專利名稱：半胱氨酸合成酶基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及半胱氨酸合成酶基因及其用途，特別是涉及制造香味優(yōu)異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)提高編碼釀造酵母半胱氨酸合成酶Ygr012wp的基因YGR012W，特別是啤酒酵母中特征性的nonScYGR012W基因或ScYGR012W基因的表達(dá)量，提高產(chǎn)品香味的酵母及使用該酵母的酒類的制造方法等。
背景技術(shù)：
市售的pilsner type淡色啤酒制造中使用的啤酒酵母具有在主發(fā)酵過(guò)程中生成硫化氫的特性。該硫化氫是造成啤酒品質(zhì)上不受歡迎的嫩啤酒味的原因之一，將其降低到閾值以下的對(duì)策可為延長(zhǎng)后發(fā)酵乃至貯酒期間。
為減少啤酒中的硫化氫，以往即有關(guān)于影響硫化氫生成的因子的研究(Jangaard，N.O.，Gress，H.S.and Coe，R.W.；Amer.Soc.Brew.Chem.Proc.，p46，1973；Kuroiwa，Y.and Hashimoto，N.；Brew.Dig.，45，44，1970；Hysert，D.W.and Morrison，N.M.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，34，25，1976)、使用突變法或細(xì)胞融合法進(jìn)行生成硫化氫少的酵母的育種研究(Molzahm，S.W.；J.Amer.Soc.Brew.Chem.，35，54，1977)的報(bào)告。
這些方法均不只減少了酵母的硫化氫生成量，還影響了酵母的其他釀造特性(發(fā)酵速度、啤酒香味)，所以至今還未得到適合作為啤酒釀造用酵母的酵母。近年來(lái)也利用基因操作技術(shù)進(jìn)行釀造用酵母的育種，特開(kāi)平5-244955號(hào)公報(bào)中公開(kāi)了導(dǎo)入編碼胱硫醚β-合成酶的DNA片段的啤酒酵母可減少硫化氫的生成。但其減少程度輕微，轉(zhuǎn)化株的硫化氫生成量仍為親代株生成量的60％～80％左右。
酵母的物質(zhì)代謝中，硫化氫是在從培養(yǎng)基中吸收的硫酸離子(SO42-)的還原過(guò)程中生成的。該代謝系統(tǒng)是蛋氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸的生物合成途徑，且有關(guān)于各階段的酶及其基因(MET17基因)的詳細(xì)的報(bào)道(Tabor，H.and Tabor，C.W.(eds.)；Methods in Enzymology Vol.17B，Academic Press，London，1971；Jakoby，W.B.and Griffith，O.W.(eds.)；Methods in EnzymologyVol.143，AcademicPress，London，1987)。
O-乙酰高絲氨酸巰基酶是將硫原子從硫化氫轉(zhuǎn)移到O-乙酰高絲氨酸(O-acetyl homoserine)的酶，由MET17基因編碼。該酶還具有向O-乙酰絲氨酸轉(zhuǎn)移硫原子的活性。有報(bào)道指出使來(lái)源于Saccharomycescerevisiae X2180-1A的MET17基因進(jìn)行組成性表達(dá)的啤酒酵母株中，硫化氫的生成量減少到了親代株的2％左右(特開(kāi)平7-303475號(hào)公報(bào))。
半胱氨酸合成酶是將硫原子從硫化氫轉(zhuǎn)移到O-乙酰-L-絲氨酸的酶。該基因在其他微生物中已被鑒定，但在Saccharomyces cerevisiae中還未被鑒定。
近年來(lái)，大量的基因組已被確定，根據(jù)確定的全堿基序列，通過(guò)基因的鑒定、與公知基因的比較，進(jìn)行功能推測(cè)。還有，通過(guò)比較分析大量的生物基因組堿基序列中存在的基因，進(jìn)行orthologue基因(2個(gè)生物種中存在的基因，在共有的祖先種中是同一的基因，現(xiàn)在的功能也同一時(shí)為各自的基因)的推斷，通過(guò)微生物基因組的orthologue分析，推測(cè)編碼Saccharomycescerevisiae的半胱氨酸合成酶的基因是YGR012W(R.L.Tatusov.，M.Y.Galperin.，D.A.Natale.，E.V.Koonin.；Nucleoc.Acids.Research.，28，33，2000)。但是，本基因的功能未經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，與硫化氫生成量的關(guān)系也不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，為使產(chǎn)品中硫化氫生成量減少，獲取了突變株，但其結(jié)果造成了未曾預(yù)期的發(fā)酵延遲和不受歡迎的香味成分的增加，所以作為實(shí)用性酵母還存在著問(wèn)題。由此，非常期望有既不影響發(fā)酵速度、不損害產(chǎn)品品質(zhì)，又能減少硫化氫生成量的酵母的育種方法。
本發(fā)明人為解決上述課題不斷銳意研究的結(jié)果，從啤酒酵母中成功地鑒定、分離出了編碼半胱氨酸合成酶的基因。還有，制備了將所得基因?qū)虢湍覆⑹蛊浔磉_(dá)的轉(zhuǎn)化酵母，確認(rèn)了硫化氫生成量的減少，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及啤酒酵母中存在的新型半胱氨酸合成酶基因、該基因編碼的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)了該基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化酵母、通過(guò)使用調(diào)節(jié)了該基因表達(dá)的酵母以控制產(chǎn)品中硫化氫生成量的方法等。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供如下所示的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體、導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母、使用該轉(zhuǎn)化酵母的酒類的制造方法等。
(1)從以下(a)～(f)組成的組中選擇的多核苷酸，其為(a)含有由序列號(hào)1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有等于或大于60％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號(hào)1中的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
(2)上述(1)所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)組成的組中選擇(g)含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列、或序列號(hào)2的氨基酸序列中1～10個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號(hào)1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
(3)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有由序列號(hào)1的堿基序列組成的多核苷酸。
(4)上述(1)中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
(5)上述(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其是DNA。
(6)蛋白質(zhì)，其由上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
(7)載體，其含有上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
(7a)上述(7)中所述的載體，其含有具有以下(x)～(z)的組成要素的表達(dá)框架(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；(y)上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其與該啟動(dòng)子以正向或反向結(jié)合；以及(z)與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的、在酵母中起作用的信號(hào)。
(8)載體，其含有從以下(j)～(l)組成的組中選擇的多核苷酸(j)含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列或序列號(hào)6的氨基酸序列中1～10個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有編碼具有與序列號(hào)6的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；及(l)含有與序列號(hào)5的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號(hào)5的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
(9)酵母，其中導(dǎo)入了上述(7)或(8)中所述的載體。
(10)上述(9)中所述的酵母，其通過(guò)導(dǎo)入上述(7)或(8)中所述的載體降低硫化氫生成能力。
(11)上述(10)中所述的酵母，其通過(guò)使上述(6)中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加降低硫化氫生成能力。
