表示其生理功能是通過(guò)電子轉(zhuǎn)移來(lái)還原細(xì)胞色素P450酶并因此是細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的反應(yīng)所需要的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“功能性藥物代謝酶”用來(lái)表示屬于I相和II相酶的功能性酶，所述I相和II相酶執(zhí)行異源生物物質(zhì)和藥物的化學(xué)修飾，即所謂的藥物或異源生物物質(zhì)代謝。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“功能活性”是指有效的可測(cè)定的肝細(xì)胞功能，例如藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的可測(cè)定的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞色素P450 (CYP)的可測(cè)定的酶代謝，它們通常是在原代人類肝細(xì)胞中被檢測(cè)到的。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“胚外內(nèi)胚層(ExE)”用來(lái)表示分化的內(nèi)胚層細(xì)胞，它們與定型內(nèi)胚層相反，在人類發(fā)育中將構(gòu)成胚胎外部的區(qū)室，例如卵黃囊。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“AAT”用來(lái)表示肝臟標(biāo)志物α-抗胰蛋白酶。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“醇脫氫酶I”用來(lái)表示一種脫氫酶類型，其促進(jìn)醇與醛或酮之間的相互轉(zhuǎn)化，其中將NAD+還原為NADH。醇脫氫酶I起到分解原本可能有毒的醇的作用。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“AFP”用來(lái)表示肝臟標(biāo)志物α-甲胎蛋白。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“BSEP ”用來(lái)表示膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膽鹽輸出泵。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“CK”用來(lái)表示肝臟標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白(可互換使用)，它有不同的亞型，例如細(xì)胞角蛋白18 (CK18/KRT18)、細(xì)胞角蛋白19 (CK19/KRT19)、細(xì)胞角蛋白8 (CK8)和細(xì)胞角蛋白7 (CK7)。
在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“FGF”是指成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選為人和/或重組來(lái)源的，屬于它的亞型是例如“bFGF”(是指堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，有時(shí)也稱為FGF2)和FGF4。“aFGF”是指酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(有時(shí)也稱為FGF1)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“BMP”是指骨形態(tài)發(fā)生蛋白，優(yōu)選為人和/或重組來(lái)源的，屬于它的亞型是例如BMP4和BMP2。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“HGF”是指肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選為人和/或重組來(lái)源的。在本文中使用時(shí)，“HNF3i3 ”或“HNF3b”可互換使用，用來(lái)表示肝細(xì)胞核因子3，它是調(diào)節(jié)內(nèi)胚層來(lái)源的組織例如肝臟、胰島和脂肪細(xì)胞中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。HNF3 0有時(shí)也可以稱為HNF3b或Fox2A,后一名稱起源于該轉(zhuǎn)錄因子是叉頭框(Forkhead box)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“0CT-1”用來(lái)表示有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I。0CT-1是主要的肝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它介導(dǎo)許多有機(jī)陽(yáng)離子從血液攝取到肝臟中，化合物可以在肝臟中被代謝或分泌到膽汁中。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“MDR”用來(lái)表示多藥耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MDRl和3是ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員，二者都是藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MDRl在調(diào)節(jié)藥物、肽和異源生物物質(zhì)運(yùn)輸?shù)缴眢w中以及在保護(hù)身體對(duì)抗異源生物物質(zhì)損傷和藥物毒性方面是重要的，而MDR3是磷脂分泌到膽汁中所必不可少的。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“激活素”用來(lái)表示一個(gè)TGF-β家族成員，它表現(xiàn)出范圍廣泛的生物活性，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，例如“激活素A”或“激活素B”。