專利名稱：：一種表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因植物，尤其涉及植酸酶重組表達(dá)載體以及由該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物所得到的表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明還涉及該植酸酶重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因植物的制備方法以及該轉(zhuǎn)基因植物作為動物飼料的應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：磷是動物生長、發(fā)育、繁殖所必需的重要礦物元素。植酸磷(六磷酸肌醇)，是谷物、豆類和油料等作物籽實(shí)中磷和肌醇的基本貯存形式，含量高達(dá)1-5%，占植物中總磷的60-80%(NelsonT.S.""/，PoultrySci.47:1842-1848,1968)，是動物飼料中的重要成分。但是由于單胃動物體內(nèi)缺乏能分解植酸的酶，導(dǎo)致以植酸磷形式存在的磷不能被直接利用，其利用率僅有0—40%，從而在飼養(yǎng)過程中造成了許多問題一、磷源浪費(fèi)。首先是飼料中磷源不能得到有效利用；其次，為了滿足動物對磷的需求，實(shí)際生產(chǎn)中要在飼料中額外添加無機(jī)磷，因此提高了飼料成本。二、形成的高磷糞便污染環(huán)境。飼料中85%左右的植酸磷不能被動物有效利用而直接排出體外，造成嚴(yán)重的土壤和水源磷污染，引發(fā)例如水環(huán)境的富營養(yǎng)和藻類過度生長等不良情況。三、植酸磷是抗?fàn)I養(yǎng)因子，在動物胃腸道的消化吸收過程中與鈣及其它多種金屬離子、蛋白質(zhì)和一些營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，形成不易被單胃動物吸收和利用的鏊合物，不但造成磷源浪費(fèi)而且影響了這些營養(yǎng)物質(zhì)特別是鈣離子的吸收利用，不僅增加了詞料成本還降低了動物生產(chǎn)性能。我國是世界上最大的禽畜養(yǎng)殖大國，每年產(chǎn)生禽畜糞便高達(dá)17.3億噸，糞便磷排放量為363萬噸。因高磷糞便帶來的環(huán)境污染問題非常嚴(yán)重。同時，我國也是缺磷大國，磷是我國飼料業(yè)中僅次于蛋白質(zhì)的第二大缺口資源。其實(shí)，飼料作物如谷物、玉米、大豆、油菜等的總磷含量一般在1%左右，其含量足以滿足動物對憐的營養(yǎng)需求。如何通過品質(zhì)改良來提高飼料作物中磷的可利用率，減輕高磷糞便造成的污染問題,是我國禽畜業(yè)需要解決的迫切問題。植酸酶是一種能將植酸磷降解成肌醇和無機(jī)磷酸的酶，作為飼料添加劑它可使玉米等植物性詞料中磷的利用率提高60%，動物糞便中磷的排出量減少40%,從而減少飼料中無機(jī)磷的添加量，降低飼料成本，減少高磷糞便造成的環(huán)境污染，還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。植酸酶作為新型單胃動物飼料添加劑,年銷售額估計為1億美元，且不斷增長。主要應(yīng)用于豬、雞、鴨等單胃動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖類動物，應(yīng)用范圍廣、需求量大，其優(yōu)良的飼喂效果在世界范圍內(nèi)得到確認(rèn)，對提高畜牧生產(chǎn)效益及降低其對環(huán)境的污染有重要意義。(WareJ.H.USPatentNo.3297548,1967;NelsonT.S.e"/"J.Nutrition101:1289-1294,1971)。隨著植酸酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，人們意識到通過基因工程手段來提高飼料作物中磷的可利用率是一更有效、更切實(shí)可行的思路，它的基本原理是在不降低作物中植酸磷本身含量的情況下，在植酸磷存在的同時也使作物含有植酸酶，在動物消化過程中自動將植酸磷降解成可利用的無機(jī)磷。中國專利申請?zhí)枮?3137476.X的發(fā)明專利申請公開了一種利用基因工程方法在轉(zhuǎn)基因植物中高效生產(chǎn)植酸酶的方法，但該方法存在如下幾方面的不足，有待改進(jìn)(1)表達(dá)的外源蛋白沒有定位到合適的細(xì)胞器中，因而酶蛋白不穩(wěn)定，實(shí)際表達(dá)量減少，最終導(dǎo)致酶活性較低(僅300-2000U/Kg);(2)使用的種子特異性啟動子僅在胚中表達(dá)；(3)僅選用了一個植酸酶基因，該植酸酶最適pH中性，比活性為100U/mg，適用范圍較窄。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一類新的植酸酶植物重組表達(dá)載體，該植酸酶植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到受體植物中后，可在植物器官(種子、葉片、莖桿)中高效、定點(diǎn)表達(dá)，得到富含植酸酶的植物飼料新品種。本發(fā)明目的之一是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的植酸酶植物重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體主要含有以下序列啟動子序列，來源于微生物的植酸酶基因，信號肽和蛋白體定位序列和終止子序列。其中所述的啟動子可以為單子葉植物組成型啟動子，如Ubi啟動子或CaMV35S啟動子，也可以是單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子，還可以是單子葉植物組織特異性啟動子；在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的啟動子是玉米胚芽特異性啟動子(SEQIDNO:3)或玉米胚乳特異性啟動子(SEQIDNO:5)。所述的玉米胚特異表達(dá)的啟動子和終止子可分別根據(jù)GenBank登記號L22344和L22345設(shè)計引物，分別擴(kuò)增得到來自于玉米基因組DNA中玉米胚芽蛋白的啟動子和終止子片段。所述的玉米胚乳特異表達(dá)的啟動子和終止子序列可根據(jù)文獻(xiàn)(Woo,a/.2001，Plantcell.OcU3(10):2297-317)來設(shè)計引物分離得到。所述來源于微生物的植酸酶基因優(yōu)選自真菌」^erg"tom'gw(黑曲霉)(專利號為ZL97121731.9)中的植酸酶基因(SEQIDNO:1)或來源于細(xì)菌Esc/^Wc/w'"coZ/中的植酸酶基因(SEQIDNO*.2)。所述的植酸酶基因可通過以下方法制備得到(1)來源于黑曲霉的植酸酶基因SeqIDNo:1的制備菌株來源真菌m'ger963(黑曲霉)(專利號為ZL97121731.9)，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心的保藏登記號為微生物保藏號為CGMCC:0332;根據(jù)該菌株基因序列設(shè)計引物上游引物5，CAATTGATCAATGCTGGCAGTCCCCGCCT3,下游弓l物5'GCTCTAGACCTAGGC丁AAGCAAAACACTCCGCCC3'用上述菌株的基因組DNA作為模板，擴(kuò)增得到酸性植酸酶基因S叫IDNo:1，因該基因來源于yls^erg///^"/ger963，因此簡稱為AO。(2)來源于細(xì)菌foc/2eWc/2/aco//的APPA-m基因(GenBankM58708)序列(SeqIDNo:2):將來源于細(xì)菌co/Z的APPA基因(GenBank58708)經(jīng)過密碼子優(yōu)化改造得到appA-m基因(GenBankDQ513832)，基因改造的具體方法見中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文"高效表達(dá)高比活植酸酶-提高植酸酶發(fā)酵效價的新途徑，，(羅會穎，2003年)，因該基因來源于appA-m，因此簡稱為MO。所述的信號肽和蛋白體定位序列優(yōu)選為SEQIDNO:9所示的核苷酸序列(引導(dǎo)基因產(chǎn)物分泌和定位的信號肽序列，控制基因產(chǎn)物的定位，該信號肽和蛋白體定位序列可以引導(dǎo)植酸酶定位到細(xì)胞的蛋白體中)。所述的終止子序列優(yōu)選為SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示的序列。作為最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明所述的植物重組表達(dá)載體選自下述載體中的任意一種PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO。本發(fā)明目的之二是提供一種構(gòu)建上述植酸酶植物重組表達(dá)載體的方法，該方法包括將信號肽和蛋白體定位序列，來源于微生物的植酸酶基因和終止子序列連接在一起后，可操作的連接到啟動子序列之后。