專利名稱：豬表皮生長因子基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體涉及一種豬表皮生長因子基因，本發(fā)明還涉及由該基因構(gòu)建的表達載體及其轉(zhuǎn)化子。
背景技術：
表皮生長因子是在60年代Cohen(1962)就從雄性小鼠的頜下腺中分離提取出一種可以使新生鼠眼瞼早開、牙齒早萌的蛋白質(zhì)。后來在1975年從人尿中分離到人表皮生長因子。人及小鼠的表皮生長因子可刺激表皮和內(nèi)皮細胞的增殖，可用于治療燒傷、角膜創(chuàng)傷、胃腸潰瘍等。1991年豬表皮生長因子基因被克隆，并在酵母中表達，發(fā)現(xiàn)表達的豬表皮生長因子能促進昆明小鼠3T3細胞的DNA合成(Pascall JC，Jones DS，Doel SM，Clements JM，Hunter M，F(xiàn)allon T，Edwards M，andBrown KD.Cloning and characterization of a gene encoding pigepidermal growth factor.J Mol Endocrinol，1991，663-70)。然后在豬腎及子宮內(nèi)膜都檢測到了豬表皮生長因子的mRNA(Kim J G，Vallet JL，Christenson R K.2001.Characterization of uterine epidermal growthfactor during early pregnancy in pigs.Domest Anim Endocrinol，20(4)253-265)。與人表皮生長因子(hEGF)和小鼠表皮生長因子(mEGF)一樣，豬表皮生長因子也是一個不帶糖基、含有53個氨基酸的單鏈多肽，分子內(nèi)含有三對二硫鍵，維持其生物活性。分子量約6147.9道爾頓，等電點為5.46。pEGF與和人表皮生長因子、鼠表皮生長因子的氨基酸序列同源性分別為85％及75.5％，在Gly18、Tyr37、Gly39、Arg41、Leu47以及六個半胱氨酸殘基為保守區(qū)域(Pascall et al.，J MolEndocrinol，1991，663-70)。豬表皮生長因子主要存在于豬的各種組織(腎臟、胰腺、子宮內(nèi)膜)以及豬乳中。
2001年美國專利6300311B1表明，pEGF具有促進靜止期的初級母卵泡變成活化卵泡，從而加速卵子的排出，因此具有提高哺乳動物的窩產(chǎn)仔數(shù)的功能。McGlone等(2003)的研究表明大腸桿菌表達的重組pEGF可提高窩產(chǎn)仔數(shù)20.79％(McGlone J J，Anderson DL，Vaughan H L.2003.Prepubertal administration of porcine EpidermalGrowth Factor increases litter size.The Annual meeting of the SouthernSection，American Society of Animal Science)。在胃腸道，表皮生長因子可刺激胃腸道的生長以及誘導小腸消化酶的表達(Jaeger L A，et al.Effect of orally administered epidermal growth factor on the jejunalmucosa of weaned pigs.American Journal of Veterinary Research，1990，51471-474；Black D D，Ellinas H.Apolipoprotein synthesis in ofdiarrhoea in newborn piglet intestinal explants.Pediatr.Res.1992，32553-558；James P S，el al.Epidermal growth factor selectively increasesmaltase and sucrase activities in neonatal piglet intestine.Journal ofPhysiology，1987，393583-594；Xua R J，Wang F，Zhang S H.Postnatal adaptation of the gastrointestinal tract in neonatal pigsapossible role of milk-borne growth factors.Livestock ProductionScience，2000，6695-107)。此外，在早期斷奶仔豬的飼料中添加畢赤酵母表達的重組豬表皮生長因子(1.5ppm)，飼喂7天時能使早期斷奶仔豬的平均日增重從對照組的24.39g/d提升到70.35g/d，并具有統(tǒng)計學的顯著性差異(Lee D N，Kuo T Y，Chen M C，et al.Expression of porcine epidermal growth factor in Pichia pastoris and itsbiology activity in early-weaned piglets.Life Sci，2006，78649-654)。
