專利名稱：根部?jī)?yōu)先的可被創(chuàng)傷和昆蟲誘導(dǎo)的2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
專利說明根部?jī)?yōu)先的可被創(chuàng)傷和昆蟲誘導(dǎo)的2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶啟動(dòng)子及其應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及到植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體的涉及到植物的基因表達(dá)調(diào)控。

背景技術(shù)：
植物基因工程領(lǐng)域中的新進(jìn)展已經(jīng)可以對(duì)植物進(jìn)行工程改造，使之具有改善的特征或性狀，例如疾病抗性、昆蟲抗性、除草劑抗性，植物來源最終消費(fèi)品穩(wěn)定性或保質(zhì)期的提高，以及植物可食部位營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的改善。因此可將非植物來源的一個(gè)或多個(gè)具有不同或改善特性的所需基因，導(dǎo)入到植物基因組中。新基因即可在植物細(xì)胞中表達(dá)并表現(xiàn)出所需表型，例如新性狀或特征。
為了在植物細(xì)胞中表達(dá)新插入的基因，必須在正確的部位存在基因的正確調(diào)控信號(hào)。這些調(diào)節(jié)信號(hào)可包括但不僅限于啟動(dòng)子區(qū)域、5’非翻譯前導(dǎo)序列和3’轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸化序列(poly(A))。
啟動(dòng)子是一段DNA序列，它在植物細(xì)胞中指揮從其本身相鄰的下游(3’)編碼序列產(chǎn)生RNA。啟動(dòng)子區(qū)域影響基因的RNA轉(zhuǎn)錄的速率、發(fā)展階段和所屬的細(xì)胞類型。RNA轉(zhuǎn)錄物被加工產(chǎn)生信使RNA(mRNA)，它作為翻譯模板將RNA序列翻譯成所編碼的多肽序列。5’非翻譯前導(dǎo)序列是mRNA蛋白編碼區(qū)上游的區(qū)域，它可能在mRNA的起始和翻譯過程中發(fā)揮作用。3’轉(zhuǎn)錄終止/多聚腺苷酸信號(hào)是蛋白編碼區(qū)的下游區(qū)域，在植物細(xì)胞中它引起RNA轉(zhuǎn)錄的停止和RNA3’末端poly(A)的添加。
外源DNA序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)依賴于操作性連接的啟動(dòng)子的存在，在植物宿主中發(fā)揮作用。根據(jù)要在生物體中何時(shí)何地表達(dá)所需的外源DNA，來選擇啟動(dòng)子序列的類型。當(dāng)需要在特定組織或器官中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，可以選用組織優(yōu)先(tissue-preferred)啟動(dòng)子。當(dāng)需要進(jìn)行刺激物響應(yīng)的表達(dá)時(shí)，選用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子作為調(diào)控元件。相反，當(dāng)需要在整個(gè)植物體細(xì)胞中進(jìn)行持續(xù)表達(dá)，則用組成性啟動(dòng)子。
誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在響應(yīng)誘導(dǎo)物時(shí)，能夠直接或間接活化一個(gè)或多個(gè)DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)誘導(dǎo)物不存在時(shí)，該DNA序列或基因則不被轉(zhuǎn)錄，或者轉(zhuǎn)錄水平比誘導(dǎo)狀態(tài)下的低。這種誘導(dǎo)物可以是化學(xué)試劑，例如代謝物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物、除草劑或酚類化合物，也可以是直接作用于植物體的物理效應(yīng)，例如低溫、干旱、高溫、鹽、毒素。如要抵御植物害蟲時(shí)，也需要可被植物病原體誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，包括植物昆蟲害蟲、線蟲或致病因子如細(xì)菌、病毒或真菌。與病原體的接觸會(huì)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的活化，從而一次產(chǎn)生有效保護(hù)植物的抗病原蛋白。病原誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也可用于檢測(cè)與病原的接觸，例如通過表達(dá)可檢測(cè)性標(biāo)記從而評(píng)價(jià)對(duì)殺蟲劑的使用需求?？赏ㄟ^在細(xì)胞或植物體外使用誘導(dǎo)物處理含有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的植物細(xì)胞，如通過噴霧、灌溉、加熱，或暴露于有效病原。
組成型啟動(dòng)子是遍及植物體不同部分以及貫穿植物體發(fā)育的持續(xù)指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。廣泛用于誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因表達(dá)的組成型啟動(dòng)子包括如，來自根瘤病土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)G藍(lán)曙紅合酶(NOS)基因啟動(dòng)子(美國(guó)專利5,034,322)、花椰菜鑲嵌病毒(CaMv)35S和19S啟動(dòng)子(美國(guó)專利5,352,605)，起源于任意幾種肌動(dòng)蛋白基因(已知它們?cè)诖蠖鄶?shù)類型的細(xì)胞中都有表達(dá))的啟動(dòng)子(美國(guó)專利6,002,068)以及泛素啟動(dòng)子(已知其是在許多細(xì)胞中累積的基因產(chǎn)物)。
核心啟動(dòng)子序列的上游和/或下游的額外調(diào)控序列可包括于轉(zhuǎn)化載體的表達(dá)構(gòu)建體中，從而在轉(zhuǎn)基因植物中引起外源基因不同水平的表達(dá)。因此，通過基因工程技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行遺傳改造以得到具備有用特性的植物的這一過程需要多種啟動(dòng)子。
為了轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)商業(yè)應(yīng)用的最大化，以位點(diǎn)特異性方式指導(dǎo)引入的基因進(jìn)行表達(dá)可能是有益的。例如在遭受病原攻擊的組織中產(chǎn)生毒素抵抗化合物，而在將被收割并被消費(fèi)者食用的組織中則不產(chǎn)生該物質(zhì)，這種方式可能是有效的。通過進(jìn)行位點(diǎn)特異性合成或儲(chǔ)存所需蛋白或化合物，可將植物用作工廠或生產(chǎn)系統(tǒng)來產(chǎn)生多種具有商業(yè)價(jià)值的化合物。細(xì)胞特異性啟動(dòng)子為高度分化的組織或器官如根、葉、脈管、胚芽、種子或花，提供對(duì)空間和時(shí)間上的化合物合成進(jìn)行指導(dǎo)的能力。
或者在植物組織中抑制天然DNA序列的表達(dá)，這可能對(duì)產(chǎn)生所需表型也是有效的。通過轉(zhuǎn)化植株使其包含操作性連接于反義核苷酸序列的組織優(yōu)先啟動(dòng)子，從而表達(dá)反義序列以產(chǎn)生干擾天然DNA的mRNA的翻譯的RNA轉(zhuǎn)錄物，最終達(dá)到抑制效果。
特別令人關(guān)注的啟動(dòng)子是由“昆蟲侵食”這一因素所誘導(dǎo)的。昆蟲是世界糧食損失的主要因素。僅由玉米根蟲所引起的糧食損失即已經(jīng)達(dá)到每年10億美元。在世界上的許多地區(qū)西方玉米根蟲(又稱為西方玉米根葉甲(western com rootworm))(WCRW)是主要的玉米害蟲。雖然不如WCRW那樣重要，但南方玉米根蟲(又稱為南方玉米根葉甲)和北方玉米根蟲(又稱為北方玉米根葉甲)也造成了相當(dāng)大的玉米損失。玉米根蟲造成的損害可能會(huì)引起倒伏(lodging)增加、干旱抗性下降，并最終造成玉米減產(chǎn)。另一種主要昆蟲是玉米螟(Ostrinia nubilalis)，通常稱作玉米鉆心蟲(European corn borer(ECB))。
因?yàn)槭褂脝?dòng)子來控制導(dǎo)入的嵌合基因的表達(dá)模式，所以對(duì)分離并鑒定可控制嵌合基因表達(dá)的新型啟動(dòng)子的需求在不斷增強(qiáng)。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了在植物體中調(diào)控基因表達(dá)的組合物和方法。組合物含有新型誘導(dǎo)型啟動(dòng)子核苷酸序列，它可在受到創(chuàng)傷或被昆蟲侵食時(shí)起始轉(zhuǎn)錄。更具體來說，提供了分離自玉米的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。本發(fā)明另外的實(shí)施方案中包含有SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列，SEQ ID NO1中所列核苷酸序列的片段以及植物啟動(dòng)子(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)在2004年11月3日以細(xì)菌宿主方式保藏，專利保藏號(hào)PTA-6278)。本發(fā)明的實(shí)施方案還包含與SEQ ID NO1中所列核苷酸序列至少具有95％同一性的核苷酸序列，它可在創(chuàng)傷和昆蟲誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)操作性連接的核苷酸序列的表達(dá)。也包含了SEQID NO1中所列核苷酸序列的功能片段，它可在創(chuàng)傷和昆蟲誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)操作性連接的核苷酸序列的表達(dá)。
本發(fā)明的實(shí)施方案中也包括DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體含有操作性連接于異源核苷酸序列上的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子含有本文公開的序列，并可在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)上述核苷酸序列進(jìn)行表達(dá)。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供了表達(dá)載體，以及在基因組中穩(wěn)定包含上述DNA構(gòu)建體的植物或植物細(xì)胞。另外組合物也包括這種植物的轉(zhuǎn)基因種子。
方法實(shí)施方案中包括在植物中選擇性表達(dá)核苷酸序列的方法，這包括使用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞并從該細(xì)胞出發(fā)再生植物體，所述DNA構(gòu)建體包含啟動(dòng)子和操作性連接于其上的異源核苷酸序列，而所述啟動(dòng)子在受到創(chuàng)傷和昆蟲誘導(dǎo)時(shí)在植物細(xì)胞中起始所述異源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。以這種方式，啟動(dòng)子序列可在誘導(dǎo)方式下發(fā)揮控制操作性連接的編碼序列表達(dá)的作用。
位于啟動(dòng)子下游并處于該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控下的序列可以是目的序列，它將對(duì)植物表型進(jìn)行修飾。這種修飾包括調(diào)節(jié)內(nèi)源產(chǎn)物的生產(chǎn)(如生產(chǎn)量、相對(duì)分布等)或者是外源表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)，以得到具有新功能或新產(chǎn)物的植株。例如異源核苷酸序列所編碼的基因產(chǎn)物提供了對(duì)除草劑、鹽、低溫、干旱、病原或昆蟲的抗性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，步驟包括(a)使用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植株，該構(gòu)建體包含上述啟動(dòng)子和操作性連接于其上的至少一個(gè)核苷酸序列；(b)在植株生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞；(c)從該植物細(xì)胞出發(fā)再生一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株，其中所述核苷酸序列的表達(dá)改變了該植株的表型。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為來自V5階段玉米根部組織(被西方玉米根蟲侵食或未被侵食)中2-酮戊二酸(2-oxoglutarate)依賴型加氧酶表達(dá)的northern印跡分析結(jié)果。這兩種情況下的葉中都沒有檢測(cè)到該酶的表達(dá)。移植指將植株轉(zhuǎn)移到新鮮土壤中。由該過程引起的根部損傷不誘導(dǎo)過氧化酶的表達(dá)。因此，該圖說明了根部表達(dá)的模式和CRW的可誘導(dǎo)性，這與Lynx MPSS數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)相同。實(shí)施例2中更詳細(xì)的描述了該圖中的印跡實(shí)驗(yàn)。
圖2中的northem印跡分析結(jié)果顯示了根部組織遭受損傷后，2-酮戊二酸依賴型加氧酶表達(dá)的時(shí)間過程。在該實(shí)驗(yàn)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒有檢測(cè)到葉組織中該酶的表達(dá)。因此，該圖說明了根部表達(dá)的模式和CRW的可誘導(dǎo)性，這與Lynx MPSS數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)相同。實(shí)施例2中更詳細(xì)的描述了該圖中的印跡實(shí)驗(yàn)。
圖3為玉米的2-酮戊二酸依賴型加氧酶啟動(dòng)子序列，標(biāo)出了TATA盒、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)(根據(jù)5’RACE作圖得到)和啟動(dòng)子序列中的其它目的基序的位置。實(shí)施例4中提供了更多細(xì)節(jié)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的實(shí)施方案包含新型植物啟動(dòng)子核苷酸序列，具體來說是可被創(chuàng)傷和昆蟲誘導(dǎo)的2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶基因啟動(dòng)子(下文中稱作2OD加氧酶基因)，更具體來說，該2-酮戊二酸依賴型加氧酶基因啟動(dòng)子在下文中被稱作2OD加氧酶啟動(dòng)子。實(shí)施方案提供了分離的核酸分子，其中包含SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列和植物啟動(dòng)子序列(該啟動(dòng)子儲(chǔ)存于細(xì)菌宿主中，專利號(hào)為PTA-6278(2004年11月3日))，以及該序列的片段、變異體和互補(bǔ)序列。
含有所述植物啟動(dòng)子核苷酸序列的質(zhì)粒被美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心專利保藏部(Patent Depository)(位于10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209)所保藏(2004年11月3日)，指定的專利保藏號(hào)為PTA-6278。該保藏物將按照國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定得以維持。該保藏物僅為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供便利，而不是承認(rèn)該保藏物是35 USC§112條款所要求的。該保藏物不能撤回，并且在不存在限制或條件的情況下，專利一經(jīng)授權(quán)公眾即可取得。但是并不能認(rèn)為允許使用該保藏物就意味著可損害政府賦予的專利權(quán)利而實(shí)施本發(fā)明。
實(shí)施方案中的啟動(dòng)子序列對(duì)按照可誘導(dǎo)方式表達(dá)操作性連接于其上的核苷酸序列來說是有用的，尤其是按照昆蟲侵食或創(chuàng)傷誘導(dǎo)方式進(jìn)行表達(dá)時(shí)，更是如此。這些序列也可用于構(gòu)建表達(dá)載體以隨后轉(zhuǎn)化到目的植物體中，用作探針以分離其它2OD加氧酶基因啟動(dòng)子，用作分子標(biāo)記等。
從玉米基因組DNA中分離出實(shí)施方案中的玉米2OD加氧酶基因啟動(dòng)子。在本文實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)部分描述了得到2OD加氧酶基因啟動(dòng)子的特異方法。
實(shí)施方案中包括了分離或基本純化的的核酸組合物?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子或其生物活性部分，基本不含其它細(xì)胞成分，或者基本不含培養(yǎng)基(當(dāng)使用重組技術(shù)制備時(shí))，或基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品(當(dāng)進(jìn)行化學(xué)合成時(shí))?！胺蛛x的”核酸基本不含該核酸來源于的生物體基因組DNA中天然存在于該核酸側(cè)翼的核苷酸序列(即位于所述核酸3’或5’末端的核苷酸序列)。例如在不同實(shí)施方案中，分離的核酸分子可包含該核酸來源于的生物體基因組DNA中天然存在于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列，而其長(zhǎng)度小于約5kb、4kb、3kh、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb。