(12)酒類的制造方法，其使用上述(9)～(11)中任一項(xiàng)所述的酵母。
(13)上述(12)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
(14)上述(12)中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
(15)酒類，其使用上述(12)～(14)中任一項(xiàng)所述的方法制造。
(16)評(píng)價(jià)方法，其為使用根據(jù)具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評(píng)價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能力的方法。
(16a)根據(jù)上述(16)中所述的方法，選別硫化氫生成能力低的酵母的方法。
(16b)使用通過(guò)(16a)中所述的方法選別的酵母制造酒類(例如啤酒)的方法。
(17)評(píng)價(jià)方法，其為通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)量，以評(píng)價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能力的方法。
(18)酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母，對(duì)上述(6)中所述的蛋白質(zhì)定量或測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)量，選擇與目的硫化氫生成能力對(duì)應(yīng)的前述蛋白質(zhì)的量或前述基因表達(dá)量的被檢酵母。
(18a)培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定硫化氫生成能力或半胱氨酸合成酶活性，選擇目的硫化氫生成能力或半胱氨酸合成酶活性的被檢酵母的酵母的選擇方法。
(19)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比標(biāo)準(zhǔn)酵母高表達(dá)的被檢酵母。
(20)上述(18)中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，對(duì)各酵母中上述(6)中所述的蛋白質(zhì)定量，選擇該蛋白質(zhì)的量比標(biāo)準(zhǔn)酵母多的被檢酵母。即培養(yǎng)復(fù)數(shù)的酵母，對(duì)各酵母中上述(6)中所述的蛋白質(zhì)定量，選擇其中該蛋白質(zhì)的量多的被檢酵母。
(21)酒類的制造方法，其特征在于，使用上述(9)～(11)中所述的酵母及通過(guò)上述(18)～(20)中所述的方法選擇的酵母中的任一種酵母，進(jìn)行用于酒類制造的發(fā)酵，調(diào)節(jié)硫化氫的生成量。


圖1是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母增殖量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示OD660的值。
圖2是啤酒試驗(yàn)釀造中浸出物消耗量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖3是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母的nonScYGR012W基因表達(dá)變動(dòng)的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示檢測(cè)出的信號(hào)輝度。
圖4是啤酒試驗(yàn)釀造中親代株、nonScYGR012W高表達(dá)株酵母增殖量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示OD660的值。
圖5是啤酒試驗(yàn)釀造中親代株、nonScYGR012W高表達(dá)株浸出物消耗量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖6是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母增殖量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示OD660的值。
圖7是啤酒試驗(yàn)釀造中浸出物消耗量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
圖8是啤酒試驗(yàn)釀造中酵母的ScYGR012W基因表達(dá)變動(dòng)的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示檢測(cè)出的信號(hào)輝度。
圖9是啤酒試驗(yàn)釀造中親代株、ScYGR012W高表達(dá)株酵母增殖量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示OD660時(shí)的值。
圖10是啤酒試驗(yàn)釀造中親代株、ScYGR012W高表達(dá)株浸出物消耗量經(jīng)時(shí)變化的示意圖。橫坐標(biāo)表示發(fā)酵時(shí)間，縱坐標(biāo)表示表觀浸出物濃度(w/w％)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人認(rèn)為，通過(guò)使酵母的半胱氨酸合成酶活性增大，可更高效地減少硫化氫?；谶@個(gè)設(shè)想反復(fù)進(jìn)行了研究，以用特開(kāi)2004-283169中公開(kāi)的方法解讀的啤酒酵母基因組信息為基礎(chǔ)，分離、鑒定了編碼啤酒酵母特有的半胱氨酸合成酶的non-ScYGR012W基因。該堿基序列如序列號(hào)1所示。由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號(hào)2所示。而且分離、鑒定了編碼啤酒酵母的半胱氨酸合成酶的ScYGR012W基因。該堿基序列如序列號(hào)5所示。由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列號(hào)6所示。
1.本發(fā)明的多核苷酸首先，本發(fā)明提供(a)含有由序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；及(b)含有編碼由序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可為DNA、也可為RNA。
作為本發(fā)明對(duì)象的多核苷酸，不只限于編碼來(lái)自上述啤酒酵母的半胱氨酸合成酶基因的多核苷酸，還包含編碼與該蛋白質(zhì)具同等功能的蛋白質(zhì)的其他多核苷酸。作為功能相同的蛋白質(zhì)，例如，可例舉為(c)由序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)的氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。
這種蛋白質(zhì)，在序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列中，例如，可為由1～100個(gè)、1～90個(gè)、1～80個(gè)、1～70個(gè)、1～60個(gè)、1～50個(gè)、1～40個(gè)、1～39個(gè)、1～38個(gè)、1～37個(gè)、1～36個(gè)、1～35個(gè)、1～34個(gè)、1～33個(gè)、1～32個(gè)、1～31個(gè)、1～30個(gè)、1～29個(gè)、1～28個(gè)、1～27個(gè)、1～26個(gè)、1～25個(gè)、1～24個(gè)、1～23個(gè)、1～22個(gè)、1～21個(gè)、1～20個(gè)、1～19個(gè)、1～18個(gè)、1～17個(gè)、1～16個(gè)、1～15個(gè)、1～14個(gè)、1～13個(gè)、1～12個(gè)、1～11個(gè)、1～10個(gè)、1～9個(gè)、1～8個(gè)、1～7個(gè)、1～6個(gè)(1～數(shù)個(gè))、1～5個(gè)、1～4個(gè)、1～3個(gè)、1～2個(gè)、1個(gè)的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。且上述氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或付加的數(shù)量，一般優(yōu)選較小的數(shù)量。這種蛋白質(zhì)可例舉為具有(d)與序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同源性的氨基酸序列，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。上述同源性的數(shù)值一般越大越好。
半胱氨酸合成酶活性，例如可根據(jù)J.Biol.Chem.4528187-28192(1994)中所述的方法來(lái)測(cè)定。
另外，本發(fā)明也包含(e)含有與序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼由序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
此處的“在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸”，是指以與序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸、或編碼序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分為探針，通過(guò)使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或Southern雜交法等得到的多核苷酸(例如DNA)。作為雜交方法，例如可利用Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons 1987-1997等中所述的方法。
