專利名稱：同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測 定同型半胱氨酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色
譜法(HPLC)、氨基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯(lián)免疫分析法 (EIA)、毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜，熒光偏振免疫分析(FPIA)、電化學(xué) 法及酶法等等。
1.高效液相色譜法(HPLC):是經(jīng)典的參考方法，但其有操作比較 復(fù)雜，試驗(yàn)耗時(shí)比較長，試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大的缺點(diǎn)，在臨床應(yīng)用方 面逐漸被酶聯(lián)免疫分析法、熒光偏振分析法和酶法所取代。高效液相 色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還 原形式，然后與熒光劑進(jìn)行衍生生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物， 將衍生后的樣品進(jìn)行色譜分析。因色譜固定相對不同物質(zhì)的吸附力不 同，因此流動(dòng)相將其洗脫下來的次序也不同，根據(jù)這一原理將樣品中 的不同物質(zhì)分開，以熒光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù) 合物的熒光強(qiáng)度，將其與標(biāo)準(zhǔn)品/內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可以 測定血總同型半胱氨酸的水平。 2. 酶聯(lián)免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的
常用方法，其特點(diǎn)是操作比較方便、快捷，重復(fù)性好，方法穩(wěn)定可靠。 缺點(diǎn)是大部分操作還是手工操作，比較耗時(shí)等。酶聯(lián)免疫分析法其基
本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成S-腺
苷-L-同型半胱氨酸，然后加入酶標(biāo)的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單
克隆或多克隆抗體，采用競爭結(jié)合的原理，將不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品與酶 標(biāo)抗體競爭結(jié)合，然后以顯色試劑和終止試劑分別進(jìn)行顯色和終止， 制作出同型半胱氨酸濃度與發(fā)色強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品也按相同步驟 處理，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以査出其同型半胱氨酸的濃度。
3. 離子色譜法主要用于實(shí)驗(yàn)研究，臨床上較少使用。其基本分
析原理是色譜分析的一種，主要是其固定相采用離子交換物質(zhì)，根據(jù) 其對不同離子的吸附力不同可將同型半胱氨酸與其它物質(zhì)分開進(jìn)行測 定。
4. 毛細(xì)電泳法主要用于實(shí)驗(yàn)研究，有在臨床使用的報(bào)道。其特 點(diǎn)與高效液相色譜方法相似，如其有操作比較復(fù)雜、試驗(yàn)耗時(shí)較長和 試驗(yàn)數(shù)據(jù)變異比較大的缺點(diǎn)?；痉治鲈硐仁褂眠€原劑使血樣中 所有形式的同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成還原形式，然后與熒光試劑進(jìn)行衍生 生成同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物，將衍生后的樣品進(jìn)行毛細(xì)電泳分
析。將樣品放置于io千伏左右的高壓電場中，因?yàn)楦鞣N物質(zhì)所帶電荷
不同，其等電點(diǎn)也不相同，因此其在電場中的遷移速度也就不同，根 據(jù)這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質(zhì)分開，再以熒光檢
測器檢測同型半胱氨酸-熒光物質(zhì)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，將其與標(biāo)準(zhǔn)品/ 內(nèi)標(biāo)的比值進(jìn)行比較和計(jì)算，就可以測定總同型半胱氨酸的水平。
5. 熒光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法， 該方法完全自動(dòng)化儀器分析，具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本 分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結(jié)合的同型半 胱氨酸的熒光偏振強(qiáng)度不同，將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)抗體競爭結(jié)合，采 用競爭結(jié)合的原理制作出同型半胱氨酸濃度與熒光偏振強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲 線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可以査出其同型半胱氨酸的濃度。
6. 酶法是因應(yīng)市場需求而新開發(fā)出來的測試方法，目前國內(nèi)有多 項(xiàng)專利申請CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半 胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶
(E.C2丄1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3丄1)的循環(huán)擴(kuò)增作用， 再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶 等，或腺苷脫氨酶、谷氨酸脫氫酶等顯色反應(yīng)測定同型半胱氨酸含量; CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之 產(chǎn)生硫化氫后再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產(chǎn)生熒光，該方法使用 全自動(dòng)熒光分析儀測試，具有快速、準(zhǔn)確、方便的優(yōu)點(diǎn)。其基本分析 原理用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產(chǎn)物再與 熒光顯色劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成可測量之熒光化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法
(Enzymatic Colorimetric Method)、酶聯(lián)法(Couple Reaction)偶聯(lián)化 學(xué)反應(yīng)技術(shù)技術(shù)，計(jì)量通過酶聯(lián)及化學(xué)反應(yīng)生成亞甲基蘭(Methylene blue)所導(dǎo)致在660nm波長處吸光度的上升，得以測定同型半胱氨酸 濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的同型半胱氨酸 診斷試劑盒，采用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生 化分析儀上進(jìn)行同型半胱氨酸濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、 準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明同型半胱氨酸濃度測定方法原理如下
同型半胱氨酸+腺苷基蛋氨酸同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶
腺苷基同型半胱氨酸+蛋氨酸 腺苷基同型半胱氨酸+氧+水氨基酸氧化酶腺苷基硫代丁酮酸
+氨+過氧化氫 蛋氨酸+氧+水氨基酸氧化酶含氧酸+氨+過氧化氫 2過氧化氫+2 10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
—"^ 2亞甲基蘭
'這種方法應(yīng)用同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(偶)聯(lián)合氨基酸氧化酶及化 學(xué)反應(yīng)終點(diǎn)比色法。同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶酶解同型半胱氨酸反應(yīng) 產(chǎn)生腺苷基同型半胱氨酸及蛋氨酸二個(gè)氨基酸，二個(gè)氨基酸再通過 (偶)聯(lián)合氨基酸氧化酶及10-(羧甲基-氮乙?；?.-3,7-雙(二甲胺 基)吩噻嗪的作用，最終生成亞甲基蘭，從而可以通過可見光分析儀 器，在660nm波長處，測定生成亞甲基蘭含量高低的光吸收大小，通 過測量660nrn處吸光度上升的程度，得出同型半胱氨酸濃度大小測定 結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考
慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明同型半胱氨酸診斷試劑盒較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移！
氨基酸氧化酶
S-腺苷基蛋氨酸
8000 U/L
12000 U/L
20 mmol/L
10-(羧甲基-氮乙?；?-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
6 mmol/L