Lynx大規(guī)模平行特征測(cè)序系統(tǒng)(Massively Parallel SignatureSequencing(MPSS))說明，該玉米2OD加氧酶基因在受到玉米根食蟲侵食或機(jī)械損傷時(shí)，優(yōu)先在玉米根部組織中表達(dá)，將在實(shí)施例1中進(jìn)一步討論。2OD加氧酶參與使用O的氧化反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)它存在于許多初級(jí)和次級(jí)代謝物生物合成途徑中。另一個(gè)緊密相關(guān)的2OD加氧酶基因的產(chǎn)物與上文所述基因的預(yù)測(cè)產(chǎn)物有81％的氨基酸同一性，該2OD加氧酶參與DIMBOA的生物合成。DIMBOA，一種苯并噁嗪類化合物(benzoxazinoid)，是一種天然殺蟲劑，并且是影響宿主植物對(duì)微生物疾病和昆蟲抗性的重要因子，同時(shí)也是一種穩(wěn)變異構(gòu)化合物(allelochemicals)。
2OD加氧酶啟動(dòng)子序列以可誘導(dǎo)的方式指導(dǎo)操作性連接于其上的核苷酸序列的表達(dá)。因此，20D加氧酶啟動(dòng)子序列可用于以可誘導(dǎo)方式表達(dá)操作性連接于其上的目的核苷酸序列。具體的，實(shí)施方案的啟動(dòng)子在損傷或昆蟲侵食后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
實(shí)施方案的組合物包括分離的核酸分子，這其中包含了SEQ IDNO1中所列的啟動(dòng)子序列?！皢?dòng)子”一詞指DNA調(diào)控序列，其中通常含有一個(gè)TATA盒，該序列能夠指導(dǎo)RNA聚合酶II在合適的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上起始特定編碼序列的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子也可另外含有其他識(shí)別序列，它們通常位于TATA盒的上游或5’端，被稱作上游啟動(dòng)子元件，這些元件能夠影響轉(zhuǎn)錄速率。應(yīng)認(rèn)識(shí)到當(dāng)鑒別了本文所公開的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列后，分離并鑒別位于本文所鑒別的特定啟動(dòng)子區(qū)域上游的5’非翻譯區(qū)內(nèi)的其它調(diào)控元件就屬于現(xiàn)有技術(shù)范圍了。因此，本文公開的啟動(dòng)子區(qū)域可另外包含上游調(diào)控元件，如那些負(fù)責(zé)編碼序列組織特異性和時(shí)間特異性表達(dá)的元件，增強(qiáng)子等。具體見澳大利亞專利(Australian Patent)AU-A-77751/94和美國(guó)專利5,466,785以及5,635,618。同樣的，能夠進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子元件也可與其它核心啟動(dòng)子一起被鑒別、分離和使用，以進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。這些實(shí)施方案中所指的核心啟動(dòng)子指沒有啟動(dòng)子元件的啟動(dòng)子。
本文中的“調(diào)控元件”也指通常(但不總是)位于結(jié)構(gòu)基因編碼序列上游(5’)的DNA序列，這包括通過提供RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)以在特定位置開始轉(zhuǎn)錄的序列。通過提供RNA聚合酶或其它轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)以確保從特定位置起始轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件的一個(gè)例子是啟動(dòng)子元件。啟動(dòng)子元件包括核心啟動(dòng)子元件，它負(fù)責(zé)起始轉(zhuǎn)錄，以及其它調(diào)控元件(如本文其它地方所公開的)，它們負(fù)責(zé)修飾基因表達(dá)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到內(nèi)含子內(nèi)的核苷酸序列或編碼區(qū)域3’端的序列也可能參與了目的編碼區(qū)域的表達(dá)調(diào)控。合適的內(nèi)含子包括(但不僅限于)玉米IVS6內(nèi)含子或玉米肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子。調(diào)控元件也可包含那些位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游(3’)的元件，或者位于被轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的元件，或者同時(shí)包含兩者。本文中的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件可包括哪些在轉(zhuǎn)錄起始后發(fā)揮作用的元件，如翻譯和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、翻譯和轉(zhuǎn)錄抑制子，以及mRNA穩(wěn)定性決定子。
實(shí)施方案中的調(diào)控元件或其片段可以與異源調(diào)控元件或啟動(dòng)子操作性連接，以調(diào)節(jié)異源調(diào)控元件的活性。這種調(diào)節(jié)包括增強(qiáng)或抑制異源調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄活性、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后事件，或既增強(qiáng)(或抑制)異源調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄活性又調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后事件。例如，實(shí)施方案中的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控元件或其片段可以與組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動(dòng)子(或其片段)操作性連接，以在目的組織的植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)這些啟動(dòng)子的活性。
當(dāng)將玉米20D加氧酶啟動(dòng)子裝配進(jìn)DNA構(gòu)建體，從而操作性連接于目的核苷酸序列上，并用該DNA構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，該啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)所述核苷酸序列的表達(dá)?！安僮餍赃B接”指使得異源核苷酸序列處于啟動(dòng)子作用下的連接方式?！安僮餍赃B接”也指將兩個(gè)核苷酸序列連接起來從而使每個(gè)DNA片段的編碼序列都保持在適當(dāng)?shù)拈喿x框內(nèi)。在這種方式下，在DNA構(gòu)建體中同時(shí)提供實(shí)施方案的啟動(dòng)子核苷酸序列和目的核苷酸序列(通常為要在目的植物中進(jìn)行表達(dá)的異源核苷酸序列)?！爱愒春塑账嵝蛄小敝柑烊粻顟B(tài)下沒有與所述啟動(dòng)子序列操作性連接的序列。雖然該核苷酸序列與所述啟動(dòng)子序列來源不同，但它對(duì)植物宿主來說可能是同源的或天然的，或者是異源的或外源的。
應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到可以將實(shí)施方案的啟動(dòng)子序列與它們的天然編碼序列共同使用，以提高或降低表達(dá)，從而改變轉(zhuǎn)化植物體表型。
對(duì)實(shí)施方案中分離的啟動(dòng)子序列進(jìn)行修飾，可以將異源核苷酸序列的表達(dá)控制在某一個(gè)范圍內(nèi)。因此可將它們修飾為弱啟動(dòng)子或強(qiáng)啟動(dòng)子。一般的，“弱啟動(dòng)子”指驅(qū)動(dòng)編碼序列低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。“低水平”表達(dá)指表達(dá)水平在約1/10,000到約1/100,000到約1/500,000轉(zhuǎn)錄物。相反，強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼序列高水平表達(dá)，或者說表達(dá)水平在約1/10到約1/100到約1/1,000轉(zhuǎn)錄物。
本文所公開的啟動(dòng)子序列的片段、變異體也包含在實(shí)施方案中。“片段”指啟動(dòng)子序列的一部分。啟動(dòng)子序列的片段可保持生物活性，從而包含能夠驅(qū)動(dòng)操作性連接于其上的核苷酸序列進(jìn)行可誘導(dǎo)的表達(dá)的序列。因此例如，可以使用不完整的本文所公開的啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)操作性連接于其上的目的核苷酸序列進(jìn)行表達(dá)，例如編碼外源蛋白的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定這些片段是降低了表達(dá)水平還是改變了表達(dá)性質(zhì)(即組成型表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá))。啟動(dòng)子核苷酸序列的片段如果用作雜交探針(如下文所述)，也可以不保持其調(diào)控活性。因此這些片段的長(zhǎng)度范圍可以為至少約20核苷酸、約50核苷酸、約100核苷酸，直到為實(shí)施方案中的全長(zhǎng)核苷酸序列。
因此，20D加氧酶啟動(dòng)子核苷酸序列可以編碼20D加氧酶啟動(dòng)子的一個(gè)生物活性部分，或者是可用作雜交探針或PCR(使用下文所述方法)引物的片段。可分離20D加氧酶啟動(dòng)子的部分核苷酸序列并評(píng)價(jià)其活性，從而制備20D加氧酶啟動(dòng)子的生物活性部分。啟動(dòng)子核苷酸序列的片段即核酸分子可包含本文所公開啟動(dòng)子核苷酸序列中的至少15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000個(gè)核苷酸，或者為全長(zhǎng)序列，如SEQ ID NO1中所列序列的1116個(gè)核苷酸。
這些片段的核苷酸通?？砂囟▎?dòng)子序列的TATA識(shí)別序列。可使用限制性酶切開本文所公開的天然啟動(dòng)子核苷酸序列，或者從天然啟動(dòng)子DNA序列合成，或者使用PCR方法，制備這些片段。具體參見Mullis等.(1987)Methods Enzymol 155335-350，和Erlich，ed.(1989)PCR Technology(StocKton Press，New York)。這些啟動(dòng)子片段的變異體，如通過定點(diǎn)突變和DNA改組(shuffling)得到的變異體，也包含在實(shí)施方案的組合物中。
實(shí)施方案中的調(diào)控元件的“類似物”包括那些調(diào)控元件序列發(fā)生替換、刪除或添加后所得的并至少保持實(shí)施方案中與調(diào)控元件相聯(lián)系的一種調(diào)控特性的序列。這些調(diào)控特性包括定向器官特異性、組織特異性(或這兩者的組合)，或者時(shí)間特異性或生長(zhǎng)階段特異性(或這兩者的組合)。
“變異體”指與本文所公開啟動(dòng)子序列具有基本相似性的序列。核苷酸序列的天然變異體包括如可通過熟知分子生物學(xué)技術(shù)(如下文所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù))進(jìn)行鑒別的序列。變異核苷酸序列也包括人工合成所得核苷酸序列，如通過定點(diǎn)突變所得的序列。一般的，實(shí)施方案中特定核酸的變異體與該核苷酸序列至少具有約40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、到95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性(通過序列比對(duì)程序確定，使用默認(rèn)參數(shù)，在本文其它部分描述)。實(shí)施方案中也包括了生物活性變異體。生物活性變異體包括如，實(shí)施方案中的啟動(dòng)子序列發(fā)生了一個(gè)或多個(gè)核苷酸替換、刪除或插入的序列?？墒褂萌鏽orthern印跡分析或轉(zhuǎn)錄融合中報(bào)告物(reporter)的活性測(cè)定等方法來測(cè)量啟動(dòng)子活性。見如Sambrook等(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningALaboratory Manual)(2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)(通過引用并入本文)，下文中簡(jiǎn)稱為“Sambrook”?；蛘呖蓽y(cè)量處于啟動(dòng)子片段或變異體控制下的報(bào)告基因產(chǎn)物如綠色熒光蛋白(GFP)等的水平。見如美國(guó)專利6,072,050(通過引用并入本文)。
本領(lǐng)域中熟知突變和核苷酸序列改變方法。見如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)酶學(xué)方法(Methods in Enzymol.)154367-382；美國(guó)專利4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)分子生物學(xué)技術(shù)(Techniques in MolecularBiology)(MacMillan Publishing Company，New York)，以及本文引用的其它文獻(xiàn)。
啟動(dòng)子核苷酸序列變異體也包括通過突變或重組技術(shù)，如DNA改組，所得的產(chǎn)物。通過這些方法，可對(duì)一個(gè)或多個(gè)不同啟動(dòng)子序列進(jìn)行操作以得到保有所需特性的新啟動(dòng)子。以這種方式，可從包含有具備基本序列同一性并可在體內(nèi)或體外發(fā)生同源重組的序列區(qū)域的相關(guān)多核苷酸序列群體中產(chǎn)生重組多核苷酸文庫。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解這種DNA改組的方法。見如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751；Stemmer(1994)Nature 370389-391；Crameri等(1997)Nature Biotech.15436-438；Moore等(1997)J Mol Biol272336-347；Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944504-4509；Crameri等(1998)Nature 391288-291；美國(guó)專利5,605,793及5,837,458。
實(shí)施方案中的核苷酸序列可用于從其它生物體中分離相應(yīng)序列，如其它植物(如單子葉植物)。這樣就可根據(jù)這些相應(yīng)序列與本文所列序列間的序列同源性，使用如PCR、雜交等技術(shù)來鑒別這些相應(yīng)序列。因此，根據(jù)它們與本文所列的完整20D加氧酶啟動(dòng)子序列(或其片段)間的序列同一性而分離的相應(yīng)片段，也包括在實(shí)施方案中。實(shí)施方案的啟動(dòng)子區(qū)域可從任何植物中分離，包括(但不僅限于)玉米(Zea mays)、蕓苔屬(油菜(Brassica napu)、蕪菁(Brassica rapassp.))、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麥(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthusannuus)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甜馬鈴薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、橘樹(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa spp.)、鱷梨(Persea americana)、無花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄欖樹(Oleaeuropaea)、燕麥、大麥、紅花、蔬菜、觀賞植物和松類。
可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物通過PCR從任何目的植物體的cDNA或基因組DNA提取物中擴(kuò)增出相應(yīng)DNA序列。本領(lǐng)域中熟知PCR引物設(shè)計(jì)和PCR克隆方法，見上文文獻(xiàn)Sambrook。也見Innis等，eds.(1990)PCR實(shí)用手冊(cè)方法指導(dǎo)與應(yīng)用(PCR ProtocolsA Guide toMethods and APPlications)(Academic Press，New York)；Innis和Gelfand等(1995)PCR策略(PCR Strategies)(Academic Press，NewYork)；nnis和Gelfand等(1999)PCR方法手冊(cè)(PCR MethodsManual)(Academic Press，New York)。已知的PCR方法包括(但不僅限于)使用成對(duì)引物、嵌套引物、單特異性引物(single speciffcprimers)、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配方法等。
在雜交方法中，所用探針為完整或部分已知核苷酸序列，它們能夠選擇性與來自選定生物基因組DNA克隆片段或cDNA片段群體(即基因組DNA或cDNA文庫)中相應(yīng)核苷酸序列雜交。雜交探針可以是基因組DNA克隆片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且也可使用可檢測(cè)性標(biāo)記物，如32P等，進(jìn)行標(biāo)記。因此，可通過對(duì)根據(jù)20D加氧酶啟動(dòng)子序列合成所得的寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記，來制備雜交探針。本領(lǐng)域中熟知探針制備方法、cDNA和基因組DNA文庫構(gòu)建方法，見上文文獻(xiàn)Sambrook。
