專利名稱：人cll1基因、其編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的人基因和蛋白，尤其涉及一種人CLL1基因的核酸序列、其編碼蛋白；此外，本發(fā)明還涉及該基因編碼蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膠凝素是一個具有膠原樣蛋白和糖識別域的C型凝集素家族，它們能結(jié)合微生物的糖類抗原并通過直接中和與凝集、激活外源凝集素補給途徑或由膠凝素調(diào)理來抑制微生物感染。CLL1(collectin liver 1，肝臟膠凝素1)具有典型的膠凝素結(jié)構(gòu)特征，N端至C端依次為4個結(jié)構(gòu)域N端富含半胱氨酸區(qū)、膠原樣區(qū)、莖區(qū)和C型凝集素糖識別域。RT-PCR實驗表明除了骨骼肌，許多組織都有CLL1的mRNA，zoo-blot分析又表明CLL1只在哺乳動物和鳥類中表達。染色體定位研究顯示CLL1基因定位于8號染色體的長臂上，而其它人的膠凝素基因定位在10號染色體。CLL1是胞質(zhì)蛋白，而其它膠凝素蛋白是分泌蛋白。對CLL1和其它膠凝素的系統(tǒng)發(fā)生樹進行分析，結(jié)果表明CLL1是繼甘露糖結(jié)合蛋白(mannose-binding protein，MBP)、肺表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白A(surfactant proteinA，SP-A)、以及肺表面活性物質(zhì)脫輔基蛋白D(surfactant protein D，SP-D)后的第四類膠凝素家族成員。
膠凝素在人體的先天免疫中起著重要的作用，如SP-A能調(diào)節(jié)局部免疫和炎癥反應(yīng)，它通過C型凝集素糖識別域識別金葡菌等細菌的膜抗原，通過膠原樣區(qū)與吞噬細胞表面膠凝素R結(jié)合、調(diào)理吞噬。由于CLL1具有一個獨特的C-末端賴氨酸簇，且對半乳糖、甘露糖、果糖及N-乙酰氨基葡萄糖有弱凝集素活性，說明CLL1在調(diào)節(jié)細胞功能中起作用。已有研究表明CLL1在細胞質(zhì)中可能起著清道夫和分子伴侶的作用(JBiol Chem 1999，274(19)13681-13689)，但至今仍沒有關(guān)于人CLL1蛋白抑制腫瘤的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種新的人CLL1基因。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種新的人CLL1蛋白。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供本發(fā)明的人CLL1蛋白在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種人CLL1基因，它包括下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列；(2)編碼序列表中SEQ ID NO.6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(3)與序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
較佳地，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.5的DNA序列。更佳地，所述序列具有SEQ ID NO.5中從核苷酸第76-909位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種人CLL1蛋白質(zhì)，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或其保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物。
較佳地，該蛋白質(zhì)選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ ID NO.6氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO.6氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
更佳地，所述蛋白質(zhì)是具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的人CLL1基因。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種含有上述載體的遺傳工程化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物，該組合物含有安全有效量的所述的人CLL1蛋白質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種能與上述人CLL1蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。
本發(fā)明還提供了一種人CLL1蛋白質(zhì)在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。
在本發(fā)明中，術(shù)語“編碼CLL1蛋白質(zhì)序列”指編碼具有人CLL1蛋白活性的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中第76-909位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的編碼框第76-909位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.5中第76-909位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQID NO.6所述的序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.5中從核苷酸第76-909位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與CLL1相同功能蛋白的SEQ ID NO.5中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“CLL1蛋白”指具有CLL1蛋白活性的SEQ ID NO.6序列的蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括具有與CLL1蛋白質(zhì)相同功能的、SEQ ID NO.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括CLL1蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的人CLL1蛋白質(zhì)的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴緊條件下能與CLL1的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗CLL1蛋白質(zhì)的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他蛋白質(zhì)，如包含CLL1蛋白質(zhì)或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還包括CLL1蛋白質(zhì)的可溶性片段。