本說(shuō)明書(shū)中所述的“嚴(yán)格條件”可為低嚴(yán)格條件、中嚴(yán)格條件、高嚴(yán)格條件中的任一種?！暗蛧?yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的條件?！爸袊?yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的條件?！案邍?yán)格條件”，例如，為5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃的條件。在上述條件中，越提高溫度，越能期待高效地獲得具有高同源性的多核苷酸(例如DNA)。影響雜交嚴(yán)格性的因素可為溫度、探針濃度、探針長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)適宜選擇這些因素，均可實(shí)現(xiàn)同樣的嚴(yán)格條件。
另外，雜交中使用市售的試劑盒時(shí)，例如可使用Alkphos Direct LabellingReagents(Amersham Pharmacia公司制)。此時(shí)，根據(jù)試劑盒中附帶的說(shuō)明方案，與標(biāo)記了的探針進(jìn)行一夜培養(yǎng)后，將膜在55℃的條件下，用含有0.1％(w/v)SDS的洗滌緩沖液1次洗滌，之后可檢測(cè)雜交后的多核苷酸(例如DNA)。
此外可雜交的多核苷酸，通過(guò)FASTA、BLAST等同源性搜索軟件，使用默認(rèn)值(default)計(jì)算時(shí)，可為與編碼序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列的多核苷酸有等于或大于約60％、等于或大于約70％、等于或大于71％、等于或大于72％、等于或大于73％、等于或大于74％、等于或大于75％、等于或大于76％、等于或大于77％、等于或大于78％、等于或大于79％、等于或大于80％、等于或大于81％、等于或大于82％、等于或大于83％、等于或大于84％、等于或大于85％、等于或大于86％、等于或大于87％、等于或大于88％、等于或大于89％、等于或大于90％、等于或大于91％、等于或大于92％、等于或大于93％、等于或大于94％、等于或大于95％、等于或大于96％、等于或大于97％、等于或大于98％、等于或大于99％、等于或大于99.1％、等于或大于99.2％、等于或大于99.3％、等于或大于99.4％、等于或大于99.5％、等于或大于99.6％、等于或大于99.7％、等于或大于99.8％、等于或大于99.9％同源性的多核苷酸。
另外，氨基酸序列、堿基序列的同源性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873，1993)來(lái)決定。開(kāi)發(fā)了基于BLAST算法、被稱為BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF，et alJ.Mol.Biol.215403，1990)。使用BLASTN分析堿基序列時(shí)，參數(shù)例如為score＝100、wordlength＝12。還有，使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)例如為score＝50、wordlength＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用各程序的默認(rèn)值(default)參數(shù)。
2.本發(fā)明的蛋白質(zhì)本發(fā)明也提供由上述多核苷酸(a)～(l)中任一個(gè)編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的優(yōu)選蛋白質(zhì)，是由序列號(hào)2或序列號(hào)6中的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。
這種蛋白質(zhì)，例如，可例舉為由序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列中上述數(shù)量的氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。還有，這種蛋白質(zhì)，可例舉為含有與序列號(hào)2或序列號(hào)6的氨基酸序列具有如上述同源性的氨基酸序列、且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。
這種蛋白質(zhì)，可使用(《分子克隆》第3版)、《Current Protocols inMolecular Biology》、“Nuc.Acids.Res.，10，6487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)”、“Gene，34，315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.，13，4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)”等中所述的定點(diǎn)誘變法來(lái)獲得。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中等于或大于1個(gè)的氨基酸殘基被缺失、取代、插入及/或添加，是指在同一序列中任意的，且1個(gè)或多個(gè)的氨基酸序列的位置上，有1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失、取代、插入及/或添加之意，缺失、取代、插入及添加中的2種或大于2種也可同時(shí)發(fā)生。
以下，舉例表示可相互取代的氨基酸殘基。同一組中包含的氨基酸殘基可相互取代。A組亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、鄰-甲基絲氨酸(o-methylserine)、叔丁基甘氨酸(t-butyl glycine)、叔丁基丙氨酸(t-butyl alanine)、環(huán)己基丙氨酸(cyclohexyl alanine)；B組天冬氨酸、谷氨酸、異天冬氨酸、異谷氨酸(isoglutamic acid)、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸(2-aminosuberic acid)；C組天冬酰胺、谷氨酰胺；D組賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2，4-二氨基丁酸、2，3-二氨基丙酸；E組脯氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸；F組絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組苯丙氨酸、酪氨酸。
還有，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過(guò)Fmoc法(fluorenylmethoxycarbonyl)、tBoc法(t-Butyl Oxy Carbonyl)等的化學(xué)合成法來(lái)制造。也可利用Advanced ChemTech公司制、珀金埃爾默(Perkin Elmer)公司制、Farumashia公司制、ProteinTechnologies Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、Perceptive公司制、島津制作所公司制等的肽合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。
3.本發(fā)明的載體及導(dǎo)入了該載體的轉(zhuǎn)化酵母其次，本發(fā)明提供含有上述多核苷酸的載體。本發(fā)明的載體，是涉及含有上述(a)～(l)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)的載體。本發(fā)明的載體通常如下構(gòu)成，其含有(x)在酵母細(xì)胞內(nèi)可轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；(y)與該啟動(dòng)子以正向或反向結(jié)合的、上述(a)～(l)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)；以及(z)含有與RNA分子的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺苷酸化有關(guān)的在酵母中起作用的信號(hào)作為構(gòu)成因子的表達(dá)框架。本發(fā)明在后述的啤酒釀造中，使上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)高表達(dá)時(shí)，為促進(jìn)上述(a)～(l)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸(DNA)的表達(dá)，將這些多核苷酸針對(duì)該啟動(dòng)子正向?qū)搿?br> 導(dǎo)入酵母時(shí)使用的載體，可利用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp型)中的任一種。例如，YEp型載體中的YEp24(J.R.Broach et al.，Experimental Manipulation of Gene Expression，AcademicPress，New York，83，1983)、YCp型載體中的YCp50(M.D.Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp型載體中的YIp5(K.Struhl et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，1035，1979)均已為人所知，且易獲得。