由于豬表皮生長因子具有多種生物學活性以及在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應用價值和應用前景，因此有必要開發(fā)能高效表達重組pEGF的工程菌和規(guī)模生產(chǎn)重組pEGF的方法。
對于豬表皮生長因子在體外的表達研究，Lee等(2006)用豬表皮生長因子的原始基因在畢赤酵母系統(tǒng)表達，表達量870mg/L(Lee DN，Kuo T Y，Chen M C，et al.Expression of porcine epidermal growthfactor in Pichia pastoris and its biology activity in early-weaned piglets.Life Sci，2006，78649-654)，但是沒有建立純化表達產(chǎn)物的方法，也沒有對表達產(chǎn)物進行純化。2001年美國專利6300311B1報道了用大腸桿菌表達在C端含有6個組氨酸的融合蛋白6His-pEGF，并用Ni-凝膠柱從細菌中純化表達產(chǎn)物，但是表達產(chǎn)物在C-端含有19個來源于表達載體的氨基酸。Pascall等(1991)S.cerevisiae表達了小量pEGF的融合蛋白。目前國際上只有澳大利亞的Gropep公司有商品化的產(chǎn)品(大腸桿菌表達產(chǎn)物)，但是價格昂貴(325美金/1mg)，難以滿足生產(chǎn)需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種豬表皮生長因子pEGF基因；本發(fā)明的第二個目的在于提供一種含有pEGF基因的重組載體；本發(fā)明的第三個目的在于提供含有所述載體的基因工程菌；本發(fā)明的再一個目的在于提供構(gòu)建上述基因工程菌的方法。
本發(fā)明的技術方案是根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性，設計合成pEGF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在pEGF基因的上游引入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-factor信號肽編碼序列，使pEGF能在畢赤酵母中分泌表達；下游引入6個組氨酸(his)編碼序列(使表達產(chǎn)物易于純化)以及一個終止密碼TGA，并與pPIC9載體重組，獲得pPIC9-pEGF表達載體，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pPIC9-pEGF用BglII單酶切線性化后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過MD、MM培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，并進一步篩選高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。
篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子的方法是，根據(jù)pEGF基因設計探針并作標記，通過斑點雜交選擇雜交信號強的轉(zhuǎn)化子。本發(fā)明篩選出了含有14個pEGF基因拷貝的轉(zhuǎn)化菌株，并將其命名為C32(Pichia pastoris/pPIC9-pEGF)(已于2006年9月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心，地址北京市海淀區(qū)中關村北一條13號中國微生物研究所，分類命名巴氏畢赤酵母(pichia pastoris)，保藏號CGMCC No.1826)。
本發(fā)明還提供了C32發(fā)酵培養(yǎng)的方法，首先將C32基因工程菌接種BMGY培養(yǎng)基上，進行擴大培養(yǎng)(30℃培養(yǎng)18h)，然后接種到生長培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，持續(xù)滴加氨水維持pH5.4，溶氧20％，20h后流加甘油至細胞濕重達300mg/ml，然后流加甲醇進行pEGF的誘導表達。將產(chǎn)物在8000-10000×g下離心，收集上清，1kD截流下超濾，然后用Ni-NTA親和層析純化方法純化。收集Ni-NTA親和層析柱的流脫液進行透析即可。
本發(fā)明的pEGF基因，是根據(jù)畢赤酵母對密碼子使用的偏好性而合成的基因，因此用它構(gòu)建的畢赤酵母工程菌能得到高效的表達；構(gòu)建重組表達載體，首先采用分泌性表達載體，其次是在pEGF的下游，引入6個組氨酸，這樣有利于表達產(chǎn)物的純化；轉(zhuǎn)化篩選得到的C32基因工程菌，其染色體中含有14個拷貝數(shù)的pEGF基因，該基因工程菌的pEGF表達量高達2g/L，并且純化簡單，生產(chǎn)成本低，為工業(yè)化生產(chǎn)豬表皮生長因子提供了可能。


