專(zhuān)利名稱(chēng)：：固定化雙酶法制備n-乙酰神經(jīng)氨酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用利用酶促反應(yīng)制備N(xiāo)-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，尤其涉及利用固定化酶的方法制備N(xiāo)-乙酰神經(jīng)氨酸。
背景技術(shù)：
：在生物體神經(jīng)氨酸生物代謝途徑中，N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)化產(chǎn)生N-乙酰甘露糖胺，由N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸通過(guò)N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的催化反應(yīng)就可以生成神經(jīng)氨酸。神經(jīng)氨酸及其衍生物通過(guò)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)結(jié)合到生物體表面發(fā)揮其生物學(xué)效力。唾液酸(N-乙酰神經(jīng)氨酸及其衍生物)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和相互識(shí)別過(guò)程之中起著十分重要的作用，例如在流感病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程之中，流感病毒的唾液酸酶可以識(shí)別N-乙酰神經(jīng)氨酸及其衍生物，并通過(guò)與唾液酸結(jié)合感染細(xì)胞并釋放出復(fù)制好的病毒。如果將其唾液酸酶進(jìn)行抑制，那么就可以治療病毒導(dǎo)致的疾病。根據(jù)唾液酸的結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)其類(lèi)似物，利用這種類(lèi)似物結(jié)合病毒的唾液酸酶，使之失去與宿主細(xì)胞表面唾液酸結(jié)合的機(jī)會(huì)，那么病毒就可以被有效地抑制。如葛蘭素公司推出的抗病毒新藥zanamavir就是N-乙酰神經(jīng)氨酸的類(lèi)似物，它具有良好的抗病毒活性。工業(yè)上生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸主要分為化學(xué)合成法、天然產(chǎn)物水解法、微生物發(fā)酵法和酶法合成，其中酶法合成相對(duì)于前幾種方法，具有高效、專(zhuān)一、快速的優(yōu)點(diǎn)，因此受到人們的重視。N-乙酰神經(jīng)氨酸的酶法合成主要以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸為底物，在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的催化下生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。使用酶法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸始于上世紀(jì)60年代，Comb等人首次使用N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。1卵5年，Ohta，Y等人從Acoh'中克隆出N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，揭開(kāi)了借助基因工程手段生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的序幕。由于N-乙酰甘露糖胺價(jià)格昂貴，人們一直在探索利用較為廉價(jià)的N-乙酰葡萄糖胺來(lái)生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸。1964年Ghost從豬腎臟中提取出了N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶，由于該酶提取困難，所以不能用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。1991年，Kragl等人使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和丙酮酸通過(guò)連續(xù)反應(yīng)生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，但是N-乙酰葡萄糖胺的轉(zhuǎn)化率僅為18%，而且從豬腎中直接提取的異構(gòu)酶量十分少，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求。1996年，IMaru等人從豬腎中成功克隆出了N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶，并且發(fā)現(xiàn)他與腎素結(jié)合蛋白有很高的同源性(99%)，由于該酶的成功克隆，使得酶法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的工業(yè)化應(yīng)用成為可能。1997年，IMaru等人利用克隆表達(dá)的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和神經(jīng)氨酸醛縮酶大規(guī)模反應(yīng)生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，他們通過(guò)補(bǔ)加丙酮酸的方法，將84%的N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)化為77%的N-乙酰神經(jīng)氨酸和7%的N-乙酰甘露糖胺。之后，人們相繼發(fā)現(xiàn)人，鼠的腎素結(jié)合蛋白具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶活力，2003年，Jeong-0hLee等人利用人腎素結(jié)合蛋白和神經(jīng)氨酸醛縮酶在同一反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，他們采用先高溫異構(gòu)反應(yīng)，再低溫轉(zhuǎn)化為N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到60%左右。人們通過(guò)堿性條件或使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶使廉價(jià)的N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)化為N-乙酰甘露糖胺。