作為一種最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20723AO或PHP20723MO的構(gòu)建方法如下1、構(gòu)建表達(dá)載體PHP20723:(a)合成SeqIDNo:9所示的信號肽和蛋白體定位序列融合片段；(b)按照現(xiàn)有技術(shù)分離得到SeqIDNo:3所示的玉米胚特異表達(dá)的啟動子序列；(c)按照現(xiàn)有技術(shù)分離得到S叫IDNo:4所示的玉米胚芽蛋白終止子序列；(d)將S叫IDNo:9和SeqIDNo:3融合在一起后再與SeqIDNo:4先后克隆到pSP72載體上，構(gòu)建成表達(dá)載體PHP20723;2、將植酸酶基因(SeqIDNo:1)用Bell和Xbal酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20723相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20723AO;將植酸酶基因SeqIDNo:2用iVcoI和SmaI酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20723相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20723MO。本發(fā)明植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20754AO或PHP20754MO的構(gòu)建方法如下1、構(gòu)建表達(dá)載體PHP20754:(a)合成SeqIDNo:9所示的信號肽和蛋白體定位序列融合片段；(b)按照現(xiàn)有技術(shù)分離得到SeqIDNo:5所示的玉米胚乳蛋白啟動子片段；(c)按照現(xiàn)有技術(shù)分離得到分離得到SeqIDNo:6所示的玉米胚乳蛋白終止子片段；(d)將SeqIDNo:5禾t1S叫IDNo:9融合，將融合后的片段與SeqIDNo:6先后克隆到pSP72載體上，構(gòu)建表達(dá)載體PHP20754;2、將植酸酶基因(SeqIDNo:1)用Bell和Smal酶切后的產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20754相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20754AO;將植酸酶基因S叫IDNo:2用TVcoI和SmaI酶切后的產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20754相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20754MO。本發(fā)明為了提高所表達(dá)的外源蛋白的穩(wěn)定性，特意將ZM-Proaleurain的信號肽序列和液泡定位序列分別構(gòu)建在以上重組表達(dá)載體上，這兩個序列將引導(dǎo)所表達(dá)的重組植酸酶定位到液泡的蛋白體中，從而顯著提高所表達(dá)植酸酶的酶活。本發(fā)明所構(gòu)建的植物重組表達(dá)載體或含有這些載體的工程菌株轉(zhuǎn)化到受體農(nóng)作物中尤其是重要的飼料用農(nóng)作物中，所得到的轉(zhuǎn)基因植物可以在種子中高效表達(dá)植酸酶。所述的植物重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物的方法可為本領(lǐng)域的常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，例如可以是農(nóng)桿菌侵染法、基因槍法、PEG介導(dǎo)法、種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)法、電擊穿孔法或微注射法，本發(fā)明優(yōu)選為農(nóng)桿菌侵染法或基因槍法，更優(yōu)選為基因槍法；所述的受體農(nóng)作物優(yōu)選為油菜、玉米、大豆或小麥，更優(yōu)選為玉米。為了便于篩選成功轉(zhuǎn)化的作物同時為了更好的符合安全性要求，上述轉(zhuǎn)化方法中還包括構(gòu)建植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體，將本發(fā)明植物重組表達(dá)載體與植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化受體作物，選育得到表達(dá)植酸酶而不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因作物。為了選育得到表達(dá)植酸酶而且不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物，更符合安全性要求，通過共轉(zhuǎn)化策略(Co-transformation)，將抗性選擇標(biāo)記基因和植酸酶基因分別構(gòu)建于不同的表達(dá)載體上，這樣在轉(zhuǎn)基因植物后代選育中，可以利用后代分離，得到表達(dá)植酸酶且不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物。所述的植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體的構(gòu)建可按照常規(guī)方法進(jìn)行，所述的選擇標(biāo)記基因可選自Bar基因(除草劑抗性的選擇性標(biāo)記)、Npt-II基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、DHFR基因(二氫葉酸還原酶基因)、Gent基因(慶大霉素抗性基因)等，優(yōu)選為Bar基因。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)的實(shí)施方案，所述的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體為用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar。作為一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)化實(shí)施方案，將本發(fā)明表達(dá)載體PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO分別與抗性選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar等摩爾比混合后，用于基因槍微彈制備，轉(zhuǎn)化外植體。更優(yōu)選為將本發(fā)明表達(dá)載體PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO、PHP20754MO以及選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar去除細(xì)菌骨架DNA后，分別得到植酸酶基因表達(dá)盒以及PHP17042Bar的Bar基因的表達(dá)盒，將Bar基因的表達(dá)盒分別與以上四種植酸酶基因表達(dá)盒等摩爾比混合，用于基因槍微彈制備，轉(zhuǎn)化玉米外植體。所述外植體優(yōu)選為玉米幼胚或幼胚誘導(dǎo)形成的愈傷組織，大豆的子葉、油菜的具柄子葉。本發(fā)明將來源于微生物并能耐受飼料制粒等高溫加工的植酸酶基因轉(zhuǎn)移到飼料用植物品種中，并在植物器官(種子、葉片、莖桿)中高效、定點(diǎn)表達(dá)，培育富含植酸酶的植物詞料品種，可以大量、廉價生產(chǎn)植酸酶。而且富含植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物可直接、方便而有效地應(yīng)用于動物飼料中，以降解植物自身的植酸磷，來滿足動物對磷源的需求，而無須在飼料中添加磷酸氫鈣或添加通過發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的植酸酶添加劑，不僅提高動物對飼料中磷的利用率，也緩解動物高磷糞便造成的環(huán)境污染。無論從經(jīng)濟(jì)角度還是從使用方便的角度來說，都更為優(yōu)越。其優(yōu)勢如下1、原材料通過農(nóng)業(yè)方式獲得生產(chǎn)成本低廉，而且通常這些植物材料是飼料的主要成分，可以直接飼喂動物或加工飼料；2、相對于發(fā)酵的方法，使用植物生物反應(yīng)載體，無需發(fā)酵工藝必不可少的設(shè)備，大大降低了資本投資；3、使用植物生物載體生產(chǎn)規(guī)模可以迅速擴(kuò)大。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物種子作為磷源植物飼料可以得到廣泛應(yīng)用。圖1PHP20723AO示意圖(摘要副圖)。圖2PHP20754AO示意圖。圖3PHP17042示意圖。圖4轉(zhuǎn)基因玉米T2植株植酸酶基因PCR檢測結(jié)果。1-10，16-25:陽性植株；11-12:陰性植株；13:100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)；14:陽性對照；15:陰性對照。圖5轉(zhuǎn)基因玉米事件49-11-01的T2代植株Southern-blot結(jié)果。1:陽性對照；2、3:植株l五coRI、五coRV酶切；4、5:植株2五coRI、五coRV酶切；6、7:植株3五coRI、五coRV酶切；8、9:植株4EcoRI、ficoRV酶切；10、11:植株5EcoRI、五coRV酶切；12:陰性對照植株；13:1Kb分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6玉米中植酸酶活性測定的流程圖。圖7磷酸二氫鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(橫坐標(biāo)為OD值，縱坐標(biāo)為磷酸二氫鉀濃度nmol/L)。