激活素屬于常見(jiàn)的TGF-β配體超家族。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“ROCK抑制劑”用來(lái)表示ROCK Rho激酶的小分子抑制劑，例如Y-27632或法舒地爾。 在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“無(wú)異源”用來(lái)表示完全避開了直接或間接暴露于非人類動(dòng)物組分。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“肝細(xì)胞毒性”是指細(xì)胞反應(yīng)例如壞死性毒性、凋亡、線粒體毒性、磷脂沉積、脂肪變性和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)。發(fā)明的具體描述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于將人類多能干細(xì)胞(hPS)或肝細(xì)胞前體細(xì)胞分化成成熟肝細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟:i)在2維表面上接種hPS或肝細(xì)胞前體細(xì)胞以起始分化ii)將步驟i)的初始分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3維(3D)支架上用于進(jìn)一步分化和成熟。然而，所述細(xì)胞在3D支架上的接種密度可以高于在2D培養(yǎng)物上的接種密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。此外，可以添加Rho激酶(rock)抑制劑和/或可以在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞或無(wú)異源的條件下執(zhí)行所述方法。本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞可以是無(wú)異源的細(xì)胞，例如無(wú)異源的hPS細(xì)胞系或來(lái)源于無(wú)異源的hPS細(xì)胞系的細(xì)胞，或者所述細(xì)胞可以是人類胚胎干(hES)細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞。本發(fā)明的肝細(xì)胞前體細(xì)胞可以是定型內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞或不是定型內(nèi)胚層細(xì)胞，并且可以具有胚胎內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層的特征。可以在2至25天、例如4至15天之后執(zhí)行從步驟i)到ii)的過(guò)渡，即將步驟i)中獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3D支架上(步驟ii)。3維支架可以選自下列類型之一:i)多孔藻酸鹽海綿，ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物，iii)乳液模板型聚苯乙烯，iv)合成納米纖維復(fù)合物，V)具有至少一個(gè)非直立側(cè)壁的微孔裝置，vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海綿，或者所述3維支架可以是另一種合適的類型。多孔藻酸鹽海綿可以具有50-200 μ M的孔徑，而乳液模板型聚苯乙烯支架的孔徑在0.1-1000 μ M、例如15-45 μ M范圍內(nèi)。此外，本發(fā)明涉及如上所述的方法，其中3D支架是未涂覆的。在另一個(gè)方面，用例如一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分預(yù)先涂覆3D支架。這樣的細(xì)胞外基質(zhì)組分的實(shí)例包括:明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白、聚賴氨酸、玻連蛋白、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸水凝膠、絲纖蛋白、殼聚糖、或任何前述項(xiàng)的復(fù)合物。本發(fā)明的3D支架可以被包含在合適的培養(yǎng)容器內(nèi)，所述培養(yǎng)容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板,或其他合適的·細(xì)胞培養(yǎng)容器。因此，本文詳述的發(fā)明包括用于提高h(yuǎn)PS細(xì)胞向更具肝臟表型的細(xì)胞或最終具有部分或完全成熟的肝臟表型的細(xì)胞分化的方法，這種方法要求細(xì)胞初始被培養(yǎng)在2維培養(yǎng)表面上，然后轉(zhuǎn)移到六種可能的3維支架之一上。肝臟表型的這種改善與任何具體的細(xì)胞培養(yǎng)基的組成無(wú)關(guān)(對(duì)于所采用的細(xì)胞培養(yǎng)方案的詳情，參見(jiàn)圖9)。根據(jù)基因表達(dá)和代謝研究，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與更傳統(tǒng)的2D基體相比，3D支架為hPS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞的成熟和進(jìn)一步分化提供了更好的環(huán)境(