使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶兩酶在同一反應(yīng)器中共轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸可以克服堿性條件異構(gòu)反應(yīng)引起的底物丙酮酸或其鹽降解，N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶酶活力下降等問(wèn)題。但兩酶共轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)中，使用的酶均為游離態(tài)的酶，其缺點(diǎn)在于酶不能重復(fù)使用，且反應(yīng)的時(shí)間較長(zhǎng)(約240小時(shí))。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種新的使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶在同一反應(yīng)器中共轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，該方法不僅轉(zhuǎn)化率高，同時(shí)N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶可以重復(fù)使用，而且所用的反應(yīng)時(shí)間短:，
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種使用固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶制備N(xiāo)-乙酰神經(jīng)氨酸的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備N(xiāo)-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，它包括步驟(a)將N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸或其鹽與0.6-10U/ml固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和1.2-10U/ml固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶混合得到反應(yīng)混合物；(b)從反應(yīng)混合物中分離得到N-乙酰神經(jīng)氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)前還包括步驟將N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶與載體結(jié)合形成固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶；及將N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶與載體結(jié)合形成固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。在另一優(yōu)選例中，所述的丙酮酸或其鹽包括但不限于丙酮酸，丙酮酸鈉。優(yōu)選丙酮酸鈉。在另一優(yōu)選例中，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶是重組的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。在另一優(yōu)選例中，所述的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶是E.C.5.1.3.8，所述的固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶是E.C.4.1.3.3。在另一優(yōu)選例中，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶N末端都有6個(gè)組氨酸殘基。在另一優(yōu)選例中，所述的固定化酶所用載體為陶瓷、玻璃、高分子合成材料、木炭、或纖維素。在另一優(yōu)選例中，所述的載體為Amberzyrae在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶的用量為1.2-2.5U/ml。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶用量為2.5-5U/ml。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的用量配比為0.1-10:1。在另一優(yōu)選例中，所述的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的用量配比為0.1-4:1，更佳地為0.5:1。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中還包括添加丙酮酸或其鹽，從而維持反應(yīng)體系中丙酮酸或其鹽的濃度為0.2-0.6M。在另一優(yōu)選例中，所述的丙酮酸或其鹽的濃度保持在O.3-0.5M，更佳地為0.4M。在另一優(yōu)選例中，在反應(yīng)中補(bǔ)加1-4次丙酮酸或其鹽。在另一優(yōu)選例中，需補(bǔ)加2次丙酮酸或其鹽。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)的反應(yīng)體系中pH為7-9，溫度為22-32°C。在另一優(yōu)選例中，所述的反應(yīng)體系中pH為7.5，溫度為28t:。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種由上述的方法得到的N-乙酰神經(jīng)氨酸。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的使用N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶在同一反應(yīng)器中共轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸而生成N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，所述方法不僅轉(zhuǎn)化率高，同時(shí)N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶可以重復(fù)使用，而且所用的反應(yīng)時(shí)間短。圖1顯示了本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)例的轉(zhuǎn)化率。圖2顯示了本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)例中制得的N-乙酰神經(jīng)氨酸的HPLC圖譜。