用于調(diào)節(jié)酵母中基因表達(dá)的啟動(dòng)子/終止子，如能在釀造用酵母中起作用，同時(shí)又不受醪液中成分的影響，可任意組合。例如可利用3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(TDH3)的啟動(dòng)子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的啟動(dòng)子等。這些基因已被克隆，例如可通過(guò)M.F.Tuite et al.，EMBO J.，1，603(1982)中詳細(xì)記載的已知方法很容易地獲得。
因釀造用酵母不能利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，所以，轉(zhuǎn)化時(shí)使用的選擇性標(biāo)記可利用耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因(G418r)、耐銅基因(CUP1)(Marin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，337 1984)、耐淺藍(lán)菌素基因(fas2m，PDR4)(分別為豬腰淳嗣等，生化學(xué)，64，660，1992；Hussain et al.，gene，101，149，1991)等。
如上所述構(gòu)建的載體被導(dǎo)入宿主酵母。宿主酵母，可例舉為可用于釀造的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說(shuō)，雖可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，但在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且，可使用威士忌酵母，例如Saccharomycescerevisiae NCYC90等；還可使用例如協(xié)會(huì)葡萄酒用1號(hào)、協(xié)會(huì)葡萄酒用3號(hào)、協(xié)會(huì)葡萄酒用4號(hào)等的葡萄酒酵母；例如協(xié)會(huì)酵母、清酒用7號(hào)、清酒用9號(hào)等的清酒酵母，但不限于這些。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用Saccharomyces pastorianus。
酵母的轉(zhuǎn)化方法，可利用一般使用的公知的方法。例如，可使用電穿孔法“Meth.Enzym.，194，p182(1990)”、原生質(zhì)球法(Spheroplast法)“Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 p1929(1978)”、醋酸鋰法“J.Bacteriology，153，p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75p 1929(1978)、Methods in yeast genetics，2000EditionA Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等中所述的方法實(shí)施，但不限于這些。
更具體地說(shuō)，將宿主酵母置于標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(例如YEPD培養(yǎng)基“Genetic Engineering.Vol.1，Plenum Press，New York，117(1979)”等)中培養(yǎng)，使OD600nm時(shí)的值為1～6。將該培養(yǎng)酵母離心分離后收集、洗滌，用濃度約為1～2M的堿金屬離子、優(yōu)選鋰離子進(jìn)行預(yù)處理。將該細(xì)胞在約30℃條件、靜置約60分鐘后，與導(dǎo)入的DNA(約1～20μg)同時(shí)在約30℃條件、靜置約60分鐘。加入聚乙二醇，優(yōu)選加入約4,000Dalton的聚乙二醇，使最終濃度約為20％～50％。在約30℃、靜置約30分鐘后，將該細(xì)胞在約42℃條件、加熱處理約5分鐘。優(yōu)選將該細(xì)胞懸浮液用標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌后，放入所定量的新鮮標(biāo)準(zhǔn)酵母營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，在約30℃、靜置約60分鐘。之后，移植到含有作為選擇性標(biāo)記使用的抗生素等的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中，獲得轉(zhuǎn)化體。
其他有關(guān)一般性的克隆技術(shù)，可參照(《分子克隆》第3版)、“Methodsin Yeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor，NY)”等。
4.本發(fā)明的酒類制造方法及根據(jù)其制法獲得的酒類將上述本發(fā)明的載體導(dǎo)入適合釀造所需制造對(duì)象的酒類的酵母中，并可通過(guò)使用其酵母，制造所需要的、且減少了硫化氫含量、增加了香味的酒類。而且也可同樣使用通過(guò)下述本發(fā)明的酵母評(píng)價(jià)方法選擇的酵母。作為制造對(duì)象的酒類并不限于此，例如可例舉為啤酒、發(fā)泡酒等的啤酒味飲料、葡萄酒、威士忌、清酒等。
制造上述酒類時(shí)，除使用本發(fā)明中所得到的釀造酵母代替親代株以外，可利用公知的手法。因此，原料、制造設(shè)備、制造管理等可與以往完全相同，不會(huì)為制造減少硫化氫含量的酒類而增加成本。即根據(jù)本發(fā)明，可在使用已有設(shè)施、不增加成本的情況下，制造出香味優(yōu)異的酒類。
5.本發(fā)明的酵母的評(píng)價(jià)方法本發(fā)明涉及使用根據(jù)具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評(píng)價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能力的方法。這種評(píng)價(jià)方法的一般手法為公知，例如WO 01/040514號(hào)公報(bào)、特開(kāi)平8-205900號(hào)公報(bào)等的記載。以下，就該評(píng)價(jià)方法進(jìn)行簡(jiǎn)單說(shuō)明。
首先，制備被檢酵母的基因組。制備方法可使用Hereford法、醋酸鉀法等公知的任何方法[例如，Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。以所得到的基因組為對(duì)象，使用根據(jù)半胱氨酸合成酶基因的堿基序列(優(yōu)選ORF序列)設(shè)計(jì)的引物或探針，測(cè)定被檢酵母的基因組中是否存在其基因或其基因的特異性序列。引物或探針的設(shè)計(jì)可使用公知的手法進(jìn)行。
基因或特異性序列的檢測(cè)，可使用公知的手法進(jìn)行。例如，將含有包含特異性序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸作為一個(gè)引物使用，另一個(gè)引物使用含有包含該序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸或其堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸，通過(guò)PCR法擴(kuò)增酵母的核酸，并測(cè)定擴(kuò)增物的有無(wú)、擴(kuò)增物分子量的大小等。用于引物的多核苷酸的堿基數(shù)通常為等于或大于10bp，優(yōu)選為15～25bp。還有，夾在兩引物間的堿基數(shù)，通常以300～2000bp為宜。
PCR法的反應(yīng)條件無(wú)特別限定，例如，可使用變性溫度90～95℃、退火溫度40～60℃、延伸溫度60～75℃、循環(huán)數(shù)等于或大于10次等的條件。所得到的反應(yīng)生成物可使用瓊脂糖凝膠等的電泳法等分離，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量。根據(jù)該方法，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量是否是含有特異部分的DNA分子的大小，來(lái)預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)其酵母的硫化氫生成能力。還有，通過(guò)分析擴(kuò)增物的堿基序列，可進(jìn)一步更正確地預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)上述性能。
本發(fā)明中，可通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)量，評(píng)價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能力。另外，半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)量的測(cè)定，可通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，對(duì)半胱氨酸合成酶基因的產(chǎn)物mRNA或蛋白質(zhì)定量來(lái)進(jìn)行。mRNA或蛋白質(zhì)的定量，可使用公知的手法。mRNA的定量例如可通過(guò)Northern雜交法、定量RT-PCR，蛋白質(zhì)的定量例如可通過(guò)Western印跡法進(jìn)行(CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。