圖1是表達載體pPIC9-pEGF；圖2是pPIC9-pEGF的序列結(jié)構(gòu)圖；圖3是pPIC9-pEGF的Xho I和EcoR I的雙酶切圖譜，其中M表示分子量標準；圖4是斑點雜交的掃描結(jié)果；圖5是多拷貝整合轉(zhuǎn)化子搖瓶誘導培養(yǎng)上清的SDS-PAGE分析，其中，M表示蛋白質(zhì)分子量標準，1～5是含有pEGF不同拷貝數(shù)菌株，6是C32，7是GS115/His+MutSalbumin菌株，9是pPIC9載體轉(zhuǎn)化子；
圖6是工程菌C32搖瓶誘導培養(yǎng)上清經(jīng)Ni-NTA純化后SDS-PAGE分析，其中1～8是濃度梯度下的流出液。
圖7是工程菌C32高密度發(fā)酵上清的SDS-PAGE分析，其中M表示蛋白質(zhì)分子量標準，1～8是不同誘導時間下的產(chǎn)物。
圖8是C32表達產(chǎn)物的Western blotting分析，其中M表示預染蛋白質(zhì)分子量標準，1、2泳道為純化的表達產(chǎn)物；圖9是用CCK-8測定的純化表達產(chǎn)物pEGF-6His對BALB/c 3T3的生物活性。
具體實施例方式
下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 表達載體的構(gòu)建根據(jù)pEGF的氨基酸序列以及畢赤酵母對密碼子的偏好性，人工合成pEGF基因。其核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列分別如序列表SEQ ID NO.1和2所示。以上序列由上海英駿公司合成。以合成的pEGF基因為模板，設計一對引物，使上游引物的5’端含有pPIC9載體上Xho I至SnaB I之間的序列，下游引物的5’端含有編碼6個組氨酸、一個TGA終止密碼以及EcoR I位點，本實施例中采用的上游引物是5’GCGCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAATTCTTACTCTGAATGTCCAC，下游引物5’GGGCCGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGTCTCAACTCCCACCATTTCAAG。用這一對引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物和pPIC9載體分別用Xho I和EcoR I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后用Qiaquick Gel Extraction試劑盒回收210bp的pEGF片段和8000bp的載體條帶，然后進行連接反應。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞。用Qiaprep Spinminiprep試劑盒提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，進行酶切鑒定以及測序鑒定。
圖1為由pPIC9和pPEGF構(gòu)建的重組表達載體為pPIC9-pEGF。pPIC9-pEGF的序列如SEQ ID NO.1所示。插入的PCR產(chǎn)物(pEGF)的上游含有5’AOX1啟動子以及內(nèi)含釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)α-factor信號肽編碼序列。
如圖2所示，圖中Xho I上游及EcoR I下游的堿基均為pPIC9載體上的堿基序列。Xho I至EcoR I之間的210堿基中含有合成的pEGF序列(159bp)，在pEGF基因上游含有24個堿基(CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT，編碼信號肽中的Leu Glu Lys-Arg*Glu Ala GluAla)，畢赤酵母中的KEX2信號肽切除酶可以在*位置切除信號肽，靶蛋白上的Glu Ala Glu Ala殘基由畢赤酵母中的STE13信號肽切除酶切除。如果STE13切除效率高，則靶蛋白的N端上不會有Glu Ala Glu Ala殘基；在pEGF基因下游含有編碼6個組氨酸的序列以及一個終止密碼(TGA)和酶切位點EcoR I。
用Xho I和EcoR I酶切pPIC9-pEGF，電泳后可以看到酶切圖譜中具有210bp大小的片斷。參見圖3。
實施例2.感受態(tài)宿主菌的制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子表型的篩選酵母表達體系常用溶液和培養(yǎng)基10×D稱取D-葡萄糖20g，加雙蒸水至100mL，加溫至完全溶解后過濾除菌或高壓滅菌，保存于4℃，保存期為一年。
YPD培養(yǎng)基(Yeast Extract Peotone Dextrose Medium)稱取酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，溶于900mL雙蒸水中，高壓滅菌20min，再加入100mL已滅菌的10×D。