圖3顯示了本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)例中制得的N-乙酰神經(jīng)氨酸的全波長(zhǎng)掃描圖譜。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)將固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶按一定的酶量和配比在同一反應(yīng)器中共轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸，可以具有較高的轉(zhuǎn)化率，而且使反應(yīng)時(shí)間大大縮短。此外，通過(guò)在反應(yīng)平臺(tái)期添加丙酮酸或其鹽，使其維持在一定濃度，從而獲得較高的轉(zhuǎn)化率和較快的反應(yīng)速度。N-乙截葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)籌和N-乙酰神經(jīng)貧酸醛縮酶本發(fā)明可使用本領(lǐng)域常用的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶，包括分離的天然的酶或重組的酶。可用于本發(fā)明的酶包括不含額外序列的酶以及含有額外序列(如帶有標(biāo)簽序列)的融合蛋白，例如N末端有6個(gè)組氨酸殘基的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶。一種優(yōu)選的酶是編號(hào)為E.C.5.1.3.8的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶。本發(fā)明所用的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶可用本領(lǐng)域熟知的方法獲得，一種優(yōu)選的方法是將來(lái)自(但不限于)豬腎、鼠腎、人腎細(xì)胞的基因或使用集胞藍(lán)藻(Synechocystissp)基因?qū)胨拗骷?xì)胞獲得具有N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶活力的轉(zhuǎn)化微生物。本發(fā)明可使用本領(lǐng)域常用的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，包括分離的天然的酶或重組的酶。可用于本發(fā)明的酶包括不含額外序列的酶以及含有額外序列(如帶有標(biāo)簽序列)的融合蛋白，例如N末端有6個(gè)組氨酸殘基的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。一種優(yōu)選的酶是編號(hào)為E.C.4.1.3.3的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。本發(fā)明所用的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，包括但不限于來(lái)源于^sc力en'c力is,等細(xì)菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。此外，還可將N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞，從而獲得具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活力的轉(zhuǎn)化微生物。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門(mén)氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。外源基因載體導(dǎo)入目標(biāo)菌株后可以通過(guò)兩種方式存在..一是重組遺傳載體以質(zhì)粒形式存在于宿主染色體外。另一種使重組遺傳載體以整合形式整合于宿主染色體上。本發(fā)明優(yōu)選重組載體以質(zhì)粒形式存在于宿主染色體外。適用于本發(fā)明的外源重組載體必須首先具有復(fù)制起始點(diǎn)，其次表達(dá)蛋白必須具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子，這樣就可以使所要表達(dá)的目標(biāo)蛋白專(zhuān)一大量的富集在宿主細(xì)胞內(nèi)。另外載體還需具有在宿主菌中進(jìn)行篩選的遺傳標(biāo)記以及具有若干限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)等。本發(fā)明中優(yōu)選表達(dá)載體PET28(b)。獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。一種優(yōu)選的方法是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能產(chǎn)生N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的重組微生物，在培養(yǎng)物中生成并蓄積N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，從該培養(yǎng)物中收集該酶，經(jīng)壓榨破細(xì)菌細(xì)胞壁后，通過(guò)重組菌產(chǎn)生的帶6個(gè)組氨酸標(biāo)記的酶進(jìn)行親和純化，獲得純酶(N-乙酰葡萄糖胺_2-差向異構(gòu)酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶)。固定化雜本發(fā)明將獲得的純酶(N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶)固定化于載體上得到固定化酶。可以用本領(lǐng)域熟知的方法得到固定化酶，一種優(yōu)選的方法是將純酶N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶)與載體按1:l-5(重量比)混合，加入緩沖液使pH7.2-9.5，在10-25"C結(jié)合12-48小時(shí)。所述的載體是本領(lǐng)域熟知或市售的，包括(但不限于)可購(gòu)自RohmandHaasCompany的Amberzyme0xirane，AmberliteIRC50，AmberliteFPA58，AmberliteXAD7HP，AmberliteXAD761，DuoliteA7，其中優(yōu)選Amberzyme0xirane。本發(fā)明的固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的酶活為10-20U/g。本發(fā)明的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶的酶活為70-100U/g。