例如，可將本文公開的2OD加氧酶啟動(dòng)子序列或其一個(gè)或多個(gè)片段作為探針，它們能夠特異性結(jié)合到2OD加氧酶啟動(dòng)子序列的相應(yīng)區(qū)域上。為了在多種條件下進(jìn)行特異性雜交，這些探針包含2OD加氧酶啟動(dòng)子序列中的獨(dú)特序列，并且長(zhǎng)度至少約為10個(gè)核苷酸，包括長(zhǎng)度至少約為20個(gè)核苷酸的序列。可使用這些探針通過PCR從選定植物體中擴(kuò)增出2OD加氧酶啟動(dòng)子的相應(yīng)序列。該方法可用于從目的植物體中分離額外的編碼序列，或者用作診斷實(shí)驗(yàn)以確定植物體中編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括雜交篩選平板DNA文庫(plated DNA libraries)(噬斑或者菌落；見如上文文獻(xiàn)Sambrook)。
可以在嚴(yán)緊性條件下進(jìn)行這些序列的雜交?！皣?yán)緊性條件”或“嚴(yán)緊性雜交條件”定義如下在這種條件下探針與其靶序列間的雜交水平可檢測(cè)性的高于與其它序列的雜交水平(如至少是背景的2倍)。嚴(yán)緊性條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境中也不同。通過控制雜交嚴(yán)緊性和/或洗滌條件，可鑒別出與探針完全互補(bǔ)的序列(同源探查(homologous probing))?；蛘撸{(diào)節(jié)嚴(yán)緊性條件以允許一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)到相似性較低的序列(異源探查(heterologous probing))。探針長(zhǎng)度一般小于1000個(gè)核苷酸，包括那些長(zhǎng)小于500個(gè)核苷酸的序列。
典型嚴(yán)緊性條件為鹽濃度小于約1.5MNa離子，通常為0.01-1.0M(或其它鹽)；pH為7.0-8.3；當(dāng)使用短探針(如10-50個(gè)核苷酸)時(shí)溫度至少約為30℃，使用長(zhǎng)探針(如大于50個(gè)核苷酸)時(shí)溫度至少為60℃。也可通過添加去穩(wěn)定物質(zhì)如甲酰胺來得到嚴(yán)緊性條件。低嚴(yán)緊性條件的實(shí)例包括用含有30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的雜交緩沖液37℃雜交，用1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)在50-55℃進(jìn)行洗滌。示例性中嚴(yán)緊性條件包括用含有40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS雜交緩沖液在37℃雜交，用0.5X-1X SSC在55-60℃進(jìn)行洗滌。示例性高嚴(yán)緊性條件包括用含有50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的雜交緩沖液在37℃雜交，用0.1X SSC在60-65℃洗滌至少30min。雜交持續(xù)時(shí)間通常小于24h，一般約為4-12h。
特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)(function)，關(guān)鍵因子是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)DNA-DNA雜交體來說，熔點(diǎn)(Tm)溫度近似值可從以下公式得到(Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284)Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L，其中M是單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％GC是鳥嘌啉和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交緩沖液中甲酰胺的濃度，L是雜交堿基對(duì)的長(zhǎng)度。Tm是互補(bǔ)靶序列在規(guī)定離子強(qiáng)度和pH下與完全配對(duì)探針發(fā)生50％雜交的溫度。每1％的錯(cuò)配使Tm下降1℃；因此可調(diào)節(jié)Tm、雜交條件就和/或洗滌條件，使得具備所需同一性的序列發(fā)生雜交。例如，如果要尋找同一性≥90％的序列，可將Tm降低10℃。通常，將嚴(yán)緊性條件選定為在規(guī)定離子強(qiáng)度和pH下，低于特異性序列與其互補(bǔ)序列的Tm約5℃。不過高嚴(yán)緊性條件的雜交和/或洗滌溫度可以為低于Tm約1、2、3或4℃；中嚴(yán)緊性條件的雜交和/或洗滌溫度可以為低于Tm約6、7、8、9、10℃低嚴(yán)緊性條件的雜交和/或洗滌溫度可以為低于Tm約11、12、13、14、15、20℃。使用上文方程、雜交和洗滌緩沖液成分以及所需Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員將充分理解本文中所述的雜交和/或洗滌條件嚴(yán)緊性的變化。如果所需的錯(cuò)配程度需要Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，優(yōu)選提高SSC濃度從而可使用更高的溫度。核酸雜交方法可見Tijssen(1993)生化和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)-核酸探針雜交(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes)，Part I，Chapter 2(Elsevier，New York)；Ausubel等編輯.(1995)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室指南(Current Protocols inMolecular Biology)，Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)，下文簡(jiǎn)稱作“Ausubel”。也見上文文獻(xiàn)Sambrook。
因此，具有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活性的分離序列，可在嚴(yán)緊性條件下與本文所公開的20D加氧酶啟動(dòng)子序列雜交，或者與它們片段雜交，也包括在實(shí)施方案中。
通常，具有啟動(dòng)子活性的序列和可與本文所公開的啟動(dòng)子序列雜交的序列，與本文所公開序列至少40-50％同源，約為60、70、80、85、90、95-98％或更高。也就是說，序列相似性至少可為40-50％，約為60、70、80、85、90、95-98％。
下列術(shù)語用于描述兩個(gè)或多個(gè)核酸或多核苷酸間的關(guān)系(a)“參考序列”，(b)“對(duì)比窗”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，和(e)“基本同一”。
(a)這里所用的“參考序列”指用于序列對(duì)比基礎(chǔ)的序列。參考序列可以是完整或部分特定序列；例如是全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段，或者是完整cDNA或基因序列。
(b)這里所用的“對(duì)比窗”指多核苷酸序列的一個(gè)連續(xù)特定片段，其中對(duì)比窗內(nèi)多核苷酸相比參考序列(不包含添加或刪除)，可包含添加或刪除(即缺口)，以對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)。通常對(duì)比窗長(zhǎng)度至少為20個(gè)連續(xù)核苷酸，可任選為30、40、50、100個(gè)連續(xù)核苷酸或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為避免由于包含缺口而引起待測(cè)序列與參考序列間的高度相似性，典型做法是引入缺口扣分值，該值將從匹配數(shù)中扣除。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知序列比對(duì)方法。因此可使用數(shù)學(xué)算法確定任意兩個(gè)序列間的一致性百分比。優(yōu)選的數(shù)學(xué)算法包括(但不僅限于)Myers and Miller(1988)CABIOS 411-17；局部同源性算法，Smith等.(1981)Adv.Appl.Math.2482；同源性比對(duì)算法，Needleman andWunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448；Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264，修改算法見Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877。
可使用電腦軟件對(duì)這些數(shù)學(xué)算法進(jìn)行補(bǔ)充，以確定對(duì)比序列間的一致性。這些電腦軟件包括(但不僅限于)CLUSTAL，PC/Gene程序(來自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(Version 2.0)；ALIGN PLUS程序(Version 3.0，copyright 1997)andGAP，BESTFIT，BLAST，F(xiàn)ASTA；TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package of Genetics Computer Group，Version 10(來自Aceelrys，9685 Scranton Road，San Diego，CA，92121，USA)。WisconsinGenetics Software Package Version 10中所用的記分矩陣是BLOSUM62(見Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad Sci.USA 8910915)。
這些程序中可以使用默認(rèn)參數(shù)。CLUSTA程序的描述見Higgins等.(1988)Gene 73237-244(1988)；Higgins等.(1989)CABIOS5151-153；Corpet等.(1988)Nucleic Acids Res.1610881-90；Huang等。(1992)CABIOS 8155-65；Pearson等。(1994)Meth.Mol.Biol.24307-331。ALIGN和ALIGN PLUS程序都基于上文文獻(xiàn)Myers and Miller(1988)。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，在ALIGN程序中可使用PAM120重量殘基工作臺(tái)，缺口長(zhǎng)度扣分值定為12，缺口扣分值定為4。BLAST程序見Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403，它基于上文文獻(xiàn)Karlin和Altschul(1990)?？墒褂肂LASTN程序進(jìn)行BLAST核苷搜索，參數(shù)為score＝100，wordlength＝12，以確定待測(cè)核苷酸序列與實(shí)施方案中蛋白編碼核苷酸序列間的同源性?？墒褂肂LASTX程序進(jìn)行BLAST蛋白搜索，參數(shù)為score＝50，wordlength＝3，以確定待測(cè)蛋白與實(shí)施方案中蛋白或多肽間的同源性。為進(jìn)行對(duì)比而確定缺口比對(duì)，可使用Gapped BLAST(inBLAST2.0)，見Altschul等.(1997)Nucleic Acids Res.253389，或者使用PSI-BLAST(in BLAST2.0)進(jìn)行反復(fù)搜索，以檢測(cè)分子間的遠(yuǎn)距離相關(guān)性。見上文文獻(xiàn)Altschul等.(1997)。當(dāng)使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST時(shí)，可使用這些程序的默認(rèn)參數(shù)(如使用BLASTN處理核苷酸序列，使用BLASTX處理蛋白)。見美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的網(wǎng)站?？赏ㄟ^瀏覽相關(guān)信息而進(jìn)行手動(dòng)比對(duì)。
如果沒有特別指出，本文所提供隊(duì)序列同一性/相關(guān)性都是使用GAP程序(默認(rèn)參數(shù)，或其它等價(jià)程序)而獲得的?！暗葍r(jià)程序”指任何對(duì)任意兩個(gè)待測(cè)序列進(jìn)行對(duì)比的程序，當(dāng)與從GAP所得的相應(yīng)比對(duì)結(jié)果相比較時(shí)，相應(yīng)它們可生成含有同一核酸或氨基酸殘基匹配的比對(duì)結(jié)果，以及序列同一性百分比。
GAP程序使用上文文獻(xiàn)Needleman和Wunsch(1970)的比對(duì)方法，以得到兩個(gè)完整序列間的最大匹配數(shù)和最小缺口。GAP考慮所有的可能的比對(duì)和缺口位置，并建立含有最大數(shù)目匹配堿基和最少缺口的比對(duì)結(jié)果，它允許在匹配堿基單位內(nèi)提供缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值。GAP程序必須為每個(gè)由它插入的缺口，在匹配堿基缺口建立扣分?jǐn)?shù)目上獲利。如果選定的缺口延伸扣分值大于零，GAP必須另外為每個(gè)插入的缺口，在缺口延伸扣分的缺口時(shí)間長(zhǎng)度上獲利。在Wisconsin Genetics Software Package Version 10的蛋白分析中，默認(rèn)的缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值分別為8和2，在核酸分析中，默認(rèn)的缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值分別為50和3。缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值可以為從0-200間的整數(shù)。因此，缺口建立扣分值和缺口延伸扣分值可以為如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更高。
(c)這里所用的兩個(gè)核酸或多肽序列間的“序列同一性”或“一致性”指當(dāng)在一個(gè)特定對(duì)比窗內(nèi)進(jìn)行比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)性(correspondence)時(shí)，兩個(gè)序列間相同的殘基。當(dāng)用序列同一性百分比用于蛋白時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到殘基不同的位置上通常都是發(fā)生的保守性氨基酸替換，其中的氨基酸殘基被其它具有相似化學(xué)特性(如電荷或疏水性)的氨基酸所替換，從而并沒有改變分子的功能特性。當(dāng)序列間的不同是由保守性替換所引起的時(shí)候，可根據(jù)替換的保守性特征將序列同一性百分比向上調(diào)整以進(jìn)行校正。這種因保守性替換而不同的序列即具有所述的“序列相似性”或“相似性”。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知進(jìn)行這種調(diào)整的方法。典型作法是將保守性替換作為部分不匹配而不是完全不匹配來進(jìn)行賦值，從而提高序列同一性百分比。因此例如，當(dāng)給相同的氨基酸賦值1，而因非保守性替換不同的氨基酸賦值0，則因保守性替換而不同的氨基酸賦值在0到1之間。保守性替換的賦值可通過如PC/GENE程序(Wisconsin GeneticsSoftware Package of Genetics Computer Group，Mountain View，California)來進(jìn)行。
(d)這里所用的“序列同一性百分比”指通過在對(duì)比窗內(nèi)對(duì)兩個(gè)進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)的序列進(jìn)行對(duì)比所得的值，其中在與參考序列(它不包含添加或刪除)對(duì)比時(shí)，對(duì)比窗內(nèi)的多肽序列部分可包含殘基添加或刪除(即缺口)，以對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)。確定序列間核酸堿基或氨基酸殘基相同的位置數(shù)目，得到匹配位置數(shù)，然后除以對(duì)比窗內(nèi)的總位置數(shù)，再乘以100，即得到序列同一性百分比。
(e)(i)多核苷酸序列的“基本同一”指多核苷酸包含一段序列同一性(使用上文所述的比對(duì)程序并使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，與參考序列相比)至少為70、80、90或至少為95％的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框位置等因素后，可對(duì)這些值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以確定兩個(gè)序列所編碼蛋白間的相應(yīng)同一性。用于這些目的的氨基酸序列基本同一通常所指的序列同一性為至少60、70、80、90、95％。
其它說明核苷酸序列具有基本同一性的標(biāo)志是，它們可以在嚴(yán)緊性條件下進(jìn)行雜交。一般的，將嚴(yán)緊性條件選定為在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH，溫度低于特定序列的Tm約5℃。但是如同本文其它部分所定義的，嚴(yán)緊性條件也包括溫度低于Tm約1-20℃，這依賴于本文其它地方確定的所需嚴(yán)緊性程度。如果兩個(gè)核酸在嚴(yán)緊性條件下不發(fā)生雜交，但是它們所編碼的多肽具有基本同一性，那么這兩個(gè)核酸分子仍然具有基本同一性。當(dāng)一個(gè)核酸在復(fù)制時(shí)使用了遺傳密碼子的最大程度簡(jiǎn)并性時(shí)，這種情況就可能發(fā)生。當(dāng)一個(gè)核酸分子編碼的多肽對(duì)另一核酸分子編碼的多肽具有免疫交叉反應(yīng)活性時(shí)，說明這兩個(gè)核酸分子具有基本同一性。