圖1-6)。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將細(xì)胞培養(yǎng)在2D表面上、然后將所述細(xì)胞接種到3D環(huán)境中時(shí)，有進(jìn)一步的效果。這可以通過(guò)比較幾種肝臟標(biāo)志物基因例如Cyp2C9、白蛋白、Cyp3A4和UGT2B7的表達(dá)看出，所述標(biāo)志物基因在3D支架上培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)均比在2D表面上培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)高，而與細(xì)胞系、基質(zhì)涂層、培養(yǎng)天數(shù)或所選的支架無(wú)關(guān)。特別是，當(dāng)被培養(yǎng)在3D中時(shí)，許多肝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BSEP、FABPl、MRP2、NTCP, 0ATP2、OCTI)的表達(dá)水平高得多，表明肝細(xì)胞更成熟和更具功能。在一系列不同的支架類型上，包括拓?fù)湫螒B(tài)支架(topographicalscaffolds)例如 Ultraweb (圖 3)和 Aggrewell (圖 5)、多孔海綿類型例如 AlgiMatrix (圖2)和聚L-賴氨酸(圖6)，以及在基于合成聚合物的支架例如Artelon (圖1)和Alvatex (圖4)上，都可以看到這種結(jié)果?？梢灶A(yù)先用基質(zhì)組分涂覆3D支架，以更好地類似于肝細(xì)胞正常遇到的體內(nèi)微環(huán)境。特別是，基質(zhì)組分明膠和基質(zhì)膠已經(jīng)顯示出在與支架一起使用時(shí)提高一些肝臟標(biāo)志物的表達(dá)水平。幾種標(biāo)志物(TAT，CYP2C9，0ATP2)在基質(zhì)膠涂覆的Artelon (Artimplant)上的表達(dá)高于未涂覆的(圖1C和E ;圖1A和D)。許多標(biāo)志物(TAT和UGT2B7)在基質(zhì)膠涂覆的Alvatex上的表達(dá)顯著高于未涂覆的(圖4F和G，在第18天時(shí)分析)，并且對(duì)于幾種其他標(biāo)志物(例如TAT，UGT2B7)也是如此，它們?cè)诿髂z涂覆的Alvatex上的表達(dá)程度高于未涂覆的(圖4E和G)。根據(jù)希望看到哪種標(biāo)志物高度表達(dá)，可以任選應(yīng)用本發(fā)明的這種具體實(shí)施方式
。因?yàn)樘囟ǖ臉?biāo)志物組的表達(dá)將暗含肝譜系的某些表型或階段，因此，本發(fā)明這方面的運(yùn)用可以允許程度更精細(xì)地控制所生成的肝細(xì)胞的功能性。這方面的擴(kuò)展是可以向接種到3D支架上的hPS細(xì)胞或hPS來(lái)源的肝祖細(xì)胞添加一種或多種不同的細(xì)胞類型，使得在3D支架上共同培養(yǎng)細(xì)胞系。值得注意的是，可以將細(xì)胞以不同的相對(duì)密度接種在3D支架上。相對(duì)密度可以是標(biāo)準(zhǔn)的Xl密度(即，與接種在2D對(duì)照表面上的細(xì)胞密度相同)或高三倍的初始密度(表示為x3)或高10倍的密度或其間的任何密度。圖1H和I顯示，當(dāng)使用未涂覆的Artelon(Artimplant)時(shí)，標(biāo)志物0ATP2、0CT1和TAT的表達(dá)在以較低的xl初始密度接種的細(xì)胞中更高。某些標(biāo)志物(例如CYP7A1)在未涂覆的Alvatex上以x3接種的細(xì)胞中的表達(dá)也比以xl接種的細(xì)胞中的表達(dá)低(圖4N和0)，但其他標(biāo)志物(例如OCTl)在未涂覆的Alvatex上以x3接種的細(xì)胞中具有更高的表達(dá)(圖41和K)。因此，這種具體實(shí)施方式
的運(yùn)用也取決于使用者需要的肝細(xì)胞的期望表型。為了容許控制分化，細(xì)胞被接種到3D支架上時(shí)的分化階段是相關(guān)的，即被接種到3D支架中之前培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間則表型更成熟。hPS細(xì)胞可以在幾個(gè)不同的分化階段，例如作為未分化的細(xì)胞(第O天)、或用激活素A進(jìn)行定型內(nèi)胚層誘導(dǎo)處理之后(第4-7天)、或作為肝前體細(xì)胞(第9、11、13、14和15天)，被接種到所述支架中用于在3D支架中成熟。在接種到支架上之前，可以對(duì)這樣的前體細(xì)胞進(jìn)行表征，以確定它們是處于胚胎內(nèi)胚層譜系(圖11)還是更晚期的肝細(xì)胞前體(圖12)，依據(jù)的是這兩個(gè)階段特征性的所定義的標(biāo)志物基因的表達(dá)。在被培養(yǎng)在Artelon (Artimplant)上的細(xì) 胞中容易觀察到差別，其中例如在14天時(shí)接種的細(xì)胞中OCTl的表達(dá)水平幾乎是在第11天時(shí)接種的細(xì)胞的兩倍(圖1F和H)。與此相反，在14天時(shí)接種到Artelon (Artimplant)上的細(xì)胞中，0ATP2的水平比在第11天時(shí)接種的細(xì)胞低(圖1J和M)。在被培養(yǎng)在Alvatex上的細(xì)胞中也可以看出這種趨勢(shì)，其中14日齡接種的細(xì)胞同樣具有比11天細(xì)胞低的0ATP2表達(dá)水平，這可能表明0ATP2是更不成熟的肝細(xì)胞表型的標(biāo)志物(圖41和J)。以類似的方式能夠看出，在更年輕時(shí)(第11天)接種的細(xì)胞中OCTl的水平也比更成熟(第14天)的細(xì)胞中的高(圖4N和P)。因此，細(xì)胞培養(yǎng)和分化時(shí)間的長(zhǎng)度是本發(fā)明在控制所產(chǎn)生的細(xì)胞的最終表型方面的重要因素，并可以相應(yīng)地進(jìn)行改變。如圖9和下面表中所概括的，可以調(diào)整培養(yǎng)的持續(xù)時(shí)間和培養(yǎng)基組成，以優(yōu)化通過(guò)本文中公開的方法獲得的細(xì)胞的成熟度和發(fā)育階段。相關(guān)的方面涉及細(xì)胞在接種到支架上之前所接受的分化方案，如實(shí)施例2中所詳述的，特別是細(xì)胞是否暴露于含有Rho激酶ROCK抑制劑的培養(yǎng)基，這種抑制劑被用來(lái)在2D和3D兩階段中傳代和接種之后提高存活率和再粘著。已經(jīng)觀察到，與生長(zhǎng)在常規(guī)的2D表面上的肝細(xì)胞相比，接種到3D支架上的肝細(xì)胞中的功能和代謝活性改善。根據(jù)實(shí)施例6，在3D支架中成熟的hESC來(lái)源的肝細(xì)胞，當(dāng)暴露于藥物非那西汀(APAP)、咪達(dá)唑侖或雙氯芬酸時(shí)，顯示出比2D對(duì)照培養(yǎng)更高的CYP活性誘導(dǎo)(圖7和8、10),其中Alvatex支架顯示出比Ultraweb更高的誘導(dǎo)。