本發(fā)明還包括CLL1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然CLL1蛋白質(zhì)的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白質(zhì)包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的蛋白質(zhì)并不限于上述例舉的代表性的蛋白質(zhì)。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白質(zhì)的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化、磷酸化等。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，病毒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的CLL1蛋白質(zhì)時，可以將本發(fā)明的人CLL1基因序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成CLL1蛋白表達載體。
在本發(fā)明中，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與蛋白質(zhì)的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于蛋白質(zhì)DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
在本發(fā)明中，所述藥物組合物含有安全有效量的人CLL1蛋白質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體，這類載體包括(但并不限于)稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇等。本發(fā)明的藥物組合物的施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。優(yōu)選的施用方式是口服，它可根據(jù)疾病程度調(diào)節(jié)。
藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.01微克/千克體重—約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的人CLL1蛋白質(zhì)還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的CLL1蛋白或其激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.01微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.01微克/千克體重—約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明還提供了對人CLL1特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對CLL1特異的抗體。例如，將提純的人CLL1基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達人CLL1或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑CLL1功能的抗體，也可以是不影響人CLL1功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人CLL1基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人CLL1基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的CLL1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過用在原核細胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來免疫動物而得到。
本發(fā)明的人CLL1抗體可以用來鑒定表達人CLL1蛋白或多肽的細胞，如Jurkat T細胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標記CLL1特異抗體，然后讓人CLL1特異抗體與細胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測出與CLL1特異抗體結(jié)合的細胞。
除了在細胞表面檢測人CLL1外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細胞裂解液可以從培養(yǎng)細胞或取自病人的組織標本如腎上腺中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞提取物(同時將提純的人CLL1多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測CLL1多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對照。
本發(fā)明的人CLL1基因也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于CLL1蛋白的無表達、異常或無活性的CLL1蛋白的表達所致的細胞的無限生長。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計成過量表達本發(fā)明的人CLL1蛋白，以補充內(nèi)源性的人CLL1蛋白的缺失或不足。另外重組人CLL1基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)。本發(fā)明的人CLL1基因?qū)虢M織或細胞內(nèi)的方法包括將人CLL1基因序列直接注入到體內(nèi)組織中，或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將基因序列導(dǎo)入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。也可通過體外補充本發(fā)明的人CLL1蛋白因子，以減輕因人CLL1蛋白的異常引起的病癥，所述的人CLL1蛋白因子可由基因工程技術(shù)產(chǎn)生，并通過進一步分離、提純而獲得。
本發(fā)明的人CLL1蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人CLL1缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥，也可通過體外補充本發(fā)明的正常人CLL1蛋白因子，以控制癌細胞增殖和殺死癌細胞。


圖1是本發(fā)明的人CLL1基因在人肝癌組織和癌旁組織中的差異表達圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1用去甲基化藥物DAC(終濃度為2000nM)，處理15株肝癌細胞株后，使用基因芯片檢測處理前后基因表達水平的差異，發(fā)現(xiàn)在8株細胞株中，CLL1基因表達上調(diào)。其中，基因芯片實驗主要包括如下四個步驟芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)和信號檢測以及結(jié)果分析。