10×YNB(13.4％Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfatewithout Amino Acid)稱取酵母氮堿(YNB)67g，加雙蒸水至500mL，加溫至完全溶解后過濾除菌，保存于4℃，保存期為一年。
500×B(0.02％D-Biotin，D-生物素)稱取D-生物素10mg，加雙蒸水至50mL，加溫至完全溶解后過濾除菌，保存于4℃，保存期為一年。
10×M(10％Methanol，甲醇)取甲醇10mL，加雙蒸水至100mL，過濾除菌，保存于4℃，保存期為兩個月。
10×GY(10％Glycerol，甘油)取甘油10mL，加雙蒸水至100mL，過濾除菌或高壓滅菌，保存于4℃，保存期為一年。
1M磷酸緩沖液pH6.0(1M Potassium Phosphate Buffer)量取33mL的1M K2HPO4和217mL的1M KH2PO4混合后，可用磷酸或KOH調(diào)節(jié)pH6.0，過濾除菌或高壓滅菌，保存于4℃，保存期為一年。
MD平板稱取1.5g瓊脂粉，加雙蒸水80mL溶解，高壓滅菌后冷卻至60℃時，快速加入10mL10×YNB，10mL10×D以及200μL500×B后，快速倒板，冷卻后4℃保存。
MM平板稱取1.5g瓊脂粉，加雙蒸水80mL溶解，高壓滅菌后冷卻至60℃時，快速加入10mL10×YNB，10mL10×M，200μL500×B后，快速倒板，冷卻后4℃保存。
BMGY培養(yǎng)基(Buffered Glycerol-complex Medium)稱取酵母提取物10g，蛋白胨20g，溶于700mL雙蒸水中，高壓滅菌20min后，冷卻至室溫，分別加入100mL已除菌的1M磷酸緩沖液(pH6.0)、10×YNB、10×GY及2mL500×B。放置4℃保存，保存期為兩個月。
BMMY培養(yǎng)基(Buffered Methanol-complex Medium)稱取酵母提取物10g，蛋白胨20g，溶于700mL雙蒸水中，高壓滅菌20min后，冷卻至室溫，分別加入100mL已除菌的1M磷酸緩沖液(pH6.0)、10×YNB、10×M及2mL 500×B。放置4℃保存，保存期為兩個月。
BMM培養(yǎng)基(Buffered Minimal Methanol)將700mL雙蒸水高壓滅菌20min后，冷卻至室溫，分別加入100mL已除菌的1M磷酸緩沖液(pH6.0)、10×YNB、10×M及2mL500×B。放置4℃保存，保存期為兩個月。
酵母裂解緩沖液0.01M Tris-Cl(pH7.6)，0.5M EDTA(pH8.0)，β-巰基乙醇(1％V/V)。
畢赤酵母GS115感受態(tài)宿主菌的制備畢赤酵母GS115(Invitrogen公司)，接種YPD板，30℃培養(yǎng)2d，挑取單菌落至3mL YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，300rpm培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)移500μL過夜的培養(yǎng)液至200mL的新鮮YPD液體培養(yǎng)基中，并于1L的培養(yǎng)瓶中搖菌至OD600為1.2-1.3，4℃，1500×g離心5分鐘，收集細胞沉淀，用200mL冰凍的無菌去離子水重懸，離心同上，去上清。用100mL冰凍的無菌去離子水重懸，離心同上，去上清。用20mL冰凍的1mol/L山梨醇溶液重懸細胞沉淀，離心同上，去上清。加入約1mL冰凍的1mol/L山梨醇，使終體積為1.5mL左右，細胞密度在1×1010左右。
重組質(zhì)粒pPIC9-pEGF線性化10.0μg重組質(zhì)粒pPIC9-pEGF用BglII單酶切線性化。將線性化完全的酶切產(chǎn)物用酚/氯仿抽提一次，用1/10體積3mol/L乙酸鈉和2.5倍體積無水乙醇-20℃沉淀20min，12000r/min離心，用70％的乙醇洗滌后晾干，加入20μL雙蒸水溶解線性化產(chǎn)物。-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 線性化pPIC9-pEGF的電轉(zhuǎn)化取80μL GS115感受態(tài)細胞與10μg線性化的重組質(zhì)粒DNA混勻后，將其轉(zhuǎn)入預冷的電轉(zhuǎn)移杯中，冰浴5min。將電轉(zhuǎn)移杯放入電轉(zhuǎn)移槽中，1500V電擊轉(zhuǎn)化。電擊后，立即加入1mL預冷的山梨醇，輕輕移至無菌的1mL EP管中。取500μL混合液均勻涂布于MD平板中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至3天，直至長出明顯的菌落。