雙酶圃定化制備N(xiāo)-乙雕神經(jīng)氣酸本發(fā)明將固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶混合后在同一反應(yīng)器中催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其鹽鈉生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。在固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶的存在下，在反應(yīng)器中催化N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)化為N-乙酰甘露糖胺。同一反應(yīng)器中，在固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的存在下，催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸或其鹽生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。優(yōu)選兩步反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。在本發(fā)明的固定化雙酶反應(yīng)體系中，將0.6-10U/ml的固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和1.2-10U/ml的固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶混合，進(jìn)行雙酶共轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺及丙酮酸或其鹽生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的配比為o.1-10:i。反應(yīng)進(jìn)行中可以補(bǔ)加丙酮酸或其鹽，優(yōu)選在反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)補(bǔ)加丙酮酸或其鹽，使其濃度維持在0.2—0.6M，更優(yōu)選在O.3—0.5M。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供的制備方法可以達(dá)到相對(duì)于N-乙酰葡萄糖胺77y。的轉(zhuǎn)化率并能在20小時(shí)完成轉(zhuǎn)化反應(yīng)，顯著少于報(bào)道的使用游離酶轉(zhuǎn)化所需的240小時(shí)。而且所使用的酶源可以反復(fù)使用多次(連續(xù)反應(yīng)5批催化效率未見(jiàn)降低)，在工業(yè)生產(chǎn)上的意義較大。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(NewYork:ColdSpringHarbourLabotatoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分比和份數(shù)按重除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。酶活力測(cè)定方法N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮籌菌液酶活的測(cè)定方法(1)取0.5ral菌液4000rpm離心10分鐘，生理鹽水洗l一2次。(2)菌體經(jīng)一2(TC過(guò)夜處理后，加入0.5ml50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，懸浮后取0.25ml，預(yù)熱10分鐘，加入0.25ml預(yù)熱的Neu5Ac溶液37。C反應(yīng)10分鐘。(3)用10%三氯乙酸0.3ml終止反應(yīng)，加入0.2ml水，加入0.2。/。2,4—二硝基苯肼0.4ml，搖勻，靜置10分鐘。(4)加入3N的氫氧化鈉1.5ml，搖勻，靜置15分鐘，12000rpm離心5分鐘取上清液在550nm比色測(cè)定光吸收值。酶活力(U)=kX0.D.550X稀釋倍數(shù)(倍)/(tXD)k:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率t:反應(yīng)時(shí)間10minD:反應(yīng)加入的酶液體積0.25mlNeu5Ac溶液40mMN-乙酰神經(jīng)氨酸溶液溶于50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中，6NNaOH調(diào)pH至7.5(0—5i:保存，一周內(nèi)使用)酶活力的定義lu酶活定義為每分鐘產(chǎn)生lixmol丙酮酸鈉所需酶量。N-乙酰神經(jīng)氨酸醛綰籌固定化,活性的測(cè)定方法(1)取20mg固定化酶，加入0,23ml50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，37°C預(yù)熱10分鐘，加入0.25ml預(yù)熱的Neu5Ac溶液37'C反應(yīng)10分鐘。(2)用10%三氯乙酸0.3ml終止反應(yīng)，加入O.2ml水。用水稀釋io倍，取lml，加入O.2。/。的2,4—二硝基苯肼0.4ml，搖勻，靜置10分鐘，(3)加入3N的氫氧化鈉1.5ml，搖勻，靜置15分鐘，12000rpm離心5分鐘，取上清液在550nra比色測(cè)定光吸收值。酶活力(U)=kX0.D.55。X稀釋倍數(shù)(倍)/(tXD)k:標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率t:反應(yīng)時(shí)間10minD:反應(yīng)加入的酶液體積0.25mlNeu5Ac溶液40mMN-乙酰神經(jīng)氨酸溶液溶于50mM磷酸鈉緩沖液(PH7.5)中，用6NNaOH調(diào)pH至7.5(0—5。C保存，一周內(nèi)使用)酶活力的定義在上述條件下，lu酶活定義為每分鐘產(chǎn)生lymol丙酮酸鈉所需酶量。N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶酶活測(cè)定N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶可以將N-乙酰葡萄糖胺的2位差向異構(gòu)化從而產(chǎn)生N-乙酰甘露糖胺，該酶活力只能通過(guò)HPLC來(lái)檢測(cè)。酶反應(yīng)系統(tǒng)200raM的N-乙酰葡萄糖胺，20mM的MgCl2,10mM的ATP溶于pH7.50.1M的Tris—HC1緩沖液中，以6N的NaOH調(diào)pH至7.5。發(fā)酵菌液酶活測(cè)定方法(1)將發(fā)酵液取出0.5ml，10000rpm離心5分鐘，棄去上清，于一20。C凍存3小時(shí)以上。