對(duì)培養(yǎng)在Alvatex(Reinnervate)上的細(xì)胞的進(jìn)一步研究顯示,在起始分化之后23和29天時(shí),如由CYP2C9活性所測(cè)定的，那些細(xì)胞均比培養(yǎng)在2D表面上的細(xì)胞具有高得多的代謝活性。CYP2C9活性在培養(yǎng)在3D表面上的細(xì)胞中已經(jīng)是高的，但是當(dāng)用雙氯芬酸處理細(xì)胞時(shí)還觀察到升高(圖8)。這再次顯示在3D支架上分化的肝細(xì)胞在與2D培養(yǎng)物細(xì)胞相比時(shí)，具有優(yōu)異的肝細(xì)胞代謝功能。這些結(jié)果得到以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持:當(dāng)對(duì)藥物咪達(dá)唑侖的細(xì)胞代謝分解產(chǎn)物進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)與2D對(duì)照相比，關(guān)鍵的肝臟標(biāo)志物CYP3A在培養(yǎng)在基質(zhì)膠涂覆的Alvatex(Reinnervate)上的細(xì)胞中的水平也較高,在培養(yǎng)在Ultraweb上的細(xì)胞中的水平略高(圖8)。因此，本發(fā)明已經(jīng)顯示了在培養(yǎng)在3D支架上的細(xì)胞中肝代謝活性提高的幾個(gè)實(shí)施例。因此，正如以上的討論，本發(fā)明的一方面涉及一種方法，其中如由一種或多種CYP標(biāo)志物例如CYP2C9或CYP3A的表達(dá)增加和/或選自CYP1A1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT的肝細(xì)胞相關(guān)遺傳標(biāo)志物的水平升高所顯示的，肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞表現(xiàn)出代謝活性升高。此外，本發(fā)明的一方面涉及一種方法，其中肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞表現(xiàn)出一種或多種肝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如BSEP、FABPl、MRP2、NTCP、0ATP2、OCTl的表達(dá)增加。正如以上的討論，本發(fā)明方法刺激了肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞與非肝細(xì)胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%ο前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中將肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞與至少一種其他細(xì)胞類型共同培養(yǎng)在3D支架上，所述其他細(xì)胞類型選自但不限于:星形肝細(xì)胞、肝免疫(Kuppfer)細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。因此并且正如以上的討論，本發(fā)明的一方面涉及可通過(guò)本文中描述的方法獲得的hPS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞或者包含hPS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞的組合物。本發(fā)明的其他方面涉及通過(guò)本文中的方法獲得的hPS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞或者包含hPS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞的組合物在治療、再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選、毒性測(cè)試或藥物遞送中的應(yīng)用。所述組合物還可以包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸鹽海綿、可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物、乳液模板型 聚苯乙烯或合成納米纖維復(fù)合物。
實(shí)施例實(shí)施例L來(lái)源于人類多能干細(xì)胞的肝細(xì)胞的起始材料所有hPS細(xì)胞(如上所定義)均可被用作本發(fā)明的起始材料。對(duì)于下面的實(shí)施例而言，肝細(xì)胞樣細(xì)胞在體外來(lái)源于被培養(yǎng)在mEF細(xì)胞上的未分化人類胚胎干細(xì)胞(hESC)(Heins, N.等2004，Stem Cells)。用于這個(gè)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞系可以是、但不限于hES細(xì)胞系SA002、SA121、SA181、SA461 (Cellartis AB，CiGteborg,瑞典，http://www.cellartis.com),并且它們可以如Heins，N等2004所描述的進(jìn)行增殖。在NIH干細(xì)胞登記處、UK干細(xì)胞庫(kù)和歐洲hESC登記處中列出了這些細(xì)胞系，并且可通過(guò)請(qǐng)求來(lái)獲得這些細(xì)胞系。與從hESC獲得的hPS—起，從hiPS (誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)獲得的hPS已被用于在本發(fā)明實(shí)施例中獲得肝細(xì)胞。在這種情況下，“hiPS-HEP”用來(lái)表示源自于誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞并表達(dá)成熟的肝臟標(biāo)志物例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6的細(xì)胞類型(也參見(jiàn)“定義”)。無(wú)異源的iPS細(xì)胞或無(wú)異源來(lái)源的hES細(xì)胞系例如SA611(Cellartis AB, GSteborg，瑞典,http://www.cellartis.com)的應(yīng)用可以任選讓整個(gè)發(fā)明
