專利名稱：裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物花粉的離體培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基，特別是涉及一種裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
花粉萌發(fā)是花粉吸水后，體積增大，內(nèi)部膨壓增加，使花粉內(nèi)壁沿萌發(fā)孔處向外突出，形成花粉管的過程。啟動花粉萌發(fā)是一個較復雜的過程，其萌發(fā)的基本條件需要有糖源、硼酸及礦質(zhì)元素(如外源Ca)的參與。目前，已經(jīng)成功離體培養(yǎng)了多種被子植物的花粉，如百合和煙草花粉的離體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當成熟，而對于裸子植物花粉離體培養(yǎng)的研究較少、技術(shù)較落后。
與被子植物花粉相比，裸子植物花粉在進化上具有較原始的特性，花粉萌發(fā)時間較長，花粉管生長緩慢(如松屬植物花粉管生長速度小于1μm/h)，花粉管內(nèi)細胞器的區(qū)域化不明顯，細胞質(zhì)和細胞器呈典型的布朗運動，花粉管細胞壁纖維素含量比較高，其初生壁在整個生長過程中都比較完整，沒有次生壁和胼胝質(zhì)襯層的形成，且無胼胝質(zhì)塞存在。因此，裸子植物花粉的生長模式被認為是與被子植物不同的獨立的一種模式，有待進一步深入研究。
花粉萌發(fā)后形成花粉管，花粉管的極性頂端生長是將雄配子體運輸?shù)阶臃康倪^程，在高等植物的有性生殖過程中起到重要作用，其生長過程涉及一系列的反應(yīng)，通常被作為理想的研究細胞極性生長和細胞信號傳導的模式體系。而花粉能否正常萌發(fā)和花粉管能否正常生長是進行上述各項研究工作的重要前提，但是迄今為止還沒有離體培養(yǎng)裸子植物花粉的有效方法和技術(shù)，從而導致與裸子植物相關(guān)的生物學研究相對于被子植物而言比較滯后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是一種簡便、高效的裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的用于裸子植物花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其配方為蔗糖120-150g，硼酸0.1-0.2g，氯化鈣0.1-0.3g，用水定容至1000mL。
所述用于配制培養(yǎng)基的水優(yōu)選為雙蒸水，蔗糖、硼酸和氯化鈣可選用市售商品。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法，是將裸子植物花粉在室溫下水合20-30分鐘后，置于上述專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-72小時，花粉萌發(fā)，得到直徑均勻、形態(tài)正常的花粉管。
為了獲得更好的培養(yǎng)效果，所述培養(yǎng)環(huán)境是避光的。
所述花粉粒與培養(yǎng)基的質(zhì)量份數(shù)比可為1∶8-10。
所述培養(yǎng)溫度可為23-27℃。
所述對白皮松花粉的培養(yǎng)時間優(yōu)選為70-72小時，其它裸子植物花粉的培養(yǎng)時間優(yōu)選為16-18小時。
為了加快裸子植物花粉的萌發(fā)速率，可將加入花粉的培養(yǎng)液置于轉(zhuǎn)速為100-120rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)。
培養(yǎng)結(jié)束后，可通過離心法收集花粉管；所述離心的轉(zhuǎn)速可為500-1000rpm。
此外，可將收集的花粉管用質(zhì)量百分濃度為12-15％的蔗糖溶液清洗2-3次，去除雜質(zhì)。
本發(fā)明的方法對所用裸子植物花粉均適用，尤其適用于松杉綱植物的花粉，特別是白皮松、青杄、紅松、油松、白杄等松科植物的花粉。
本發(fā)明提供了一種裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的蔗糖是花粉粒萌發(fā)及花粉管壁合成的主要營養(yǎng)物質(zhì)，并用于維持溶液的滲透壓；硼酸可增加糖的吸收、運轉(zhuǎn)和代謝，形成糖硼酸復合體，增加氧的吸收，并促進構(gòu)成花粉管膜的成分果膠物質(zhì)的合成，從而控制細胞壁的構(gòu)建，此外，硼酸還可作為Ca2+誘導劑引導胞外Ca2+進入細胞內(nèi)，形成花粉管頂端生長依賴的Ca2+梯度，三種培養(yǎng)基組分相互影響，協(xié)調(diào)作用，為花粉的萌發(fā)和生長提供必需的環(huán)境條件。用本發(fā)明的方法進行裸子植物花粉的離體培養(yǎng)，不僅快速、簡單易行，而且培養(yǎng)效果好，可獲得大量具有生活力的裸子植物花粉管，具有較大的實際應(yīng)用價值。
下面結(jié)果具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為離體培養(yǎng)的青杄花粉在明場顯微鏡下的觀察結(jié)果圖2為離體培養(yǎng)的白杄花粉在明場顯微鏡下的觀察結(jié)果圖3為離體培養(yǎng)的白皮松花粉在明場顯微鏡下的觀察結(jié)果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
實施例1、青杄和白杄花粉的離體培養(yǎng)一、配制培養(yǎng)基取蔗糖120g，硼酸(H3BO3)0.2g和氯化鈣(CaCl2)0.3g，用水定容至1000mL，得到裸子植物花粉的離體培養(yǎng)基。