轉(zhuǎn)化子的Mut+和MutS篩選將MD板中長出的單個菌落用牙簽挑出，沾于新的MD板中，并將沾上的菌落做好標記，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至3天。將新的MD板中長出的菌落重新用牙簽挑出，沾于新的MM板中，做好相同的標記，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2至3天后，觀察菌落生長的快慢，確定Mut表型在MD板中，所有的轉(zhuǎn)化子生長情況相似，轉(zhuǎn)化子之間大小沒有明顯的差異，但是在MM板中，Mut+(利用甲醇快)型轉(zhuǎn)化子生長快，克隆大；MutS(利用甲醇慢)型轉(zhuǎn)化子生長較慢，克隆較小。在鑒定的200個轉(zhuǎn)化子中，有一半是Mut+(利用甲醇快)型轉(zhuǎn)化子。
實施例3 斑點雜交篩選多拷貝整合轉(zhuǎn)化子酵母裂解緩沖液0.01M Tris-Cl(pH7.6)，0.5M EDTA(pH8.0)，β-巰基乙醇(1％V/V)。
斑點雜交液(1×)20×SSC 250mL，5％SDS 5mL，10％Sarkosyl10mL，ddH2O 735mL，Blocking Reagent 5g。
將已經(jīng)確定表型的轉(zhuǎn)化子置于每孔含100μl YPD培養(yǎng)基的96孔板中，30℃培養(yǎng)48h，取10μl接種每孔含100μl新鮮YPD培養(yǎng)基的96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48h。然后每孔取50μl培養(yǎng)的菌液于2ml離心管中，離心去上清后，用80μl含有酵母裂解酶(lyticase)的酵母裂解緩沖液重懸細胞沉淀，37℃裂解4h，100℃作用10min后，立即將離心管放入冰中，并加入等體積的20×SSC，得到裂解液。利用斑點雜交加樣器，將制備的裂解液轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，變性后80℃烘烤2h，置入雜交管，加入預雜交液預雜交4h。用引物(上游引物AOX primer5’-GACTGGTTCCAATTGACAAG-3’，下游引物pPSEGF primer5’-CCTAGGGAATTCTC AATGATGA-3’)從pPIC9-pEGF上擴增出長度為535bp含有pEGF基因的片段。用Qiaquick Gel Extraction試劑盒回PCR產(chǎn)物，以之為模板，用Takara Random Primer DNA labeling試劑盒以及[α-32P]dCTP進行同位素探針標記反應。將標記的探針加入預雜交的管中，雜交過夜。洗膜后，取出硝酸纖維素膜壓磷板24h。將該磷板在Bio-Rad FX掃描儀上掃描，篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。
參見圖4，圖中D3、D4為pPIC9轉(zhuǎn)化子；D5、D6為未轉(zhuǎn)化的GS115；D7、D8為pPIC9-pEGF質(zhì)粒；其他為pPIC9-pEGF轉(zhuǎn)化子。多拷貝整合轉(zhuǎn)化子是信號較強的轉(zhuǎn)化子，如A8、B2、B7、B8、C6、C7。其中C6的信號最強，含有14pEGF基因拷貝數(shù)，C6所對應的菌株C32為基因工程菌。
實施例4 工程菌搖瓶培養(yǎng)時pEGF的表達與純化工程菌C32搖瓶誘導工程菌C32菌落接種40mL BMGY中擴大培養(yǎng)16-18h后，于10mL BMMY(含1％Casamino Acid)中誘導表達，分別在0、24、48、72、96、120h收獲100μL上清，-20℃?zhèn)溆?。表達產(chǎn)物進行Tricine-SDS-PAGE分析。
結(jié)果參見附圖5，圖中1-5泳道為拷貝數(shù)不同的5個菌株的誘導72h的表達上清，6泳道為基因工程菌C32的誘導72h表達上清；7為GS115/His+MutSalbumin誘導72h表達上清；M，蛋白質(zhì)分子量標準；9，pPIC9載體轉(zhuǎn)化子的誘導表達上清。從該圖可以看出，工程菌C32的表達很高。
搖瓶表達的蛋白質(zhì)的純化將工程菌接種400ml BMGY培養(yǎng)基，30℃搖瓶培養(yǎng)16-18h，離心，去上清，細胞接種100ml BMMY培養(yǎng)基，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)，用1％甲醇誘導96h；誘導表達的上清用磷酸鉀調(diào)pH值至7.8。離心去細胞及碎片，離心上清用過Ni-NTA親和層析柱純化，用洗脫液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，250mM咪唑，用NaOH調(diào)pH值至8.0)從親和層析柱上洗脫目標產(chǎn)物，流出液按1ml體積分裝到2ml EP管。取各EP管中的流出液少量，進行Tricine-SDS-PAGE分析，將含靶蛋白流出液對1L 10mM的磷酸緩沖液透析24h，然后凍干保存。
結(jié)果參見附圖6。附圖6中1-8泳道為第1-8離心管接收的洗脫液，M為蛋白質(zhì)分子量標準。所以表達上清過Ni-NTA親和柱后，靶蛋白主要集中在第2、3、4管洗脫液中，表達上清過Ni-NTA新和柱后，雜蛋白非常少。