還有，通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)量，選擇與目的硫化氫生成能力相應(yīng)的前述基因表達(dá)量的酵母，可選擇適合釀造所需酒類的酵母。也可培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測(cè)定各酵母中前述基因的表達(dá)量，比較標(biāo)準(zhǔn)酵母和被檢酵母的前述基因的表達(dá)量，以選擇所需的酵母。具體地說(shuō)，例如，可通過(guò)培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比標(biāo)準(zhǔn)酵母高表達(dá)的被檢酵母，來(lái)選擇適合所需酒類釀造的酵母。
或者可通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，選擇硫化氫生成能力低的、或半胱氨酸合成酶活性高或低的酵母，以選擇適合所需酒類釀造的被檢酵母。
此時(shí)，作為被檢酵母或標(biāo)準(zhǔn)酵母，例如可使用上述導(dǎo)入了本發(fā)明載體的酵母、抑制了上述本發(fā)明的多核苷酸(DNA)表達(dá)的酵母、實(shí)施了突變處理的酵母、自發(fā)突變的酵母等。硫化氫生成量，例如可通過(guò)Brauwissenschaft.31.1(1978)、Applied.Environm.Microbiol.664421-4426(2000)、J.Am.Soc.Brew.Chem.5358-62(1995)中任一個(gè)所述的方法來(lái)測(cè)定。半胱氨酸合成酶活性，例如可通過(guò)J.Biol.Chem.4528187-28192(1994)中所述的方法測(cè)定。突變處理，例如可使用紫外線照射、放射線照射等的物理方法，通過(guò)甲磺酸乙酯(EMSEthylmethanesulfonate)、N-甲基-N-亞硝基胍(N-methyl-N-nitrosoguanidine)等藥劑處理的化學(xué)方法等的任何方法進(jìn)行(例如，參照大島泰治編著、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)法39酵母分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)法、p67-75、學(xué)會(huì)出版中心等)。
另外，可作為標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母使用的酵母，可例舉為釀造時(shí)可使用的任意的酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的釀造用酵母等。具體地說(shuō)，可例舉為酵母屬(Saccharomyces)等的酵母，在本發(fā)明中，可使用啤酒酵母例如Saccharomyces pastorianus W34/70等，Saccharomyces carlsbergensisNCYC453、NCYC456等，Saccharomyces cerevisiae NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。而且還可使用例如協(xié)會(huì)葡萄酒用1號(hào)、協(xié)會(huì)葡萄酒用3號(hào)、協(xié)會(huì)葡萄酒用4號(hào)等的葡萄酒酵母；例如協(xié)會(huì)酵母、清酒用7號(hào)、清酒用9號(hào)等的清酒酵母，但不限于這些。本發(fā)明中，啤酒酵母例如可優(yōu)選使用Saccharomyces pastorianus。標(biāo)準(zhǔn)酵母、被檢酵母可從上述酵母中以任意組合選擇。
實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于以下實(shí)施例。
實(shí)施例1新型半胱氨酸合成酶基因(nonScYGR012W)的克隆使用特開(kāi)2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中特有的新型半胱氨酸合成酶基因nonScYGR012W(序列號(hào)1)。以所得到的堿基序列信息為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各自全長(zhǎng)基因的引物nonScYGR012W_for(序列號(hào)3)/nonScYGR012W_rv(序列號(hào)4)，以基因組解讀株Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株(有時(shí)簡(jiǎn)稱為“W34/70株”)的染色體DNA為模板，通過(guò)PCR，獲得了含有nonScYGR012W全長(zhǎng)基因的DNA片段(約1.2kb)。
將如上所述得到的nonScYGR012W基因片段通過(guò)TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(invitrogen公司制)。將nonScYGR012W基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。
實(shí)施例2啤酒試驗(yàn)釀造中nonScYGR012W基因表達(dá)分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒試驗(yàn)釀造，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測(cè)。
麥汁浸出物濃度 12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度 8.6ppm發(fā)酵溫度 15℃酵母投入量 12.8×106cells/mL對(duì)發(fā)酵液經(jīng)時(shí)抽樣，觀察酵母增殖量(圖1)、表觀浸出物濃度(圖2)的經(jīng)時(shí)變化。且與此同時(shí)對(duì)酵母菌體抽樣，對(duì)制備后的mRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，使其在啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號(hào)檢測(cè)使用GCOS；Gene ChipOperating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)進(jìn)行。nonScYGR012W基因表達(dá)模式如圖3所示。由此結(jié)果，可確認(rèn)通常的啤酒發(fā)酵中nonScYGR012W基因進(jìn)行了表達(dá)。
實(shí)施例3nonScYGR012W基因高表達(dá)株的制備將實(shí)施例1中所述的nonScYGR012W/pCR2.1-TOPO用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI酶切，制備了包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)域全長(zhǎng)的DNA片段。使該片段與用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot連接，構(gòu)建了nonScYGR012W高表達(dá)載體nonScYGR012W/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過(guò)丙酮酸激酶基因PYK1的啟動(dòng)子高表達(dá)。酵母中的選擇性標(biāo)記包含耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因G418r、大腸桿菌中的選擇性標(biāo)記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的高表達(dá)載體，用特開(kāi)平07-303475中所述的方法轉(zhuǎn)化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷類抗生素(geneticin)300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例4啤酒試驗(yàn)釀造中硫化氫生成量的解析使用親代株(W34/70株)及由實(shí)施例3得到的nonScYGR012W高表達(dá)株通過(guò)以下條件進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)。
麥汁浸出物濃度12％麥汁容量 1L麥汁溶解氧濃度約8ppm發(fā)酵溫度 15℃恒定酵母投入量5g濕酵母菌體/L麥汁對(duì)發(fā)酵醪液經(jīng)時(shí)抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)(圖4)、浸出物消耗量的經(jīng)時(shí)變化(圖5)。對(duì)發(fā)酵終止時(shí)硫化氫的定量參考Takahashi等[Brauwissenschaft.31.1(1978)]的手法。測(cè)定含有預(yù)知濃度的硫化氫的試樣，從檢測(cè)出的硫化氫峰面積來(lái)制成硫化氫的校正曲線，用與標(biāo)準(zhǔn)試樣的分析條件相同的條件測(cè)定發(fā)酵醪液，從檢測(cè)出的硫化氫的面積與校正曲線的關(guān)系對(duì)硫化氫量進(jìn)行定量(表1)。
表1.發(fā)酵終止時(shí)發(fā)酵醪液中的硫化氫量

如表1所示，發(fā)酵終止時(shí)硫化氫生成量相對(duì)于親代株的22.1ppb，其nonScYGR012W高表達(dá)株為3.3ppb。由該結(jié)果可知，通過(guò)nonScYGR012W高表達(dá)，硫化氫的生成量約減少了85％。
