專利名稱：一種高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng) 方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草為中外馳名的珍貴中草藥，其主要成分為蟲草酸、蟲草素、蟲草多 糖以及抗衰老、抗惡性腫瘤的活性物質(zhì)等，具有滋肺補(bǔ)腎、益精定喘、擴(kuò)展血管、降 低血壓、抗病毒等多種功效。于是冬蟲夏草需求量不斷增加，有限的天然資源，曰趨 枯竭，且人工栽培不易成功。
北蟲草，又稱北冬蟲夏草。北蟲草的藥用成分及含量和藥用價值可與冬蟲夏草媲
美，其中蟲草素含量為冬蟲夏草的3-5倍，其它主要成分的含量多數(shù)高于或相當(dāng)于冬 蟲夏草。北蟲草可以人工栽培，培養(yǎng)基的原料主要為大米。本發(fā)明通過對北蟲草菌株 的篩選，得到蛹蟲草COB201，其蟲草素含量平均為1.4%，最高可達(dá)1.7%。目前， 其他北冬蟲夏草菌株蟲草素含量為0.5-0.7%,天然蟲草中蟲草素含量約為0.2%。關(guān) 于高含量蟲草素的北冬蟲夏草，因各種原因尚無工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究設(shè)計高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培 養(yǎng)方法。
本發(fā)明人經(jīng)過長期研究，篩選到能用于工業(yè)化生產(chǎn)制備高含量蟲草素的北冬蟲夏 草的菌株。
本發(fā)明所涉及的北冬蟲夏草菌株是從沈陽棋盤山上的野生北冬蟲夏草中分離馴 化出來的。從棋盤山上采集來的野生北冬蟲夏草先用75%的酒精清洗，再用l%HgC12 溶液浸泡2min，然后用無菌水洗4次。清洗干凈的野生北冬蟲夏草進(jìn)行北蟲草孢子 分離，進(jìn)而分離得到純的菌株，經(jīng)三個世代的培養(yǎng)馴化，篩選出蟲草素含量較高的 COB201株菌。該菌株為蟲草屬菌種，蛹蟲草(蛹蟲草擬青霉)Cordyceps militaris。 由上海高博特生物保健品有限公司篩選得到。菌種培養(yǎng)條件PDA馬鈴薯葡萄糖瓊
脂培養(yǎng)基，避光溫度2o。c土rc。
北冬蟲夏草菌株COB201經(jīng)北京微生物研究所進(jìn)行菌種鑒定和毒力試驗，鑒定為 蛹蟲草擬青霉，該菌株作為一個新的北冬蟲夏草株已于2006年9月22日在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。(地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村一條13號， 中國科學(xué)院微生物研究所)。保藏號CGMCCNo.1823，蟲草屬菌種，蛹蟲草(蛹蟲草 擬青霧) Coniyce戸。
本發(fā)明提供了一種高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng)方法 本發(fā)明方法包括下列歩驟-
(1) 菌種制備從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草母種，蛹蟲草擬青霉，
CGMCCNo.l823接入改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，2(TC土rC，避光培養(yǎng)10-12 天，再接入原種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，2(TC士rC，搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)好的北冬蟲夏 草菌液放入冰箱，備用；
改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方，每1000ml:
土豆190 —210g庶糖19一21g瓊脂19 —21g
加水補(bǔ)足1000ml 原種培養(yǎng)基配方，每1000mh
土豆190—210g蔗糖9一llg蛋白胨0.9—l.lg胡蘿卜9 — llg 洋蔥9— llg蘑菇9一llg雞蛋4—6g明礬0.04—0.06g碳酸氫鈉0.9 — 1.lg 加水補(bǔ)足1000ml
(2) 配料裝瓶
培養(yǎng)瓶體積為255ml，每個培養(yǎng)瓶中加入大米24g，水32ml，混勻后上蓋，準(zhǔn)備 滅菌；
(3) 滅菌
將培養(yǎng)瓶排列整齊放入滅菌鍋內(nèi)，在121'C下，高壓蒸汽滅菌30分鐘。冷卻后， 取出準(zhǔn)備接種；
(4) 接種
將步驟(1)里培養(yǎng)好的原種液，按每個培養(yǎng)瓶中加入2.5ml的原種液進(jìn)行接
種；
(5)培養(yǎng)
接好種的北蟲草培養(yǎng)瓶，移至培養(yǎng)架中，控制培養(yǎng)溫度2(TC士rC，濕度控制在 65%-95%，每天光照9小時，光照強(qiáng)度為15001x-35001x，每天通風(fēng)1小時以上。培 養(yǎng)45-60天，待北冬蟲夏草成熟后(直徑2mm，長8cm),即可進(jìn)行檢驗和包裝成品。
本發(fā)明產(chǎn)品的檢測結(jié)果
北冬蟲夏草中腺苷和蟲草素的檢測方法
1. 原理
