專利名稱：用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列及其鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術中的DNA序列及其利用DNA序列鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法。
背景技術：
近年來，黃瓜炭疽病[Colletocrichum lagenarium]的危害越來越嚴重，它具有分布廣泛，發(fā)生普遍的特點，特別是保護地，炭疽病已成為黃瓜的重要病害。除為害黃瓜外，還為害西瓜、冬瓜、甜瓜、苦瓜等。此病全生育期都可發(fā)生。主要為害葉片，也可為害葉柄、莖蔓和瓜果。苗期發(fā)病，子葉邊緣出現(xiàn)圓形或半圓形紅褐至黑褐色病斑，邊緣常有一淺綠色至黃褐色暈環(huán)，其上產生淡紅色粘稠物，后期產生黑色小點，即病菌分生孢子盤和分生孢子。成株期發(fā)病，葉片上出現(xiàn)水浸狀小點，逐漸擴展成圓形或近圓形紅褐色病斑，上面長許多小黑點，病斑邊緣有時有黃色暈圈，濕度大時病斑上長出少許桔紅色粘質物，干燥時病斑中部可出現(xiàn)星狀破裂。嫩莖染病，多從近地表莖基開始，病部黑褐色，收縮變細，致幼苗猝倒。葉柄或莖蔓染病，初為水漬狀淡黃色、近圓彤斑點，稍凹陷，后變黑色，病斑環(huán)繞莖蔓一周全株枯死。葉片染病，初為圓形至不規(guī)則形水漬狀斑，有時有輪紋。干燥時病斑易破裂穿孔；空氣潮濕，病斑表面生出粉紅色粘稠物，瓜條上病斑圓開形、褐色，稍凹陷，中部開裂，在病部產生粉紅色粘稠物。
長期以來，對黃瓜炭疽病的防治主要采用化學藥劑噴灑來進行，但常規(guī)的化學防治常常造成化學藥物的過量使用和產品表面的農藥殘留，在保護生態(tài)環(huán)境和倡導綠色食品的今天，化學防治炭疽病受到了一定的限制。傳統(tǒng)的育種方法主要是通過雜交和多代自交，因此，抗病材料的選擇和田間鑒定過程復雜，周期較長，而且精確性差，育種效率低。常規(guī)抗病品種的選育造成人力、財力和地力使用上的浪費。應用抗病品種防治植物病害，是一條經(jīng)濟、安全、有效的途徑。近二十年來，黃瓜新品種選育工作發(fā)展迅速，成績卓著，育成了一大批抗病，高產，優(yōu)質的黃瓜新品種。但傳統(tǒng)的育種方法往往以對表現(xiàn)型而非基因型的選擇為依據(jù)，要求育種工作者有豐富的育種實踐經(jīng)驗，并且育種周期長。
近年來，分子標記輔助育種發(fā)展很快，在許多作物中已定位了很多重要性狀的基因。天津科潤黃瓜研究所已經(jīng)相繼找到與黃瓜白粉病、炭疽病和黑星病抗性相關基因緊密連鎖的分子標記，并申請國家發(fā)明專利。但與黃瓜炭疽病抗性相關基因緊密連鎖的分子標記目前尚未見報道。在利用分子標記進行抗性鑒定的過程中，特異性的引物序列是關鍵。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列；本發(fā)明的另一個目的是提供一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法；本發(fā)明的第三個目的是提供另一種用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列；本發(fā)明的最后一個目的是提供另一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法。
本發(fā)明的技術方案概述如下一種用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列，它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列。
一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，55～60℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
第二種用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列，是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQID No4所述的核苷酸序列。
第二種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ IDNo4所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，56～60℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。有益效果本發(fā)明鑒定結果與田間抗病吻合率達97.27％，而且該方法具有簡單、快速、高效，提高育種效率，縮短育種周期等優(yōu)點，在黃瓜炭疽病抗性篩選上具有很大的應用價值。
圖1為第一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的擴增產物的電泳圖；圖2為第二種鑒定黃瓜炭疽病抗性的擴增產物的電泳圖。
具體實施例方式
下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，下面的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA20ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.0單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性200秒，94℃變性60秒，55℃退火50秒，72℃延伸90秒，30個循環(huán)，再72℃延伸350秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
由于抗病單株、感病單株或中間類型單株經(jīng)擴增以后產生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離時其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相對位置就可對黃瓜炭疽病材料的抗性進行快速鑒定。如圖1所示1為指示DNA標準條帶的分子量200bp；2為抗性帶，3為感性帶，P1為抗病母本，P2為感病父本，1～5為抗病單株；6～10為感病單株，M為DNA標準，純合抗性株僅有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型同時具有抗性帶和感性帶。
實施例2一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性300秒，94℃變性60秒，59℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個循環(huán)，再72℃延伸420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
實施例3一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQID No2所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180秒，94℃變性60秒，60℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個循環(huán)，再72℃延伸300秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