本發(fā)明的同型半胱氨酸含量診斷試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基 酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙酰基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
'也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑，更有利于消除內(nèi)外源氨 基酸污染
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷基蛋氨酸。
s-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑，不但有利于消除內(nèi)外 源氨基酸污染，還有利于試劑的穩(wěn)定
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷基蛋氨酸。 S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 6000 U/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
S-腺苷基蛋氨酸 20 mmol/L
10-(羧甲基-氮乙?；?-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
2 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑; 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，測
試主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn) 法，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于 生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同 型半胱氨酸的濃度大小。 實(shí)'施例二
本實(shí)施例的同型半胱氨酸診斷試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
氨基酸氧化酶 15000 U/L
10-(羧甲基-氮乙?；?-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 10000 U/L
S-腺苷基蛋氨酸 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測試 主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的 體積比例為1/20，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn)法， 延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同型半 胱氨酸的濃度大小。
實(shí)施例三同型半胱氨酸診斷試劑為三試劑，包括 ' 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
10-(羧甲基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
氨基酸氧化酶 14000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50鵬ol/L
同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 8000 U/L
S-腺苷基蛋氨酸 20 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37X:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測試 主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的 體積比例為1/30,反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點(diǎn)法， 延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于 生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同 型半胱氨酸的濃度大小。
'申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源 物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.一種同型半胱氨酸濃度測定方法，其方法原理如下同型半胱氨酸+腺苷基蛋氨酸 同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶腺苷基同型半胱氨酸+蛋氨酸腺苷基同型半胱氨酸+氧+水 氨基酸氧化酶 腺苷基硫代丁酸+氨+過氧化氫蛋氨酸+氧+水 氨基酸氧化酶 含氧酸+氨+過氧化氫2過氧化氫+2 10-(羧甲基-氮乙酰基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪-→2亞甲基蘭腺苷基硫代丁酸(S-adenosyl-γ-thio-ketobutyrate)含氧酸(oxo-acid)將最終反應(yīng)物亞甲基蘭(Methylene blue)置于可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的大小程度，測算出同型半胱氨酸濃度大小測定結(jié)果。
2. —種同型半胱氨酸診斷試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 氨基酸氧化酶 S-腺苷基蛋氨酸20-500畫ol/L1- 50mmol/L200——500000 U/L200-500000 U/L0.1-20mmol/L10-(羧甲基-氮乙?；?-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪0.1-20mmol/L 其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、S-腺苷基蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine)、 同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(homocysteine S"-methyltransferase EC 2.1.1.10)、氨基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙?；?腸3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成 單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、S-腺苷基蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine)、 同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(homocysteine S-methyltransferase EC 2.1.1.10)、氨基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成 雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、10-(羧甲 基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成；試劑2,由緩沖液、'穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、S-腺苷基蛋氨酸組成。S-腺苷 基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基 -氮乙?；?-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、S-腺苷基蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine)、 同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(homocysteine S-methyltransferase EC 2.1.1.10)、氨基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶組成；試劑 2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、10-(羧甲基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移 酶、S-腺苷基蛋氨酸組成。S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn) 移酶、氨基酸氧化酶及10-(羧甲基-氮乙?；?-3,7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特征在 于還包括穩(wěn)定劑1一000 mmol/L或0.in/。-100。/。體積比。所述穩(wěn) 定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇 (Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少 一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙?；?-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪(DA-67)及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測主波長660nm處吸光度上升的大小程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101097191SQ200610085578
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月26日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司