蟲草素和腺苷的酸堿性不同以及結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致他們與柱內(nèi)載體吸附能力的不 同，同時利用緩沖溶液加大蟲草素和腺苷的洗脫時間差，從而達(dá)到分離的目的。腺苷 在256nm處有最大吸收，蟲草素在此波長接近最大吸收，且吸收值與濃度呈線形關(guān) 系。
2. 試劑
2.1磷酸二氫鉀(分析純)、乙醇(優(yōu)級純)、甲醇(優(yōu)級純)、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品、蟲草素標(biāo) 準(zhǔn)品、雙蒸水 2.2溶液的配制
腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品O.OlOOg，加水溶解并定容到50ml， 放置冰箱，備用。
蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)4.2mg，加水溶解并定容到100ml， 放置冰箱，備用。
0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液稱取磷酸二氫鉀1.3609g，加雙蒸水溶解，定容至 1000ml。
3. 儀器
高效液相色譜儀、超聲波清洗器、離心機(jī)
4. 分析步驟
4.1樣品溶液的制備
精密稱取100目蟲草粉0.2g，于50ml三角燒瓶中，加20ml提取液，超聲提取 15分鐘，3000rpm離心5分鐘，殘渣重復(fù)操作一次，合并濾液，定容至50ml，再吸 取5ml定容到100ml。 4.2色譜柱條件
色譜柱C18柱4.6X150mm， 5"m 柱溫室溫
紫外檢測器檢測波長256mn 流動相甲醇0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液
=10: 90
流速1.0mL/min 4.3測定
取20uL標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液注入色譜柱，以保留時間定性，以峰面積比較定量。 4.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制濃度為0.200、 1.00、 2.00、 5.00、 10.00 u g/ml腺苷標(biāo)準(zhǔn) 溶液，在給定的儀器條件下進(jìn)行液相色譜分析，以峰面積對濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線分別配制濃度為0.42、 1.005、 5.025、 10.050、 15.075 " g/ml 腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在給定的儀器條件下進(jìn)行液相色譜分析，以峰面積對濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5.結(jié)果計算A-峰面積/100
蟲草素％= (0.0017A+0.0142) *20*50/1000/(M*1000)*100
本發(fā)明方法釆用篩選的菌株蛹蟲草COB201、 CGMCC No.1823進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)， 得到高含量蟲草素的北冬蟲夏草，經(jīng)檢測產(chǎn)品中蟲草素含量達(dá)到1.7%，本發(fā)明方法 簡單，適于規(guī)模型的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式
實施例一
(改良PDA培養(yǎng)基)
土豆190g 蔗糖21g 瓊脂20g
加水補(bǔ)足1000ml_從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草母種，接入改良PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)
培養(yǎng)基中，2crc土rc，避光培養(yǎng)io-i2天，即得到原種液。
(原種培養(yǎng)基)
土豆200g 蔗糖10g 蛋白胨1.0g 胡蘿卜10g 洋蔥10g 蘑菇10g 雞蛋5g 明礬0.05g 碳酸氫鈉l.Og
加水補(bǔ)足1000ml_
每個培養(yǎng)瓶中加入大米24g，水32ml，混勻后上蓋，滅菌；按每個培養(yǎng)瓶中加入 2.5ml的原種液進(jìn)行接種。接好種的北蟲草培養(yǎng)瓶，移至培養(yǎng)架中，控制培養(yǎng)溫度20 。C士rC，濕度控制在65%-95%，每天光照9小時，光照強(qiáng)度為15001x-35001x，每 天通風(fēng)l小時以上。培養(yǎng)45-60天，待北冬蟲夏草成熟后(直徑2mm，長8cra),即可 進(jìn)行檢驗和包裝成品。經(jīng)檢測，蟲草素含量為1.7%。
實施例二 (改良PDA培養(yǎng)基)
土豆200g
蔗糖20g
瓊脂20g
加水補(bǔ)足1000ml_
從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草母種，接入改良PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)
培養(yǎng)基中，2crc土rc，避光培養(yǎng)io-12天，即得到原種液。
(原種培養(yǎng)基):
土豆204g 蔗糖9g 蛋白胨1.0g 胡蘿卜9g 洋蔥9g
蘑菇9g 雞蛋5g 明礬0.05g 碳酸氫鈉l.Og