實(shí)施例5半胱氨酸合成酶基因(ScYGR012W)的克隆使用特開(kāi)2004-283169中記載的比較數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了啤酒酵母中的半胱氨酸合成酶基因ScYGR012W(序列號(hào)5)。以所得到的堿基序列信息為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各自全長(zhǎng)基因的引物ScYGR012W_for(序列號(hào)7)/ScYGR012W_rv(序列號(hào)8)，以基因組解讀株Saccharomycespastorianus Weihenstephaner 34/70株的染色體DNA為模板，通過(guò)PCR，獲得了含有ScYGR012W全長(zhǎng)基因的DNA片段(約1.2kb)。
將如上所述得到的ScYGR012W基因片段通過(guò)TA克隆插入到pCR2.1-TOPO載體(invitrogen公司制)。將ScYGR012W基因的堿基序列用Sanger方法(F.Sanger，Science，214，1215，1981)進(jìn)行分析，以確認(rèn)堿基序列。
實(shí)施例6啤酒試驗(yàn)釀造中ScYGR012W基因表達(dá)分析使用啤酒酵母Saccharomyces pastorianus W34/70株進(jìn)行啤酒試驗(yàn)釀造，將從發(fā)酵中的啤酒酵母菌體中提取的mRNA用啤酒酵母DNA微陣列檢測(cè)。
麥汁浸出物濃度12.69％麥汁容量 70L麥汁溶解氧濃度8.6ppm發(fā)酵溫度 15℃酵母投入量12.8×106cells/mL對(duì)發(fā)酵液經(jīng)時(shí)抽樣，觀察酵母增殖量(圖6)、表觀浸出物濃度(圖7)的經(jīng)時(shí)變化。且與此同時(shí)對(duì)酵母菌體抽樣，對(duì)制備后的mRNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，使其在啤酒酵母DNA微陣列雜交。信號(hào)檢測(cè)使用GCOS；Gene ChipOperating Software 1.0(AFFYMETRIX公司制)進(jìn)行。ScYGR012W基因表達(dá)模式如圖8所示。由該結(jié)果，可確認(rèn)通常的啤酒發(fā)酵中ScYGR012W基因進(jìn)行了表達(dá)。
實(shí)施例7ScYGR012W基因高表達(dá)株的制備將實(shí)施例5中所述的ScYGR012W/pCR2.1-TOPO用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI酶切，制備了包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)域全長(zhǎng)的DNA片段。使該片段與用限制性內(nèi)切酶SacI及NotI処理的pYCGPYNot連接，構(gòu)建了ScYGR012W高表達(dá)載體ScYGR012W/pYCGPYNot。pYCGPYNot是YCp型的酵母表達(dá)載體，導(dǎo)入的基因通過(guò)丙酮酸激酶基因PYK1的啟動(dòng)子高表達(dá)。酵母中的選擇性標(biāo)記包含耐氨基糖苷類抗生素(geneticin)基因G418r，大腸桿菌中的選擇性標(biāo)記包含氨芐青霉素抗性基因Ampr。
使用由上述方法制備的高表達(dá)載體，用特開(kāi)平07-303475中所述的方法轉(zhuǎn)化Saccharomyces pastorianus Weihenstephaner 34/70株。用含有氨基糖苷類抗生素(geneticin)300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1％酵母浸出物、2％多聚蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)選擇轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例8啤酒試驗(yàn)釀造中硫化氫生成量的解析使用親代株(W34/70株)及由實(shí)施例7得到的ScYGR012W高表達(dá)株通過(guò)以下條件進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)。
麥汁浸出物濃度12％麥汁容量 1L麥汁溶解氧濃度約8ppm發(fā)酵溫度 15℃恒定酵母投入量5g濕酵母菌體/L麥汁對(duì)發(fā)酵醪液經(jīng)時(shí)抽樣，觀察酵母增殖量(OD660)(圖9)、浸出物消耗量的經(jīng)時(shí)變化(圖10)。對(duì)發(fā)酵終止時(shí)硫化氫的定量參考Takahashi等[Brauwissenschaft.31.1(1978)]的手法。測(cè)定含有預(yù)知濃度的硫化氫的試樣，從檢測(cè)出的硫化氫峰面積來(lái)制成硫化氫的校正曲線，用與標(biāo)準(zhǔn)試樣的分析條件相同的條件測(cè)定發(fā)酵醪液，從檢測(cè)出的硫化氫的面積與校正曲線的關(guān)系對(duì)硫化氫量進(jìn)行定量(表2)。
表2.發(fā)酵終止時(shí)發(fā)酵醪液中的硫化氫量

如表2所示，發(fā)酵終止時(shí)硫化氫生成量相對(duì)于親代株的22.1ppb，其ScYGR012W高表達(dá)株為2.6ppb。由該結(jié)果可知，通過(guò)ScYGR012W高表達(dá)，硫化氫的生成量約減少了88％。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性因根據(jù)使用本發(fā)明的酵母的酒類制造方法(本發(fā)明的酒類的制造方法)，可通過(guò)半胱氨酸合成酶迅速消耗硫化氫，所以啤酒釀造及產(chǎn)品中硫化氫的濃度可被抑制到很低的水平，從而制造出香味優(yōu)異的酒類。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>三得利株式會(huì)社(Suntory Limited)<120>半胱氨酸合成酶基因及其用途(Cysteine synthase gene and its use)<130>PCT06-0075<150>JP2005-240350<151>2005-08-22<150>JP2006-47554<151>2006-02-23<160>8<210>1<211>1188<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>1atgtccagtt cacgagataa gaacgctttg tatttgcctt ggaacgaatg catttccatc 60gcttccgtcc taatcggcgc atatgcatcg tataaatatt ataaactatg caaggcgcag 120gatataccac gtccaaaaga tggtgtggag cagctaatag gaaacactcc cctggttcag 180attagatccc tttccaaggc caccggagtt aacatttatg caaaattaga gttatgtaac 240ccagcaggaa gtgctaaaga tagagtagca ttaaacataa taaagaccgc agaggaacga 300ggtgagctaa tcagaggcga acctggttgg gtgttcgaag gaacaagcgg ttcaacaggc 360atttctatag ccatggtctg taatgcacta ggatataggg cacacatttc tttacccgac 420gacacatcgt tagaaaagtt ggcattacta gaaagtctcg gtgctacagt caataaggtt 480aagcctgcca gtattgtcga tccaaatcaa tatgttaatg cagctaagaa agcatgcgat 540gatttgagta aggaaggtaa tggagtaaag gcagtttttg ctgaccaatt tgaaaatgaa 600gccaattgga gagtacacta tcaaaccacg ggtccagaaa ttgcccatca aatggaagga 660aaaattgatg cgtttattgc tggctgtggt accggtggaa cgataactgg agtggccaaa 720tatctaaagg aaagcgcaaa aattccgtgc catgtcgttc ttgcagatcc acaaggttca 780ggcttttata ataggataaa ctacggcgtg atgtatgact atgtagaaaa agaaggtaca 840agaaggaggc atcaggtgga tactattgta gaaggtatcg ggctaaacag gattactcaa 900aatttccaca tgggcgaaga gtttatcgat gaatcgatac gtgtcaatga cactcaagct 960atcagaatgg caaaatacct atcagtaaac gatgggttat tcgtaggaag tagtacagct 1020ataaacgcag tagctgctgt tcaaatcgcg aaaagactcc ctcctggtgc caacattgta 1080attattgcat gcgacagcgg atcaagacat ttaagtaaat tctggaaaga agctaaacaa 1140atagagtatg acatatcgtt aaaggagata acaggtggca ttcgatga1188<210>2<211>395<212>PRT
