專利名稱：重組塵螨二類變應(yīng)原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組塵螨二類變應(yīng)原，尤其涉及重組戶塵螨二類變應(yīng)原Der p2。
背景技術(shù)：
隨著感染性疾病的控制和工業(yè)化程度的提高，過敏性疾病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增高的趨勢。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約有1.5億人患有哮喘，其中50％以上的成人及至少80％的兒童患者均由過敏因素誘發(fā)，每年有18萬多人死于哮喘。世界變態(tài)反應(yīng)組織(World Allergy Organization，WAO)在2005年7月世界首個(gè)變態(tài)反應(yīng)日公布的數(shù)據(jù)顯示，全球約22％的人患有變態(tài)反應(yīng)性疾病，如過敏性鼻炎、哮喘、結(jié)膜炎、濕疹、食物過敏等。美國一項(xiàng)依據(jù)皮膚試驗(yàn)的調(diào)查顯示，大約4000萬-5000萬人有過敏問題，其中3950萬人患有季節(jié)性過敏性鼻炎。
塵螨是重要的吸入性變應(yīng)原，也是最重要的室內(nèi)變應(yīng)原來源，其身體各組分、代謝產(chǎn)物等均為強(qiáng)烈致敏原，全球分布最為普遍的塵螨包括粉塵螨和戶塵螨等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并定名的塵螨變化應(yīng)原有20類，其中一類和二類變應(yīng)原為最主要，絕大多數(shù)塵螨過敏患者的血清IgE對這兩類變應(yīng)原呈高反應(yīng)性。天然和重組的二類變應(yīng)原都已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、變應(yīng)性疾病的機(jī)制研究以及治療性疫苗的開發(fā)等領(lǐng)域。天然的Der p2由塵螨的中腸內(nèi)皮細(xì)胞分泌，在其代謝產(chǎn)物中濃集。至今二類變應(yīng)原的生物學(xué)功能尚不明確，Mueller等用核磁共振的方法研究Derp2的結(jié)構(gòu)，認(rèn)為其序列與蛾的esr16有同源性，該蛋白與蛻皮有關(guān)；近期的研究發(fā)現(xiàn)Der p2的序列中含有一個(gè)MD-2相關(guān)的脂類識別結(jié)構(gòu)域(Keber MM，Gradisar H，Jerala R.J Endotoxin Res 2005；11(3)186-92.)。MD-2是一個(gè)LPS結(jié)合蛋白，在對革蘭氏陽性菌的反應(yīng)中起到重要作用，但是Der p2與LPS的親和力相當(dāng)?shù)?。通過獲取螨cDNA序列，已有一些粉塵螨、戶塵螨和其它螨種的二類變應(yīng)原異構(gòu)體(isoforms)被報(bào)道(Yuuki T，et al.Int Arch Allergy Immunol.1997；112(1)44-8.；Chua KY，et al.Clin Exp Allergy 1996；26(7)829-37.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組塵螨二類變應(yīng)原，尤其涉及重組塵螨二類變應(yīng)原Der p2。
本發(fā)明所述的重組塵螨二類變應(yīng)原Der p2具有序列1和序列2不同編碼序列，所述的序列與現(xiàn)有的Der p2全長cDNA序列(AF276239，GenBank)比較，具有14個(gè)核苷酸多樣性位點(diǎn)，對應(yīng)的蛋白序列與鼠單抗1D8的親和力不同，與人群IgG結(jié)合力相似(r＝0.864)。
本發(fā)明通過對上海地區(qū)的戶塵螨的克隆化培養(yǎng)，公開了Der p2的核酸序列的多樣性的特點(diǎn)。本發(fā)明所述的塵螨二類變應(yīng)原Der p2基因以AF276239(Genebank)作為參照，獲得了14個(gè)Derp2的多態(tài)性位點(diǎn)，其中3個(gè)改變了對應(yīng)的氨基酸殘基。第237由G轉(zhuǎn)為T，使第40位氨基酸殘基由精氨酸(V)轉(zhuǎn)為亮氨酸(L)；第258為由A轉(zhuǎn)為T，使第47位氨基酸殘基由蘇氨酸(T)轉(zhuǎn)為絲氨酸(S)；第459位G轉(zhuǎn)為A，使第114位天冬氨酸(D)轉(zhuǎn)為天冬酰氨(N)。