1.芯片制備 目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體。通過點樣法將靶基因作為探針按順序排列在載體上，靶基因可分為基因組DNA、cDNA(或人工合成DNA)。
2.樣品制備 待測樣品中總RNA的抽提步驟如下分別取用去甲基化藥物DAC處理的15株肝癌細胞株和15株未經(jīng)去甲基化處理的肝癌細胞株，再用TRIZol法抽提總RNA。抽提時，每5×106細胞加入1ml TRIzol，在旋渦震蕩器上混勻；對于組織樣品，每100mg組織可加入1ml TRIzol，用液氮研磨或采用電動勻漿器充分打碎組織塊。再加入大約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。然后，4℃，12000rpm離心15分鐘后小心將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置5分鐘。再4℃，12000rpm離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70％乙醇，4℃，12000rpm離心洗滌沉淀15分鐘。去上清，沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶的水充分溶解沉淀，測定A260和A280值。
提取的總RNA可進一步用于樣品cDNA探針制備，其過程如下1)熒光探針的制備(cDNA第一鏈標記)從-70℃冰箱中取出RNA，在室溫下解凍，然后在0.2ml PCR管中配制反應(yīng)溶液，若用Cy3/Cy5熒光標記探針，則PCR管中配制的反應(yīng)溶液體系是，總RNA 5～50μg、熒光標記的引物1μg，再加入無核酸酶的水Xμl使總反應(yīng)體積為10μl，若用生物素標記探針，則PCR管中配制的反應(yīng)溶液體系是總RNA 5～50μg、生物素標記的引物1μg，再加入無核酸酶的水Xμl組成10μl的總反應(yīng)體積，其中，所有熒光標記的引物都采用隨機八聚體引物；再在70℃預(yù)變性10分鐘，變性反應(yīng)結(jié)束后在PCR管中配制cDNA第一鏈反應(yīng)體系，在該體系中分別加入4ul的5 x first-strand buffer(第一鏈合成緩沖液)、2ul的0.1MDTT、1ul的5mM Unlabeled dNTP mix(未標記的dNTP混合液，對于引物用生物素標記的情況則換為加入1μl的10mM dNTP mix)、1μl的1mM Cy3/Cy5 dCTP、1μl的RNA抑制劑及1ul的SuperScript II RNaseH reverse transcriptase(逆轉(zhuǎn)錄酶，200 U/μl)，從而組成20μl的總體積；然后，42℃保溫2小時，70℃變性5分鐘。在PCR管中加入2μl 2.5 N的NaOH水解RNA終止反應(yīng)，37℃保溫15分鐘，加入10μl 2N HEPES中和。
2)熒光探針的純化可應(yīng)用QIAquick Nucleotide Removal Kit進行純化，首先，標記好的探針轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入大約10倍體積的PN緩沖液，混勻，將QIAquick柱套入2ml離心管中，并轉(zhuǎn)移探針至QIAquick柱，6000rpm離心1分鐘，棄去濾過液；再向柱中加入700～750μl的PE緩沖液，6000rpm離心1分鐘，棄去濾過液；再于13 000rpm離心1分鐘，并將QIAquick柱子轉(zhuǎn)入一新的1.5mlEppendorf管上，然后，向柱中加入100～150μl的EB緩沖液，13 000rpm離心1分鐘。
3)熒光探針的定量將下清液轉(zhuǎn)移至酶標板中，分別測定A260、A550、A650；再通過Cy3-probe(pmol)＝A550×洗脫體積/0.15和Cy5-probe(pmol)＝A650×洗脫體積/0.25的計算公式進行定量；定量后的探針吸回至1.5ml離心管中，加熱抽干，保存于-20℃，待雜交。
3.芯片雜交1)準備工作(1)洗滌蓋玻片，將蓋玻片依次放入ddH2O、95％乙醇、ddH2O，各3min，最后放入干燥的50ml離心管中1000rpm，離心3min，去除殘留的水漬，放置待用；(2)配制10％PBS溶液；(3)平衡雜交爐，用水平儀校準雜交爐，保持水平；(4)配制如下洗片液20×SSC溶液、10％SDS溶液、洗液I(2×SSC/0.5％SDS)、洗液II(1×SSC/0.1％SDS)、洗片溶液III(0.1×SSC)。
2)預(yù)雜交 預(yù)雜交液的配制是30μl的總體積中有9μl的20×SSPE緩沖液、3μl的50×Denhandts緩沖液及18μl ddH2O，再從干燥箱中取出芯片，將適量的預(yù)雜交液滴加于芯片上，蓋上蓋玻片，然后將芯片放入加有PBS的雜交盒中，置于42℃雜交箱中預(yù)雜交約1小時。預(yù)雜交完成之后取出芯片用ddH2O浸洗片刻，待蓋玻片脫落后將芯片放入干燥的離心管中離心，去除殘留的水漬，放置待用。
3)雜交 取出經(jīng)定量的Cy3和Cy5標記的探針，各用9～15μl ddH2O充分溶解混合于1.5ml離心管內(nèi)，然后配制雜交液，Cy3/Cy5熒光標記探針的雜交液由20×SSPE緩沖液、50×Denhandts緩沖液和溶解有探針的ddH2O組成，而生物素標記探針的雜交液由20×SSPE緩沖液、50×Denhandts緩沖液、SA-Cy3/SA-Cy5及溶解有探針的ddH2O組成，接著，取雜交液滴加在芯片上，并蓋上蓋玻片，同時保證蓋玻片覆蓋在含有雜交液的芯片的有效點樣區(qū)域。最后，將該雜交芯片放入加有PBS的雜交盒，置于42℃雜交箱中雜交12～20小時。
4.洗滌、掃描和數(shù)據(jù)分析 芯片雜交反應(yīng)結(jié)束后，需進行芯片洗滌。先將洗液I與洗液II置于42℃水浴預(yù)熱，再用鑷子取出片子，浸入經(jīng)過42℃預(yù)熱的洗液I中，當(dāng)蓋玻片從芯片上脫離后，再在42℃洗液I中洗滌8～20min。然后將片子換著浸入經(jīng)過42℃預(yù)熱的洗液II中，洗滌8～12min，從洗液II中取出片子后，再將片子浸入洗液III中，洗滌3～8min。最后把片子在ddH2O中洗滌1～2min，轉(zhuǎn)入干凈離心管離心，以去除殘留的水滴，經(jīng)過上述洗滌，可將芯片放入芯片盒，待掃描分析。
通過特定的掃描儀比如激光共聚焦掃描儀進行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強度的數(shù)字信號，隨后進行數(shù)據(jù)分析和處理。所得復(fù)合圖須經(jīng)軟件分割成單色熒光圖像，再將圖像導(dǎo)入圖像分析軟件Imagene，經(jīng)過自動和人工定位與排列，確定雜交點的范圍，過濾背景噪音，提取得到基因表達的熒光信號強度值，最后以列表形式輸出，從而完成將掃描得到的圖像定量轉(zhuǎn)化為數(shù)值。輸出的數(shù)據(jù)通常需要包括信號強度，背景，信噪比等參數(shù)。