本文所公開的20D加氧酶啟動(dòng)子及其變異體和片段可用于植物基因工程，例如制備轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因植物，以產(chǎn)生目的表型。這里所用的“轉(zhuǎn)化植物”或“轉(zhuǎn)基因植物”指在基因組內(nèi)含有外源多核苷酸的植物。通常轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)基因植物基因組穩(wěn)定含有這些外源多核苷酸，以連續(xù)的將該外源多核苷酸傳遞給下一代。這些外源多核苷酸可單獨(dú)或與重組DNA構(gòu)建體一起存在于基因組中。當(dāng)然這里所用的“轉(zhuǎn)基因物質(zhì)”包括任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物體部分或完整植物體，只要它們的基因型被外源核酸的存在所改變，包括通過轉(zhuǎn)基因操作而改變的起始宿主，以及這些起始宿主進(jìn)行有性或無性繁殖所得的后代。這里所用的“轉(zhuǎn)基因物質(zhì)”并不包括通過傳統(tǒng)植物種植方法或天然事件(例如隨機(jī)雜交、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變)改變了基因組(染色體或染色體外)的植物。
轉(zhuǎn)基因“事件”通過以下步驟而得到，使用外源DNA構(gòu)建體(含有核酸表達(dá)盒，其中又含有目的轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，從所得的在基因組插入了轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞出發(fā)再生大量植物體，根據(jù)在基因組特定位置插入了轉(zhuǎn)基因這一特征進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)基因事件的典型表型特征是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在遺傳水平上，轉(zhuǎn)基因事件是植物基因組成(makeup)的一部分。轉(zhuǎn)基因“事件”也指轉(zhuǎn)化植物體與其它植物體進(jìn)行遠(yuǎn)交所得的含有外源DNA的后代。
這里所用的“植物”包括整株植物、植物器官(如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞，以及它們的后代。實(shí)施方案中轉(zhuǎn)基因植物的部分植株應(yīng)理解為包括如轉(zhuǎn)基因植物或其后代的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、晶胚，以及從轉(zhuǎn)基因植物或其后代長(zhǎng)出的花、莖、果實(shí)、胚珠、葉或根，因?yàn)檗D(zhuǎn)化有實(shí)施方案的DNA分子，因此這些部位都至少含有部分轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
這里所用的“植物細(xì)胞”包括但不僅限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚芽、分生組織區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子、花粉、孢子體和小孢子?？捎糜诒疚乃_方法的植物種類包括所有可進(jìn)行轉(zhuǎn)化的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物。
本文所公開的啟動(dòng)子序列在宿主植物中可調(diào)控任何異源核苷酸序列的表達(dá)。因此，所述的異源核苷酸序列可以是操作性連接于本文所公開的啟動(dòng)子之上的結(jié)構(gòu)基因(編碼目的蛋白)。目的基因考慮市場(chǎng)需求，尤其是農(nóng)作物研發(fā)中感興趣的基因。農(nóng)作物和市場(chǎng)發(fā)生了變化，同時(shí)由于發(fā)展中國(guó)家和地區(qū)向世界市場(chǎng)開放，新型農(nóng)作物和技術(shù)將會(huì)出現(xiàn)。此外，當(dāng)我們所理解的農(nóng)業(yè)特性和特征如產(chǎn)出和雜種優(yōu)勢(shì)增長(zhǎng)時(shí)，目的基因的選擇也相應(yīng)發(fā)生變化。實(shí)施方案中的目的基因通常種類包括如參與信息的基因如鋅指結(jié)構(gòu)基因，參與通信的基因如激酶基因，持家基因如熱休克蛋白基因。更具體來說轉(zhuǎn)基因的種類包括如，所編碼蛋白賦予植物對(duì)非生物壓力的抗性的基因，所述壓力如干旱、溫度、鹽度和毒素如殺蟲劑和除草劑，或者所編碼蛋白賦予植物對(duì)生物壓力的抗性的基因，如真菌、病毒、細(xì)菌、昆蟲和線蟲的攻擊，以及與這些生物相關(guān)的疾病。表型的目的變化包括，修飾植物中的一個(gè)基因的表達(dá)，改變植物對(duì)病原體或昆蟲的防御機(jī)制，提高植物對(duì)除草劑的抗性，根據(jù)環(huán)境壓力改變植物的生長(zhǎng)階段等。這些改變可通過在植物體內(nèi)表達(dá)外源基因或提高內(nèi)源基因表達(dá)來得到。或者通過減少植物體內(nèi)一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因產(chǎn)物的生成，特別是酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、輔因子，通過影響植物的營(yíng)養(yǎng)攝取來得到。這些變化是由轉(zhuǎn)化植物體表型的變化所引起的。
應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可將任何目的基因操作性連接到實(shí)施方案中的啟動(dòng)子序列上，并在植物體中進(jìn)行表達(dá)。
可通過如下文所述的轉(zhuǎn)化方法使用含有這些目的基因之一的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，以在敏感表型植株中建立對(duì)疾病或昆蟲的抗性，或者提高敏感表型植株對(duì)疾病或昆蟲的抗性。因此，實(shí)施方案中包括了保護(hù)植物抵御真菌病原、細(xì)菌、病毒、線蟲和昆蟲等的方法。通過“疾病抗性”或“昆蟲抗性”植物可避免由植物-病原相互作用所引起的有害癥狀。
疾病抗性和昆蟲抗性基因例如溶菌酶基因、有抗菌作用的昆蟲抗菌肽(cecropin)、兩棲動(dòng)物抗茵肽(maganin)、硫蛋白基因，或者病原相關(guān)蛋白蛋白(如葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶、抗真菌)基因，或者控制線蟲或昆蟲的蘇云金芽胞桿菌內(nèi)毒素基因，蛋白酶抑制物基因，膠原酶基因，血凝素基因，糖苷酶基因。
實(shí)施方案中的病原包括(但不僅限于)病毒或類病毒、細(xì)菌、昆蟲、線蟲、真菌等。病毒包括煙草或黃瓜鑲嵌病毒、環(huán)斑病毒、壞疽病毒、玉米矮花葉病毒等。線蟲包括寄生線蟲，如根結(jié)線蟲、孢囊線蟲、根腐線蟲(lesion nematode)。
昆蟲抗性基因可以編碼對(duì)引起大量減產(chǎn)的昆蟲具有抗性的產(chǎn)物，如根蟲、毛蟲、玉米鉆心蟲等。這些基因包括蘇云金芽胞桿菌毒蛋白基因(美國(guó)專利5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等.(1986)Gene 48109)；凝集素基因(lectin)(Van Damme等.(1994)Plant Mol.Biol.24825)等。
編碼產(chǎn)物具有疾病抗性特性的基因包括包括解毒基因(detoxification genes)，如針對(duì)伏馬菌素(fumonisin)的基因(美國(guó)專利5,792,931)，無毒基因(avirulence(avr))和疾病抗性(R)基因(Jones等.(1994)Science 266789；Martin等.(1993)Science 2621432；Mindrinos等.(1994)Cell 781089)等。
可通過轉(zhuǎn)入編碼產(chǎn)物對(duì)除草劑具有抗性的基因來向植物導(dǎo)入除草劑抗性，如產(chǎn)物對(duì)抑制乙酰甲醇合酶(ALS)活性的除草劑具有抗性的基因，這種除草劑具體如磺酰脲類類除草劑(如含有突變的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，從而引起這種抗性，特別是S4和/或Hra突變)，產(chǎn)物對(duì)抑制谷氨酸合酶活性的除草劑具有抗性的基因，如草胺磷或basta基因(如bar基因)，或者本領(lǐng)域所知的其它該種基因。bar基因編碼產(chǎn)物對(duì)basta除草劑具有抗性，nptII基因編碼產(chǎn)物對(duì)卡那霉素和遺傳霉素(geneticin)具有抗性，ALS基因編碼產(chǎn)物對(duì)氯磺隆除草劑具有抗性。
草甘膦抗性由突變的5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)合酶(EPSPS)和aroA基因所導(dǎo)入。如見美國(guó)專利4,940,835(Shah等)，該文公開了一種能夠帶來草柑膦抗性的EPSPS的核苷酸序列。美國(guó)專利5,627,061(Barry等)也描述了EPSPS酶編碼基因。也可見美國(guó)專利6,248,876、6,040,497、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225,114、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、RE36,449、RE37,287和5,491,288，和國(guó)際公布說明書WO97/04103、WO97/04114、WO00/66746、WO01/66704、WO00/66747和WO00/66748，它們通過引用并入本文。也可通過編碼草柑膦氧化還原酶的基因的表達(dá)來向植物導(dǎo)入草柑膦抗性，更全面的敘述見美國(guó)專利5,776,760和5,463,175，它們通過引用并入本文。另外，也可通過草柑膦N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因的過度表達(dá)來導(dǎo)入草柑膦抗性。如見.美國(guó)專利申請(qǐng)10/004,357、10/427,692和10/835,615。
也可在DNA構(gòu)建體中包含不育基因，從而為植物去雄提供一種方法候選。這種基因例如雄性組織優(yōu)先基因和具有雄性不育表型的基因，如QM見美國(guó)專利5,583,210。其它這種基因包括激酶基因和編碼對(duì)雄性和雌性配子發(fā)育均有毒性的化合物的基因。
市場(chǎng)所需特性也可由一個(gè)或多個(gè)可提高表達(dá)的基因編碼，如生成淀粉以用于乙醇生產(chǎn)，或者提供蛋白表達(dá)。其它重要的轉(zhuǎn)化植物的市場(chǎng)用途包括生成聚合體和原生質(zhì)體，例如見美國(guó)專利5,602,321。如β-硫解酶基因、PHB合酶(聚羥基丁酸合酶(polyhydroxybutryratesynthase))基因和乙酰輔酶A還原酶基因(見Schubert等(1988)J.Bacteriol.1705837-5847)能促進(jìn)聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate(PHA))的表達(dá)。
可使用實(shí)施方案的方法從遺傳上改變影響農(nóng)作物質(zhì)量的重要農(nóng)業(yè)特性，如油脂的水平、種類、飽和和不飽和，必需氨基酸的質(zhì)量和數(shù)量，纖維素和淀粉的水平，以及蛋白成分等。修飾包括提高油酸成分，飽和和不飽和油脂，提高賴氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸以及修飾淀粉。在玉米中進(jìn)行硫素蛋白(Hordothionin)修飾見美國(guó)專利5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,049，它們通過引用并入本文。其它例子如通過大豆2S白蛋白基因編碼富賴氨酸和/或硫種子蛋白，見美國(guó)專利5,850,016(申請(qǐng)于1996年3月20日)，和通過大麥基因編碼胰凝乳蛋白酶抑制物，見Williamson等(1987)Eur.J.Biochem.16599-106，這些文獻(xiàn)通過引用并入本文。
外源基因產(chǎn)物包括植物酶，以及來自其它原核生物和真核生物的產(chǎn)物，如酶、輔因子、激素等。
其它可用的基因及其相關(guān)表型例如，編碼病毒衣殼蛋白和/或RNA的基因，或其它賦予植物病毒抗性的病毒或植物基因；賦予植物真菌抗性的基因；賦予植物害蟲抗性的基因；促進(jìn)產(chǎn)物產(chǎn)出的基因；以及賦予植物對(duì)外界壓力抗性的基因，例如由高溫和高鹽引起的脫水，有毒金屬或微量元素等。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，2OD加氧酶啟動(dòng)子序列上操作性連接的目的基因，是在高密度種植條件下，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)或提高農(nóng)作物產(chǎn)出的基因。例如，2OD加氧酶啟動(dòng)子序列上操作性連接了表達(dá)重要農(nóng)業(yè)特性的基因，它可改善初級(jí)根和側(cè)根系統(tǒng)。這些基因包括(但不僅限于)營(yíng)養(yǎng)成分/水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和生長(zhǎng)誘導(dǎo)物基因，例如(但不僅限于)玉米H+-ATPase基因(MHA2)(Frias等(1996)PlantCell 81533-44)；AKT1基因，產(chǎn)物是擬南芥中鉀攝取裝置的成分，(Spalding等(1999)J Gen.Physiol.113909-18)；RML，它在根尖細(xì)胞中活化細(xì)胞分裂循環(huán)(Cheng等1995)Plant Physiol.108881)；玉米谷氨酸合酶基因(Sukanya等(1994)Plant Mol.Biol.261935-46)；和血色素基因(Duff等(1997)J.Biol.Chem.2716749-16752；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.1151259-1266；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.114493-500，以及這些文獻(xiàn)中的參考文獻(xiàn))。20D加氧酶啟動(dòng)子也可用于表達(dá)某些基因的反義核酸，這些基因在高密度種植條件下抑制根部系統(tǒng)的發(fā)展。
操作性連接于本文所公開的2OD加氧酶啟動(dòng)子(及其生物活性片段或變異體)上的異源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反義序列?！胺戳xDNA核苷酸序列”指與一段與該核苷酸序列正常的5’→3′方向相反的核苷酸序列。當(dāng)導(dǎo)入到植物細(xì)胞中后，反義DNA序列的表達(dá)能夠防止靶基因DNA序列的正常表達(dá)。反義核苷酸序列編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物與靶基因轉(zhuǎn)錄生成的內(nèi)源mRNA互補(bǔ)，并可與其雜交。這樣，由靶基因編碼的天然蛋白的生成就受到抑制，從而得到所需的表型反應(yīng)。當(dāng)序列發(fā)生雜交并干擾了相應(yīng)mRNA的表達(dá)時(shí)，反義序列修飾就隨即發(fā)生。以這種方式，可使用與相應(yīng)反義核酸具有70、80、85％序列同一性的反義構(gòu)建體。另外，也可使用反義核苷酸的部分序列破壞靶基因的表達(dá)。序列長(zhǎng)度通常至少為50、100、200個(gè)核苷酸或更高。因此，本文公開的啟動(dòng)子序列可與反義DNA序列操作性連接，以減少或抑制植物天然蛋白的表達(dá)。
在在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，2OD加氧酶啟動(dòng)子序列上操作性連接的目的基因，是在高密度種植條件下，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)或提高農(nóng)作物產(chǎn)出的基因。例如，2OD加氧酶啟動(dòng)子序列上操作性連接了表達(dá)重要農(nóng)業(yè)特性的基因，它可改善初級(jí)根和側(cè)根系統(tǒng)。這些基因包括(但不僅限于)營(yíng)養(yǎng)成分/水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和生長(zhǎng)誘導(dǎo)物基因，例如(但不僅限于)玉米H+-ATPase基因(MHA2)(Frias等(1996)Plant Cell 81533-44)；AKT1基因，產(chǎn)物是擬南芥中鉀攝取裝置的成分，(Spalding等(1999)J.Gen.Physiol.113909-18)；RML，它在根尖細(xì)胞中活化細(xì)胞分裂循環(huán)(Cheng等(1995)Plant Physiol.108881)；玉米谷氨酸合酶基因(Sukanya等1994)Plant Mol.Biol.261935-46)；和血色素基因(Duff等(1997)J.Biol.Chem.2716749-16752；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.1151259-1266；Arredondo-Peter等(1997)Plant Physiol.114493-500，以及這些文獻(xiàn)中的參考文獻(xiàn))。2OD加氧酶啟動(dòng)子也可用于表達(dá)某些基因的反義核酸，這些基因在高密度種植條件下抑制根部系統(tǒng)的發(fā)展。
“RNAi”指一系列降低基因表達(dá)的的方法(如美國(guó)專利6,506,559)?，F(xiàn)在認(rèn)為被稱作其它名稱的舊時(shí)方法依賴的機(jī)制相同，只是名稱不同。這些方法包括“反義抑制”，生成可抑制靶蛋白表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物，“共抑制”或“正義抑制(sense-suppression)”，指生成可抑制序列相同或基本相似的外源或內(nèi)源基因表達(dá)的正義RNA轉(zhuǎn)錄物(美國(guó)專利5,231,020，通過引用并入本文)。這些技術(shù)都依賴于使用核苷酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體可通過一條與待沉默靶基因序列互補(bǔ)的核酸鏈，引起雙鏈RNA的積累。實(shí)施方案中的2OD加氧酶啟動(dòng)子序列(以及本文公開的與其相關(guān)的生物活性片段或變異體)，可被用來驅(qū)動(dòng)這種會(huì)引起RNA干擾(包括微RNA和siRNA)的核苷酸構(gòu)建體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，其中含有一個(gè)本文公開的啟動(dòng)子序列(或其片段或變異體)，在該啟動(dòng)子序列上操作性連接了一個(gè)外源基因，該基因的表達(dá)受到啟動(dòng)子序列的可誘導(dǎo)式控制。在這種DNA構(gòu)建體中包含多個(gè)限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以插入待受到調(diào)控區(qū)域轉(zhuǎn)錄調(diào)控的序列。另外，這種DNA構(gòu)建體還可含有可選的標(biāo)記基因。