本發(fā)明進(jìn)行了Dot Blot和ELISA檢測其抗原性及與人群血清IgG的反應(yīng)水平分析，結(jié)果表明檢測不同地區(qū)塵螨主要變應(yīng)原的序列多樣性，有助于開發(fā)更有針對性的疫苗組分，以及特異性保護(hù)性IgG的篩選。為進(jìn)行更有針對性地特異性免疫治療等研究提供了依據(jù)。
本發(fā)明通過下述方法實(shí)現(xiàn)從過敏性疾病患者床褥采集分離戶塵螨，采用封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，分離培養(yǎng)單個(gè)孕螨獲得克隆化的螨群。用RT-PCR的方法擴(kuò)增不同螨克隆的Der p2編碼基因，插入原核表達(dá)載體pET-19b在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，獲得重組塵螨二類變應(yīng)原蛋白，證實(shí)Der p2的核酸序列的多樣性。
具體步驟如下述(1)戶塵螨的培養(yǎng)及克隆化按已知方法分離，培養(yǎng)及克隆化戶塵螨種群。
搜集灰塵，分離塵螨進(jìn)行初步培養(yǎng)。體視鏡下對成螨進(jìn)行大體形態(tài)鑒定，定種后挑取雌雄成螨純培養(yǎng)，體視鏡下挑取單個(gè)孕螨進(jìn)行隔離培養(yǎng)后，獲得小型克隆化螨群。
(2)設(shè)計(jì)與合成引物根據(jù)GenBank Der p2全長cDNA序列AF276239，設(shè)計(jì)成熟Der p2的引物(Invitrogen公司)，并在引物5’端加上限制性酶切位點(diǎn)。
所述上游引物5’-CCCATATGGATCAAGTCGATGTCAAAGATTG-3’，含Nde I酶切位點(diǎn)；下游引物5’-CCCTCGAGTTAATCGCGGATTTTAGCATGAG-3’，含Xho I酶切位點(diǎn)。
(3)克隆Der p2基因從克隆化的螨群分別挑取螨，采用RNeasy Total RNA Kits提取總RNA；用GeneAmp RNA PCR Kit進(jìn)行RT-PCR。
(4)構(gòu)建質(zhì)粒EZNA extraction kit膠回收純化上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，NdeI和XhoI 37℃雙酶切過夜，再次膠回收。pET-19b經(jīng)Nde I和Xho I 37℃雙酶切后用堿性磷酸酶(CIAP)處理。采用Takara Ligation Kit進(jìn)行載體和目標(biāo)DNA的連接。采用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定，再抽提陽性克隆質(zhì)粒，測序完成。
(5)表達(dá)rDer p2將上述質(zhì)粒用氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS。
(6)蛋白純化本發(fā)明的塵螨二類蛋白以包涵體的形式表達(dá)。
(7)rDer p2的抗原性檢測采用Dot blot法檢測不同序列成熟rDer p2和rDer f2的抗原性。
ELISA法檢測人血清特異性IgG。
本發(fā)明所涉及的戶塵螨及其分離，培養(yǎng)方法為現(xiàn)有技術(shù)(專利申請?zhí)?00510023631.6)；所述質(zhì)粒pET-19b購自美國Novagen公司；載體菌大腸桿菌JM109購自大連寶生物有限公司、BL21(DE3)plysS購自美國Invitrogen公司；塵螨浸出液戶塵螨為泰國商品化螨體(滅活)；螨體超聲破碎后，以PBS 1∶10(m/v)浸出；rDer f2由pET-19b構(gòu)建質(zhì)粒，表達(dá)方法與包涵體純化方法同Der p2；主要試劑及試劑盒RNeasy Total RNA Kits購自德國Qiagen公司；GeneAmpRNA PCR Kit購自美國Perkin-Elmer公司；Pyrobest DNA多聚酶、堿性磷酸酶(CIAP)、Ligation Kit、MiniBEST plasmid Purification Kit購自大連寶生物(Takara)公司；EZNA extraction kit購自美國Omega公司；限制性內(nèi)切酶NdeI和Xho I購自購自日本Takara公司；小鼠抗塵螨二類抗原單抗8D1和7A1購自英國Indoor公司；辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG、HRP-抗人IgG購自美國Zymed公司；Protein Assay購自美國Bio-Rad公司；Mite Group 2ELISA kit購自英國Indoor公司。