由于樣本差異、熒光標記效率和檢出率的不平衡，需對原始提取信號進行均衡和修正才能進一步分析實驗數(shù)據(jù)，Normalization正是基于此種目的。數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件Genespring，用Background subtraction based on negativecontrols和perspot and per chip Intensity dependentnormalization(non-linear or LOWESSnormalization)方法標準化，計算得到ratio值(兩種熒光Cy3與Cy5的比值)。一般認為ratio值在0.5-2.0范圍內(nèi)的基因不存在顯著的表達差異，而在該范圍之外的基因則被認為表達出現(xiàn)顯著改變，此域值范圍可根據(jù)具體實驗條件有所調(diào)整，再通過使用genespring和cluster分析軟件進行聚類分析，建立各種不同的數(shù)學(xué)模型，可以得到各種統(tǒng)計分析結(jié)果，確定不同基因在表達上的相關(guān)性，從而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene tree，experiment tree，K-means，SOM，PCA等方法均可通過Genespring實現(xiàn)和展示。由cluster軟件分析結(jié)果可通過treeview軟件以圖形顯示。
實施例2RT-PCR實驗檢測CLL1基因在肝癌組織中的表達情況。
1.組織分離(Tissue isolation)實驗用組織來源于72例HBV陽性并表達甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人(RT-PCR證實AFP在肝癌均為陽性而癌旁為陰性)。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(-80℃)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。
2.總RNA的抽提試劑盒抽提RNA試劑采用TRIzol reagent(GIBCO/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進行無RNA酶處理，以保證實驗中無RNA酶的環(huán)境。
3.RNA的抽提步驟將碾杵和勻漿器等器皿在200℃干烤4h，去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzol試劑的勻漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4℃離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4℃離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4℃離心沉淀RNA；用75％乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計測定260/280比值(比值均在1.7～2.0)；并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。
4.cDNA的合成取總RNA2μg，OligodT16 1μL，70℃保溫3min，立即冰上變性5min。加入5×buffer，DTT和50mg/L的dNTP各2μL及1μL的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42℃2h。模板使用終濃度通常為1μg/100μL。
5.RT-PCR擴增Beta-actin(F)前向引物為5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’(SEQ ID NO1)；Beta-actin(R)后向引物為5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’(SEQ ID NO2)。
CLL1(F)5’-GTAGGTGCTTTGAACCCCTTT-3’(SEQID NO3)；CLL1(R)5’-TGTCAGAAACCATAACTGGAGTAG-3’(SEQ ID NO4)。
以β-actin作內(nèi)對照，反應(yīng)混合物中各成分為β-actin(F)、β-actin(R)、CLL1(F)、CLL1(R)、10×Buffer、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0.2、0.2、0.4、0.4、1.0、1.0、0.2、0.1和5μLcDNA模板，最后補充ddH20使反應(yīng)體系為10μL。PCR的反應(yīng)條件是94℃變性5min；然后每個循環(huán)94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7min。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
6.實驗結(jié)果顯示，在癌旁組織中，有616bp的CLL1特異擴增片斷，而在肝癌組織中，CLL1基因的表達水平明顯低于癌旁組織中CLL1基因的表達水平(圖1)，許多肝癌組織中幾乎沒有CLL1的表達，內(nèi)參β-actin的長度為300bp，圖中，“N”指癌旁組織，“C”指肝癌組織。在肝癌組織中，CLL1基因的表達下降可能使原本受其抑制的基因過量表達，從而引起細胞的惡性增殖。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人CLL1基因、其編碼蛋白及應(yīng)用<130>NP-10422<160>6<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1TCACCCACACTGTGCCCA TCTACGA25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物
<400>2CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG25<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3GTAGGTGCTTTGAACCCCTTT 21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4TGTCAGAAACCATAACTGGAGTAG24<210>5<211>1686<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(76)..