按照轉(zhuǎn)錄的5’-3’方向，所述DNA構(gòu)建體依次包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域(即實(shí)施方案中的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)，翻譯起始區(qū)域，目的外源基因，翻譯終止區(qū)域，并可任選含有在宿主生物中具有活性的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。調(diào)控區(qū)域(即啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，翻譯終止區(qū)域)和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账幔唛g彼此可以是天然的/類似的，或者對(duì)宿主細(xì)胞可以是天然的/類似的?；蛘哒{(diào)控區(qū)域和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账?，二者間彼此可以是異源的，或者對(duì)宿主細(xì)胞可以是異源的。這里所用的“異源”指序列來源相對(duì)宿主來說是異種的，或者如果是同種，那么該序列相比其天然形式在組成和/或基因組位置上被人工進(jìn)行了實(shí)質(zhì)上的修飾。例如，操作性連接于啟動(dòng)子序列上的外源多核苷酸的來源與啟動(dòng)子來源是異種的，或者如果是同種，那么啟動(dòng)子和外源多核苷酸二者中的一個(gè)(或兩個(gè)同時(shí))在其起始形式和/或基因組位置上進(jìn)行了實(shí)質(zhì)上的修飾，或者啟動(dòng)子序列不是該操作性連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。
可任選包含的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄起始區(qū)域來說可以是天然的，或者對(duì)操作性連接的目的多核苷酸來說可以是天然的，或者對(duì)宿主植物細(xì)胞來說可以是天然的，或者其來源與啟動(dòng)子、目的多核苷酸、宿主(或者這三者的任意組合)的來源可以不同(即外來或異源)?？梢詮母┺r(nóng)桿菌(又稱為根癌土壤桿菌)Ti質(zhì)粒獲得方便的終止區(qū)域，如羧乙基精氨酸合酶或胭脂氨酸合酶基因終止區(qū)域。也見Guerineau等(1991)Mol.Gen.Genet.262141-144；Proudfoot(1991)Cell 64671-674；Sanfacon等(1991)Genes Dev.5141-149；Mogen等(1990)Plant Cell 21261-1272；Munroe等(1990)Gene 91151-158；Ballas等(1989)Nucleic Acids Res.177891-7903；Joshi等(1987)Nucleic Acids Res.159627-9639。在具體的實(shí)施方案中，使用馬鈴薯蛋白酶抑制物II基因(PinII)的終止子。如見Keil等(1986)Nucl.Acids Res.145641-5650；及An等(1989)Plant Cell 1115-122，均通過引用并入本文。
含有實(shí)施方案的啟動(dòng)子序列和操作性連接于其上的異源核苷酸序列的DNA構(gòu)建體也可至少包含一個(gè)有待共轉(zhuǎn)化入有機(jī)體的基因的額外核苷酸序列?；蛘呖赏ㄟ^另外的DNA構(gòu)建體提供這種額外序列。
如果可行，那么可對(duì)處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的異源核苷酸序列和任何額外核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化以提高它們?cè)谵D(zhuǎn)化植物體中的表達(dá)。也就是說，可以使用植物偏好密碼子合成這些核苷酸序列以改善表達(dá)。本領(lǐng)域中已有這種合成植物偏好核苷酸序列的方法。見如美國(guó)專利5,380,83l和5,436,391，Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17477-498，它們通過引用并入本文。
已知對(duì)額外序列進(jìn)行修飾可以提高基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。這些方法包括刪除掉編碼假poly-A信號(hào)、編碼外顯子-內(nèi)含子拼接信號(hào)、編碼轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)的序列，以及其它可能對(duì)基因表達(dá)有害的序列。異源核苷酸序列的G-C含量可以調(diào)整到給定宿主細(xì)胞的平均水平，這參考已知在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因進(jìn)行計(jì)算而得到。如果可能，對(duì)額外序列進(jìn)行修飾以避免可能出現(xiàn)在mRNA中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。
所述DNA構(gòu)建體還可含有5’前導(dǎo)序列。這種前導(dǎo)序列可提高翻譯水平。本領(lǐng)域已知翻譯前導(dǎo)序列，包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5′非編碼區(qū)(Encephalomyocarditis 5′noncoding region))(Elroy-Stein等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 866126-6130)；馬鈴薯Y病毒屬(potyvirus)前導(dǎo)序列，如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒(Tobacco Etch Virus))(Allison等(1986)Virology 1549-20)；MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus))；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等(1991)Nature 35390-94)；來自玉米鑲嵌病毒衣殼蛋白mRNA的非翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA 4)(Jobling等(1987)Nature325622-625)；煙草鑲嵌病毒前導(dǎo)序列(TMV)(Gallie等(1989)RNA的分子生物學(xué)(Molecular Biology of RNA)，pages 237-256)；玉米退綠斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(Lommel等(1991)Virology 81382-385)。也見Della-Cioppa等(1987)Plant Physiology 84965-968。其它可用以提高翻譯水平和/或mRNA穩(wěn)定性的方法也可使用，如內(nèi)含子，如玉米泛素內(nèi)含子(Christensen和Quail(1996)Transgenic Res.5213-218；Christensen等(1992)Plant Mol Biol 18675-689)，或者玉米AdhI內(nèi)含子等(Kyozuka等(1991)Mol.Gen.Genet.22840-48；Kyozuka等(1990)Maydica 35353-357)。
實(shí)施方案的DNA構(gòu)建體也可進(jìn)一步包含增強(qiáng)子，根據(jù)需要，可以是翻譯增強(qiáng)子也可以是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。這些增強(qiáng)子區(qū)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可包括ATG起始密碼子和鄰近序列。起始密碼子必須出現(xiàn)在編碼序列的閱讀框中，以確保整個(gè)序列都被翻譯。翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以來自多種來源，可以是天然的也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域來自于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，或者來自于結(jié)構(gòu)基因。翻譯起始區(qū)域也可來自于被選擇以表達(dá)基因的調(diào)控元件，或者可被特異性修飾以提高mRNA的翻譯。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，為提高轉(zhuǎn)錄水平，可以同時(shí)使用增強(qiáng)子和啟動(dòng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知增強(qiáng)子，包括SV40增強(qiáng)子區(qū)域、35S增強(qiáng)子元件等。
在制備DNA構(gòu)建體的過程中，可操作這些種類不同的DNA片段，以為該DNA序列提供正確的方法和正確的閱讀框。向著此末端方向，可使用連接序列或接頭連接DNA片段，或者采用其它操作以在構(gòu)建體中提供方便使用的限制性酶位點(diǎn)?？上?qū)嵤┓桨傅男蛄刑砑踊騽h除限制性酶位點(diǎn)，或者可刪除掉所述序列中的多余序列，或者進(jìn)行其它類似修飾。因此，可使用體外突變、引物修復(fù)、限制性酶解、退火、再替換，如轉(zhuǎn)換和顛換。
DNA構(gòu)建體中可包含報(bào)告基因或篩選標(biāo)記基因。本領(lǐng)域中的合適報(bào)告基因如下列文獻(xiàn)中所述，Jefferson等(1991)在植物分子生物學(xué)手冊(cè)(Plant Molecular Biology Manual)、Gelvin等(KluwerAcademic Publishers)，pp.1-33；DeWet等(1987)Mol.Cell.Biol.7725-737；Goff等(1990)EMBO J.92517-2522；Kain等(1995)BioTechniques 19650-655；及Chiu等(1996)Current Biology 6325-330。
用以選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織的篩選標(biāo)記基因可包括抗生素抗性基因或除草劑抗性基因。合適的篩選基因包括(但不僅限于)氯霉素抗性基因(Herrera Estrella等(1983)EMBO J.2987-992)；甲氨蝶呤抗性基因(Herrera Estrella等.(1983)Nature 303209-213；Meijer等.(1991)Plant Mol.Biol.16807-820)；潮霉素抗性基因(Waldron等.(1985)Plant Mol.Biol.5103-108；Zhijian等.(1995)Plant Science108219-227)；鏈霉素抗性基因(Jones等.(1987)Mol.Gen.Genet.21086-91)；大觀霉素抗性基因(Bretagne-Sagnard等.(1996)Transgenic Res.5131-137)；博來霉素抗性基因(Hille等.(1990)Plant Mol.Biol.7171-176)；磺胺抗性基因(Guerineau等.(1990)Plant Mol.Biol.15127-136)；辛酰溴苯腈抗性基因(Stalker等.(1988)Science 242419-423)；草柑膦抗性基因(Shaw等.(1986)Science 233478-481)；草胺膦抗性基因(DeBlock等(1987)EMBOJ.62513-2518)。
其它可用于標(biāo)記轉(zhuǎn)基因事件但最終產(chǎn)物可能不需要的基因包括如(但不僅限于)GUS(b-葡萄糖苷酸酶；Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5387)，GFP(綠色熒光蛋白Chalfie等.(1994)Science263802)，熒光素酶(Riggs等.(1987)Nucleic Acids Res.15(19)8115；Luehrsen等.(1992)Methods Enzymol.216397-414)和參與玉米花青素合成的基因(Ludwig等.(1990)Science247449)。
實(shí)施方案中的核酸分子可用于指導(dǎo)植物中的核苷酸序列的表達(dá)。這可通過使用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化目的植物細(xì)胞，然后從所述的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化子再生出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植株來實(shí)現(xiàn)，該構(gòu)建體中包含本文鑒別的啟動(dòng)子，以及操作性連接于其上的異源核苷酸序列。實(shí)施方案中的方法也指導(dǎo)植物中核苷酸序列的可誘導(dǎo)式表達(dá)。這些方法包括，使用含有本文鑒別的啟動(dòng)子(它在植物細(xì)胞中以可誘導(dǎo)方式起始轉(zhuǎn)錄，并且在其上操作性連接了異源核苷酸序列)的DNA構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，從所述的植物細(xì)胞出發(fā)再生轉(zhuǎn)化植物，用所需的刺激物處理該植物體以誘導(dǎo)表達(dá)。
含有實(shí)施方案的特定啟動(dòng)子序列以及連接于其上的目的核苷酸序列的DNA構(gòu)建體可用來轉(zhuǎn)化任何植物。以這種方式，可得到遺傳修飾(即轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化)的植物體、植物細(xì)胞、植物組織、種子、根等。
適于本發(fā)明實(shí)施方案的植物種類包括(但不僅限于)玉米(Zeamays)、蕓苔類(如油菜，蕪菁，芥菜)，特別是用作種子油來源的蕓苔類(Brassica species)、苜蓿(Medicago sativa)、大米(Oryza sativa)、裸麥(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、粟類(如，珍珠小米(pearl millet)(Pennisetum glaucum)、黍稷(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、雞爪粟(Eleusine coracana)、向日葵(Helianthus annuus)、紅花(Carthamus tinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotiana tabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypiumbarbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡豆(Cofea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、鳳梨(Ananas comosus)、柑橘樹(Citrus spp.)、可可豆(Theobromacacao)、茶葉(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鱷梨(Perseaamericana)、無花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄欖(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亞堅(jiān)果(Macadamiaintegrifolia)、杏仁(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和松類。
蔬菜類包括番茄(Lycopersicon esculentum)、苦菜類(Lactucasativa)、綠豆(Phaseolus vulgaris)、萊豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和一部分甜瓜屬如黃瓜(C sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)和香瓜(C. melo)。觀賞植物包括杜鵑花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscusrosasanensis)，玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.)、水仙花(Narcissus spp.)、矮牽牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、猩猩木(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于本發(fā)明實(shí)施方案的松類植物包括如，松樹如火炬松(Pinus taeda)、濕地松(Pinus elliotii)、北美黃松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和輻射松(Pinus radiata)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、西部鐵杉(Tsuga canadensis)、西岸云杉(Picea glauca)、紅杉(Sequoia sempervirens)、冷杉如銀樅(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)以及雪松如西部紅雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黃檜(Chamaecyparis nootkatensis)。實(shí)施方案中的植物可以是農(nóng)作物(例如，玉米、紫花苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、粟類、煙草等等)。例如，此項(xiàng)發(fā)明適合于任何單子葉植物，包括但不僅限于玉米、稻、大麥、燕麥、小麥、高粱、黑麥、甘蔗、鳳梨、山藥、洋蔥、香蕉、椰子和海棗(date)。
