專利名稱：：選擇her抑制劑療法的患者的制作方法選擇HER抑制劑療法的患者發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明關(guān)注基于基因表達(dá)分析來(lái)選擇HER抑制劑療法的患者的方法，所述HER抑制劑諸如Pertuzumab。本發(fā)明還關(guān)注通過(guò)基因表達(dá)分析來(lái)評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法。發(fā)明背景HER2受體及針對(duì)它的抗體受體酪氨酸激酶的HER家族是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要介質(zhì)。該受體家族包括四個(gè)不同成員，包括表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR、ErbBl或HER1)、HER2(ErbB2或pl85"e")、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。由w犯l基因編碼的EGFR已經(jīng)有原因的與人惡性腫瘤聯(lián)系起來(lái)。具體而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中觀察到EGFR表達(dá)升高。EGFR受體表達(dá)升高常常與同一腫瘤細(xì)胞的EGFR配體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子oc(TGF-a)的產(chǎn)量升高有關(guān)，通過(guò)自分泌刺激途徑導(dǎo)致受體活化。BaselgaandMendelsohn,/Twrmac.7Tz^:64:127-154(1994)。針對(duì)EGFR或其配體TGF-a和EGF的單克隆抗體已經(jīng)作為治療此類惡性腫瘤的治療劑進(jìn)4亍了"^N古。參見例^口BaselgaandMendelsohn,見上文；MasuiWa/.，Ca"ceri^ewr/244:1002-1007(1984);Wu"a/"JC7/"./"ve"95:1897-1905(1995)。HER家族的第二個(gè)成員pl85"e"最初鑒定為來(lái)自化學(xué)處理大鼠的成神經(jīng)細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物。朋w原癌基因的活化形式源自所編碼蛋白質(zhì)跨膜區(qū)+的點(diǎn)突變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中觀察到的人同系物的擴(kuò)增，而且這與預(yù)后不良有關(guān)(Slamon"a/.，6Wewce235:177-182(1987);Slamon5We"ce244:707-712(1989);美國(guó)專利第4,968,603號(hào))。迄今為止，對(duì)于人腫瘤尚無(wú)"w原癌基因中與之類似的點(diǎn)突變的報(bào)道。在其它癌中也已觀察到HER2的過(guò)表達(dá)(頻繁但不均一，原因在于基因擴(kuò)增)，包括胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰和膀胱的癌。參見King"a/.，6W置e229:974(1985);Yokota&a/.，1:765-767(1986);Fukushigeefa/"Mo/.Ce//說(shuō)o/.6:955-958(1986》Guerina/,,ie義3:21-31(1988);Cohenda/.，O腳g麼4:81-88(1989);Yonemuraaa/"C露erL51:1034(1991);Borstefa/.,G戸co/.38:364(1990);Weiner"a/"L50:421-425(1990);Kem&"/，C騰erL50:5184(1990);Park"a/"M49:6605(1989);Zhau&a/.,Mo/.C頻'呵.3:254-257(1990);Aaslandda/.,JCa"cer57:358-363(1988);Williamse/a/"尸a&o&o/ogy59:46-52(1991);McCannefa/"Ca"cer65:88-92(1990)等等。HER2可在前列腺癌中過(guò)表達(dá)(Guefa/.,Ca"cai:e".99:185-9(1996);Ross"a/"http://聽.尸涵o/.28:827-33(1997);RossefO膨r79:2162-70(1997);Sadasivane^/"Jt/ra/.150:126-31(1993))。針對(duì)大鼠pi85"e"和人HER2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體已有記載。