(2)取出凍存的發(fā)酵菌體，加入O.5mlpH7.5，0.1M的Tris—HCl緩沖液重懸菌體。(3)取250ul懸浮的菌體，在37'C水浴10分鐘，同時(shí)將底物緩沖液置于37t:水浴搖床上IO分鐘。(4)在250ul懸浮的菌體中加入250ul底物緩沖液，振蕩均勻，于37°C水浴精確反應(yīng)15分鐘。(5)反應(yīng)結(jié)束后，迅速用300ul10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，再補(bǔ)加200ul蒸餾水混勻，于10000rpm離心5分鐘。(6)取300ul用HPLC測(cè)定。固定化瞎活力測(cè)定方法(1)、稱(chēng)取10毫克固定化酶，加入990ulpH7,5，0.1M的Tris—HCl緩沖液，在37'C水浴10分鐘，同時(shí)將底物緩沖液置于37t:水浴搖床上預(yù)熱10分鐘。(2)在上述反應(yīng)體系中加入lml底物緩沖液，振蕩均勻，于37。C水浴精確反應(yīng)15分鐘。(3)反應(yīng)結(jié)束后，取500ul反應(yīng)液，迅速用300ul10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，再補(bǔ)加200ul蒸餾水混勻，于10000rpra離心5分鐘。(4)取300ul用HPLC測(cè)定。單位酶活的定義為上述條件下，每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生luraolN-乙酰甘露糖胺所需的酶量實(shí)施例l來(lái)源于豬腎的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶(E.C.5.1.3.8)生成基因的獲得及重組質(zhì)粒pRY印i的構(gòu)建以下列引物1:5'catatggagaaggagcgcgaa3'(Seq.ID.No.1)2:5'gaattctaggcgaggcggctcagca3'(Seq.ID,No.2)為引物，以豬腎總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)束后參照分子克隆進(jìn)行0.9%的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，利用膠回收試劑盒進(jìn)行1.2Kb大小片段的回收。將獲得的DNA片斷經(jīng)過(guò)亞克隆至pKS載體后，經(jīng)過(guò)NdeI和EcoRI雙酶切，凝膠電泳后膠回收，載體pET28(b)經(jīng)過(guò)同樣處理與前者通過(guò)T4連接酶16。C連接過(guò)夜。將連接過(guò)夜的DNA轉(zhuǎn)化Aco"DH5a感受態(tài)細(xì)胞。在含有卡那霉素的LB平板上選出重組子。重組子DNA經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與豬腎N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶基因吻合。重組質(zhì)粒命名為pRY印i。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入常規(guī)的￡co7./BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到表達(dá)型工程菌BL21(DE3)/pRY印i。實(shí)施例2來(lái)源于Ecoh'TGl總DM的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(E.C.4.1.3.3)生成基因的獲得及重組質(zhì)粒pNAl的構(gòu)建以下列引物1:5'gacgctaccatggcaacgaatttacgt3'(Seq.ID.No,3)2:5'gatccagtcgactcgcccgcgctcttg3'(Seq.ID.No.4)為引物，以EcoJiTGl總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)束之后將回收的0.9kb的片斷經(jīng)NcoI和HindIII雙酶切，克隆進(jìn)pUC118質(zhì)粒，命名為pNA，轉(zhuǎn)化進(jìn)EcoWDH5a感受態(tài)細(xì)胞。之后，以下列引物1:5'ggaattccatatggcaacgaatttacgtggcg3'(Seq.ID-No.5)2:5'cgggatcctcacccgcgctcttgcatc3'(Seq.ID.No.6)為引物，以質(zhì)粒pNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)束之后將回收的O.9kb的片斷經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切，克隆進(jìn)pET28b載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化￡DH5a感受態(tài)細(xì)胞。在含有卡那霉素的LB平板上選出重組子。重組子DNA經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證與豬腎N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因吻合。重組質(zhì)粒命名為pNAl。提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)常規(guī)的￡co"BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到表達(dá)型工程菌BL21(DE3)/pNAl。實(shí)施例3工程苗BL21(DE3)/pRY印i的發(fā)酵及固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)的制備使用3LTB培養(yǎng)基(配制每升高濃度肉湯，在900ml去離子水中加入細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨12g;細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物24g;甘油4ml。高壓滅菌20分鐘，然后使該溶液降溫至6(TC或6(TC以下，再加入100ml經(jīng)滅菌得0.17mol/LKH具、0.72mol/LK2HP04溶液)在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵工程菌BL21(DE3)/pRY印i，37'C培養(yǎng)約lh后，加入終濃度為1%的乳糖誘導(dǎo)，同時(shí)降溫至22"C，誘導(dǎo)后2h再補(bǔ)加終濃度為0.5%的乳糖誘導(dǎo)，發(fā)酵約26小時(shí)左右收罐，8000rpm離心10分鐘收集菌體。