這里所用的“載體”指用以向宿主細(xì)胞導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體(如DNA構(gòu)建體)的DNA分子，如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體。典型的克隆載體含有一個(gè)或較少的幾個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，通過這些位點(diǎn)可插入(以可確定方式(in a determinable fashion))外源DNA序列(而同時(shí)不損害載體中必需的生物功能)，此外還含有標(biāo)記基因(它適于鑒定并選出被克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)。典型的標(biāo)記基因包括四環(huán)素抗性基因、潮霉素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。
實(shí)施方案中的方法包括向植物細(xì)胞中導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體。這里所用的“導(dǎo)入”指將核苷酸構(gòu)建體以某種方式遞送至植物體從而使得所述構(gòu)建體進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部。實(shí)施方案中的方法并不依賴于特定的導(dǎo)入方法，只要所述構(gòu)建體能夠進(jìn)入至少一個(gè)植物細(xì)胞即可。本領(lǐng)域中已知植物細(xì)胞核酸導(dǎo)入方法，包括(但不僅限于)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。
“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”指導(dǎo)入的核苷酸構(gòu)建體被整合進(jìn)植物基因組，并可被宿主后代所繼承?！八矔r(shí)轉(zhuǎn)化”指導(dǎo)入的核苷酸構(gòu)建體沒有被整合進(jìn)植物基因組。
可通過使植物與病毒或病毒核酸相接觸來導(dǎo)入實(shí)施方案中的核苷酸構(gòu)建體。通常，這種方法涉及到將實(shí)施方案的核苷酸構(gòu)建體整合到病毒RNA或DNA分子內(nèi)。本領(lǐng)域已知通過病毒RNA或DNA將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞并表達(dá)其編碼的蛋白質(zhì)的方法。見如美國(guó)專利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931，它們通過引用并入本文。
可根據(jù)待轉(zhuǎn)化靶植物或植物細(xì)胞的種類，即單子葉或雙子葉植物，來選擇轉(zhuǎn)化方法和核苷酸序列導(dǎo)入方法。將核苷酸序列導(dǎo)入植物細(xì)胞并隨之插入到植物基因組中的合適方法包括微注射法(Crossway等.(1986)Biotechniques 4320-334)，電穿孔法(Riggs等.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835602-5606，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Agrobacterium-mediated transformation)(美國(guó)專利5,981,840和5,563,055)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等.(1984)EMBO J.32717-2722)，彈道微粒加速作用(ballistic particle acceleration)(見如美國(guó)專利4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等.(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture；Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等.(1988)Biotechnology 6923-926)。也見Weissinger等.(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477；Sanford等.(1987)Particulate Science andTechnology 527-37(onion)；Christou等.(1988)Plant Physiol.87671-674(soybean)；McCabe等.(1988)Bio/Technology 6923-926(soybean)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P175-182(soybean)；Singh等.(1998)Theor.Appl.Genet.96319-324(soybean)；Datta等.(1990)Biotechnology 8736-740(rice)；Klein等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854305-4309(maize)；Klein等.(1988)Biotechnology 6559-563(maize)；U.S.Patent 5,240,855；5,322,783 and 5,324,646；Klein等.(1988)PlantPhysiol. 91440-444(maize)；Fromm等.(1990)Biotechnology8833-839(maize)；Hooykaas-Van Slogteren等.(1984)Nature(London)311763-764；U.S.Patent 5,736,369(cereals)；Bytebier等.(1987)Proc.Natl.Acad Sci.USA 845345-5349(Liliaceae)；DeWet等.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等.(Longman，New York)，pp.197-209(pollen)；Kaeppler等.(1990)Plant Cell Reports 9415-418 and Kaeppler等.(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(whisker-mediated transformation)；D＇Halluin等.(1992)Plant Cell 41495-1505(electroporation)；Li等.(1993)Plant Cell Reports 12250-255 and Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75407-413(rice)；Osjoda等.(1996)NatureBiotechnology 14745-750(maize via Agrobacterium tumefaciens)，上述所有文獻(xiàn)均通過引用并入本文。
按照常規(guī)的方法，細(xì)胞轉(zhuǎn)化子可生長(zhǎng)成植物體。見如McCormick等(1986)Plant Cell Reports 581-84。然后可種植這些植物，并使用經(jīng)相同轉(zhuǎn)化的植株或不同株對(duì)這些植物授粉，然后鑒別出所得雜種中誘導(dǎo)表達(dá)了所需表型特征的雜種?？煞N植兩代或更多代，以確認(rèn)所需表型特征的誘導(dǎo)表達(dá)被穩(wěn)定維持并遺傳，然后收集種子以確保獲得所需表型特征的誘導(dǎo)表達(dá)。因此，這里使用的“轉(zhuǎn)化種子”指在植物基因組中穩(wěn)定整合有所導(dǎo)入核苷酸構(gòu)建體的種子。
有多種方法可從植物組織出發(fā)再生植物體。根據(jù)起始植物組織和特定的待再生植物種類來選擇特定的再生方法。從單個(gè)植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化子或從多種轉(zhuǎn)化子出發(fā)，再生、發(fā)展和培養(yǎng)植物體的方法在本領(lǐng)域中眾所周知(Weissbach和Weissbach，(1988)植物分子生物學(xué)方法(Methods for Plant Molecular Biology)(Eds.)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)。這種再生和培養(yǎng)方法的典型步驟包括，選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過生根苗(rooted plantlet)階段的一般胚芽發(fā)育階段培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞。類似的，再生轉(zhuǎn)基因胚芽和種子。所得的轉(zhuǎn)基因生根苗隨后被種植在合適的植物培養(yǎng)基中，如土壤。對(duì)再生的植物優(yōu)選進(jìn)行自身授粉，以提供純合子轉(zhuǎn)基因植株。另外，使用從再生植株得到的花粉與重要農(nóng)作物品系的種子生成植物體進(jìn)行雜交。相反，使用從這些重要農(nóng)作物品系的種子生成植物體得到的花粉對(duì)再生植物授粉。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，培養(yǎng)實(shí)施方案中的含有所需多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施方案提供了用以篩選在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)表達(dá)的化合物的組合物?？墒褂幂d體、細(xì)胞、植物體來篩選候選分子，以得到2OD加氧酶啟動(dòng)子的拮抗劑或激動(dòng)劑。例如，可將一個(gè)報(bào)告基因操作性連接于2OD加氧酶啟動(dòng)子上，并作為轉(zhuǎn)基因在植物體中進(jìn)行表達(dá)。加入待測(cè)化合物，并測(cè)量報(bào)告基因的表達(dá)水平以確定該物質(zhì)對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。
下文的實(shí)施例僅用以闡述本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明做出任何限制。
實(shí)驗(yàn) 通過下文實(shí)施例進(jìn)一步定義本實(shí)施方案，其中如果沒有特別指出，份和百分比均為重量份和重量百分比，溫度為攝氏度。所用的分子生物學(xué)方法均參照上文Ausubel或Sambrook所述進(jìn)行。當(dāng)然這些實(shí)施例僅以說明的方式闡明實(shí)施方案。通過上文所述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可掌握實(shí)施方案的本質(zhì)特征，并且在不偏離實(shí)施方案的精髓和范圍的情況下，可以根據(jù)不同用途和條件，對(duì)實(shí)施方案做出多種改變和改進(jìn)。因此，鑒于前述說明書所述，除本文所述實(shí)施方案之外，實(shí)施方案的多種修改方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也將會(huì)是顯而易見的。這些修改方案也在所附的權(quán)利要求書范圍內(nèi)。
所有列出的參考文獻(xiàn)均通過引用整體并入本文。
實(shí)施例12OD加氧酶基因的鑒定 使用大規(guī)模平行特征測(cè)序(Massively Parallel SignatureSequencing technology(MPSS))技術(shù)鑒定所述的加氧酶基因(見Brenner S，等.(2000)Nature Biotechnology 18630-634，Brenner S等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 971665-1670)。該技術(shù)涉及到從已反轉(zhuǎn)錄的mRNA樣品中得到17個(gè)堿基的特征標(biāo)簽。標(biāo)簽進(jìn)行測(cè)序，同時(shí)將其指定為基因或EST(表達(dá)標(biāo)簽序列)。對(duì)這些標(biāo)簽的豐度進(jìn)行賦值，這些值被規(guī)格化為PPM，這樣就可對(duì)不同組織中標(biāo)簽的表達(dá)或豐度加以比較。因此，可通過MPSS平臺(tái)來確定特定基因的表達(dá)及其在不同組織中的表達(dá)水平。
在MPSS數(shù)據(jù)庫中查詢到在受到玉米根蟲(CRW)侵食時(shí)優(yōu)先受到上調(diào)的特征標(biāo)簽，就可鑒別出相應(yīng)于玉米2OD加氧酶基因的標(biāo)簽。從用CRW處理的V5階段玉米植株中查詢鑒別到了根標(biāo)簽序型。從未用CRW處理的V6階段玉米植株中也查詢鑒別到了根標(biāo)簽序型。對(duì)二者進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生CRW侵食后的24h內(nèi)，2OD加氧酶標(biāo)簽從704ppm被增量調(diào)節(jié)到2566ppm。在MPSS數(shù)據(jù)庫中對(duì)所有實(shí)驗(yàn)和組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2OD加氧酶基因在根部被優(yōu)先表達(dá)。
實(shí)施例2加氧酶基因表達(dá)的誘導(dǎo) 通過northern印跡(圖1)證實(shí)該加氧酶基因是被誘導(dǎo)表達(dá)的。使B73玉米植株的根受到玉米根蟲侵食破壞24h，從植株的節(jié)根和V5階段的V5葉(5頸圈葉(collared leaves))中分離RNA。所得結(jié)果表明2OD加氧酶基因的表達(dá)受到CRW侵食破壞的強(qiáng)烈上調(diào)。僅在根部觀察到這種誘導(dǎo)，而沒有在葉中觀察到。
為確定昆蟲直接侵食葉組織是否會(huì)誘導(dǎo)2OD加氧酶表達(dá)，使玉米鉆心蟲(又稱歐洲玉米螟(European com borer))侵食V5階段玉米24h。通過MPSS確定輪生體/葉轉(zhuǎn)換帶中的表達(dá)水平，結(jié)果表明幼蟲對(duì)葉的損傷沒有增量調(diào)控該表達(dá)，因?yàn)槠浔磉_(dá)水平仍在背景水平(7ppm)。
在CRW侵食實(shí)驗(yàn)中，移植一些植株而另一些不移植，以確定該過程造成的根部損傷是否會(huì)誘導(dǎo)所述加氧酶基因的表達(dá)。移植指將植株移栽到新土壤中。該過程造成的根部損傷不誘導(dǎo)2OD加氧酶基因的表達(dá)。
根部的機(jī)械損傷，具體來說是折斷根尖，會(huì)誘導(dǎo)所述加氧酶基因的表達(dá)。MPSS分析結(jié)果表明，這種損傷對(duì)所述基因的誘導(dǎo)作用約在損傷發(fā)生后的3h時(shí)達(dá)到峰值，然后逐步降低，直到24h時(shí)(該實(shí)驗(yàn)的時(shí)間終點(diǎn))。通過northem印跡分析(圖2)也得到了相似的結(jié)果。在V5階段植株的根尖引入機(jī)械損傷，然后在損傷后的0、2、6、12和24h時(shí)收集節(jié)根(nodal root)和V5葉。結(jié)果表明在根部該基因的表達(dá)約在損傷后的6h時(shí)達(dá)到峰值，然后逐步下降直到24h。實(shí)驗(yàn)中沒有檢測(cè)到在葉中的表達(dá)。因此，根據(jù)這些數(shù)據(jù)可說明2OD加氧酶基因在根部受到誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間段約為損傷后的3-6h。
總而言之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所述加氧酶基因的表達(dá)在根部受到CRW侵食和機(jī)械損傷時(shí)發(fā)生增量調(diào)控。這種增量調(diào)控和表達(dá)是根部?jī)?yōu)先(root preferred)的，這使得該啟動(dòng)子成為一種合適的候選分子，用以在需要昆蟲侵食或損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行表達(dá)時(shí)，在植物體(如玉米)中指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行顯著水平的表達(dá)。
材料和方法 在溫室條件下培養(yǎng)B73系玉米到V5階段，并使75個(gè)第二齡CRW幼蟲侵食。在侵食24h后收集葉(V5葉)和節(jié)根。使用未被侵食的V5階段葉樣本作為對(duì)照。用RNA Easy Maxi Kit試劑盒(Qiagen，Valencia，CA.)從組織中提取RNA。
用Northem Max Denaturing Gel Buffers緩沖液(Ambion，Austin，TX.)進(jìn)行RNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)甲醛凝膠電泳。然后用20X SSC洗滌凝膠一次，15min，隨后在20xSSC溶液中將RNA轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，反應(yīng)過夜(Turboblotter，來自S&S)。膜用UV進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)2min。50℃在15mL DIG Easy Hyb Solution溶液(Roche Applied Sciences，Indianapolis，IN.)中預(yù)雜交3h。使用PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche)通過PCR從2OD加氧酶EST獲得單鏈DNA探針。根據(jù)試劑盒的推薦使用說明，每1mL DIG Easy Hyb溶液加入2μL變性探針。隨后50℃下在10mL溶液中雜交過夜。次日，用低嚴(yán)緊性緩沖液(2X SSC，含有0.1％SDS)室溫下洗滌5min，再用高嚴(yán)緊性緩沖液(0.1X SSC，含有0.1％SDS)在55℃下洗滌兩次，每次15min。
使用DIG0MNI Systemfor PCR Probes探針系統(tǒng)和DIG Washand Block Buffer Set緩沖液(均來自Roche)使2OD加氧酶轉(zhuǎn)錄物顯形。簡(jiǎn)短來說，室溫下在洗滌緩沖液(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH7.5；0.3％(v\v)Tween20)中平衡膜2min。然后放入封阻溶液(將10X封阻緩沖液按1∶10的比例稀釋在馬來酸緩沖液中(0.1M馬來酸，0.15M NaCl，pH7.5))中放置30min。加入抗體溶液(將抗DIG-堿性磷酸鹽按110,000稀釋在封阻溶液中(將10X封阻緩沖液按110的比例稀釋在馬來酸緩沖液中))溫育30min，然后用洗滌緩沖液洗滌兩次共30min。在檢測(cè)緩沖液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH9.5)中平衡3min后，將膜放置在塑料顯相夾(plastlc development folder)(AppliedBioSystems)中，并向膜滴加1mL CDP-Star工作溶液(將CDP-Star液(25mM，12.38mg/mL)按1100的比例稀釋在檢測(cè)緩沖液中)。室溫下溫育5min后，將膜暴露在X射線膠片下顯影，顯影時(shí)間為20min至過夜。