Drebin及其同事制備了針對(duì)大鼠"ew基因產(chǎn)物，pl85""的抗體。參見例如Drebin"a/.,CW/41:695-706(1985);Myers"a/"Me仇198:277-290(1991);WO94/22478。Drebin"a/"O"coge"e2:273-277(1988)報(bào)道了與pl85"e"的兩個(gè)不同區(qū)域有反應(yīng)性的抗體混合物對(duì)植入棵鼠的轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。還可參見1998年10月20日公告的美國(guó)專利第5,824,311號(hào)。Hudziak"a/"Mo/.Ce〃.Ao/.9(3):1165-1172(1989)描述了一組HER2抗體的生成，并使用人乳瘤細(xì)胞系SK-BR-3表征。將SK-BR-3細(xì)胞暴露于抗體后72小時(shí)通過(guò)細(xì)胞單層的結(jié)晶紫染色測(cè)定了相對(duì)細(xì)胞增殖。利用此測(cè)定法，用稱作4D5的抗體獲得了最大抑制，它抑制細(xì)胞增殖達(dá)56%。該組其它抗體在此測(cè)定法中以較低程度降低細(xì)胞增殖。還發(fā)現(xiàn)抗體4D5使過(guò)表達(dá)HER2的乳瘤細(xì)胞系對(duì)TNF-a的細(xì)胞毒性作用敏化。還可參見1997年10月14日公告的美國(guó)專利第5,677,171號(hào)。Hudziak等人的文章中所討論的HER2抗體在下列文獻(xiàn)中進(jìn)行了進(jìn)一步表征Fendlyef<a/.,Ga打ceriesearc/z50:1550-1558(1990);Kottsa/"/"26(3):59A(1990);Sarupaa/.，OcwAiegw/加'ow1:72-82(1991);Shepardefa/.,■/C7/"./畫畫/.11(3):117-127(1991);Kumar"a/"Mo/.CW/.J5/o/.11(2):979-986(1991);LewisC朋cer/mmwo/./mm，of/^37:255-263(1993》Pietrasda/.，Ozcogewe9:1829-1838(1994);VitettaWa/.，Ca"ceriesearc/z54:5301-5309(1994);Sliwkowski&a/.,Ozew.269(20):14661-14665(1994);Scott&a/.，7!歷o/.C7^w.266:14300-5(1991);D'souza&a/.，尸rac.7V^/.5W.91:7202-7206(1994);Lewis<3/.,Cawceriayea/r/z56:1457-1465(1996);Schaefer(9"cog^7e15:1385-1394(1997)。鼠HER2抗體4D5的重組人源化型式(huMAb4D5-8、rhuMAbHER2、Trastuzumab或HERCEPTIN;美國(guó)專利第5,821,337號(hào))在臨床上對(duì)患有HER2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌并已接受大量現(xiàn)有抗癌療法的患者起作用(Baselgaefa/.,/C"打.(9腳/.14:737-744(1996))。Trastuzumab在1998年9月25日得到了美國(guó)食品和藥品管理局的銷售許可，可用于治療其腫瘤過(guò)表達(dá)HER2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。下列文獻(xiàn)中記載了具有各種特性的其它HER2抗體Tagliabuee/a/.，/"AJC露er47:933-937(1991);McKenzieda/"4:543-548(1989);Maierda/"Ca"cez-51:5361-5369(1991》Bacusa/"M/ecw/orC固'"，固;y3:350-362(1990);Stancovski"a/"卩,」88:8691-8695(1991);Bacus"a/"C露er7e廳w/z52:2580-2589(1992);Xu"a/"/"A/Ca"cer53:401-408(1993);WO94/00136;Kasprzykda/"Ca"cwie化"/r/z52:2771-2776(1992);HancockdCa"cer51:4575-4580(1991);Shawveraa/.，C離erL54:1367-1373(1994);Arteagada/"Ca膨rL54:3758-3765(1994);Harwerth編.CTz綴267:15160-15167(1992);美國(guó)專利第5,783,186號(hào)；Klapper自/"(9"cog潔14:2099-2109(1997)。