實施例5 工程菌高密度發(fā)酵及產(chǎn)物的純化C32基因工程菌接種2個含有250ml的BMGY培養(yǎng)基的2L三角瓶中，30℃培養(yǎng)18h，然后接種到含有3L生長培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐(上海保興公司)中(高密度發(fā)酵培養(yǎng))，30℃培養(yǎng)，持續(xù)滴加氨水維持pH5.4，溶氧20％，20h后流加甘油至細胞濕重達300mg/ml，然后流加甲醇進行pEGF的誘導表達。高密度發(fā)酵時，在不同誘導時間取表達上清，用15μl表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。
生長培養(yǎng)基H3PO426.7mlCaSO4·2H2O 0.9gK2SO418gMgSO415gKOH4.13g甘油 40gPTM1鹽溶液 4.4ml加水至1L結(jié)果參見圖7。M蛋白質(zhì)分子量標準；1甲醇誘導2h；2甲醇誘導8h；3甲醇誘導14h；4甲醇誘導26h；5甲醇誘導32h；6甲醇誘導38h；7甲醇誘導49h；8甲醇誘導58h。從該圖可以看出，誘導26h，表達上清中表達產(chǎn)物大量增加，以后隨著時間延長，表達產(chǎn)物的含量也增加。最高表達量可達2g/L。
表達蛋白質(zhì)的純化將發(fā)酵液在8000-10000×g下離心，收集上清，磷酸鉀調(diào)pH至7.8。1kD截流下超濾，超濾液直接加入到用緩沖液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑，用NaOH調(diào)pH值至8.0)已經(jīng)平衡的Ni-NTA層析柱，控制流速在0.8-1.2mL/min范圍。待超濾液全部通過層析柱后，用10倍柱體積的wash buffer(300mMNaCl，50mM NaH2PO4，20mM咪唑，用NaOH調(diào)pH值至8.0)清洗柱子。然后用5倍柱體積的Elution buffer(300mM NaCl，50mMNaH2PO4，250mM咪唑，用NaOH調(diào)pH值至8.0)從親和層析柱上洗脫目標產(chǎn)物。表達產(chǎn)物純度達95％以上。
實施例6 表達產(chǎn)物的鑒定western bloting將Ni-NTA親和層析柱純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳，再經(jīng)轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉，然后用小鼠源性的抗His-Tag單克隆抗體(Novagen公司)以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG進行免疫印跡反應。結(jié)果見圖8。在圖8的1、2泳道為純化的表達產(chǎn)物；M預染蛋白質(zhì)分子量標準。
N端氨基酸測序取少量凍干的純化表達產(chǎn)物，用蒸餾水溶解，加β-巰基乙醇(終濃度為5％)，100℃反應10min，使分子中的二硫鍵還原。然后將樣品進行Tricine-SDS-PAGE電泳以及轉(zhuǎn)PVDF膜。將含有目的條帶的PVDF膜送上海基康生物技術有限公司進行N端的氨基酸測序，測定N端15個氨基酸殘基。結(jié)果樣品中含有2條多肽，其N端的15氨基酸殘基的序列分別為NSYSECPPSHDGYCL和EANSYSECPPSHDGY，說明檢測得到的多肽為pEGF-6His，同時也表明宿主菌GS115的蛋白酶STE13對pEGF-6His的氨基端的Glu-Ala切除不完全。
實施例7 融合蛋白生物活性檢測材料和試劑BALB/c 3T3細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心；DMEM基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、鏈霉素、胺酰胺購自GBICO公司。重組人表皮生長因子(Recombinant Human EGF，hEGF)，英國PeproTech House公司。Cell Counting Kit-8(CCK-8)，Dojindo Molecular Technologies公司。
BALB/c3T3細胞用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)傳代培養(yǎng)，用完全培養(yǎng)基稀釋至5×104/ml，以每孔100μl加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)24小時，用含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基(基礎培養(yǎng)基)饑餓培養(yǎng)12小時，加入系列稀釋的含純化的pEGF樣品或hEGF標準品的培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48小時，加10μl的CCK-8溶液，37℃作用2小時后測定600nm波長的吸收度值(OD)。