主要實(shí)驗(yàn)儀器恒溫恒濕箱購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；體視鏡K-400L購自Motic公司；相差顯微鏡Eclipse 50i購自日本Nikon公司；PCR儀PTC-150為美國MJ Research公司產(chǎn)品。
本發(fā)明應(yīng)用重組蛋白的技術(shù)可完全解決標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)中存在的不同批號的粗體螨浸液之間各組分的比例有很大差異等問題，且具有周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是雙酶切鑒定重組質(zhì)粒Der p2-pET19b圖，其中，1100bp Ladder；2Nde I和Xho I雙酶切PCR產(chǎn)物；3Nde I和Xho I雙酶切重組質(zhì)粒；4Nde I和Xho I雙酶切pET-19b空載體。
圖2是rDer p2 SDS-PAGE電泳其中泳道1～3依次為未誘導(dǎo)菌液，誘導(dǎo)后菌液，純化后的包涵體蛋白。
圖3為Dot Blot結(jié)果其中，第1行以天然抗原點(diǎn)樣，a為2μg Der p2，b為1μg Der p2，c為2μg Derf2；第2～4行用重組抗原點(diǎn)樣，A和B用rDer p2，C用rDer f2；第5行用Am-C點(diǎn)樣，a和c用1μg，b用0.1μg。A和C用鼠單抗1D8作為一抗與膜上的抗原結(jié)合；B用mAb 7A1作為一抗。
圖4為ELISA結(jié)果表示同一個(gè)人群血清IgG對兩種rDer p2的反應(yīng)性，Am-C為無關(guān)包涵體蛋白對照。
圖5表示血清IgG對兩者反應(yīng)的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(1)戶塵螨的培養(yǎng)及克隆化從過敏性鼻炎患者的床鋪搜集灰塵，在體視鏡下分離塵螨進(jìn)行初步培養(yǎng)。培養(yǎng)基由魚粉、干酵母和實(shí)驗(yàn)動物飼料、脫脂奶粉用Co60照射滅菌后以一定比例混和而成。培養(yǎng)系統(tǒng)溫度控制在25±2℃，濕度控制在RH 75％，系統(tǒng)內(nèi)加消毒劑抑制霉菌生長。培養(yǎng)采用封閉式容器，防止污染。經(jīng)體視鏡下對成螨進(jìn)行大體形態(tài)鑒定，定種后挑取雌雄成螨開始純培養(yǎng)。在體視鏡下挑取單個(gè)孕螨(疑似孕螨)進(jìn)行隔離培養(yǎng)，6周后可獲得小型克隆化螨群。
(2)設(shè)計(jì)與合成引物根據(jù)GenBank Der p2全長cDNA序列AF276239，設(shè)計(jì)成熟Der p2的引物(Invitrogen公司)，并在引物5’端加上限制性酶切位點(diǎn)。
所述上游引物5’-CCCATATGGATCAAGTCGATGTCAAAGATTG-3’，含Nde I酶切位點(diǎn)；下游引物5’-CCCTCGAGTTAATCGCGGATTTTAGCATGAG-3’，含Xho I酶切位點(diǎn)。
(3)克隆RT-PCR及Der p2基因從克隆化的螨群分別挑取螨，采用RNeasy Total RNA Kits提取總RNA；用GeneAmp RNA PCR Kit進(jìn)行RT-PCR。取10μl cDNA為模板在PTC-150熱循環(huán)儀上進(jìn)行PCR。25μl反應(yīng)體系含上下游引物各1μmol/L，Pyrobest DNA多聚酶1U/μl。PCR基本循環(huán)參數(shù)變性94℃變性45秒；55℃退火60秒；72℃延伸90秒，共執(zhí)行30個(gè)循環(huán)。起始94℃變性3分鐘；最后72℃延長1分鐘。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為406bp與預(yù)期相符。