同源性篩選使得HER受體家族的兩個(gè)其它成員得以鑒定HER3(美國(guó)專利第5,183,884和5,480,968號(hào)以及Krausa/.,iWJS86:9193-9197(1989))和HER4(歐洲專利申請(qǐng)第599,274號(hào)；Plowman"a/.,A^/.爿c^/.<SW.固90:1746-1750(1993);Plowmand。/.，淑,366:473-475(1993))。這兩種受體均在至少有些乳腺癌細(xì)胞系中展示出表達(dá)升高。HER受體在細(xì)胞中通常以多種組合發(fā)現(xiàn)，而且認(rèn)為異二聚化增加了對(duì)各種HER配體的纟田月包應(yīng)答的多樣性(Earp&"/.，萬(wàn)reasfOwcwiaseorc/zaw/腸加W35:115-132(1995))。EGFR受到6種不同配體的結(jié)合:表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子oc(TGF-a)、雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)、betacellulin和epiregulin(Groenena/.，Grawf/zFactors11:235-257(1994))。由單一基因的可變剪接產(chǎn)生的一個(gè)調(diào)蛋白蛋白質(zhì)家族是HER3和HER4的配體。調(diào)蛋白家族包括a、P和y調(diào)蛋白(Holmes&a/.,Sc/認(rèn)e256:1205-1210(1992);美國(guó)專利第5,641,869號(hào)；Schaeferefa/.，O"coge"e15:1385-1394(1997));neu分化因子(NDF);神經(jīng)月交質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF);乙酰膽石咸受體誘導(dǎo)活性(ARIA);及感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元書f生因子(SMDF)。有關(guān)綜述參見Groenena/"GrawAFactor11:235-257(1994);Lemke,G.，Mo/ec.cfeCe〃.7Ve腳sc/.7:247-262(1996);Leea/.，fto"m.iev.47:51-85(1"5)。最近鑒定了另外三種HER配體神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)，據(jù)報(bào)道它結(jié)合HER3或HER4(Chang"a/.，Ato""387:509-512(1997);CarrawayeM/.,A^wre387:512-516(1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3，它結(jié)合HER4(Zhange^/.,/WASYL/"&i)94(18):9562-7(1997));和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4,它結(jié)合HER4(Harari&a/"O"coge"e18:2681-89(1999))。HB-EGF、betacellulin和epiregulin也結(jié)合HER4。盡管EGF和TGFa不結(jié)合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成異二聚體，它活化EGFR并導(dǎo)致異二聚體中HER2的轉(zhuǎn)磷酸作用。二聚化作用和/或轉(zhuǎn)磷酸作用看來(lái)活化HER2酪氨酸激酶。參見Earp"a/.，見上文。同樣，當(dāng)HER3與HER2共表達(dá)時(shí)，形成有活性的信號(hào)復(fù)合物，而針對(duì)HER2的抗體能夠破壞此復(fù)合物(Sliwkowski"a/.,/腸/.CTzem.269(20):14661-14665(1994))。另外，在與HER2共表達(dá)時(shí)，HER3對(duì)調(diào)蛋白(HRG)的親和力升高到更高的親和力狀態(tài)。關(guān)于HER2-HER3蛋白質(zhì)復(fù)合物還可參見Leviefa/"Jow"a/o/A^waydewce15:1329-1340(1995);Morrisseyefa/"尸rac.層.^cad5W.園92:1431-1435(1995);Lewis&a/"C鬆erM56:1457-1465(1996)。HER4,與HER3類似，與HER2形成有活性的信號(hào)復(fù)合物(CarrawayandCantley，Ce〃78:5隱8(1994))。卵巢癌卯巢癌是來(lái)自女性生殖道惡性腫瘤的最常見死因。估計(jì)美國(guó)每年有24,000例新診斷，有大約13,000人死于該病。