二、青杄和白杄花粉的離體培養(yǎng)用本發(fā)明的方法對青杄和白杄花粉進行離體培養(yǎng)，包括以下步驟1)將成熟的青杄和白杄的花粉粒室溫下進行干燥后，-20℃保存?zhèn)溆茫?)取步驟1)的花粉粒5mg，在室溫下水合30分鐘后，置于步驟一制備的5mL培養(yǎng)基中，在25℃、120rpm下振蕩培養(yǎng)18小時；3)1000rpm離心，收集沉淀，棄上清，用12％蔗糖溶液和離心的方法清洗沉淀2次，得到青桿和白杄的花粉管。
將收集的青杄和白杄的花粉管轉(zhuǎn)移到載玻片上，用甘油封片后置于明場顯微鏡下進行鏡檢，離體培養(yǎng)的青杄和白杄的花粉在明場顯微鏡下的觀察結(jié)果分別如圖1和圖2所示(標尺＝20μm)，經(jīng)統(tǒng)計，花粉的萌發(fā)率高達70％，其中有生活力的花粉管占90％以上，表明用本發(fā)明的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法可有效地對青杄和白杄的花粉進行離體培養(yǎng)。
實施例2、白皮松花粉的離體培養(yǎng)一、配制培養(yǎng)基取蔗糖150g，硼酸0.1g和氯化鈣0.1g，用水定容至1000mL，得到裸子植物花粉的離體培養(yǎng)基。
二、白皮松花粉的離體培養(yǎng)用本發(fā)明的方法對白皮松花粉進行離體培養(yǎng)，包括以下步驟1)將成熟的白皮松花粉粒室溫下進行干燥后，-20℃保存?zhèn)溆茫?)取步驟1)的花粉粒5mg，在室溫下水合20分鐘后，置于步驟一制備的4mL培養(yǎng)基中，在27℃、100rpm的避光條件下振蕩培養(yǎng)72小時；3)500rpm離心，收集沉淀，棄上清，用15％蔗糖溶液和離心的方法清洗沉淀3次，得到白皮松的花粉管。
將收集的白皮松的花粉管轉(zhuǎn)移到載玻片上，用甘油封片后置于明場顯微鏡下進行鏡檢，離體培養(yǎng)的白皮松的花粉在明場顯微鏡下的觀察結(jié)果分別如圖3所示(標尺＝20μm)，經(jīng)統(tǒng)計，花粉的萌發(fā)率高達90％，其中有生活力的花粉管占90％以上，表明用本發(fā)明的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法可有效地對白皮松的花粉進行離體培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.用于裸子植物花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其配方為蔗糖120-150g，硼酸0.1-0.2g，氯化鈣0.1-0.3g，用水定容至1000mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述用于配制培養(yǎng)基的水為雙蒸水。
3.一種裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法，是將裸子植物花粉在室溫下水合20-30分鐘后，置于權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-72小時，花粉萌發(fā)，得到花粉管。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)環(huán)境是避光的。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述花粉粒與培養(yǎng)基的質(zhì)量份數(shù)比為1∶8-10。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為23-27℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述白皮松花粉的培養(yǎng)時間為70-72小時，其它裸子植物花粉的培養(yǎng)時間為16-18小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述花粉是在振蕩條件下培養(yǎng)的，振速為100-120rpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)結(jié)束后，用離心的方法收集花粉管，再將收集的花粉管用質(zhì)量百分濃度為12-15％的蔗糖溶液清洗2-3次；所述離心的轉(zhuǎn)速為500-1000rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述裸子植物為松杉綱植物；所述松杉綱植物為松科的白皮松、青桿、紅松、油松或白桿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種裸子植物花粉的離體培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基配方為蔗糖120－150g，硼酸0.1－0.2g，氯化鈣0.1－0.3g，用水定容至1000ml。培養(yǎng)方法是將裸子植物花粉在室溫下水合20－30分鐘后，置于所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)16－72小時，花粉萌發(fā)，得到花粉管。本發(fā)明的培養(yǎng)基為花粉的萌發(fā)和生長提供必需的環(huán)境條件。用本發(fā)明的方法進行裸子植物花粉的離體培養(yǎng)，不僅快速、簡單易行，而且培養(yǎng)效果好，可獲得大量具有生活力的裸子植物花粉管，具有較大的實際應(yīng)用價值。
文檔編號C12N3/00GK1869203SQ20061001208
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月1日
發(fā)明者林金星, 田翠婷, 呂洪飛 申請人:中國科學院植物研究所