實(shí)施例3進(jìn)行5’RACE實(shí)驗(yàn)以鑒別轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 5’RACE被用來進(jìn)行20D加氧酶mRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)作圖，并根據(jù)快速擴(kuò)增cDNA末端的5’RACE系統(tǒng)(5’RACE System for theRapid Amplification of cDNA Ends)(Invitrogen，Carlsbad，CA)附帶的操作說明，用從同系繁殖B73玉米植株根部分離的RNA進(jìn)行操作。根據(jù)鑒別的EST序列針對(duì)2OD加氧酶基因3’UTR設(shè)計(jì)基因特異性探針(GSP)。針對(duì)富GC模板，可使用SuperScript II ReverseTranscriptase反轉(zhuǎn)錄酶(試劑盒中提供)和GSP1R(SEQ ID NO2)(定位在互補(bǔ)鏈上，位于2OD加氧酶基因翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的+1321到+1340bp)合成第一條鏈，而隨后的RNase處理、反應(yīng)處理(clean-up)和cDNA的dC-加尾反應(yīng)這些步驟均使用常規(guī)系統(tǒng)方法。使用GSP2R(SEQ ID NO3)(也定位在互補(bǔ)鏈上，位于2OD加氧酶基因轉(zhuǎn)錄翻譯位點(diǎn)(ATG)的+1252和+1271bp之間)，和Abridged錨引物(試劑盒中提供)以及HotStarTaq Polymerase(Qiagen)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的溫度循環(huán)為，首先95℃15min；然后35個(gè)循環(huán)94℃30s，55℃45s，72℃1min；最后72℃10min。
使用GSP3R(SEQ ID NO4)(定位在互補(bǔ)鏈上的+1141到+1160bp)，和試劑盒中提供的AUAP引物，以及HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)。溫度循環(huán)為，首先95℃15min；然后35個(gè)循環(huán)94℃30s，55℃45s，72℃1min；最后72℃10min。
5’RACE產(chǎn)物被TA-克隆到pCR2.1(Invitrogen)中，并使用M13正向和反向引物進(jìn)行測(cè)序。5’RACE序列鑒別出20D加氧酶mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于2OD加氧酶翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的-39bp處。
實(shí)施例42OD加氧酶基因啟動(dòng)子的分離和序列分析 實(shí)施例1和實(shí)施例2中對(duì)2OD加氧酶基因的分析說明該基因可被根部的機(jī)械損傷和昆蟲侵食所誘導(dǎo)。因此，2OD加氧酶啟動(dòng)子可被用來在根部受到機(jī)械損傷和昆蟲侵食后指導(dǎo)玉米植株中的基因表達(dá)。
從2OD加氧酶基因中分離到了長(zhǎng)約1116bp的啟動(dòng)子(SEQ IDNO1)。在2OD加氧酶基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(ATG)的-35和-29bp之間鑒別到一個(gè)推測(cè)為TATA盒的序列(圖3)。在SEQ ID NO1所述序列的遠(yuǎn)端鑒別到由TTGAC組成的兩個(gè)序列基序(相應(yīng)為“W-盒”)。受到環(huán)境脅迫時(shí)，由水楊酸誘導(dǎo)的WRKY-DNA結(jié)合蛋白識(shí)別“W-盒”基序(Chen等.，2002，Plant Cell.14559-574)。
根據(jù)從兩個(gè)EST克隆得到的EST序列使用多反復(fù)(multiplereiterative)BLASTN搜索工具在Genome Survey Sequence(GSS)數(shù)據(jù)庫中分離所述序列。每次對(duì)GSS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索時(shí)，使用從前一個(gè)搜索所得的序列沿著基因組序列進(jìn)行“步移”，直到?jīng)]有另外的重疊序列被鑒別到。GSS搜索得到在2OD加氧酶轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游597bp的序列。通過下文所述的基因組步移得到了另外一個(gè)長(zhǎng)486bp的GSS-起源的上游序列。
使用從GSS搜索得到的序列進(jìn)行基因組步移反應(yīng)，以得到更多的上游側(cè)翼序列。使用Universal Genome Walker Kit試劑盒(來自Clontech/BD Biosciences(Palo Alto，CA))完成反應(yīng)。根據(jù)試劑盒使用說明使用B73植株基因組DNA構(gòu)建基因組DNA文庫。使用PlatinumPfx DNA Polymerase(Invitrogen)進(jìn)行PCR反應(yīng)，溫度循環(huán)條件見附錄C(GeneAmp System 9600)。第一輪反應(yīng)使用GSPlGW(SEQ ID NO5)(相應(yīng)于互補(bǔ)鏈上2OD加氧酶翻譯起始位點(diǎn)的-362bp到-336bp之間的序列)和AP1引物(試劑盒中提供)進(jìn)行。第二輪反應(yīng)使用第一輪的反應(yīng)產(chǎn)物作為模版，并使用GSP2GW(SEQ ID NO6)或GSP3GW(SEQ ID NO7)序列，以及AP2引物(試劑盒中提供)。GSP2GW和GSP3GW分別相應(yīng)于互補(bǔ)鏈上2OD加氧酶翻譯起始位點(diǎn)的-442bp到-416bp之間和-468bp到-440bp的序列。第二輪反應(yīng)的產(chǎn)物DNA被克隆到TA載體pCR2.1(Invitrogen)上并進(jìn)行測(cè)序。
使用Platinum Pfx DNA Polymerase聚合酶(Invitrogen)以及寡核苷酸引物OligoXbaI(SEQ ID NO8)和OligoBamHINcoI(SEQ ID NO9)，在2X緩沖液中進(jìn)行PCR反應(yīng)以從基因組DNA中分離出2OD加氧酶啟動(dòng)子。在產(chǎn)物中引入XbaI、NcoI和BamH限制性酶位點(diǎn)以便于隨后的克隆。PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)為，首先95℃5min；然后35個(gè)循環(huán)94℃30s，60℃45s，68℃2min；最后68℃10min。
實(shí)施例52OD加氧酶啟動(dòng)子的活性 為證實(shí)被作為2OD加氧酶啟動(dòng)子序列而分離的序列具有啟動(dòng)子功能，進(jìn)行微顆粒瞬時(shí)轟擊(transient particle bombardment)實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)可快速評(píng)價(jià)受試DNA序列是否能夠指導(dǎo)基因表達(dá)。
從基因組DNA中用PCR擴(kuò)增所述的1116bp啟動(dòng)子，并克隆到表達(dá)載體中，在該序列后有B-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因以驗(yàn)證該啟動(dòng)子是否驅(qū)動(dòng)表達(dá)。使用該表達(dá)盒對(duì)3日齡的玉米籽苗進(jìn)行Biolistic轟擊，結(jié)果在胚芽鞘上可觀察到GUS著色點(diǎn)，其著色水平低于對(duì)照(對(duì)照為組成型根啟動(dòng)子Rootmetpro2(見美國(guó)專利申請(qǐng)11/022,449)，它驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá))。這些結(jié)果說明1116bp的2OD加氧酶啟動(dòng)子能夠在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的玉米細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)。
Biolistic瞬時(shí)根部表達(dá)實(shí)驗(yàn)所用的材料和方法 沿發(fā)芽紙(預(yù)先用7％的蔗糖溶液浸泡過)的邊緣放置B73種子，然后用同樣大小并經(jīng)同樣浸泡的發(fā)芽紙蓋住這些種子。隨后卷起該包有種子的兩層紙，并置于盛有7％蔗糖溶液的燒杯中，從而使得溶液可以沿著發(fā)芽紙浸潤(rùn)位于發(fā)芽紙卷頂端的種子。這樣即可使根呈直線生長(zhǎng)。27-28℃下，在黑暗中使這些種子生長(zhǎng)2-3d。轟擊前除去覆蓋胚芽鞘的外層鞘，然后將秧苗放置在無菌陪替氏平皿(60mm)上(在陪替氏平皿中鋪有一層用1mL水浸濕的Whatman#1濾紙)。每個(gè)平皿中按相對(duì)位置放置兩個(gè)秧苗，用0.5％瓊脂糖溶液將它們固定在濾紙上。
按以下方法制備轟擊用的DNA/金微?；旌衔?。取0.6-1.0微米大小的金顆粒60mg，首先用乙醇洗滌，然后用無菌蒸餾水漂洗，并用總體積為1mL的無菌水重懸浮。將此懸浮液分成50微升每份，室溫下保藏于硅化Eppendorf管中。按50μL的0.6μM金顆粒(預(yù)先洗滌)，5-10μg待測(cè)DNA，50μL2.5M CaCl2和25μL的0.1M亞精胺的順序使它們結(jié)合，從而將DNA沉淀在金顆粒的表面上。隨后立即振搖該溶液3min，并短暫離心使得DNA/金顆粒沉淀。用500μL100％乙醇洗滌DNA/金顆粒一次，并用終體積為50μL的100％乙醇重懸。-20℃下溫育DNA/金混合物至少60min，然后在每個(gè)MylarTM的大載體使用該混合物6μL。
用該DNA/金顆粒轟擊經(jīng)上文所述制備的秧苗兩次，裝置為PDS-1000/He槍(1100psi，真空壓力為27-28英寸Hg柱)。大載體和停止屏(screen)間的距離在6-8cm之間。轟擊后將平板置于密封容器中，27-28℃下在黑暗中溫育24h。
溫育18-24h后，使用轟擊過的秧苗進(jìn)行瞬時(shí)GUS表達(dá)實(shí)驗(yàn)。將秧苗浸在10-15mL的GUS實(shí)驗(yàn)緩沖液中(含100mM NaH2PO4-H2O(pH7.0)，10mM EDTA，0.5mM K4Fe(CN)6-3H2O，0.1％Triton X-100，2mM5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸化物)，37℃下在黑暗中溫育24h，用100％乙醇替換GUS著色溶液以停止反應(yīng)。在顯微鏡下觀察GUS的表達(dá)/著色情況。
實(shí)施例62OD加氧酶在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá) 使用土壤桿菌(又稱為農(nóng)桿菌(Agrobacterium))按照實(shí)施例8中所述所述方法制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植株，以得到啟動(dòng)子活性的更詳細(xì)地特征，所用方法中包括通過機(jī)械損傷和昆蟲侵食誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
將1116bp的2OD加氧酶啟動(dòng)子(SEQ ID NO1)操作性連接于Adhl內(nèi)含子和GUS基因上(簡(jiǎn)寫為20D加氧酶(Adhl內(nèi)含子1)GUS)，以通過組化著色植物組織表示的GUS酶活檢測(cè)啟動(dòng)子活性。GUS著色的模式反應(yīng)了啟動(dòng)子發(fā)揮活性的部位。引入Adhl內(nèi)含子的目的是提高基因表達(dá)，這是因?yàn)橐阎诠阮愔参锛?xì)胞的基因結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)含子可以提高外源基因的表達(dá)(Callis等.(1987)Genesand Development 11183-1200；Kyozuka等.(1990)Maydica 35353-357)。
在正常生長(zhǎng)條件下，機(jī)械損傷條件下和CRW侵食條件下，測(cè)試了V5階段的植株(5頸圈葉)。使用鋸齒鉗折斷約1英寸長(zhǎng)的根尖，從而在2OD加氧酶植株的節(jié)根引入機(jī)械損傷，并在損傷后的24h采集組織樣本。在罐中的根下放置約100個(gè)第二齡的CRW幼蟲，從而引入CRW侵食。48h后收集葉和根。在以上兩種處理前也對(duì)植株進(jìn)行測(cè)試(即在正常溫室條件下)，以為計(jì)算每種處理的誘導(dǎo)水平提供基準(zhǔn)。
在不經(jīng)任何處理的溫室植株中基本沒有表達(dá)。但是機(jī)械損傷引起表達(dá)，每個(gè)處理的植株均表現(xiàn)出GUS的誘導(dǎo)表達(dá)。有趣的是，這種表達(dá)僅位于損傷部位，而在損傷的鄰近部位和根部損傷的上游部分都沒有檢測(cè)到表達(dá)。
這種定位反應(yīng)也出現(xiàn)在CRW侵食實(shí)驗(yàn)中。在被CRW損傷或穿透的根部部位及鄰近部位的根組織觀察到GUS表達(dá)。但不同于機(jī)械損傷，在CRW侵食根的根尖上游部分以及在根成熟區(qū)內(nèi)部，都可檢測(cè)到表達(dá)。在這些植株的葉中沒有觀察到表達(dá)，這與機(jī)械損傷植株的表現(xiàn)相似?？傊?，這些結(jié)果表明2OD加氧酶啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植株的根部是可誘導(dǎo)的。
對(duì)R1-R2階段的植株(表征是出須和落粉)的花粉、穗(tassels)和須(silks)中的2OD加氧酶驅(qū)動(dòng)的表達(dá)進(jìn)行鑒定。在所有植株的花粉中都沒有觀察到表達(dá)。但是在穗中，GUS組化分析結(jié)果表明大約有一半的植株樣本發(fā)生了GUS活性著色。該組織著色的水平往往較低，并且與根部的著色水平相比，僅相當(dāng)或低于根部水平。而須分析表明，除一株外所有植株都有一定水平的GUS表達(dá)。不是在所有須絲(strand)上都有表達(dá)，而是在每個(gè)樣本中有約5-50％的須絲發(fā)生了表達(dá)。這些表達(dá)幾乎都位于位于脈管(vein)中，但須絲的整體著色不一致。
對(duì)植物組織進(jìn)行組化著色以分析GUS活性 從轉(zhuǎn)化植株中采集組織，并置于盛有0.5-5mL GUS實(shí)驗(yàn)緩沖液(實(shí)施例5中所述的實(shí)驗(yàn)緩沖液)的48、12或6孔板中檢測(cè)GUS活性。將板置于室內(nèi)真空系統(tǒng)中10min，然后37℃下溫育過夜。室溫下在100％乙醇中連續(xù)溫育1-3個(gè)12h時(shí)段，以清洗組織著色。然后將組織在4℃下保藏于乙醇中。
實(shí)施例8農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的再生 按照Zhao所述的方法(美國(guó)專利5,981,840，(下文稱作‘840專利)和PCT專利申請(qǐng)WO98/32326，它們通過引用并入本文)使用實(shí)施方案的2OD加氧酶啟動(dòng)子通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米。
在800培養(yǎng)基的主平板上28℃下黑暗中培養(yǎng)農(nóng)桿菌3d，然后保藏于4℃下(時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月)。在810培養(yǎng)基農(nóng)桿菌工作板上，28℃下黑暗中溫育1-2d。
簡(jiǎn)短來說，胚芽從新鮮無菌玉米穗(ear)中分出，并保持在561Q培養(yǎng)基中直至收集到所有需要的胚芽。然后使胚芽與農(nóng)桿菌懸浮液(叢工作板制得)相接觸，農(nóng)桿菌含有包含了實(shí)施方案所述啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒。在562平板上共培養(yǎng)胚芽和農(nóng)桿菌，如‘840專利所述將胚芽軸朝下(axis down)置于平板。
在562P培養(yǎng)基中一周后，將胚芽轉(zhuǎn)移到563Q培養(yǎng)基中。在新鮮563Q培養(yǎng)基中次培養(yǎng)胚芽，每?jī)芍芨鼡Q一次培養(yǎng)基，并在相同條件下繼續(xù)溫育。經(jīng)選擇在6-8周后開始出現(xiàn)愈傷組織。
當(dāng)愈傷組織達(dá)到合適大小后，將它們轉(zhuǎn)移到再生(288W)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在黑暗中保持2-3周以起始植株再生。體細(xì)胞胚成熟后，將充分發(fā)育的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到再生272V培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)室中以進(jìn)行再生。約7-10d后，將發(fā)育中的幼苗轉(zhuǎn)移到不含激素的272V培養(yǎng)基試管中，保持7-10d直到幼苗充分長(zhǎng)大。然后將植株轉(zhuǎn)移到含有盆栽土的育苗盤(flats)(相當(dāng)于2.5”罐)中的插入式培養(yǎng)板(inserts)中，并在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)1周，隨后在溫室中再培養(yǎng)1-2周，然后轉(zhuǎn)移到的常規(guī)的600罐中(1.6加侖)并培養(yǎng)至成熟。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因玉米再生過程中使用的培養(yǎng)基 561Q培養(yǎng)基含有4.0g/L N6基本鹽類(basal salts)(SIGMA C-1416)，1.0mL/L Eriksson＇sVitamin Mix復(fù)合維生素(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L鹽酸硫胺，68.5g/L蔗糖，36.0g/L葡萄糖，1.5mg/L2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸(用KOH調(diào)節(jié)到pH5.2后用蒸餾水定容)，2.0g/L GelriteTM(用dI H2O定容后添加)，8.5mg/L硝酸銀(培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。