在無(wú)異源的條件下用于產(chǎn)生無(wú)異源的細(xì)胞產(chǎn)物。實(shí)施例2.
利用3D支架從人類多能干細(xì)胞獲得肝細(xì)胞
按照下面詳述的方案a-e，從hES細(xì)胞和人類hiPS細(xì)胞二者獲得肝細(xì)胞。在開始分化之前，用PBS洗滌培養(yǎng)物兩次。新鮮制備不同的培養(yǎng)基(表1)，并從O天以后根據(jù)方案概述添加所述培養(yǎng)基。在初始分化(ID)步驟期間，每天或每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基，以后每?jī)商旎蛎咳旄鼡Q培養(yǎng)基。每個(gè)實(shí)驗(yàn)只使用一種細(xì)胞系，但是任選在將初始細(xì)胞系接種到3D支架上時(shí)可以添加第二種(或更多種)細(xì)胞系，讓所述細(xì)胞共同培養(yǎng)。除了在實(shí)驗(yàn)114和116中，2D培養(yǎng)物被接種在明膠涂覆的培養(yǎng)容器上之外，2D培養(yǎng)物均被接種在基質(zhì)膠涂覆的培養(yǎng)容器上。2D培養(yǎng)物以150.000-200.000細(xì)胞/cm2進(jìn)行接種。下表顯示了關(guān)于不同實(shí)驗(yàn)、哪種細(xì)胞系被用作起始材料、如圖9中概括的不同形式的分化方案、分化方案中細(xì)胞被接種到3D支架中時(shí)的時(shí)間、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析時(shí)的分化時(shí)間、和在接種到支架中時(shí)是否向培養(yǎng)基添加了 IOmM ROCK抑制劑的概述(對(duì)于所采用的方案的示意性細(xì)節(jié)，也參見(jiàn)圖9):
權(quán)利要求
1.關(guān)于將人類多能干細(xì)胞(hPS)或肝細(xì)胞前體細(xì)胞分化成肝細(xì)胞祖細(xì)胞、肝細(xì)胞樣細(xì)胞或成熟肝細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟: i)在2維表面上接種和生長(zhǎng)hPS或肝細(xì)胞前體細(xì)胞以起始分化 ii)將步驟i)的初始分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3維(3D)支架上用于進(jìn)一步分化和成熟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞在3D支架上的接種密度高于在2D培養(yǎng)物上的接種密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在細(xì)胞存活因子例如ROCKRho激酶抑制劑的存在下接種細(xì)胞。
4.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下執(zhí)行步驟i)或ii)中的至少一個(gè)。
5.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在無(wú)異源的條件下執(zhí)行步驟i)或ii)中的至少一 個(gè)。
6.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中hPS細(xì)胞或肝細(xì)胞前體細(xì)胞是無(wú)異源的細(xì)胞，例如來(lái)源于無(wú)異源的hPS細(xì)胞系。
7.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中hPS細(xì)胞是人類胚胎干(hES)細(xì)胞。
8.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中hPS細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中肝細(xì)胞前體細(xì)胞是定型內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中肝細(xì)胞前體細(xì)胞不是定型內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞。
11.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中肝細(xì)胞前體細(xì)胞具有胚胎內(nèi)胚層的特征。
12.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中肝細(xì)胞前體細(xì)胞具有肝內(nèi)胚層的特征。
13.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在2至25天、例如4至15天之后，將步驟i)中獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3D支架上(步驟ii)。
14.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中3D支架選自下列之一: i)多孔藻酸鹽海綿 ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物 iii)乳液模板型聚苯乙烯 iv)合成納米纖維復(fù)合物 V)具有至少一個(gè)非直立側(cè)壁的微孔裝置 vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海綿。
15.權(quán)利要求14的方法，其中3D支架是孔徑為50-200μ M的多孔藻酸鹽海綿。
16.權(quán)利要求14的方法，其中3D支架是孔徑在0.11000 μ Μ、例如15-45 μ M范圍內(nèi)的乳液模板型聚苯乙烯支架。
17.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中3D支架是未涂覆的。
18.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中用一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分預(yù)先涂覆3D支架。