將BL21(DE3)/pRY印i發(fā)酵26h收得的菌體稱(chēng)取30g，加入45ml0.5MpH7.5的磷酸鈉緩沖液，重懸后壓榨，壓力為1500psi，共壓榨兩次，壓榨后12000rpm離心40rain，得到60mlN-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶粗酶液。粗酶液經(jīng)親和載體FP-IDA純化，獲得純化的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶。純酶經(jīng)測(cè)定蛋白含量后，以300rag蛋白加入lg干載體的比例投入Amberzyuieoxirane載體，并加入相對(duì)于純酶液兩倍體積的1MpH8.0的磷酸鉀緩沖液，于18r結(jié)合24小時(shí)。結(jié)合完畢后，取出固定化酶，使用0.5MpH7.5的磷酸鉀緩沖液緩沖液沖洗，抽干，得到固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶顆粒。測(cè)定得酶活力為78.18U/g。實(shí)施例4工程菌BL21(DE3)/pNAl的發(fā)酵及固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的制備使用3LTB培養(yǎng)基(配制每升高濃度肉湯，在900ral去離子水中加入細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨12g;細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物24g;甘油4ml。高壓滅菌20分鐘，然后使該溶液降溫至6(TC或6(rC以下，再加入lOOral經(jīng)滅菌得O.17mol/LKH2P04、0.72mol/LK2HP04溶液)在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵工程菌BL21(DE3)/pNAl，37"培養(yǎng)約lh后，加入終濃度為1%的乳糖誘導(dǎo)，同時(shí)降溫至22°C，誘導(dǎo)后2h再補(bǔ)加終濃度為0.5%的乳糖誘導(dǎo)，發(fā)酵約20小時(shí)左右收罐，8000rpm離心10分鐘收集菌體。將BL21(DE3)/pNAl發(fā)酵20h收得的菌體稱(chēng)取15g，加入20ml0.5MpH7.5的磷酸鈉緩沖液，重懸后壓榨，壓力為1500psi，共壓榨兩次，壓榨后12000rpm離心40min，得到33mlN-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶粗酶液。粗酶液經(jīng)親和載體FP-IDA純化，獲得純化的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。純酶經(jīng)測(cè)定蛋白含量后，以300mg蛋白加入lg干載體的比例投入Amberzymeoxirane載體，并加入相7寸于純酶液兩倍體積的1MpH8.0的磷酸鉀緩沖液，于18"C結(jié)合24小時(shí)。結(jié)合完畢后，取出固定化酶，使用0.5MpH7.5的磷酸鉀緩沖液緩沖液沖洗，抽干，得到固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶顆粒。測(cè)定得酶活力為15.12U/g。實(shí)施例5-12兩種固定化酶共轉(zhuǎn)化實(shí)施例5實(shí)施例6實(shí)施例7實(shí)施例8實(shí)施例9實(shí)施例10實(shí)施例11實(shí)施例12醛縮酶(U/ml)55552.552.51.2差向異構(gòu)酶(U/ml)1052.51.21.20.60.610按上表稱(chēng)取一定量的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶固定化酶和一定量的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶固定化酶，將兩者混合，加入到3ml反應(yīng)液中(N-乙酰-D-葡萄糖胺0.6M;丙酮酸鈉0.4M;ATP7.5mM;MgCl27.5mM;pH7.5)，混勻后28。C、150rpm反應(yīng)，每隔lh取樣一次。每次取樣取20ul，加20ul10%的乙酸終止，再加入960ul蒸餾水，混勻后12000rpm離心5分鐘，取出300ulHPLC測(cè)定。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)入第一平臺(tái)期時(shí)，產(chǎn)物增速緩慢，所以補(bǔ)加0.132g丙酮酸鈉，使體系中的丙酮酸鈉達(dá)到O.4M。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)入第二平臺(tái)期時(shí)，補(bǔ)加0.132g丙酮酸鈉，使體系中的丙酮酸鈉達(dá)到0.4M。結(jié)果見(jiàn)表l表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果表明，當(dāng)N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶減少到1.2U/ml以下時(shí)，共轉(zhuǎn)化的效率才開(kāi)始有顯著的降低。而N-乙酰-D-神經(jīng)氨酸醛縮酶在酶量小于2.5U/ml時(shí)，共轉(zhuǎn)化效率就開(kāi)始有顯著的降低。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)，得到較為合適的兩酶之間的配比N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶0.6-5U/ml、N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶1.2-5U/ml之間。此時(shí)轉(zhuǎn)化效率較高，反應(yīng)時(shí)間短(比游離酶約縮短時(shí)間90%以上)，且固定化酶得到充分的利用。實(shí)施例13按以上條件將實(shí)施例5各連續(xù)進(jìn)行3批雙酶共轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化效率未見(jiàn)明顯下降。見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，該方法在應(yīng)用上具有較大的潛力。實(shí)施例14-17按實(shí)施例13的方式將實(shí)施例6-9各連續(xù)進(jìn)行3批雙酶共轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化效率未見(jiàn)明顯下降，與實(shí)施例13的結(jié)果類(lèi)似。實(shí)施例18-22結(jié)晶在上述固定化酶反應(yīng)(實(shí)施例5-9)終止后，抽濾反應(yīng)液，濾液12000rpm離心5min，去除顆粒雜質(zhì)，加入7倍體積冰醋酸，加入稍許晶種，4。