圖8PHP20754AO兩個事件的Western-blot結(jié)果。1、陰性對照，2、蛋白marker,3、CK+未去糖基化，4、CK+去糖基化，5、1276-4的胚，6、1276-4的胚乳(事件B57-10-07)，7、1280-1的胚，8、1280-1的胚乳，9、1283-10的胚，1283-10的胚乳(事件B46-17-05)。圖9PHP20723AO兩個事件的Western-blot結(jié)果。1、陰性對照，2、蛋白marker,3、CK+未去糖基化，4、CK+去糖基化，5、1203-5的胚，6、1203-5的胚乳(事件B49-02-02)，7、1733-5的胚，8、1733-5的胚乳(事件B49-03-03)，9、CK-胚，10CK-胚乳。本發(fā)明將進(jìn)一步描述下列實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:1、材料的準(zhǔn)備植酸酶基因如前所述使用專利號為ZL97121731.9的植酸酶基因和appA-m基因。菌種大腸桿菌￡.co//DH5a、JM109。工具酶和修飾酶各種限制性內(nèi)切酶、修飾酶、pGEM5Zf質(zhì)粒和pGEMT-easy載體購自Promega公司，NewEnglandBiolabs公司禾口TakaraBio公司?；瘜W(xué)試劑酵母浸膏和胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司，CHU(N6)大量鹽購自Gibco公司，組織培養(yǎng)用的其它試劑和激素購自Sigma公司。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物及片段合成由北京奧科生物工程公司和上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。測序由上海申能博彩生物技術(shù)有限公司完成?；驑尲八煤牟馁徸訠io-Rad公司。2、植酸酶基因表達(dá)載體構(gòu)建-(1)載體PHP20723的構(gòu)建片段l:合成信號肽(ZM-PROLEURAINSP，signalpeptide)和液泡蛋白體定位序列片段(ZM-PROLEURAINVTS，vacuoletargetings叫uence)，在片段5'端和3，端分別包含WcoI和&/HI位點(diǎn)CCGACCGCGCGGCCTCCGCGCTCGAGGGATCC(SeqIDNo:9);片段2:分離用于玉米中胚特異表達(dá)的啟動子根據(jù)GenBank登記號L22344設(shè)計引物(上游引物5'AAGCTTGCCGAGTGCCATCCTT3'，下游引物5'CCATGGGTTGGCTGTATGCAGAA3')，擴(kuò)增(反應(yīng)條件94。C，5分鐘；94°C，1分鐘；52°C，l分鐘；72°C，l分鐘；35個循環(huán)；72"C延伸5分鐘。)得到來自于玉米基因組DNA中玉米胚芽蛋白Globulinl的啟動子(GLBlPro;DescribedbyBelanger,F.C.andKriz,A.L.(1991)"MolecularBasisforAllelicPolymorphismoftheMaizeGlobulin-1gene"Genetics129:863-972.)，在片段的5'端和3，端分別包含///"^11歸col位點(diǎn)(SeqIDNo:3);片段3:分離終止子片段根據(jù)GenBank登記號L22345設(shè)計引物(上游引物5'GAGCTCGCCAAAACGAGCAGGAA3，；下游引物5，GAATTCGTTTTATGAATAATAATAAT3，)，擴(kuò)增(反應(yīng)條件94。C，5分鐘；94°C，1分鐘；52°C，1分鐘；72°C，l分鐘；35個循環(huán)；72匸延伸5分鐘。)得到來自于玉米基因組DNA中玉米胚芽蛋白Globulinl的終止子(GLBlTerm),在片段的5'端和3'端分別包含I和￡coRI位點(diǎn)(S叫IDNo:4);將上述片段1和片段2融合，即歷"^HoI啟動子元件和TVcoI-5amHI定位序列元件融合后，得到州WIII-B纖HI片段，將融合后的幼W1II-5纖HI片段與片段3SacI-feoRI片段分別先后克隆到pSP72載體上(購自Promega公司)，構(gòu)建成表達(dá)載體PHP20723。(2)載體PHP20754的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)(Woo,e"/.2001，Plantcell.Oct.l3(10):2297-317)設(shè)計引物分離用于玉米中胚乳特異表達(dá)的Leguminl啟動子(ZM-LEG1APR0)和終止子(ZM-LEG1TERM):啟動子片段上游引物5，AAGCTTGATATCGAGTCAGGTCAA3，；下游引物5，CCATGGCAGCGCTGCCTCTGCTCGCT3，。終止子片段上游弓l物5'CCCGGGAGATCCGCACAACCTCA3，；下游引物5，GAATTCAGTATAACTATGCCGAGGTT3，。片段4:擴(kuò)增(反應(yīng)條件94匸，5分鐘；94°C，l分鐘；52°C，l分鐘；72°C，l分鐘；35個循環(huán)；72"C延伸5分鐘。)得到來自玉米基因組DNA中玉米胚乳蛋白的啟動子片段，該啟動子片段的5'端和3'端分別包含///"^111和臉0I位點(diǎn)(SeqIDNo:5);片段5:擴(kuò)增(反應(yīng)條件94。C，5分鐘；94°C，1分鐘；52°C，1分鐘；72°C，l分鐘；35個循環(huán)；72"延伸5分鐘。)得到來自玉米基因組DNA中玉米胚乳蛋白的終止子片段，該終止子片段的5'端和3'端分別包含Smal和五coRl位點(diǎn)(SeqIDNo:6);將片段4和片段1融合，即///m/III-WcoI啟動子元件和I-5fl/nHI定位序列元件融合后，得到///m/III-5amHI片段，將I片段再與片段5即I-￡coRI片段先后克隆到pSP72載體上，構(gòu)建成表達(dá)載體PHP20754。(3)植酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建來源于真菌^sp^^〃u963(黑曲霉)(專利號為ZL97121731.9，在中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心的保藏登記號為CGMCC:0332)的植酸酶基因序列為SeqIDNo:1，根據(jù)基因序列及載體上表達(dá)盒各元件的連接點(diǎn)序列，合成以下一對引物上游引物序列為CAATTGATCAATGCTGGCAGTCCCCGCCT(下劃線所示為位點(diǎn))，下游引物序列GCTCTAGACCCGGGCTAAGCAAAACACTCCGCCC(下劃線為酶切位點(diǎn)J^al和Sw"I)。從上述黑曲霉基因組DNA中擴(kuò)增(反應(yīng)條件94。C，5分鐘；94°C，l分鐘；52°C，1分鐘；72°C，1分半鐘；35個循環(huán)；72'C延伸10分鐘)植酸酶基因，經(jīng)Bell和Xbal或Bell和Smal酶切后的產(chǎn)物分別與經(jīng)過Bell和Xbal酶切處理的載體PHP20723、或Bell禾卩Smal酶切處理的PHP20754連接，構(gòu)建得到PHP20723AO，PHP20754AO，重組載體示意圖見圖1和2。來源于細(xì)菌五sc/zen'c/z/"co//的appA基因(GenBank58708)，經(jīng)過密碼子優(yōu)化改造得到的appA-m基因(GenBankDQ513832，SeqIDNo:2所示)，為便于進(jìn)一步的克隆和在植物中表達(dá)，去除該基因N端的信號肽序列66個堿基(堿基1到堿基66)，根據(jù)該序列，由北京奧科公司制備合成appA-m基因與來自玉米的信號肽序列和液泡定位序列(SeqIDNo:9)相連接的融合片段，5，端分別包括WCOI位點(diǎn)，3，端包括SmflI位點(diǎn)，用臉oI和SmaI酶切后將該片段與經(jīng)過同樣處理的載體PHP20723和PHP20754相連，得到PHP20723MO和PHP20754MO，二者的結(jié)構(gòu)圖除基因不同外與PHP20723AO，PHP20754AO—致。3、選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體構(gòu)建PHP17042Bar是為本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒，構(gòu)建過程如下PHP17042構(gòu)建示意圖見圖3，分別含有H2B(HistoneB)啟動子，H2B啟動子序列在文獻(xiàn)中有報道(Harvey,R.P.，Robbins,A.J.，andWells,J.R.E.(1982)NucleicAcidsRes.10,7851-7863)，根據(jù)文獻(xiàn)合成序列(SeqIDNo:7)，5，和3，端分別包含HindIII和PstI位點(diǎn)。PINII(ProteinaseInhibitorII)終止子來自馬鈴薯，根據(jù)文獻(xiàn)(Ko,K.,Norelli，J.L.，Reynoird,J.-P.，Boresjza陽Wysocka,E.，Brown,S.K.&Aldwinckle,H.S.(2000)Biotechnol.Lett.22,373-381)合成序歹ij(SeqIDNo:8)，5，和3'端分別包含Smal和Sacl位點(diǎn)。兩個片段先后連接于載體pUC119(購買自Promega公司)。