晚期卵巢癌患者通常用基于鉑的化療法處置，常常與紫杉烷聯(lián)合。在這些藥劑失敗后，就只有^[艮少的治療選擇了?；笺K敏感性疾病的患者常常用鉑復(fù)治，但相當(dāng)一部分患者在復(fù)治后只有短暫的響應(yīng)持續(xù)時(shí)間。對(duì)于那些患鉑耐受性疾病的，結(jié)果就不太有利。托泊替康(topotecan)得到食品和藥品管理局(FDA)的批準(zhǔn)用于初始或后續(xù)化療失敗的患者；多柔比星(doxorubicin)脂質(zhì)體只得到批準(zhǔn)用于基于鉑和紫杉醇(paclitaxd)的化療方案均難以治愈的卵巢癌患者。托泊替康和多柔比星脂質(zhì)體已在鉑耐受性疾病患者中分別顯示出6%和12%的部分響應(yīng)率，有14-18周的中值無(wú)進(jìn)展存活。最近，報(bào)道了吉西他濱(gemcitabine)在鈾耐受性卵巢癌中部分響應(yīng)為16%的有希望結(jié)果，導(dǎo)致越來(lái)越多的將此藥劑用作第二梯隊(duì)療法。然而，顯然需要新的和改良的治療選擇用于現(xiàn)有療法失敗的晚期卵巢癌患者。受體酪氨酸激酶的HER家族牽涉卵巢癌的發(fā)病機(jī)理。為了耙向HER信號(hào)途徑，將Pertuzumab(rhuMAb2C4)開發(fā)成抑制HER2與其它HER受體二聚化的人源化抗體，由此抑制配體驅(qū)動(dòng)的磷酸化和活化，及RAS和AKT途徑的下游激活。吉西他濱已經(jīng)用于多種腫瘤，并且指明用于胰癌和肺癌。單獨(dú)使用藥劑吉西他濱的最常見毒性包括血細(xì)胞減少，貧血和嗜中性粒細(xì)胞減少的發(fā)生率分別為68%和63%。另一常見的毒性是惡心和嘔吐，聯(lián)合發(fā)生率為69%,三級(jí)為13%，四級(jí)為1%。腹瀉的發(fā)生不太頻繁，為19%。皮滲的發(fā)生更為常見，為30%,三級(jí)發(fā)生率只有1%。吉西他濱已經(jīng)與許多其它化療劑4關(guān)合，諸如紫杉烷、蒽環(huán)類抗生素和鉑，沒(méi)有任何顯著的毒性增加或未預(yù)料到的毒性。Trastuzumab已經(jīng)在二期試驗(yàn)中在不同化療劑的幾種組合中與吉西他濱聯(lián)合，而且耐受同樣良好，未觀察到心臟毒性或未預(yù)料到的毒性。Safranda/.,尸rac.顛.5bcC7/w.0"co/.20:130a(2001);Millerda/"(9,/ogy15(2):38-40(2001)。關(guān)于Trastuzumab和吉西他濱的聯(lián)合還可參見Zinner^a/.,爿m.Soc.C7/w.(9wco/.20:328a(2001);Nagourneyefo/.，5reos/Ca〃cerie義7>ea/.57:116,Abstract475(1999);Bunaa/.，iVoc.爿附.A^oc.Cawc.41:719,Abstract#4571(2000);Konecnya/.，C羅er組r固f.57:114,Abstract467(1999);O'Shaugnessyda/.，5"度(9腳/.2(suppl3):22-26(2004);Sledgea/.,<Sem.(9"co/.2(suppl3):19-21(2003);ZinnerZ^w"gCa"cer44(1):99-110(2004);Gatzemeierda/.,^肌。/0腳/.15:19-27(2004)。在Omnitarg作為單一藥劑用于治療實(shí)體瘤的一期試馬全中，用Pertuzumab處置3名晚期卵巢癌患者。一人具有持久的部分響應(yīng)，而另一名受試者病情穩(wěn)、定了15周。Agusa/.,Prac.Jw.5bc.C"".0"co/.22:192,Abstract771(2003)。診斷劑用HER2抗體Trastuzumab處置的患者通常是基于HER2過(guò)表達(dá)/擴(kuò)增而為療法選擇的。參見例如WO99/31140(Paton等人)、US2003/0170234A1(Hellmann,S,)和US2003/0147884(Paton等人)；以及WO01/89566、US2002/0064785和US2003/0134344(Mass等人)。關(guān)于檢測(cè)HER2過(guò)表達(dá)和擴(kuò)增的免疫組化(IHC)和焚光原位雜交(FISH)還可參見Cohen等人的US2003/0152987。WO2004/053497(Bacus等人)涉及測(cè)定或預(yù)測(cè)對(duì)HERCEPTIN⑧療法的響應(yīng)。US2004/013297A1(Bacus等人)關(guān)注測(cè)定或預(yù)測(cè)對(duì)ABX0303EGFR抗體療法的響應(yīng)。WO2004/000094(Bacus等人)致力于測(cè)定對(duì)GW572016,一種小分子，EGFR-HER2酪氨酸激酶抑制劑的響應(yīng)。