結(jié)果見附圖9。從圖9可見，本研究表達純化的pEGF蛋白對BALB/c 3T3細胞具有顯著的細胞增殖活性(P＜0.01)，與重組人表皮生長因子對照品的細胞增殖活性相比，無統(tǒng)計學學差異(P＞0.05)。
序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學<120>豬表皮生長因子基因及其應用<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>159<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(159)<400>1aat tct tac tct gaa tgt cca cca tcc cac gac ggt tac tgt ttg cac 48Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His1 5 10 15ggt ggt gtt tgt atg tat att gaa gcc gtc gac tct tat gcc tgt aac 96Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn20 25 30tgt gtt ttt ggt tac gtt ggc gag aga tgt caa cac aga gac ttg aaa144Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys35 40 45tgg tgg gag ttg aga159Trp Trp Glu Leu Arg50<210>2<211>53<212>PRT<213>人工序列<400>2Asn Ser Tyr Ser Glu Cys Pro Pro Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His1 5 10 15Gly Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Val Asp Ser Tyr Ala Cys Asn20 25 30Cys Val Phe Gly Tyr Val Gly Glu Arg Cys Gln His Arg Asp Leu Lys35 40 45Trp Trp Glu Leu Arg50
<210>3<211>236<212>DNA<213>重組質(zhì)粒<400>3aagaaggggt atctctcgag aaaagagagg ctgaagctaa ttcttactct gaatgtccac 60catcccacga cggttactgt ttgcacggtg gtgtttgtat gtatattgaa gccgtcgact120cttatgcctg taactgtgtt tttggttacg ttggcgagag atgtcaacac agagacttga180aatggtggga gttgagacat catcatcatc atcattgaga attccctagg gcggcc23權(quán)利要求
1.一種豬表皮生長因子基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的表達載體。
3.如權(quán)利要求2所述的表達載體，其具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述表達載體的宿主。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主，其為畢赤酵母。
6.如權(quán)利要求4或5所述的宿主，其是通過將權(quán)利要求2或3所述表達載體導入畢赤酵母GS115菌株制備的。
7.一種基因工程菌巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)C32 CGMCCNo.1826，其特征在于，該菌株含有權(quán)利要求1所述基因的14個拷貝。
8.通過權(quán)利要求7所述菌株獲得的豬表皮生長因子。
9.如權(quán)利要求8所述的豬表皮生長因子，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬表皮生長因子基因，其具有如序列表SEQID NO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了含有該基因的基因工程菌C32，該菌株含有上述基因的14個拷貝，該基因工程菌的pEGF表達量高，并且純化簡單，生產(chǎn)成本低，為工業(yè)化生產(chǎn)豬表皮生長因子提供了可能。
文檔編號C12R1/84GK1974767SQ200610114038
公開日2007年6月6日 申請日期2006年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月25日
發(fā)明者楊桂香, 汪洋, 彭險峰, 黃顯會, 陳杖榴, 曾振靈, 吳波浪 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學