C放置4天。過(guò)濾收集結(jié)晶，丙酮淋洗，4CTC干燥恒重得到N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)晶體。實(shí)施例23酶法合成Neu5Ac的HPLC分析將實(shí)施例18得到的Neu5Ac晶體恒重后，與Sigma公司的同類(lèi)商品(純度95%)，作HPLC圖譜比較，結(jié)果表明兩者的出峰時(shí)間一致(7.77分)。但在實(shí)施例18制得的Neu5Ac結(jié)晶圖譜中，除了Neu5Ac吸收峰外，7.24分處未發(fā)現(xiàn)存在有Sigma產(chǎn)品的雜質(zhì)小峰(圖2)。通過(guò)全波長(zhǎng)掃描分析，表明Sigma產(chǎn)品和實(shí)驗(yàn)室結(jié)晶品的全波長(zhǎng)掃描圖譜有相同的特征(圖3)。實(shí)施例24-27用實(shí)施例23的方法對(duì)實(shí)施例19-22制得的Neu5Ac晶體進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果與實(shí)施例23的類(lèi)似。本發(fā)明所涉及的多個(gè)方面已經(jīng)作如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明之精神與范圍的前提下，對(duì)上述描述的任何修飾都是允許的。同樣，類(lèi)似的情況也包括在權(quán)利要求中。序列表<110〉中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>固定化雙酶法制備N(xiāo)-乙酰神經(jīng)氨酸<130〉064450<160〉6〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉1catatggagaaggagcgcgaa21<210〉2<211〉25〈212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature〈223>引物<400>2gaattctaggcgaggcggctcagca25<210>3<211>27<212〉DNA<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400〉3gacgctaccatggcaacgaatttacgt27<210>4<211>27<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>4gatccagtcgactcgcccgcgctcttg27<210〉5<211〉32<212>腿<213>人工序列<220><221〉misc一feature<223>引物<400>5ggaattccatatggcaacgaatttacgtggcg32<210>6〈211〉27〈212〉腿<213〉人工序列<220><221〉tnisc一feature<223〉引物<400>6cgggatcctcacccgcgctcttgcatc2權(quán)利要求1.一種制備N(xiāo)-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，其特征在于，它包括步驟(a)將N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸或其鹽與0.6-10U/ml固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和1.2-10U/ml固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶混合得到反應(yīng)混合物；(b)從反應(yīng)混合物中分離得到N-乙酰神經(jīng)氨酸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶是重組的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶N末端都有6個(gè)組氨酸殘基。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的固定化酶所用載體為陶瓷、玻璃、高分子合成材料、木炭、或纖維素。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶的用量為1.2-2.5U/ml。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶用量為2.5-5U/ml。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶和固定化N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的用量配比為0.1-10:1。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中還包括添加丙酮酸或其鹽，從而維持反應(yīng)體系中丙酮酸或其鹽的濃度為0.2-0.6M。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在反應(yīng)中補(bǔ)加1-4次丙酮酸或鹽°10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)的反應(yīng)體系中pH為7-9，溫度為22-32°C。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種利用兩種固定化酶混合來(lái)生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的工藝。該工藝使用固定化的0.6-10U/mlN-乙酰葡萄糖胺-2-差向異構(gòu)酶(E.C.5.1.3.8)和1.2-10U/mlN-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(E.C.4.1.3.3)在同一反應(yīng)器中轉(zhuǎn)化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸或其鹽獲得N-乙酰神經(jīng)氨酸。本發(fā)明方法可以達(dá)到相對(duì)于N-乙酰葡萄糖胺77％的轉(zhuǎn)化率并能在20小時(shí)完成轉(zhuǎn)化反應(yīng)，所使用的酶源可以反復(fù)使用多次，在工業(yè)生產(chǎn)上意義較大。文檔編號(hào)C12P19/00GK101165190SQ20061011719公開(kāi)日2008年4月23日申請(qǐng)日期2006年10月17日優(yōu)先權(quán)日2006年10月17日發(fā)明者姜衛(wèi)紅,晟楊,楊仲毅,楊蘊(yùn)劉,驊白,羅家立,胡世元,邵麗君,軍陳,嬈饒申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;浙江海正藥業(yè)股份有限公司