用尸WI酶切載體pAHC25(pAHC25按照以下文獻(xiàn)構(gòu)建而成ChristensenAHandQuailHP(1996)TransgenicRes5:213-218.)分離得到玉米Ubiquitin基因的5'端非翻譯區(qū)和第一個內(nèi)含子，以尸WI片段連結(jié)到上述H2B啟動子和PINII終止子之間的尸WI單切點(diǎn)，得到PHP17042。Bar基因從載體pAHC25(pAHC25按照以下文獻(xiàn)構(gòu)建而成ChristensenAHandQuailHP(1996)TransgenicRes5:213-218.)上用酶切得到，pGEM5Zf經(jīng)Pstl酶切后，脫磷酸化，與Bar基因片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定測序后得到pGEM5ZfBar;BamHI和EcoRV酶切pGEM5Zffiar，BamHI和Smal酶切PHP17042，按常規(guī)方法分別回收目的片段，將兩片斷按照常規(guī)方法連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Exoli感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后得到選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar，重組載體圖見圖3。實(shí)施例2轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物1、基因槍介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的配制和玉米基因槍轉(zhuǎn)化方法參照《植物細(xì)胞，組織和器官培養(yǎng)基本方法》(PlantCell,TissueandOrganCulture:fundamentalmethods/O丄.Gamborg,G.C.Phillipseds.，Springer)—書中的方法進(jìn)行。選擇培養(yǎng)保持愈傷的培養(yǎng)基中加入3mg/L的BASTA作為選擇壓力，對被轉(zhuǎn)化的材料進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每兩周繼代一次。再生經(jīng)過兩個月的選擇培養(yǎng)后，抗性愈傷在選擇性培養(yǎng)基上生長迅速，顏色新鮮。將抗性愈傷轉(zhuǎn)到再生培養(yǎng)基上，兩到三周后，即可得到成熟的胚狀體。將胚狀體放到MS培養(yǎng)基上生根，即得到再生玉米苗。植酸酶表達(dá)盒PCR陽性的植物轉(zhuǎn)到土壤中，于溫室內(nèi)生長。實(shí)施例3再生基因玉米植株的分子檢測1、再生玉米植株基因組DNA的提取1)在液氮中研磨0.1-0.2g植株葉片，轉(zhuǎn)移至1.5ml的Eppendorf管中；2)加入0.7mlCTAB(Trisl00mM，NaCl1.4M，20mMEDTA，CTAB2%，巰基乙醇0.1%)，60°C，45分鐘，每隔10分鐘，顛倒混勻一次。3)加入0.7ml酚氯仿(1:1)，顛倒幾次，1000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管。加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，混勻，1000rpm離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一新的離心管。4)在離心管加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，1000rpm離心10分鐘，棄去上清，70%乙醇洗一次，抽干，溶于50)iL的無菌水中，用于PCR檢測。2、再生玉米植株的PCR檢測植酸酶基因的檢測正向引物AACACTCTCGATCCGGGCACCT反向引物ACCAAGACACGGACCAAAGGC反應(yīng)體系(20pL):再生植株DNAlpL(20-50ng);10x緩沖液2pL;MgC12(2.5mM)2nL;dNTP(2.5mM)2nL;Taq酶0.2pL;引物lOpM;加無菌水至。反應(yīng)條件94°C，5分鐘；94°C，45秒；55°C，45秒；72°C，1分鐘；35個循環(huán)；72t:延伸5分鐘。篩選出PCR陽性植株(如圖4所示)。Bar基因的檢測正向引物CCGAGGCGGACATGCCGGCG反向引物CAGCATGCCGCGGGGGGCAT反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件94。C，5分鐘；94°C，45秒；62°C，45秒；72°C，45秒；35個循環(huán)；72'C延伸5分鐘。3、再生玉米植株的Southern-blot分析參照SambrookJ,等編著的《分子克隆試驗手冊》，(科學(xué)出版社，1992年版)中的方法進(jìn)行。1)對植酸酶基因的為陽性的玉米植株，選取0.5-0.8g葉片組織，液氮研磨后提取基因組DNA，提取方法同PCR檢測中所用。2)得到的DNA經(jīng)RNase禾BProteinaseK處理后，再用等體積的酚氯仿(i:i)，氯仿異戊醇(24:i)抽提，用紫外分光光度計測定dna的量。3)每個樣品取15嗎DNA酶切過夜，50V，電泳6小時后轉(zhuǎn)移至尼龍膜。4)預(yù)雜交6小時后，以植酸酶基因的片段作模板，經(jīng)放射性同位素"P標(biāo)記探針，進(jìn)行雜交。5)洗膜完成后，尼龍膜壓X光片，所得結(jié)果見圖5。Southern結(jié)果表明植酸酶基因己經(jīng)整合到玉米基因組中。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因玉米后代種子中植酸酶的活性檢測轉(zhuǎn)基因玉米To代植株經(jīng)過分子檢測，植酸酶基因為陽性的植株，作為母本，選擇玉米自交系作為父本。雜交授粉結(jié)實(shí)后，所得種子為T,種子。TJ巾子播種后可以正常萌發(fā)、發(fā)育成T,植株。對T,植株進(jìn)行PCR檢測，繼續(xù)用同一玉米自交系作為父本，雜交授粉，得到T2種子。選擇PCR檢測植酸酶基因為陽性的T,植株的種子用來進(jìn)行植酸酶活性分析。未轉(zhuǎn)基因的玉米種子作為陰性對照，內(nèi)源植酸酶較高的小麥作為陽性對照。測定參照WyssM.et.al.(1999)方法進(jìn)行。1)植酸酶活性定義。一個單位(U)的植酸酶為在pH5.5，37"C的條件下，每分鐘從底物植酸鉀、鎂(肌醇六磷酸鉀、鎂)釋放出lpmd無機(jī)磷酸所需要的酶2)試劑。提取緩沖液(Extractionbuffer):(0.05MpH=5.5的NaAc緩沖液，含有l(wèi)mMCaCl2);0.4MpH5.5的NaAc緩沖液；50mM植酸鈉；15%TCA;顯色液(0.6MH2SO4—2%Vc—0.5%鉬酸銨)，用前加Vc。3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。配制9mMKH2P04貯液，按表1稀釋度稀釋KH2P04t^^:表1KH2P04貯液稀釋度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>取1ml稀釋液，加入1ml15%TCA和2ml顯色液，5(TC保溫20分鐘，每個稀釋度設(shè)3個平行樣，分光光度計820nm測定OD值。以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，測定的體系中無機(jī)磷的量(nmol)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)，并計算直線回歸方程。4)玉米子粒中植酸酶活性的測定。取植株籽粒20粒，研磨機(jī)充分磨碎至細(xì)粉末，稱取100mg粉末，加入lml提取緩沖液(ExtractionBuffer)，室溫下在Gyrotory搖床上劇烈振蕩l小時。3000g，離心10分鐘。然后按圖6所示的流程進(jìn)行。每樣品三次重復(fù)。5)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶活性單位計算公式樣品中植酸酶含量(U/ml)=KXAXnX(l/0.1)+15其中K:標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。A:樣品相對OD值(A二OD本底一OD反應(yīng)液)。n:稀釋倍數(shù)。1/0.1:將0.1ml的取樣量換算成lml。15:反應(yīng)時間(分鐘)n:稀釋倍數(shù)。1/0.1:將0.1ml的取樣量換算成lml。15:反應(yīng)時間(分鐘)。6)表2顯示的是實(shí)施例1所構(gòu)建的四個表達(dá)載體轉(zhuǎn)化玉米得到10個轉(zhuǎn)基因事件的不同世代玉米酶活測定結(jié)果，表明植酸酶基因在轉(zhuǎn)基因玉米種子中有表達(dá)，且能夠穩(wěn)定遺傳給后代；不同事件表達(dá)水平不一致，表2中測定結(jié)果是經(jīng)過重復(fù)測定的。表2轉(zhuǎn)基因玉米T2種子植酸酶活測定結(jié)果構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?5-35從表2中可以看出，本發(fā)明所獲得的轉(zhuǎn)基因玉米種子中植酸酶活性，低的達(dá)到2000U/Kg比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗岣?0倍，最高可以達(dá)到97085U/Kg，是未轉(zhuǎn)基因植株的3000倍。