實施例4第二種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA20ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列30ng、序列表中SEQID No4所述的核苷酸序列30ng、dNTP0.2mM、Mg2+1.5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.0單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性200秒，94℃變性60秒，58℃退火50秒，72℃延伸90秒，30個循環(huán)，再72℃延伸350秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
由于抗病單株、感病單株或中間類型單株經(jīng)擴增以后產生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離時其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相對位置就可對黃瓜炭疽病材料的抗性進行快速鑒定。如圖2所示1為指示DNA標準條帶的分子量200bp；2為抗性帶，3為感性帶，P1為抗病母本，P2為感病父本，1～9為抗病單株；10～18為感病單株，19～27為中間類型單株，M為DNA標準，純合抗性株僅有抗性帶，純合感性株僅有感性帶，雜合類型同時具有抗性帶和感性帶。
實施例5第二種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA30ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列40ng、序列表中SEQID No4所述的核苷酸序列40ng、dNTP0.25mM、Mg2+2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性300秒，94℃變性60秒，56℃退火60秒，72℃延伸120秒，35個循環(huán)，再72℃延伸420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
實施例6第二種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20ng、序列表中SEQID No4所述的核苷酸序列20ng、dNTP0.15mM、Mg2+1.2mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180秒，94(℃變性60秒，60℃退火40秒，72℃延伸60秒，25個循環(huán)，再72℃延伸300秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
序列表SEQ ID No1
<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mutation<222>(1)…(21)<400>
cgtttacttc tctcccattt c 21SEQ ID No2<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mutation<222>(1)…(19)<400>
ggttagtgag acgaaggga19SEQ ID No3<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mutation
<222>(1)…(21)<400>
cgtttacttc tctcccattt c 21SEQ ID No4<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mutation<222>(1)…(18)<400>
ttgagcggag atggagac 18
權利要求
1.一種用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ IDNo2所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，55～60℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
3.一種用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，所述上游引物具有序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列，所述下游引物具有序列表中SEQ ID No4所述的核苷酸序列。
4.一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法，它包括如下步驟(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)進行PCR擴增，在PCR擴增專用薄壁管中放入所述黃瓜基因組DNA15～30ng、序列表中SEQ ID No3所述的核苷酸序列20～40ng、序列表中SEQ IDNo4所述的核苷酸序列20～40ng、dNTP0.15～0.25mM、Mg2+1.2～2.0mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶0.8～1.2單位，加無菌重蒸餾水至20μl，將所述PCR擴增專用薄壁管放入PCR儀中擴增，擴增條件為94℃預變性180～300秒，94℃變性60秒，56～60℃退火40～60秒，72℃延伸60～120秒，25～35個循環(huán)，再72℃延伸300～420秒，擴增完成；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析將擴增產物采用5％變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95℃變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，100W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于鑒定黃瓜炭疽病抗性的引物序列及其鑒定方法，引物序列由具有SEQ ID No1所述序列和具有SEQ ID No2所述序列組成；一種鑒定黃瓜炭疽病抗性的方法，它的步驟是(1)提取黃瓜基因組DNA；(2)用序列表中SEQ ID No1所述的核苷酸序列及序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列進行PCR擴增；(3)PCR擴增產物的凝膠電泳分析；(4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜炭疽病的抗性，本發(fā)明鑒定結果與田間抗病吻合率達97.27％，而且該方法具有簡單、快速、高效，提高育種效率，縮短育種周期等優(yōu)點，在黃瓜炭疽病抗性篩選上具有很大的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1858248SQ20061001335
公開日2006年11月8日 申請日期2006年3月22日 優(yōu)先權日2006年3月22日
發(fā)明者李淑菊, 王惠哲, 霍振榮, 管煒, 張桂華, 孫玉河 申請人:天津科潤農業(yè)科技股份有限公司