19.權(quán)利要求18的方法，其中一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)組分選自:明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白、聚賴氨酸、玻連蛋白、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸水凝膠、絲纖蛋白、殼聚糖、或任何前述項(xiàng)的復(fù)合物。
20.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中支架被包含在合適的培養(yǎng)容器內(nèi)，所述培養(yǎng)容器例如多孔板，包括但不限于6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、96孔板、384孔板、1536孔板，或其他合適的細(xì)胞培養(yǎng)容器。
21.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法,其中如由一種或多種CYP標(biāo)志物例如CYP2C9或CYP3A的表達(dá)增加所顯示的，肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞表現(xiàn)出代謝活性升高。
22.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞表現(xiàn)出一種或多種肝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如BSEP、FABP1、MRP2、NTCP、0ATP2、0CT1的表達(dá)增加。
23.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞與非肝細(xì)胞相比的比例大于5%，例如10%、例如20%、例如30%、例如40%、例如50%、例如60%、例如70%、例如80%、例如90%、例如100%ο
24.述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中將肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞與至少一種其他細(xì)胞類型共同培養(yǎng)在3D支架上， 所述其他細(xì)胞類型選自但不限于:星形肝細(xì)胞、肝免疫(Kuppfer)細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮 細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。
25.PS來(lái)源的肝細(xì)胞、肝細(xì)胞樣細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞，其顯示出選自下列的肝細(xì)胞相關(guān)遺傳標(biāo)志物的水平升高:CYPIA1、CYPIA2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
26.權(quán)利要求25的hPS來(lái)源的肝細(xì)胞、肝細(xì)胞樣細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞，其被培養(yǎng)在或已經(jīng)被培養(yǎng)在3D支架中，并且當(dāng)與生長(zhǎng)在2D表面上的相應(yīng)細(xì)胞相比時(shí)，顯示出一種或多種以下標(biāo)志物的水平升高:CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A7、CYP7A1、MRP2、白蛋白、UGT2B7、AAT、TAT。
27.PS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞，其可通過(guò)權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)描述的方法獲得。
28.權(quán)利要求27的hPS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞在治療、再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選、毒性測(cè)試或藥物遞送中的應(yīng)用。
29.合物，其包含可通過(guò)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)描述的方法獲得的hPS來(lái)源的肝細(xì)胞或肝細(xì)胞祖細(xì)胞。
30.權(quán)利要求29的組合物，其還包含3D支架，例如但不限于多孔藻酸鹽海綿、可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物、乳液模板型聚苯乙烯或合成納米纖維復(fù)合物。
31.權(quán)利要求29-30任一項(xiàng)的組合物在治療、再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選、毒性測(cè)試或藥物遞送中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及合成或動(dòng)物來(lái)源的3維(3D)生物支架作為基體用于提高h(yuǎn)PS(人類多能干細(xì)胞)的生長(zhǎng)和分化的應(yīng)用；這些支架適合與現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室塑料器皿一起使用。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及用hPS細(xì)胞接種單獨(dú)的或具有各種生物基質(zhì)涂層的這些支架，以提高所述hPS細(xì)胞分化成肝細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞類型。本發(fā)明還涉及將部分分化的肝細(xì)胞祖細(xì)胞接種到支架上，以進(jìn)一步分化成更成熟的肝細(xì)胞細(xì)胞類型。
文檔編號(hào)C12N5/071GK103097517SQ201180037237
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者楊內(nèi)·延森 申請(qǐng)人:塞拉帝思股份公司