其活性比中國專利申請03137476.X中所公開的轉(zhuǎn)基因玉米(活性僅為357.5U/Kg)相比，其活性提高了約5-271.5倍(表2)。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因玉米后代種子中植酸酶的表達(dá)檢測,選擇PHP20723AO得到胚表達(dá)事件B49-02-01和B49-03-03,PHP20754AO得到的胚乳表達(dá)事件B46-17-05和B47-10-07四個事件的T3代種子進(jìn)行該實(shí)驗，同時，以AO基因在畢赤酵母中的表達(dá)產(chǎn)物及其用EndoH脫糖基化處理后的酶蛋白(EndoH購買自Biolabs公司，處理方法按照說明書進(jìn)行)作為陽性對照(CK+)，以未轉(zhuǎn)基因的玉米作為陰性對照(CK-)。SDS-PAGE和Western-blot參照SambrookJ,等編著的《分子克隆試驗手冊》，(科學(xué)出版社，1992年版)中的方法進(jìn)行。1、將轉(zhuǎn)基因玉米種子的胚與胚乳剝離，分別加入蛋白電泳的2x上樣緩沖液研磨；2、10，OOOrpm離心，后取出上清，移入新的離心管中；3、配制SDS-PAGE，進(jìn)行蛋白電泳，使用。4、轉(zhuǎn)膜，用六一儀器廠的轉(zhuǎn)膜儀，按照說明書所示方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5、Western-blot按照常規(guī)方法進(jìn)行，使用的一抗為AO基因(SeqIDNo.l)在酵母中表達(dá)產(chǎn)物(專利申請?zhí)朲L97121731.9)按照常規(guī)方法免疫兔子制備的抗血清，二抗是堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，購自鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明使用的種子特異性啟動子有在胚中表達(dá)，也有在胚乳中表達(dá)(圖8、圖9);所表達(dá)的植酸酶能定位到合適的器官和細(xì)胞器中，因而酶蛋白非常穩(wěn)定，導(dǎo)致所表達(dá)的植酸酶活性較高。實(shí)施例6篩選得到無選擇標(biāo)記Bar基因的轉(zhuǎn)基因事件，Bar基因編碼的產(chǎn)物可以賦予轉(zhuǎn)基因植物對除草劑草胺膦的抗性。對以上有酶活的事件逐代進(jìn)行葉片Basta涂抹和子粒的酶活性測定，Basta涂抹的方法如下將除草劑Basta與凡士林或羊毛脂混合，使其有效成分的濃度為0.8-1.5%，涂抹葉片一周后，觀察并統(tǒng)計葉片涂藥處，如能保持與未涂藥部位一致，表明該植株有Bar基因；如失綠、枯黃直至死亡，表明該植株沒有Bar基因。以上幾個事件的篩選結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>上述結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因后代選育過程中，利用后代的分離，通過篩選可以獲得只含有目的植酸酶基因并能夠正常表達(dá)和遺傳(酶活結(jié)果如表2所示)，不含篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因株系(表3中49-02-01、49-03-03、50-16-05、46-17-05、47-10-07等事件均為此類型)。與中國專利申請03137476.X中所公開的轉(zhuǎn)基因玉米相比，該申請僅提出了構(gòu)想，并沒有實(shí)現(xiàn)最終去掉篩選標(biāo)記基因。而本發(fā)明則實(shí)現(xiàn)了共轉(zhuǎn)化策略的構(gòu)想，得到的轉(zhuǎn)基因株系不含篩選標(biāo)記基因，更符合轉(zhuǎn)基因生物的安全性的要求。實(shí)施例7植酸酶酶學(xué)性質(zhì)測定本發(fā)明選用了兩個植酸酶基因(SEQIDNO.l、SEQIDN0.2)。將所表達(dá)的植酸酶分別進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測定，其中，來源黑曲霉的植酸酶(AO基因產(chǎn)物，SEQIDNO.l)最適pH2.5-5.5,偏酸性，比活性為200U/mg(測定方法如專利號為ZL97121731.9所公開)；來源于大腸桿菌的appA-m(SEQIDN0.2)，最適pH3.0-5.5，比活性3190U/mg(測定方法如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文"高效表達(dá)高比活植酸酶-提高植酸酶發(fā)酵效價的新途徑"(羅會穎，2003年))，本發(fā)明及其產(chǎn)物的適用范圍得到拓寬。試驗例1本發(fā)明轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米作為飼料添加劑的飼養(yǎng)試驗1試驗材料實(shí)驗動物為AA商品代肉仔雞，試驗期從142日齡。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米(本發(fā)明實(shí)施例所制備)為平均每公斤玉米含12000U的植酸酶；微生物來源的植酸酶(5000U/g)為市場所購。2試驗分組與日糧設(shè)計試驗共設(shè)一個對照組和兩個試驗組，每組三個重復(fù)，每個重復(fù)40只雞，共360只。對照組磷水平以NRC(1998)推薦的非植酸磷含量為參考標(biāo)準(zhǔn)，以磷酸氫鈣作為補(bǔ)充磷源；試驗I組在對照組日糧中把磷酸氫鈣減半添加外源植酸酶(來源于微生物)劑量為500U/kg;試驗II組氫鈣用量為對照組的一半，用本發(fā)明轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米代替部分普通玉米，相當(dāng)于每公斤日糧添加500U植酸酶。3試驗結(jié)果試驗結(jié)果見表4。表4不同詞料處理對肉仔雞生長性能的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從表4可以看出，利用轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米作為添加劑與發(fā)酵生產(chǎn)的添加劑和對照相比，都可以替代磷酸氫鈣而不影響肉雞成活率、日均。相反，其增重耗料增重比(每增加1公斤肉需要消耗的詞料量)在21日齡和42日齡分別為1.46和1.67，是三組中最低的，表明利用轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米作為添加劑能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率。表5肉雞血清中的鈣、磷含量<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表7肉雞排泄物中磷含量<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>從上表可以看出，利用本發(fā)明轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米作為添加劑與發(fā)酵生產(chǎn)的添加劑和對照相比，都可以替代磷酸氫鈣，肉雞的血清鈣、磷含量正常。在肉仔雞曰糧中添加轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米(相當(dāng)于500U/kg水平)可以取得與添加外源植酸酶(500U/kg水平)一致的效果，降低肉仔雞脛骨中磷含量，脛骨中磷含量降低，其硬度降低，韌度增加。飼喂試驗結(jié)果表明在肉仔雞日糧中添加轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米，能夠降低肉仔雞排泄物(糞尿)中磷的存留量，分別在21日齡和42日齡分別比不添加任何外源植酸酶的糞尿中磷存留量降低49.43%、55.17%和31.50%、32.28%。以上結(jié)果表明，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因玉米能夠取得與添加發(fā)酵生產(chǎn)的植酸酶同樣的飼喂效果，可以替代磷酸氫鈣并提高詞料中磷的利用率從而節(jié)省磷源，減少動物排泄物中磷的存留量，有利于環(huán)境保護(hù)。