專利名稱：一株短小芽孢桿菌及其在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法，具體地說，尤其涉及使用一株短小芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法。
背景技術(shù)：
香蘭素，化學(xué)名為4-羥基-3-甲氧基苯甲醛(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)，又名香草醛、香莢蘭素。英文名為vanillin，分子式為C8H803，分子量為152.14。香蘭素外觀為白色至微黃色針狀結(jié)晶或粉末，呈香莢蘭豆特有的香氣，微甜，在潮濕的空氣中緩慢氧化為香蘭酸。沸點(diǎn)為284～285℃，相對密度為1.056，微溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸、二硫化碳和吡啶等有機(jī)溶劑。香蘭素有低微毒性，大白鼠經(jīng)口LD50為1580毫克/千克。
香蘭素是世界上產(chǎn)量最大、用途最廣的香料之一，被譽(yù)為“香料之王”。香蘭素廣泛應(yīng)用于巧克力、冰激凌、糖果等食品以及香煙、飲料和高檔化妝品中。它不僅可以用作增香劑和定香劑，還可在食品中用作防腐劑、保鮮劑和抗氧化劑。在化學(xué)工業(yè)中，香蘭素可抑制潤滑劑發(fā)泡，用作鍍鋅槽的增白劑、鋅電鍍的活性劑。香蘭素也是重要的醫(yī)藥合成中間體，用作生產(chǎn)L-多巴、L-甲基多巴和罌粟堿的基礎(chǔ)原料。目前世界市場上香蘭素的需求為每年1.5萬噸，且以每年10％的速度增長。
目前常用的香蘭素生產(chǎn)方法是植物原料提取法和化學(xué)合成法。香蘭素是天然香莢蘭的主要成分，其在香莢蘭豆中的含量約為15～20克/千克。香莢蘭在種植過程中需要對花朵進(jìn)行人工授粉，勞動(dòng)強(qiáng)度大，難以進(jìn)行大規(guī)模栽種，從植物原料提取不能滿足日益增長的天然香蘭素市場需求，其年產(chǎn)量僅為2000噸左右。絕大多數(shù)的香蘭素產(chǎn)品是通過化學(xué)合成的，常用的化學(xué)合成底物包括丁香酚、木質(zhì)素、乙醛酸、黃樟素和愈創(chuàng)木酚等。國內(nèi)常用的是采用愈創(chuàng)木酚和烏洛托品反應(yīng)的亞硝化工藝，該方法線路長，分離過程復(fù)雜，收率低，環(huán)境污染嚴(yán)重，原料消耗高，國外早已被淘汰。國外主要采用愈創(chuàng)木酚和乙醛酸縮合工藝，該工藝設(shè)備簡單，產(chǎn)率較高，但還處于研究階段，未能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)?？傮w來說，化學(xué)合成法工藝成熟，產(chǎn)物純度高，原料來源廣泛，但存在嚴(yán)重的缺陷，比如環(huán)境污染嚴(yán)重，產(chǎn)品香氣單一，易摻雜質(zhì)，合成香蘭素的安全性也受到質(zhì)疑。
隨著生活水平的提高，人們對天然綠色產(chǎn)品的需要也越來越高。與化學(xué)合成相比，生物法合成香蘭素具有反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，提取步驟簡單，生產(chǎn)清潔，環(huán)境污染低，產(chǎn)品安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，正日益受到人們的重視。包括阿魏酸、木質(zhì)素、香蘭酸、丁香酚和異丁香酚在內(nèi)的多種天然底物可用做生產(chǎn)香蘭素的底物，其中研究得較為深入的是阿魏酸和丁香酚。以阿魏酸為底物生產(chǎn)香蘭素，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)物收率高，香蘭素最終濃度可以達(dá)到1％以上。但天然阿魏酸本身就是一種重要的藥用原料，價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高。采用阿魏酸酯酶等在溫和條件下水解麥麩、米糠和甜菜等植物廢料可獲得天然阿魏酸，但水解效率很低，產(chǎn)物分離提取困難，難以達(dá)到工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的要求。
丁香酚和異丁香酚是天然丁香油的主要成分，原料來源廣泛，價(jià)格低廉，是生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)天然香蘭素的合適底物。通過丁香酚和異丁香酚的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素的對比發(fā)現(xiàn)，以丁香酚為原料生產(chǎn)香蘭素的生產(chǎn)工藝，香蘭素終濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1克/升，且轉(zhuǎn)化時(shí)間一般很長，大部分研究者認(rèn)為，異丁香酚更適合作為天然香蘭素生產(chǎn)的底物。截止到目前為止，文獻(xiàn)報(bào)道僅有幾株芽孢桿菌、黑曲霉、沙雷氏菌和紅球菌有轉(zhuǎn)化異丁香酚累積香蘭素的能力，但香蘭素產(chǎn)率低，達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。Abraham首次報(bào)道黑曲霉能轉(zhuǎn)化異丁香酚產(chǎn)生香蘭素，但累積的香蘭素濃度僅為0.1克/升。Chatterjee使用一株紅球菌Rhodococcus rhodochrous MTCC 289轉(zhuǎn)化異丁香酚，香蘭素摩爾產(chǎn)率高達(dá)58％，但最終香蘭素濃度低于1克/升。Furukawa從土壤中篩選到一株轉(zhuǎn)化異丁香酚為香蘭素的芽孢桿菌Bacillus sp.B2，使用生長體系轉(zhuǎn)化時(shí)香蘭素濃度為0.8克/升，使用粗酶液轉(zhuǎn)化時(shí)提高到0.9克/升，轉(zhuǎn)化率不到10％。Furukawa篩選到的另外一株惡臭假單胞菌Pseudomonasputida I58有較高的異丁香酚降解活力，在30分鐘內(nèi)能完全降解1.5克/升的異丁香酚，但終產(chǎn)物為香蘭酸，不累積香蘭素。到目前為止有報(bào)道的以異丁香酚為底物通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香蘭素產(chǎn)量最高的是一株粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens DSM 30126，據(jù)報(bào)道其香蘭素濃度在9天內(nèi)最高可達(dá)3.8克/升，但其缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化時(shí)間過長，且轉(zhuǎn)化率很低，僅為20.5％。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前天然香蘭素需求逐年增加，以天然阿魏酸為底物生產(chǎn)香蘭素成本過高，而以丁香酚底物的生產(chǎn)過程香蘭素濃度低，轉(zhuǎn)化率低的不足，本發(fā)明提供了一株從土壤中篩選得到的短小芽孢桿菌Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165，以及利用該菌株以廉價(jià)天然異丁香酚為底物高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)高濃度天然香蘭素的方法。
本發(fā)明提供了一株能夠轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)高濃度香蘭素的短小芽孢桿菌Bacilluspumilus S-1。該菌株于2006年1月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM 205165。
上述Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165具有如下生物學(xué)特征革蘭氏陽性，好氧，產(chǎn)芽孢，菌落淡黃色，平坦，不透明，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，不能水解淀粉，不能利用硝酸鹽，不能利用3-酮基乳糖，接觸酶陽性，明膠液化陽性，其16S rDNA序列與多株短小芽孢桿菌的16S rDNA序列比對相似性達(dá)到100％。
本發(fā)明涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下，靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20～40小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1～20克/升的異丁香酚，28℃～37℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)90～150小時(shí)。
其中，步驟(3)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是25～35小時(shí)。
其中，步驟(4)中所述的轉(zhuǎn)化溫度優(yōu)選是30～37℃。
其中，步驟(4)中所述的加入的異丁香酚濃度優(yōu)選為5～15克/升。
其中，步驟(4)中所述的轉(zhuǎn)化時(shí)間優(yōu)選是90～150小時(shí)。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