<213>酵母(Yeast)<400>2Met Ser Ser Ser Arg Asp Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Pro Trp Asn Glu1 5 10 15Cys Ile Ser Ile Ala Ser Val Leu Ile Gly Ala Tyr Ala Ser Tyr Lys20 25 30Tyr Tyr Lys Leu Cys Lys Ala Gln Asp Ile Pro Arg Pro Lys Asp Gly35 40 45Val Glu Gln Leu Ile Gly Asn Thr Pro Leu Val Gln Ile Arg Ser Leu50 55 60Ser Lys Ala Thr Gly Val Asn Ile Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Cys Asn65 70 75 80Pro Ala Gly Ser Ala Lys Asp Arg Val Ala Leu Asn Ile Ile Lys Thr85 90 95Ala Glu Glu Arg Gly Glu Leu Ile Arg Gly Glu Pro Gly Trp Val Phe100 105 110Glu Gly Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ile Ser Ile Ala Met Val Cys Asn115 120 125Ala Leu Gly Tyr Arg Ala His Ile Ser Leu Pro Asp Asp Thr Ser Leu130 135 140Glu Lys Leu Ala Leu Leu Glu Ser Leu Gly Ala Thr Val Asn Lys Val145 150 155 160Lys Pro Ala Ser Ile Val Asp Pro Asn Gln Tyr Val Asn Ala Ala Lys165 170 175Lys Ala Cys Asp Asp Leu Ser Lys Glu Gly Asn Gly Val Lys Ala Val180 185 190Phe Ala Asp Gln Phe Glu Asn Glu Ala Asn Trp Arg Val His Tyr Gln195 200 205Thr Thr Gly Pro Glu Ile Ala His Gln Met Glu Gly Lys Ile Asp Ala210 215 220Phe Ile Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Val Ala Lys225 230 235 240Tyr Leu Lys Glu Ser Ala Lys Ile Pro Cys His Val Val Leu Ala Asp245 250 255Pro Gln Gly Ser Gly Phe Tyr Asn Arg Ile Asn Tyr Gly Val Met Tyr260 265 270Asp Tyr Val Glu Lys Glu Gly Thr Arg Arg Arg His Gln Val Asp Thr275 280 285Ile Val Glu Gly Ile Gly Leu Asn Arg Ile Thr Gln Asn Phe His Met290 295 300Gly Glu Glu Phe Ile Asp Glu Ser Ile Arg Val Asn Asp Thr Gln Ala305 310 315 320Ile Arg Met Ala Lys Tyr Leu Ser Val Asn Asp Gly Leu Phe Val Gly325 330 335Ser Ser Thr Ala Ile Asn Ala Val Ala Ala Val Gln Ile Ala Lys Arg
340 345 350Leu Pro Pro Gly Ala Asn Ile Val Ile Ile Ala Cys Asp Ser Gly Ser355 360 365Arg His Leu Ser Lys Phe Trp Lys Glu Ala Lys Gln Ile Glu Tyr Asp370 375 380Ile Ser Leu Lys Glu Ile Thr Gly Gly Ile Arg385 390 395<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>3gagctcatag cggccatgtc cagttcacga gataagaacg 40<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>4ggatcctatg cggccgcgga aaaactaaca aggaattcag aa 42<210>5<211>1182<212>DNA<213>酵母(Yeast)<400>5atgtcctgtt ctcaaaataa gacttctgtc agtctggcct ggcgtgaatg catatccatc 60gcttccgtcc taattggcgc gtatgcatca tacagatact ataagttgtt caaaacacgc 120gatattccac gtccaaaaga aggcattgaa gaactcatag gaaacactcc tctggttaag 180atcagatctc ttaccaaggc tactggagtt aacatttacg ctaagttgga gttatgcaac 240ccagcaggaa gtgctaagga tagagtggct ttaaacatca taaagacggc tgaggaatta 300ggcgagctcg tcagaggtga acctggctgg gtatttgaag gaacaagtgg gtcgactggt 360atctctatag cagtggtctg taatgcgttg ggttataggg cacacatttc tttgcccgat 420gacacatcgc tagaaaaatt ggcattacta gaaagcctcg gtgctactgt taataaggtt 480aagcccgcta gtattgtcga tccaaaccaa tacgtaaatg ccgccaaaaa ggcatgtaat 540
gaactaaaga agagtggtaa tggaataaga gcagtttttg ccgatcagtt cgaaaacgaa 600gccaactgga aagtacatta ccagaccaca ggcccagaaa ttgcccatca aactaaggga 660aatattgacg cattcattgc tggttgcggt actggtggca ccataactgg tgtggcaaaa 720ttcttaaagg aaagagcaaa gataccttgc catgtcgttc tagcggatcc acaaggatct 780ggcttttata atagagtcaa ctatggcgtg atgtatgact atgtagagaa ggaaggtact 840agaagaaggc atcaagttga cactatcgta gaagggattg ggttaaacag aatcactcat 900aattttcata tgggcgaaaa atttattgat gaatcaatac gagtcaacga taatcaagcc 960attagaatgg caaaatacct atcggtaaac gacgggctat tcgtggggag tagtacagct 1020attaatgcgg tagccgctat tcaggttgca aaaacgcttc ctcacggctc aaacattgtg 1080attattgcat gcgacagcgg ttcaagacac ctaagtaaat tctggaaaga agctaaagaa 1140atcgatcacg acgtatcatt agaagaagta ataaatatct aa 1182<210>6<211>393<212>PRT<213>酵母(Yeast)<400>6Met Ser Cys Ser Gln Asn Lys Thr Ser Val Ser Leu Ala Trp Arg Glu1 5 10 15Cys Ile Ser Ile Ala Ser Val Leu Ile Gly Ala Tyr Ala Ser Tyr Arg20 25 30Tyr Tyr Lys Leu Phe Lys Thr Arg Asp Ile Pro Arg Pro Lys Glu Gly35 40 45Ile Glu Glu Leu Ile Gly Asn Thr Pro Leu Val Lys Ile Arg Ser Leu50 55 60Thr Lys Ala Thr Gly Val Asn Ile Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Cys Asn65 70 75 80Pro Ala Gly Ser Ala Lys Asp Arg Val Ala Leu Asn Ile Ile Lys Thr85 90 95Ala Glu Glu Leu Gly Glu Leu Val Arg Gly Glu Pro Gly Trp Val Phe100 105 110Glu Gly Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ile Ser Ile Ala Val Val Cys Asn115 120 125Ala Leu Gly Tyr Arg Ala His Ile Ser Leu Pro Asp Asp Thr Ser Leu130 135 140Glu Lys Leu Ala Leu Leu Glu Ser Leu Gly Ala Thr Val Asn Lys Val145 150 155 160Lys Pro Ala Ser Ile Val Asp Pro Asn Gln Tyr Val Asn Ala Ala Lys165 170 175Lys Ala Cys Asn Glu Leu Lys Lys Ser Gly Asn Gly Ile Arg Ala Val180 185 190Phe Ala Asp Gln Phe Glu Asn Glu Ala Asn Trp Lys Val His Tyr Gln195 200 205Thr Thr Gly Pro Glu Ile Ala His Gln Thr Lys Gly Asn Ile Asp Ala