(4)構(gòu)建質(zhì)粒上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EZNA extraction kit膠回收純化，Nde I和Xho I 37℃雙酶切過夜，再次膠回收。pET-19b經(jīng)Nde I和Xho I 37℃雙酶切后用CIAP處理。采用Takara Ligation Kit進(jìn)行載體和目標(biāo)DNA的連接。采用氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，菌液均勻鋪涂LB平板(含氨芐青霉素50μg/ml)。挑平板上克隆，搖菌抽提質(zhì)粒。2％瓊脂糖凝膠鑒定單酶切產(chǎn)物。酶切片斷大小與預(yù)期相符者，進(jìn)行雙酶切鑒定，得到大小406bp的片段，為Der p2基因。陽性克隆質(zhì)粒用MiniBESTplasmid Purification Kit再次抽提后，由英俊生物技術(shù)有限(Invitrogen)公司在ABI370測序儀上完成。
Der p2的測序結(jié)果與AF276239(BenBank)用DNASTAR MegAlign 5.01，采用Clustal W進(jìn)行分析。得到兩個(gè)不同的序列Der p2-I和Der p2-III，與AF276239相比，共有14個(gè)核酸位點(diǎn)與AF276239不同，其中有3個(gè)核苷酸的不同造成對應(yīng)氨基酸殘基的改變。
表1是上海地區(qū)分離的Der p2的編碼基因多態(tài)性。
表1

其中Der p2(cDNA來源)的核苷酸和對應(yīng)氨基酸序列比較AF276239為GenBank上公布的全長Der p2 cDNA序列；Der p2-I和Der p2-III為上海地區(qū)分離得到的戶塵螨Der p2的序列。
(5)表達(dá)rDer p2將上述質(zhì)粒用氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS。當(dāng)菌液OD600達(dá)0.6時(shí)，加入IPTG至1.0mmol/L IPTG，2小時(shí)候收菌。
(6)蛋白純化本發(fā)明的塵螨二類蛋白以包涵體的形式表達(dá)。
10000g離心10分鐘收菌。用0.1倍培養(yǎng)體積的Wash Buffer(20mmol/L TrisHCl pH 7.5，10mmol/L EDTA，1％ Trition X-100)重懸細(xì)菌，冰浴中超聲。加溶菌酶至終濃度100μg/ml，混勻后30℃處理15分鐘；10000g離心10分鐘，沉淀用0.1倍培養(yǎng)體積的Wash Buffer清洗5次，期間可超聲數(shù)次。清洗后的包涵體用10mg/ml in 50mmol CAPS，pH 11.0(含0.3％ N-lauroylsarcosine，1mmol/L DTT)溶解。蛋白溶液用至少50倍體積的透析液(20mmol/L Tris-HCl，pH8.5)透析，3小時(shí)更換一次透析液，前兩次含0.1mmol/L DTT，后兩次不含DTT。最后用至少25倍體積含1mmol/L還原型谷胱甘肽和0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽的透洗液透析過夜。12.5％SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳檢測表達(dá)量。
(7)rDer p2的抗原性檢測采用Dot blot法檢測不同序列成熟rDer p2和rDer f2的抗原性。
采用商品化戶塵螨提取物作為陽性對照，用相同載體和宿主菌表達(dá)，并用同樣方法純化的無關(guān)包涵體蛋白阿米巴150kD凝集素C末端(Am-C)作為陰性對照。將蛋白在硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣，晾干；用5％脫脂奶室溫封閉30分鐘；小鼠抗塵螨二類抗原單抗mAb 8D1和7A1用封閉液1∶400稀釋浸沒硝酸纖維素膜，室溫反應(yīng)1小時(shí)；PBST洗膜30分鐘(5’，5’，10’，10’)；HRP-山羊抗鼠IgG用封閉液1∶250稀釋浸沒硝酸纖維素膜，室溫反應(yīng)1小時(shí)；洗膜30分鐘(5’，5’，10’，10’)；二甲基聯(lián)苯二胺(DAB)顯色。
ELISA法檢測16例上海人血清特異性IgG。16人中，2例有哮喘史，3例為季節(jié)性鼻炎患者，11例自述無過敏癥狀。16人均未接受過特異性免疫治療(SIT)。重組抗原包被0.5μg/孔，對照蛋白Am-C包被0.1μg/孔，4℃過夜；PBST洗板5次；5％脫脂奶室溫封閉1小時(shí)；人血清以封閉液1∶400稀釋，室溫反應(yīng)1小時(shí)；PBST洗板5次；HRP-抗人IgG以封閉液1∶5000稀釋，室溫反應(yīng)1小時(shí)；PBST洗板6次；OPD顯色30分鐘，50μl 1mol/L硫酸中止反應(yīng)。OD490讀數(shù)。
SEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)<120>重組塵螨二類變應(yīng)原<130>11<160>2<170>PATENTIN VERSION 3.1<210>1<211>390<212>DNA<213>醫(yī)學(xué)節(jié)肢動物<400>1GATCAAGTCG ATGTCAAAGA TTGTGCCAAT CATGAAATCA AAAAAGTTTTGGTACCAGGA60TGCCATGGTT CAGAACCATG TATCATTCAT CGTGGTAAAC CATTCCAATTGGAAGCTTTA 120TTCGAAGCCAATCAAAACTC AAAAACAGCT AAAATTGAAATCAAAGCTTC AATCGATGGT 180
TTAGAAGTTG ATGTTCCCGG TATCGATCCA AATGCATGCC ATTATATGAAATGTCCATTG 240GTTAAAGGAC AACAATATGA TATTAAATAT ACATGGAATG TTCCAAAAATTGCACCAAAA 300TCTGAAAATG TTGTCGTCAC TGTTAAAGTT ATGGGTGATA ATGGTGTTTTGGCTTGTGCT 360ATTGCTACTCATGCTAAAATCCGCGATTAA390<210>2<211>390<212>DNA<213>醫(yī)學(xué)節(jié)肢動物<400>2GATCAAGTCG ATGTCAAAGA TTGTGCCAAT CATGAAATCA AAAAAGTTTTGGTACCAGGA60TGCCATGGTT CAGAACCATG TATCATTCAT CGTGGTAAAC CATTCCAATTGGAAGCCGTT 120TTCGAAGCCAACCAAAACAC AAAAACCGCT AAAATTGAAATCAAAGCCTC AATCGATGGT 180TTAGAAGTTG ATGTTCCCGG TATCGATCCA AATGCATGCC ATTACATGAAATGTCCATTG 240GTCAAAGGAC AACAATATGA TATTAAATAT ACATGGAATG TTCCGAAAATTGCACCAAAA 300
TCTGAAAATG TTGTCGTCAC TGTCAAAGTT ATGGGTGATG ATGGTGTTTTGGCCTGTGCT 360ATTGCTACTCATGCTAAAATCCGCGATTAA390。
權(quán)利要求
1.重組塵螨二類變應(yīng)原，其特征是戶塵螨二類變應(yīng)原Der p2，具有序列1和序列2的編碼序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組塵螨二類變應(yīng)原，其特征是所述的序列與全長cDNA序列AF276239比較，具有14個(gè)核苷酸多樣性位點(diǎn)，對應(yīng)的蛋白序列與鼠單抗1D8的親和力不同，與人群IgG結(jié)合力為r＝0.864。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組塵螨二類變應(yīng)原，其特征是所述的變應(yīng)原基因的14個(gè)Der p2的多態(tài)性位點(diǎn)，其中3個(gè)改變了對應(yīng)的氨基酸殘基第237由G轉(zhuǎn)為T，使第40位氨基酸殘基由精氨酸(V)轉(zhuǎn)為亮氨酸(L)；第258為由A轉(zhuǎn)為T，使第47位氨基酸殘基由蘇氨酸(T)轉(zhuǎn)為絲氨酸(S)；第459位G轉(zhuǎn)為A，使第114位天冬氨酸(D)轉(zhuǎn)為天冬酰氨(N)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組塵螨二類變應(yīng)原的制備方法，其特征是通過下述步驟(1)戶塵螨的培養(yǎng)及克隆化獲得小型克隆化螨群；(2)設(shè)計(jì)與合成引物根據(jù)GenBank Der p2全長cDNA序列AF276239，設(shè)計(jì)成熟Der p2的引物，并在引物5’端加上限制性酶切位點(diǎn)，所述上游引物5’-CCCATATGGATCAAGTCGATGTCAAAGATTG-3’，含Nde I酶切位點(diǎn)；下游引物5’-CCCTCGAGTTAATCGCGGATTTTAGCATGAG-3’，含Xho I酶切位點(diǎn)；(3)克隆Der p2基因從克隆化的螨群分別挑取螨，采用RNeasy Total RNA Kits提取總RNA；用GeneAmp RNA PCR Kit進(jìn)行RT-PCR；(4)構(gòu)建質(zhì)粒EZNA extraction