異丁香酚原料來源廣泛，價(jià)格低廉，使用Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法有反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，產(chǎn)物濃度高，副產(chǎn)物少，提取步驟簡單，生產(chǎn)清潔，產(chǎn)品環(huán)境友好，安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，解決了長期以來采用植物原料提取法和化學(xué)合成法遇到的多種難題。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，采用該方法可高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)高濃度香蘭素，具有很大的應(yīng)用前景。


本發(fā)明提供的一株Bacillus pumilus S-1，于2006年1月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 205165。
附圖為Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素的過程中異丁香酚和香蘭素的變化曲線。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165的篩選取丁香樹周圍的土壤，稱取5克溶于100毫升生理鹽水，充分混勻后取10毫升加入50毫升轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后加入質(zhì)量體積比為1％的異丁香酚，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，重復(fù)這一過程3～5次。將培養(yǎng)的菌液稀釋1,000,000倍涂布添加質(zhì)量體積比為1％的葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)。選取長出的單菌落接種50毫升的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后加入1％質(zhì)量體積比的異丁香酚，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)120小時(shí)，篩選能夠轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香蘭素菌株，最終獲得一株降解能力較好、能大量積累香蘭素的菌株，即Bacillus pumilusS-1 CCTCC M 205165，實(shí)驗(yàn)表明該菌株具有非常高的穩(wěn)定性，多次傳代后降解異丁香酚的能力沒有降低。
該菌株為革蘭氏陽性菌，好氧，不運(yùn)動(dòng)，菌落為淡黃色、平坦、不透明，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，不能水解淀粉，不能利用硝酸鹽，不能利用3-酮基乳糖，接觸酶陽性，明膠液化陽性，所述Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165的16S rDNA與多株短小芽孢桿菌的16S rDNA序列相似性達(dá)到100％，確定該菌株屬于短小芽孢桿菌。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，瓊脂16克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
在上述篩選能轉(zhuǎn)化異丁香酚生成香蘭素的菌株過程中，使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例2Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以體積百分比6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)25小時(shí)后加入10克/升異丁香酚，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。120小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％的葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)120小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到2.2克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為23.7％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例3Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以體積百分比6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)35小時(shí)后加入10克/升異丁香酚，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。120小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％的葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)40小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)120小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到3.2克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為34.5％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例4Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)30小時(shí)后加入10克/升異丁香酚，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。120小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％的葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)120小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到3.79克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為40.5％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例5Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)30小時(shí)后加入10克/升異丁香酚，在35℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。120小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％的葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在35℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)120小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到3.57克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為38.5％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例6Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)30小時(shí)后加入10克/升異丁香酚，在37℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。120小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％的葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)30小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在37℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)120小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到3.4克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為36.7％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例7Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)30小時(shí)后加入10克/升異丁香酚，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。90小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)90小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到2.25克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為24.3％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例8Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)30小時(shí)后加入10克/升異丁香酚，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。150小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)30小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(4)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)150小時(shí)；