800培養(yǎng)基含有50.0mL/L母液A和850mL dI H2O，用dI H2O補(bǔ)足定容所缺少的l00mL/L(brought to volume minus 100mL/L withdI H2O)，然后加入9.0g植物瓊脂。滅菌并冷卻后，加入50.0mL/L母液B以及5.0g葡萄糖和2.0mL的50mg/mL大觀霉素母液。母液A含有60.0g K2HPO4和20.0g單堿性磷酸鈉(磷酸二氫鈉)，溶解在950mL水中，用KOH調(diào)節(jié)到pH7.0后用dI H2O定容到1.0L。母液B含有20.0g NH4Cl，6.0g MgSO4·H2O，3.0g氯化鉀，0.2gCaCl2，0.05g FeSO4·7H2O，均用蒸餾水定容，滅菌并冷卻。
810培養(yǎng)基含有5.0g酵母提取物(Difco)，10.0g蛋白胨(Difco)，5.0g NaCl，溶解在dI H2O中，調(diào)節(jié)到pH6.8后定容，然后加入15.0g細(xì)菌瓊脂，滅菌并冷卻，然后加入1.0mL的50mg/mL大觀霉素母液。
562P培養(yǎng)基含有4.0g/L N6基本鹽類(SIGMA C-1416)，1.0mL/LEriksson＇s Vitamin Mix復(fù)合維生素(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L鹽酸硫胺，30.0g/L蔗糖，2.0mg/L 2，4-D(用KOH調(diào)節(jié)到pH5.8后dI水定容)，3.0g/L GelriteTM(用蒸餾水定容后添加)，0.85mg/L硝酸銀和1.0mL的100mM乙酰丁香酮母液(都在培養(yǎng)基滅菌并冷卻后添加)。
5630培養(yǎng)基含有4.0g/LN6基本鹽類(SIGMA C-1416)，1.0mL/L Eriksson＇s Vitamin Mix復(fù)合維生素(1000x SIGMA-1511)，0.5mg/L鹽酸硫胺，30.0g/L蔗糖，1.5mg/L2，4-D，0.69g L-脯氨酸，和0.5g MES緩沖液(用KOH調(diào)節(jié)到pH5.8后用去離子(D-I)水定容)。然后加入6.0g/L UltrapureTM瓊脂-瓊脂(EM Science)，隨后培養(yǎng)基滅菌并冷卻。然后再加入0.85mg/L硝酸銀，3.0mL的1mg/mLBialaphos母液，和2.0mL的50mg/mL羧芐青霉素母液。
288W含有4.3g/L MS鹽(GIBCO 11117-074)，5.0mL/L MS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/L鹽酸硫胺、0.10g/L鹽酸吡哆辛、0.40g/L甘氨酸(用精制(polished)D-I H2O定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15473)、100mg/L肌(myo)-肌醇、0.5mg/L玉米素和60g/L蔗糖，調(diào)節(jié)到pH5.6后用精致去離子水定容。隨之加入6.0g/L的UltrapureTM瓊脂-瓊脂(EM Science)，隨后培養(yǎng)基滅菌并冷卻。再加入1.0mL/L的0.1mM脫落酸、1.0mg/L吲哚乙酸和3.0mg/L Bialaphos以及2.0mL的50mg/mL羧芐青霉素母液。
無激素培養(yǎng)基(272V)含有4.3g/L MS鹽(GIBCO 11117-074)，5.0mL/L MS維生素母液(0.100g/L煙酸、0.02g/L鹽酸硫胺、0.10g/L鹽酸吡哆辛、0.40g/L甘氨酸(用精制去離子水定容)、0.1g/L肌(myo)-肌醇、40.0g/L蔗糖調(diào)節(jié)到pH5.6后用精制去離子水定容)、6g/L Bacto-瓊脂(用精致去離子水定容后添加)，然后對(duì)培養(yǎng)基滅菌并冷卻到60℃。
發(fā)明詳述中涉及到的所有公布說明書和專利申請(qǐng)對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員來說都是可理解的。當(dāng)每篇單獨(dú)的發(fā)明公開和發(fā)明申請(qǐng)都被具體的通過個(gè)別引用并入本文時(shí)，所有公開和發(fā)明申請(qǐng)都通過相同程度的引用結(jié)合至本文。
盡管在上文已經(jīng)通過說明和實(shí)施例為了清晰理解的目的對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了闡述，但顯然可以在附錄的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行一定的變化和修改。
序列表
<110>Pioneer Hi-Bred International,Inc.
E.I.DuPont de Nemours & Co。
<120>A ROOT-PREFERRED，WOUND-AND INSECT-INDUCIBLE
2-OXOGLUTARATE-DEPENDENT OXYGENASE PROMOTER FROM MAIZE AND
ITS USE
<130>1887-PCT
<150>60/636,890
<151>2004-12-17
<160>9
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1116
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>1
gtcgacatgt cacgttatca atgtagagac tgataaaaat ttgactctgt ttcgtgaaag 60
ttgacatgca ctatgtgtag aaacctagcc ggccttcaca tgaaatcata aaacttctac 120
ggaggtcggc taggtttgta tacacaacac tcgacaaaga aggcatatct ggaaaccgat 180
atggcttttt tttataagtg ttgtagtcct gacactcgac aaagaagctc catttgccga 240
gtgcctccca gcacacttgg caaagtgact ggcaaagggg cccactattg ccccctttgt 300
cgagagtgcc aggctggcag tcactcgaca aagatgctcc ctttgccaag tgtcaattgc 360
ggctctcggc acaaaggctg tcgtgggggc ccactggagc cttatttgcc gagtgtcacg 420
ccagcaggca ctcgataaag gcttccttt tgccgagtgc cattgaggac actcgacata 480
gtctctgtca ccatcacttg tcgctgtcac ggcaatttt ctttgccgag cactagggga 540
cacttggtaa agactttgcc gagtgtccga cataatgcta tcggtaaaga ggtcgttgct 600
gatgtacagt tcactgagtc ctttttacta agtgtcacac tcgacaaaga gtttgttgag 660
tgttttttag gctttgccga gtgcttgcga cactcggcaa agcagtatgt tttggtagtg 720
aggtcgttgt cgataaacag ttcaccgatc cctatttgcc gaatgctaca ctcgaagtgc 780
cgcaggcact cgggaaagaa ccctgtttcg gttgtgactt ggtattgtta ggctgtgtat 840
tgaatccaat gctatcacat tagatataaa ctagataacc gcgtatacag tgttttattc 900
gataaaactc taccctctcc tatgaaactg tctctatatc tttcctctta attacagtca 960
tgttccgcac atgatgctgt atcaccgcac atggagagag agaaaaatag attggtcagg 1020
ctgtttgtat atgcaaggcc tacgcttcta tttaaagacc gtatcgtggt tgcaggcaga 1080
agcacacaag ctagcaattg aaaaaaaaaa caggca1116
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP1R
<400>2
cacaaaggta ccacacacac 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP2R
<400>3
tctgcggatg aagggaatgg 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP3R
<400>4
caagactaga cgtggtgtgc20
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP1GW
<400>5
gcctgcggca cttcgagtgt agcattc 27
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP2GW
<400>6
tactgctttg ccgagtgtcg caagcac 27
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物GSP3GW
<400>7
cactcggcaa agcctaaaaa acactcaac 29
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物OligoXbaI
<400>8
cgcgtctaga gtcgacatgt cacgttatc 29
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物OligoBamHINcoI
<400>9
gcggtcggag ccatggatcc tgcctg26
App.Ref.1887-PCT
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，所述核酸分子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1中所示序列的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列；
b)含有專利保藏號(hào)為PTA-6278的質(zhì)粒的植物啟動(dòng)子序列的核苷酸序列，或其互補(bǔ)序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄；和
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述序列在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄。
2.一種DNA構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有權(quán)利要求1的核苷酸序列，該核苷酸操作性連接于目的異源核苷酸序列。
3.一種載體，所述載體含有權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體。
4.一種植物細(xì)胞，所述細(xì)胞含有穩(wěn)定整合入其基因組的權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體。
5.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
6.權(quán)利要求5的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物是玉米。
7.權(quán)利要求4的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
8.一種植物，所述植物含有穩(wěn)定整合入其基因組的權(quán)利要求2的DNA構(gòu)建體。
9.權(quán)利要求8的植物，其中所述植物是單子葉植物。
10.權(quán)利要求9的植物，其中所述單子葉植物是玉米。
11.權(quán)利要求8的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
12.一種權(quán)利要求8的植物的轉(zhuǎn)基因種子。
13.權(quán)利要求8的植物，其中所述目的異源核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物賦予植物對(duì)除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
14.一種在植物體中表達(dá)核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物體導(dǎo)入DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體含有啟動(dòng)子及操作性連接于所述啟動(dòng)子的目的異源核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列；
b)含有專利保藏號(hào)為PTA-6278的質(zhì)粒的植物啟動(dòng)子序列的核苷酸序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物中起始轉(zhuǎn)錄；和
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述植物是單子葉植物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述單子葉植物是玉米。
18.權(quán)利要求14的方法，其中所述的異源核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物賦予植物對(duì)除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
19.權(quán)利要求1 4的方法，其中所述目的異源核苷酸序列在根部選擇性表達(dá)。
20.一種在植物細(xì)胞中表達(dá)核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物細(xì)胞導(dǎo)入DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體含有操作性連接于目的異源核苷酸序列的啟動(dòng)子，其中所述啟動(dòng)子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列；
b)含有專利保藏號(hào)為PTA-6278的質(zhì)粒的植物啟動(dòng)子序列的核苷酸序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄；和
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述單子葉植物是玉米。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述的異源核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物賦予植物對(duì)除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
25.一種在植物根部選擇性表達(dá)核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物細(xì)胞導(dǎo)入DNA構(gòu)建體，并從所述植物細(xì)胞出發(fā)再生出轉(zhuǎn)化植株，所述DNA構(gòu)建體含有啟動(dòng)子及操作性連接于所述啟動(dòng)子的目的異源核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子含有的核苷酸序列選自
a)含有SEQ ID NO1所示序列的核苷酸序列；
b)含有專利保藏號(hào)為PTA-6278的質(zhì)粒的植物啟動(dòng)子序列的核苷酸序列；
c)含有SEQ ID NO1所示序列中的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其中所述序列在植物根部細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄；
d)包含的序列與SEQ ID NO1所示序列至少有95％序列同一性的核苷酸序列，其中所述序列在植物根部細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述異源核苷酸序列的表達(dá)改變了所述植物的表型。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述植物是單子葉植物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的單子葉植物是玉米。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述植物是雙子葉植物。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述的異源核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物賦予植物對(duì)除草劑、鹽、低溫、干旱、病原體或昆蟲的抗性。
全文摘要
本發(fā)明提供了在植物體中調(diào)節(jié)異源核苷酸序列表達(dá)的組合物和方法。組合物包括一種用于2-酮戊二酸依賴型玉米加氧酶編碼基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的新型核苷酸序列。提供了使用本文所公開的啟動(dòng)子序列在植物中表達(dá)異源核苷酸序列的方法。該方法包括，在植物細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合一段操作性連接本發(fā)明根部?jī)?yōu)先啟動(dòng)子的核苷酸序列，并再生表達(dá)該核苷酸序列的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物體。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101146910SQ200580048126
公開日2008年3月19日 申請(qǐng)日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者S·迪恩, 盧偉柏, B·F·麥卡琴, L·E·辛斯, K·R·沃德 申請(qǐng)人:先鋒高級(jí)育種國(guó)際公司, 納幕爾杜邦公司