序列表<110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120〉表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因校物、-:R:制備方法及在飼料中的應(yīng)用<130〉018<160>9<170>Patentlnversion3.3<210>1<211.〉1350<212〉DNA<213〉A(chǔ)spergillusniger963<400〉1atgctggc3gtccccgcctcgagaaatcagtccacttgcgatacggtcgatC￡tggggt3t60caatgcttctcggagacttcgC3tCtttggggCC3a.t3Cgcgccgttcttttctctggca120幼C幼3tCggccatctcccctgatgttcccgccggatgccaagtcactttcgctcaggtt180ctctcccgcc3tggagcgcggtatccgaccgactcc犯ggctccgctctc240atcgaggagatccagcagaacgcgactaccttcaaggaga犯tatgccttcctgaagaca300tacaactacag朋tgggcgcggatgacctgactccctttgg卿gC3gg3gctggtcaac360tccggcgtcaagttctaccagcgat3cgagtcgctcacaagaaacfittgtcccgttcatc420cgatcctcaggctccagccgcgtgattgcctctggcaata犯ttcatcg3gggctaccag480agcactaagctg朋ggstcctcgtgctcagcccggccaatcgtcgccc8ag3tcgacgtg540gtcatttcagaggccagcac3tCCa3C肪Cactctcgatccgggcacctgcaccgttttc600ga卿tagcgaattggccgatgacatcgaagcc犯tttcaccgccacgttcgtcccttcc660attcgtcaacgtctggsgaacgacttgtctggcgtgsctctcacggacac3gsagtg3cc720tacctcatggacatgtgctccttcgacaccatctccaccagcaccgtcgacaccaagctg780tcccccttctgtgacctgttcacccatgaagaatggatcaactacgactacctccagtcc840ctgaacasatactscggccatggcgcaggtaacccgctcggcccgacccagggcgtcggc900tacgctaacgagctcatcgcccgtctcacccactcgcctgtccacgatgacaccagctcc%0助ccacacattggactccaacccggctactttcccgctcaactccactctctatgcggac1020ttttcgcatgat犯cggcaitcatctctatcctctttgctttgggtctgtacaacggcacc1080肪gccgctgtcctccacgaccgcgg卿statcacccagaccgstgggUctcatctgcc1140tggacggttcctttcgcgtcgcgcatgtacgtcg卿tgatgcaatgccagtctgagcag1200gagcctttggtccgtgtcttggttatatgatcgcgttgttccgctgcatggctgtccggtt1260gatgctttgggg卿tgtacgcgggatagcUcgtga鄉(xiāng)gtttgagctttgccagstct1320ggcggtg3Ugggtggsgtgttttgcttag1350<210>2<2il〉1299<212>■<213>Escherichiacoli<■>2atg犯ggctatcttgatcccatttctgtctcttctgattccactgaccccaicaatctgct60t.tcgctcagagtgagcct.gagUgaaactgg3atccgttgtcalxgtctctagacat.ggt120gttagagcaccaaccaaggcC3CCC33Cttatgcaagatgt.caccccagacgcttggcca180acctggcc鄧tc鄉(xiāng)ctgggttggttg固cctagaggtggtgagctcattgcttacttg240ggtcactacc朋卿cagcgtcttgUgccgacggattgttggccaagaagggtt.gtcca300caatctggtcaagtagctattattgctgacgtcgacgaiaagaacccgtaagacsggtgaa360gccttcgccgccggtcttgctcctgsctgtgccattaccgttxacacccaagctgacact420tcttctccagatccattgttcaaccctttgaagactggtgtttgccaattggacsacgct480aacgttactgacgctatcttgtccagagctggaggatccattgctgacttcaccggtcsc540agacagactgccttcagagagttgg3aag3gttcttaapttcccacaatccaacttgtgc600cttaagcgtgagaagc犯gacgaatcctgttccttgactcaagcattaccatctgagttg660犯ggtctccgccgacaacgtctctttgaccggtgctgtcagcttggcttccatgttgatct720gaaatctttcttctgcaacaagctcaaggtatgcctgagccaggttggggtagaatcacc780gactctcaccaatgg犯c3ccttgttgtccttgcacaacgctcaattctacttgctgcag840agaactccagaggttgctagatccagagccaccccattgttggacttgatc犯gactgct900ttgactcctc3CCC3CCtC3aaagcaagcctacggtgttaccttgcccacttctgtcttg960ttcattgccggtcacgatactaacttggcaaatctcggcggtgctUggagttgaactgg1020actcttcctggtcaacctgataacactccaccaggtggtgagctcgttncgsa卿tgg1080cgtagactatctgataactctc肪tggattcaggtttcgttggtcttccaaactttgcag1140cagatg聊gacaagactccactgtctttgaacacgcctccaggagaagtc犯attgacc1200ttggctggatgtg幼g鄉(xiāng)gaastgctcagggtatgtgttccttggctggtttcactc犯1260atcgttaacgaagctagaatcccagcttgttccttgtaa1299〈210〉3<211>1403<212>DNA<213>Zeamays<400>3aagcttgccgagtgccatccttggacactcgataaagtatattttattttttttattttg60CC33CC33aCUtUgtggtatgttcctacactatgtagatctacatgtaccattttggc120acaatt3C3t6Ltttac犯3aatgttttctataaatattagatttagttcgtttatttgaa180tttcttcggaaaattcacatttaaactgcaagtcactcgaaacatggaaaaccgtgcatg240c犯aataaatgatatgcatgttatctagcacaagttacgaccgatttcagsagcagacca300gaatcttcaagcaccatgctcactaaacatgsccgtgaacttgtteitctagttgtttaaa360aattgtataaaacac犯eita3agtc3g犯3ttaatgaaacttgtccacatgtcatgatat420cat3tatagaggttgtgataaa犯tttgataqtgtttcggtaaagttgtgacgtact.atg480tgt3g犯acctaagtgaccttcatagagtttcaatgtagt.tcactcgaca540aagactttgtcaagtgtccgataa朋agt3ctcgacaaagaagccgttgtcgatgt.actg600ttcgtcgagatctctttgt.cgagtgtcacactaggcaaagtctttacggagtgtttttca660ggctttgacactcggcaaagcgctcgattccagtagtgacagtaattt.gcatcsaaaata720gctgagag￡itttaggccccgtttcaatctcacgggataaagtttagcttcctgctaaact780tt,agctfvta1.agUtcaatta(:caccat,tagct(:tcctgt詣ttagattaca33tggCt.3Magtagct朋aaaatagctgctaaagtttatctcgcgagat900tga33C3gggccttaaaatgagtc犯ctaatagaccaact犯ttat,tsgctattagtcgt960tagcttxUt助tctaagctaatagctt3tttgttg33U3C朋U3gCt翻caacggaattctctgUUtactgcccctctcttacagcaaattgtccgc1080tgcccgtcgtccagatacaatgaacgtacct3gtagg朋ctcttttacacgctcggtcgc1140tcgccgcggatxggagtccccgg犯cacgaC3CC3Ctgtgaagtctgctc12003g3ggCggCCeicaccctggcgtgcaccgagccggagcccggataagcacggt卿g卿g1260t￡lCggCggg3cgtggcgacccgtgtgtctgCtgCC3CgC3gccttcctccacgtagccgci320gcggccgcgccacgtaccagggcccggcgctggtataaatgcgcgccacctccgctttag1380ttctgcatacagccei3cccatgg1403<210>4<211>1007<212>DNA<213>玉米<400>4gagctcgcca朋acgagcsggaagcaacgagsgggtggcgcgcggtccgacgtgcgtacgt60agcatgagcctgagtggagacgttggacgtgtatgtatatacctctctgcgtgttaacta120tgtacgt犯gcggcaggcagtgcaataagtgtggctctgtagtatgtacgtgcgggtacg180atgctgtaagctactgaggcaagtccataaataaataatgacacgtgcgtgttctataat240ctcttcgcttcttcatttgtccccttgcggagtttggcatccattgatgccgttacgctg300agaacagacacagcagacgaaccaaaagtgagttcttgtatgaaactatgacccttcatc360gctaggctcaaacagcaccccgtacgaacacagcaaattagtcatct犯ctattagcccc420tacatgtttcagacgatacataaatatagcccattccttagcaattagctattggccctgc480ccatcccaagcaatgatctcgaagtatttttaatatatagtatttttaatatgtagcttt540taaaattagetagataattttgagacaaaaatctcc幼gtatttttttgggtattttttac600tgcctccgttttt.ctttatttctcgtcacctagtttaattttgtgctaatcggctataaa660cg犯ac3gagagaaasgtt3ctcta犯agca3ctcc犯csg3ttagatat朋atcttata720tcctgcctagagctgttaaaaagatagacaactttagtggattagtgtatgcaacaaact780ctccaaatttaagtatcccaactacccaacgcatatcgttcccttttcattggcgcacga840actttcacctgctatagccgacgtacatgttcgttttttttgggcggcgcttactttctt900ccccgttcgttctcagcatcgcaactcaatttgttatggcggagaagcccttgtatccca960ggtagtaatgcacagatatgcattattattattcataaaacgaattc1007<210〉5<2U>1086<212>DNA<213>Ze柳ays<柳〉5aagcttgatatxgagtcaggtcaacttggccaaacttaaactgtctcggctcgatatatt60aaggaaccgaataagagaacc肪ctcgtctcatttgt.gfigttcgagctctcccgagctaa120aaaaacaatatacacatatataaaatagtataaccaattaUagttaattctagacctat180t,taacactaaaaaagagt.aacaatactcacactttcacatatcat.gtcaatataacacca240aattaacaaatcacttattaattcatccaacac犯gtgcgagatttgtttttXtg3C犯3300tggttgctcattcaagctaaagagctgactcgaacacagctcgagctggcttgttaacaa360atcttgctgagatactagctcagctcgtgaatgagctgagctgaattgag420tCg3gCt犯Ccatgaaccgagcgatctcacgagccacgagtattttgtctagtcctacca480aaasgaccggtccattcttctagtatctagtccgaaccccgaaaactttatgatt.tccata540gcatttgtcaaggctgcctcattaatcaittttgttg3Cg3tctagagtactctagcgaaa600acatgcaagc犯CC333CCgtagagaagtgggctggtcgctaatgcgtgc660acctggacagtCgt33tCggactgtgcgtgaacgaactaaaaaggcgcaacaaactgttg720gagtcgcteigtC3gt3C3333Ctg肪gCggcctttgcccttttgtgactg780caacaagtcca朋ctgttgagcacacgatccatcc犯gtcgacatcctactgctgatcga840tcgcgagcttgtc鄉(xiāng)ttcttcccatccaaCgtgC3C3gCtcctatcacg900gcaccagcagcgtatcg3ggac犯ggcctgaatttgttcccaggtgcaacEtaacscttttt960gttctttttagctttgcatccttctcgttccacttacttaatggcacacc3tc3gcaatg1020cacaccacggcaacsgcattcactgccsag3gagtgsgcgagcgagcagaggcagcgctg1080ccatgg1086<210〉6<211>797<212>DNA<213>Zeamays<400>6cccgggagatCCgC3C3aCCtc卿gtgatctgcctgaataagtactcgtagactgtaat60agcttgctcatggttaaactgcgtgttgattagtctttcaactacatagc120tctaaagtttttgatacaccgagtgatttgcceiggaaaaeiastgagcag3ttgttgt犯g180caaaacatgtttgttatggctaaactgcatgtctacctggatttgtattttttttcaact240acctagttcatctgataaaaacaatttagttgagtaacatca犯tgaaaa300tttattccaaggcaaacatactaaaat3C3tgtggctctggaagataggg360g3gtg咖gCatU郷agcaggt3actg3gtaca3t3tatccatgcaccatctg肪tga420actactacct犯ggttaaagcttgaacttccccatgactgC3ttga幼ctaaaggacaac480agatcaccctcatatatctacatatccaaacctaaataaaggtcaatcttcatctggtgt540ttcctcatcgtcatcattgttgccatatctccagccatcttc犯tgttgttgcctccatx600ttcttccgtctcttcactatcatcttggtacgtagctttacctggccactggttcctgac660gccaatgtcag犯ggcaUgctctcgaaaccttggcattgtaggctttggatgagtggac720ctt'gtgcccatgattcgtcttgctccttttggggtttggtgc犯tctcgccaacctcggc7803tagttatactg33ttC797<210>7<211>1597<212>DNA<213>SolanuratuberosumL<400>7agcttcggccggggccc3tcga.tctggcga33gggggatgtgct.gc朋ggcgat.t:EuigU60gggt犯cgccagggmtcccagtcacgacgttgta朋acgacggccagtgccaagctca120gatcagcttggggctggtatcgata犯tgtttccacatagattttgcatatcataatgat180gtttgtcguccgtatctatgtt1xatacagcatatcgc3acacatgggc240acatacct3gtgactgtataactctgcatgUtgagtgtatgactatatgatgtagtaac300taat33gaagggtagscatttgagtgattcttttattcctggacttgtaagacttgac3t360Uctgccttgagtgcgatacatcatatggac鄉(xiāng)ggtUtgcatacactgcttgtttgU420gtttatgttxtaagagcatctCC33C犯Cgtgacatatgsaaaitgccctac33tttaa3a480ELtggtt3t3ttt3gggcataaataasacatcccgctccaacattaaagcc540ttaaatctattatag卿agcccactatgatatagtatatttgaggcactttagagggtg600ccctataattttttgaccatttttttatga犯tgagacactattggagtattttttttcc660gtagagcaccatatttcaatttgagscaccaattt3aggcattgttggagatgttctaaa720tgttggttt3ttttgtctgtatcgttgtggttttgatagtggtgcctttgcaatgtacat780cttacattgacaataataat3ggtaaaactctacasattttttatctaatggactcttgt歸atgaaacattgtacttgcacacatctgatgt朋3cactgcatacttttaaceigtgacaag900attctgtttct鄰tttgggaaccaaattttattagggtttttattttcta960agaaaaagtaatttattttaccttgagaaaatataaattacttgagaaaatagagttcca鵬犯ctagctxttatctttgtcgaatcctcctctattcaaatgtgacatttctggcacgtga1080caactggtg3tgttgtagsctgtgUaagtaatacgtgtc3tt3ttscta膽tgccattt1140tagtaaatgttgagtatgtetctctactacagtaagtattattggtgtatttacactagac1200agttggcggcctggcgggtaaagttatcctgt3g肪agttgggccaggcca幼acc犯cc1260gcca朋gg肪aggccttccggcccgcccacctttgcgcgccgaaggtcagttccttcagt1320ctcctcccgcttcagactctgaccacgtcgacaatccgggcxg犯acacatctgcaccgtccacttgcg3cagattgaacacaccacttctatccacgtcagcgstccgtggcsctagcc1440cttccaccaatcagcccaagttgcccctttcctttaaattcgccgcacccattgctcttc1500tcacggccatagaaatcgaccgagcg肪tccctcgcatcgcattcgcagcctttgctgca1560tC3C3CC3CCgcgaaaccccagcagccgc3tCtgC3g1597<210>8<211〉453<212>腿<213>Solariumtuberosum〈400〉8gggctattgcggtgC3ggCtgcc卿gcggcggctgtgacgctgtctttgccggcgccat60caccgcc33ctccactcttctcgcagaatgatgatag3tccaccatggtt犯cctagact120tgtccatcttctggattggccaacttaat.t犯tgt3tgaaata犯aggatgcacacatag180tgacatgctaatcactat&atgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactagt.t240atctg朋t朋aag3g朋agagatcatccatattt,cttatcctaaatgaatgtcacgtgtc300tttat犯ttc"tgatg犯ct,cattaaccaaatccat,atacatat犯ata360ttaatcatottcaattgggttagcaaaaca33tCt3gtCt3ggtgtgtU420t.gcgaattgcggccgccaccUg453<210>9<211〉137<212>廳<213>artificalsequence<400>9ccatggccccacgccgcctgctcgtcctcgccgtcgtcgccctcgcggccaccgccgccg60cggccaactccggcttcgcggactcgaacccgatccgccccgtcaccgaccgcgcggcct120ccgcgctcgagggatcc13權(quán)利要求1、植酸酶植物重組表達(dá)載體，其特征是該重組表達(dá)載體主要含有以下序列啟動子序列，來源于微生物的植酸酶基因，信號肽和蛋白體定位序列和終止子序列。2、按照權(quán)利要求1的植酸酶植物重組表達(dá)載體，其特征是所述的啟動子序列選自單子葉植物組成型啟動子、單子葉植物誘導(dǎo)型啟動子或單子葉植物組織特異性啟動子。3、按照權(quán)利要求1的植酸酶植物重組表達(dá)載體，其特征是所述的啟動子序列是SEQIDNO:3或SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；所述的來源于微生物的植酸酶基因是SEQIDNO:l或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；所述的信號肽和蛋白體定位序列是SEQIDNO:9所示的核苷酸序列;所述的終止子序列是SEQIDNO:4或SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。4、按照權(quán)利要求1的植酸酶植物重組表達(dá)載體，其特征是所述的植酸酶植物重組表達(dá)載體是PHP20723AO或PHP20723MO。5、按照權(quán)利要求1的植酸酶植物重組表達(dá)載體，其特征是所述的植酸酶植物重組表達(dá)載體是PHP20754AO或PHP20754MO6、權(quán)利要求1所述的植酸酶植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括-將信號肽和液泡蛋白體定位序列、來源于微生物的植酸酶基因和終止子序列連接在一起后，可操作的連接到啟動子序列之后。7、權(quán)利要求4植酸酶植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括(1)、構(gòu)建表達(dá)載體PHP20723:(a)合成SeqIDNo:9所示的信號肽和蛋白體定位序列融合片段；(b)分離得到SeqIDNo:3所示的玉米胚特異表達(dá)的啟動子序列；(C)分離得到S叫IDNO:4所示的玉米胚芽蛋白終止子序列；(d)將SeqIDNo:9和SeqIDNo:3融合在一起后再與SeqIDNo:4先后克隆到pSP72載體上，構(gòu)建成表達(dá)載體PHP20723;(2)、將SeqIDNo:1序列用Bell和Xbal酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20723相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20723AO;將SeqIDNo:2用臉oI和SmaI酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20723相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20723MO。8、權(quán)利要求5植酸酶植物重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括(1)、構(gòu)建表達(dá)載體PHP20754:(a)合成SeqIDNo:9所示的信號肽和蛋白體定位序列融合片段；(b)按照現(xiàn)有技術(shù)分離得到SeqIDNo:5所示的玉米胚乳蛋白啟動子片段；(c)按照現(xiàn)有技術(shù)分離得到SeqIDNo:6所示的玉米胚乳蛋白終止子片段；(d)將SeqIDNo:5和SeqIDNo:9融合，將融合后的片段與SeqIDNo:6先后克隆到pSP72載體上，構(gòu)建表達(dá)載體PHP20754;(2)、將S叫IDNo:1用Bc/I和Swfll酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20754相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20754AO;將SeqIDNo:2用臉oI和SmaI酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體PHP20754相連接，得到植酸酶植物重組表達(dá)載體PHP20754MO。9、一種制備表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括將權(quán)利要求1構(gòu)建成的植酸酶植物重組表達(dá)載體按照常規(guī)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物，培育、篩選再生植物，即得。10、按照權(quán)利要求9的方法，其特征是所述的植酸酶植物重組表達(dá)載體為PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO;所述的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌侵染法或基因槍法；所述的受體農(nóng)作物選自玉米、油菜、大豆或小麥。11、按照權(quán)利要求9的方法，其特征是將權(quán)利要求1植酸酶植物重組表達(dá)載體與植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物。12、按照權(quán)利要求ll的方法，其特征是所述的植酸酶植物重組表達(dá)載體選自PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO或PHP20754MO;所述的植物選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體是PHP17042Bar;所述的受體農(nóng)作物是玉米。13、按照權(quán)利要求12的方法，其特征是將PHP20723AO、PHP20723MO、PHP20754AO、PHP20754MO以及選擇標(biāo)記基因表達(dá)載體PHP17042Bar去除細(xì)菌骨架DNA，分別得到植酸酶基因表達(dá)盒以及PHP17042Bar的Bar基因的表達(dá)盒，將Bar基因的表達(dá)盒分別與以上四種去除細(xì)菌骨架DNA后的植酸酶基因表達(dá)盒等摩爾比混合，用于基因槍微彈制備，轉(zhuǎn)化玉米外植體。全文摘要本發(fā)明公開了一類植酸酶重組表達(dá)載體以及由該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體農(nóng)作物所得到的表達(dá)植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明還公開了該植酸酶重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，該轉(zhuǎn)基因植物作為動物飼料的應(yīng)用。將本發(fā)明重組表達(dá)載體按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到受體農(nóng)作物中，外源植酸酶基因可在植物器官中高效、定點(diǎn)表達(dá)，得到富含植酸酶的植物飼料新品種，可以大量、廉價的生產(chǎn)植酸酶。富含植酸酶的轉(zhuǎn)基因植物可直接、方便而有效地應(yīng)用于動物飼料中，以降解植物自身的植酸磷，滿足動物對磷源的需求，無須在飼料中添加磷酸氫鈣或添加通過發(fā)酵技術(shù)所生產(chǎn)的植酸酶添加劑，不僅提高了動物對飼料中磷的利用率，同時也有效緩解了動物高磷糞便對環(huán)境造成的污染。文檔編號C12N15/82GK101153285SQ20061013765公開日2008年4月2日申請日期2006年11月2日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者斌姚,范云六,薛光行,陳茹梅申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所