(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到3.15克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為34.0％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例9Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，菌體培養(yǎng)30小時(shí)后加入5克/升異丁香酚，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。120小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)30小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入10克/升的異丁香酚，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)150小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到1.8克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為23.0％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
實(shí)施例10
Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165菌體在種子培養(yǎng)15小時(shí)后以6％接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，茵體培養(yǎng)30小時(shí)后加入15克/升異丁香酚，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化120小時(shí)后取樣測定香蘭素濃度。
本實(shí)施例涉及的Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素，其涉及的詳細(xì)步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilus S-1 CCTCC M 205165接種到添加1％葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)30小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入20克/升的異丁香酚，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)120小時(shí)；(5)香蘭素濃度檢測轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)分析純乙酸丁酯萃取后使用瓦里安3380氣相色譜儀檢測香蘭素濃度，最終香蘭素濃度達(dá)到4.8克/升，摩爾轉(zhuǎn)化率為34.5％。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。LB固體培養(yǎng)基配方為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比1.6％的瓊脂。
在上述利用短小芽孢桿菌轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的方法中，菌株轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)香蘭素使用的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。115℃條件下滅菌20分鐘。
權(quán)利要求
1.一株短小芽孢桿菌，其特征在于該菌株名為Bacillus pumilus S-1，于2006年1月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 205165，該短小芽孢桿菌Bacillus pumilusS-1 CCTCC M 205165的特征是革蘭氏陽性，好氧，產(chǎn)芽孢，菌落淡黃色、平坦、不透明，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，不能水解淀粉，不能利用硝酸鹽，不能利用3-酮基乳糖，接觸酶陽性，明膠液化陽性，其16S rDNA序列與多株短小芽孢桿菌的16S rDNA序列相似性達(dá)到100％。
2.一株短小芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用，其方法涉及的步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將Bacillus pumilusS-1 CCTCC M 205165接種到添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB固體培養(yǎng)基上，在30℃條件下靜置培養(yǎng)20小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到添加質(zhì)量體積比為1％的葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，制得種子培養(yǎng)液；(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)使用步驟(2)所得的種子培養(yǎng)液，按體積百分比6％的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在30℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20～40小時(shí)；(4)轉(zhuǎn)化使用步驟(3)所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1～20克/升異丁香酚，在28℃～37℃條件下，120轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)70～150小時(shí)。
3.如權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用，其特征在于所述種子培養(yǎng)使用的添加質(zhì)量體積比為1％葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基配方為酵母粉5克/升，蛋白胨10克/升，氯化鈉5克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0；斜面培養(yǎng)使用的LB固體培養(yǎng)基為在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂。
4.如權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖32克/升，酵母粉14克/升，硫酸鎂0.8克/升，氯化鈉0.2克/升，調(diào)節(jié)pH至7.0。
5.如權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用，其特征在于步驟(3)中所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間是25～35小時(shí)。
6.如權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用，其特征在于步驟(4)中所述的轉(zhuǎn)化溫度是30～37℃。
7.如權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用，其特征在于步驟(4)中所述的異丁香酚的加入量為5～15克/升。
8.如權(quán)利要求2所述的短小芽孢桿菌在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用，其特征在于步驟(4)中所述的培養(yǎng)時(shí)間為90～150小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株短小芽孢桿菌及其在生物轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素中的應(yīng)用。該菌株名為Bacillus pumilus S－1，于2006年1月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M205165。利用Bacillus pumilus S－1 CCTCC M 205165轉(zhuǎn)化異丁香酚生產(chǎn)天然香蘭素的過程包括(1)斜面培養(yǎng)，(2)制備種子培養(yǎng)液，(3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)，(4)轉(zhuǎn)化。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，采用該方法可高轉(zhuǎn)化率生產(chǎn)高濃度香蘭素，解決生物法生產(chǎn)天然香蘭素產(chǎn)物濃度低和產(chǎn)率低的問題，具有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/31GK101078005SQ20061002692
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日
發(fā)明者許平, 華棟梁, 林山, 杜毅, 魏中浩, 陳洪 申請人:上海凱信生物科技有限公司, 上海愛普香料有限公司