(909)<400>51aagcaggagg ttttatttaa aataaagctg tttatttggc atttctggga gacccttttc61 tgaggaacca cagcaatgaa tggctttgca tccttgcttc gaagaaacca atttatcctc121 ctggtactat ttcttttgca aattcagagt ctgggtctgg atattgatag ccgtcctacc181 gctgaagtct gtgccacaca cacaatttca ccaggaccca aaggagatga tggtgaaaaa241 ggagatccag gagaagaggg aaagcatggc aaagtgggac gcatggggcc gaaaggaatt301 aaaggagaac tgggtgatat gggagatcgg ggcaatattg gcaagactgg gcccattggg361 aagaagggtg acaaagggga aaaaggtttg cttggaatac ctggagaaaa aggcaaagca421 ggtactgtct gtgattgtgg aagataccgg aaatttgttg gacaactgga tattagtatt481 gcccggctca agacatctat gaagtttgtc aagaatgtga tagcagggat tagggaaact541 gaagagaaat tctactacat cgtgcaggaa gagaagaact acagggaatc cctaacccac601 tgcaggattc ggggtggaat gctagccatg cccaaggatg aagctgccaa cacactcatc661 gctgactatg ttgccaagag tggcttcttt cgggtgttca ttggcgtgaa tgaccttgaa721 agggagggac agtacatgtt cacagacaac actccactgc agaactatag caactggaat781 gagggggaac ccagcgaccc ctatggtcat gaggactgtg tggagatgct gagctctggc841 agatggaatg acacagagtg ccatcttacc atgtactttg tctgtgagtt catcaagaag901 aaaaagtaac ttccctcatc ctacgtattt gctattttcc tgtgaccgtc attacagtta961 ttgttatcca tccttttttt cctgattgta ctacatttga tctgagtcaa catagctaga1021 aaatgctaaa ctgaggtatg gagcctccat catcatgctc ttttgtgatg attttcatat1081 tttcacacat ggtatgttat tgacccaata actcgccagg ttacatgggt cttgagagag
1141 aattttaatt actaattgtg cacgagatag ttggttgtct atatgtcaaa tgagttgttc1201 tcttggtatt tgctctacca tctctcccta gagcactctg tgtctatccc agtggataat1261 ttcccagttt actggtgatg attaggaagg ttgttgatgg ttaggctaac ctgccctggc1321 ccaaagccag acatgtacaa gggctttctg tgagcaatga taagatcttt gaatccaaga1381 tgcccagatg ttttaccagt cacaccctat ggccatggct atacttggaa gttctccttg1441 ttggcacaga catagaaatg ctttaacccc aagcctttat atgggggact tctagctttg1501 tgtcttgttt cagaccatgt ggaatgataa atactctttt tgtgcttctg atctatcgat1561 ttcactaaca tataccaagt aggtgctttg aacccctttc tgtaggctca caccttaatc1621 tcaggcccct atatagtcac actttgattt aagaaaaatg gagctcttga aatcaaaaga1681 aaaaaa<210>6<211>277<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>61MNGFASLLRR NQFILLVLFL LQIQSLGLDI DSRPTAEVCA THTISPGPKG51 DDGEKGDPGE EGKHGKVGRM GPKGIKGELG DMGDRGNIGK TGPIGKKGDK101 GEKGLLGIPG EKGKAGTVCD CGRYRKFVGQ LDISIARLKT SMKFVKNVIA151 GIRETEEKFY YIVQEEKNYR ESLTHCRIRG GMLAMPKDEA ANTLIADYVA201 KSGFFRVFIG VNDLEREGQY MFTDNTPLQN YSNWNEGEPS DPYGHEDCVE251 MLSSGRWNDT ECHLTMYFVC EFIKKKK
權(quán)利要求
1.一種人CLL1基因，其特征在于，它包括下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列；(2)編碼序列表中SEQ ID NO.6蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(3)與序列表中SEQ ID NO.5的DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.5的DNA序列。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，所述序列具有SEQ ID NO.5中從核苷酸第76-909位的核苷酸序列。
4.一種人CLL1蛋白質(zhì)，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或其保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)將SEQ ID NO.6氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO.6氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
6.如權(quán)利要求4或5所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
7.一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的人CLL1基因。
8.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求7所述的載體。
9.一種抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)及藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種能與權(quán)利要求4所述的人CLL1蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人CLL1基因序列及其編碼蛋白，本發(fā)明還公開了人CLL1蛋白在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的人CLL1蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人CLL1蛋白缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥，且可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使本發(fā)明的人CLL1基因在癌細胞中過量表達，或通過體外補給人CLL1蛋白，以控制癌細胞增殖并殺死癌細胞。
文檔編號C12N15/63GK101045926SQ20061002511
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月27日
發(fā)明者黃健, 韓澤廣, 鄧福興 申請人:上海人類基因組研究中心