kit膠回收純化上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，NdeI和XhoI 37℃雙酶切后用堿性磷酸酶(CIAP)處理，過夜，再次膠回收，采用Takara Ligation Kit進(jìn)行載體和目標(biāo)DNA的連接，氯化鈣法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定，再抽提陽性克隆質(zhì)粒，測序完成；TCAAAGCTTC AATCGATGGT 180TTAGAAGTTG ATGTTCCCGG TATCGATCCA AATGCATGCC ATTATATGAAATGTCCATTG240GTTAAAGGAC AACAATATGA TATTAAATAT ACATGGAATG TTCCAAAAATTGCACCAAAA300TCTGAAAATG TTGTCGTCAC TGTTAAAGTT ATGGGTGATA ATGGTGTTTTGGCTTGTGCT360ATTGCTACTCATGCTAAAATCCGCGATTAA390<210>2<211>390<212>DNA<213>醫(yī)學(xué)節(jié)肢動物<400>2GATCAAGTCG ATGTCAAAGA TTGTGCCAAT CATGAAATCA AAAAAGTTTTGGTACCAGGA60TGCCATGGTT CAGAACCATG TATCATTCAT CGTGGTAAAC CATTCCAATTGGAAGCCGTT120TTCGAAGCCA ACCAAAACAC AAAAACCGCTAAAATTGAAATCAAAGCCTC AATCGATGGT180TTAGAAGTTG ATGTTCCCGG TATCGATCCA AATGCATGCC ATTACATGAAATGTCCATTG240GTCAAAGGAC AACAATATGA TATTAAATAT ACATGGAATG TTCCGAAAAT(5)表達(dá)rDer p2將上述質(zhì)粒用氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS；(6)蛋白純化塵螨二類蛋白以包涵體的形式表達(dá)；(7)rDer p2的抗原性檢測采用Dot blot法檢測不同序列成熟rDer p2和rDer f2的抗原性，ELISA法檢測人血清特異性IgG。SEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)<120>重組塵螨二類變應(yīng)原<130>11<160>2<170>PATENTIN VERSION 3.1<210>1<211>390<212>DNA<213>醫(yī)學(xué)節(jié)肢動物<400>1GATCAAGTCG ATGTCAAAGA TTGTGCCAAT CATGAAATCA AAAAAGTTTTGGTACCAGGA60TGCCATGGTT CAGAACCATG TATCATTCAT CGTGGTAAAC CATTCCAATTGGAAGCTTTA120TTCGAAGCCAATCAAAACTC AAAAACAGCT AAAATTGAAATGCACCAAAA300TCTGAAAATG TTGTCGTCAC TGTCAAAGTT ATGGGTGATG ATGGTGTTTTGGCCTGTGCT360ATTGCIACTCATGCTAAAATCCGCGATTAA390。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組塵螨二類變應(yīng)原Der p2。本發(fā)明成功對戶塵螨種群進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，獲得不同編碼序列的重組Der p2變應(yīng)原，其中存在14個(gè)核苷酸多樣性位點(diǎn)，對應(yīng)的兩個(gè)不同序列的重組Der p2蛋白與鼠單抗1D8的親和力不同，與人群IgG結(jié)合力相似(r＝0.864)。經(jīng)Dot Blot和ELISA檢測其抗原性及與人群血清IgG的反應(yīng)水平分析，結(jié)果表明檢測不同地區(qū)塵螨主要變應(yīng)原的序列多樣性，有助于開發(fā)更有針對性的疫苗組分，以及特異性保護(hù)性IgG的篩選。為進(jìn)行更有針對性地特異性免疫治療等研究提供了依據(jù)。
文檔編號C12N15/09GK1847398SQ200610025388
公開日2006年10月18日 申請日期2006年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月31日
發(fā)明者范怡敏, 程訓(xùn)佳 申請人:復(fù)旦大學(xué)