加水補(bǔ)足1000ml_
每個培養(yǎng)瓶中加入大米24g，水32ml，混勻后上蓋，滅菌；按每個培養(yǎng)瓶中加入2.5ml
的原種液進(jìn)行接種。接好種的北蟲草培養(yǎng)瓶，移至培養(yǎng)架中，控制培養(yǎng)溫度2crc土i
°C，濕度控制在65%-95%,每天光照9小時，光照強(qiáng)度為15001x-35001x，每天通風(fēng)l 小時以上。培養(yǎng)45-60天，待北冬蟲夏草成熟后(直徑2mm，長8cm)，即可進(jìn)行檢驗 和包裝成品。經(jīng)檢測，蟲草素含量為1.5%。
實施例三 (改良PDA培養(yǎng)基)
土豆190g
蔗糖21g
瓊脂20g
加水補(bǔ)足1000ml_
從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草母種，接入改良PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基) 培養(yǎng)基中，20'C士rC，避光培養(yǎng)10-12天，即得到原種液。
(原種培養(yǎng)基) 土豆196g 蔗糖llg 蛋白胨1.0g 胡蘿卜llg 洋蔥llg 蘑菇llg 雞蛋5g 明礬0.05g 碳酸氫鈉l.Og
加水補(bǔ)足1000ml_
每個培養(yǎng)瓶中加入大米24g，水32ml，混勻后上蓋，滅菌；按每個培養(yǎng)瓶中加入2.5ml 的原種液進(jìn)行接種。接好種的北蟲草培養(yǎng)瓶，移至培養(yǎng)架中，控制培養(yǎng)溫度2(TC土1 。C，濕度控制在65%-95%，每天光照9小時，光照強(qiáng)度為15001x-35001x，每天通風(fēng)l
小時以上。培養(yǎng)45-60天，待北冬蟲夏草成熟后(直徑2mm,長8cm)，即可進(jìn)行檢驗 和包裝成品。經(jīng)檢測，蟲草素含量為1.4%。
權(quán)利要求
1、一種高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)菌種制備從野生蟲草中分離得到的北冬蟲夏草母種，蛹蟲草COB201、CGMCC No.1823，接入改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，20℃±1℃，避光培養(yǎng)10-12天，再接入原種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，20℃±1℃，搖床培養(yǎng)5天，培養(yǎng)好的北冬蟲夏草菌液放入冰箱，備用；(2)配料裝瓶培養(yǎng)瓶體積為255ml，每個培養(yǎng)瓶中加入大米24g，水32ml，混勻后上蓋，準(zhǔn)備滅菌；(3)滅菌將培養(yǎng)瓶排列整齊放入滅菌鍋內(nèi)，在121℃下，高壓蒸汽滅菌30分鐘。冷卻后，取出準(zhǔn)備接種；(4)接種將步驟(1)里培養(yǎng)好的原種液，按每個培養(yǎng)瓶中加入2.5ml的原種液進(jìn)行接種；(5)培養(yǎng)接好種的北蟲草培養(yǎng)瓶，移至培養(yǎng)架中，控制培養(yǎng)溫度20℃±1℃，濕度控制在65％-95％，每天光照9小時，光照強(qiáng)度為1500lx-3500lx，每天通風(fēng)1小時以上。培養(yǎng)45-60天，待北冬蟲夏草成熟后直徑2mm，長8cm時，即可進(jìn)行檢驗和包裝成品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng)方法，其 特征在于該方法步驟(1)的改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方，每1000ml:土豆190—210g蔗糖19一21g瓊脂19一21g加水補(bǔ)足lOOOml; 原種培養(yǎng)基配方，每1000ml:土豆190—210g 蔗糖9一llg 蛋白胨0.9—l.lg胡蘿卜9一llg 洋蔥9一 llg蘑菇9一llg雞蛋4一6g明礬0.04—0.06g碳酸氫鈉0.9—Ug力口水補(bǔ)足lOOOml。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng)方法，其 特征在于該方法制得的北冬蟲夏草中，蟲草素含量為1.4%-1.7% 。
4、 一種北冬蟲夏草菌株蛹蟲草COB201、 CGMCC No.1823，其特征在于該菌株 為蟲草屬菌種，蛹蟲草擬青霉 Cw辦ce/WAm7/ton、。
全文摘要
本發(fā)明提供了高含量蟲草素的北冬蟲夏草工業(yè)化培養(yǎng)方法。本發(fā)明方法采用篩選的菌株蛹蟲草COB201、CGMCC No.1823進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)，得到高含量蟲草素的北冬蟲夏草，經(jīng)檢測產(chǎn)品中蟲草素含量達(dá)到1.7％，本發(fā)明方法簡單，適于規(guī)模型的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/14GK101177665SQ200610117998
公開日2008年5月14日 申請日期2006年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月6日
發(fā)明者剛 張, 范培萍 申請人:張 剛;范培萍