210 215 220Phe Ile Ala Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ile Thr Gly Val Ala Lys225 230 235 240Phe Leu Lys Glu Arg Ala Lys Ile Pro Cys His Val Val Leu Ala Asp245 250 255Pro Gln Gly Ser Gly Phe Tyr Asn Arg Val Asn Tyr Gly Val Met Tyr260 265 270Asp Tyr Val Glu Lys Glu Gly Thr Arg Arg Arg His Gln Val Asp Thr275 280 285Ile Val Glu Gly Ile Gly Leu Asn Arg Ile Thr His Asn Phe His Met290 295 300Gly Glu Lys Phe Ile Asp Glu Ser Ile Arg Val Asn Asp Asn Gln Ala305 310 315 320Ile Arg Met Ala Lys Tyr Leu Ser Val Asn Asp Gly Leu Phe Val Gly325 330 335Ser Ser Thr Ala Ile Asn Ala Val Ala Ala Ile Gln Val Ala Lys Thr340 345 350Leu Pro His Gly Ser Asn Ile Val Ile Ile Ala Cys Asp Ser Gly Ser355 360 365Arg His Leu Ser Lys Phe Trp Lys Glu Ala Lys Glu Ile Asp His Asp370 375 380Val Ser Leu Glu Glu Val Ile Asn Ile385 390<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>7gagctcatag cggccatgtc ctgttctcaa aataagactt 40<210>8<211>42<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220>
<223>引物(Primer)<400>8ggatcctatg cggccgccca cggaaagtag caaaaaatgt ag。4權(quán)利要求
1.從以下(a)～(f)組成的組中選擇的多核苷酸，其為(a)含有由序列號(hào)1的堿基序列組成的多核苷酸的多核苷酸；(b)含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(c)含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列中1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(d)含有編碼具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有等于或大于60％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(e)含有與序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；以及(f)含有與編碼序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其從以下(g)～(i)組成的組中選擇(g)含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列或序列號(hào)2的氨基酸序列中1～10個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(h)含有編碼具有與序列號(hào)2的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；及(i)含有與序列號(hào)1的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號(hào)1的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
3.權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有由序列號(hào)1的堿基序列組成的多核苷酸。
4.權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其含有編碼由序列號(hào)2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其是DNA。
6.蛋白質(zhì)，其由權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼。
7.載體，其含有權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
8.載體，其含有從以下(j)～(l)組成的組中選擇的多核苷酸(i)含有編碼由序列號(hào)6的氨基酸序列或序列號(hào)6的氨基酸序列中1～10個(gè)氨基酸缺失、取代、插入及/或添加了的氨基酸序列組成的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；(k)含有編碼具有與序列號(hào)6的氨基酸序列有等于或大于90％同源性的氨基酸序列的，且具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸；及(l)含有與序列號(hào)5的堿基序列組成的多核苷酸、或序列號(hào)5的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有半胱氨酸合成酶活性的蛋白質(zhì)的多核苷酸的多核苷酸。
9.酵母，其中導(dǎo)入了權(quán)利要求7或8中所述的載體。
10.權(quán)利要求9中所述的酵母，其通過(guò)導(dǎo)入權(quán)利要求7或8中所述的載體降低硫化氫生成能力。
11.權(quán)利要求10中所述的酵母，其通過(guò)使權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加降低硫化氫生成能力。
12.酒類的制造方法，其使用權(quán)利要求9～11中任一項(xiàng)所述的酵母。
13.權(quán)利要求12中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是麥芽飲料。
14.權(quán)利要求12中所述的酒類的制造方法，其釀造的酒類是葡萄酒。
15.酒類，其用權(quán)利要求12～14中任一項(xiàng)所述的方法制造。
16.評(píng)價(jià)方法，其使用根據(jù)具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的堿基序列設(shè)計(jì)的引物或探針，評(píng)價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能力。
17.評(píng)價(jià)方法，其通過(guò)培養(yǎng)被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)量，評(píng)價(jià)被檢酵母的硫化氫生成能力。
18.酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)被檢酵母，對(duì)權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)定量或測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)量，選擇與目的硫化氫生成能力相應(yīng)的前述蛋白質(zhì)的量或前述基因表達(dá)量的被檢酵母。
19.權(quán)利要求18中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，測(cè)定具有序列號(hào)1或序列號(hào)5的堿基序列的半胱氨酸合成酶基因在各酵母中的表達(dá)量，選擇該基因比標(biāo)準(zhǔn)酵母高表達(dá)的被檢酵母。
20.權(quán)利要求18中所述的酵母的選擇方法，其包括培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)酵母及被檢酵母，對(duì)各酵母中權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)定量，選擇該蛋白質(zhì)的量比標(biāo)準(zhǔn)酵母多的被檢酵母。
21.酒類的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求9～11中所述的酵母及通過(guò)權(quán)利要求18～20中所述方法選擇的酵母中的任一個(gè)酵母，進(jìn)行用于酒類制造的發(fā)酵，調(diào)節(jié)硫化氫的生成量。
全文摘要
本發(fā)明涉及半胱氨酸合成酶基因及其用途，特別是涉及制造香味優(yōu)異的酒類的釀造酵母、使用該酵母制造的酒類及其制造方法等。進(jìn)一步具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)提高編碼釀造酵母半胱氨酸合成酶Ygr012wp的基因YGR012W，特別是啤酒酵母中特征性的nonScYGR012W基因的表達(dá)量，提高產(chǎn)品香味的酵母及使用該酵母的酒類的制造方法等。
文檔編號(hào)C12C7/00GK1920043SQ20061012138
公開(kāi)日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2006年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月22日
發(fā)明者中尾嘉宏, 兒玉由紀(jì)子, 下永朋子 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社