WO2004/063709(Amler等人)涉及用于測(cè)定對(duì)EGFR抑制劑，鹽酸erlotinib的敏感性的生物標(biāo)志和方法。US2004/0209290(Cobleigh等人)關(guān)注乳腺癌預(yù)后的基因表達(dá)標(biāo)志。關(guān)注Pertuzumab及其療法的患者選纟奪的專利出版物包括WOO1/00245(Adamsetal.);US2003/0086924(Sliwkowski，M.);US2004/0013667A1(Sliwkowski,M.);及WO2004/008099A2和US2004/0106161(Bossenmaieretal.)。Croninetal.,Am.J.Path.164(1):35-42(2004)描述了存檔石蠟包埋組織中基因表達(dá)的測(cè)量法。Maetal.,CancerCell5:607-616(2004)描述了使用取自存檔原代活檢的腫瘤組織切片的分離RNA通過(guò)基因寡核苷酸微陣列的基因制譜。發(fā)明概述本發(fā)明，至少部分，涉及某些基因的表達(dá)譜可充當(dāng)測(cè)定HER磷酸化或活化的代替物的發(fā)現(xiàn)。這在所測(cè)試樣品是固定后的標(biāo)本時(shí)特別有利，因?yàn)榭煽吭u(píng)估固定后的組織或腫瘤樣品中的HER2磷酸化存在技術(shù)挑戰(zhàn)。篩選顯示出期望表達(dá)語(yǔ)的患者將導(dǎo)致鑒定出可從HER抑制劑諸如Pertuzumab獲得更大臨床收益的患者亞群。因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的方法，包括對(duì)患者施用有效治療癌癥量的HER抑制劑，其中來(lái)自患者的腫瘤樣品表達(dá)兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體。另外，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的方法，包括對(duì)患者施用有效治療癌癥量的HER抑制劑，其中來(lái)自患者的腫瘤樣品表達(dá)betacdlulin或雙調(diào)蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明關(guān)注用于治療癌癥的方法，包括對(duì)患者施用有效治療癌癥量的結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域II的HER2抗體，其中來(lái)自患者的肺瘤樣品表達(dá)HER2和EGFR或HER3,以及betacellulin或雙調(diào)蛋白。本發(fā)明還涉及評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法，包括測(cè)定樣品中兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體的表達(dá)，其中兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體表達(dá)指示樣品中有HER磷酸化或活化。同樣，本發(fā)明涉及評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法，包括測(cè)定樣品中betacellulin或雙調(diào)蛋白的表達(dá)，其中betacellulin或雙調(diào)蛋白表達(dá)指示樣品中有HER磷酸化或活化。在還有一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定HER二聚化抑制劑療法的患者的方法，包括測(cè)定來(lái)自患者的樣品中兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體的表達(dá)，其中HER受體和HER配體表達(dá)指示患者有可能響應(yīng)HER二聚化抑制劑療法。在還有一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及用于治療卵巢癌的方法，包括對(duì)患者施用有效治療卵巢癌量的HER抑制劑，其中來(lái)自患者的腫瘤樣品表達(dá)betacellulin或雙調(diào)蛋白。附圖簡(jiǎn)述圖l提供了HER2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖，及其胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域I-IV的氨基S臾序列(分別是SEQIDNo.19-22)。圖2A和2B描繪了鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VO(圖2A)和重鏈可變區(qū)(Vh)(圖2B)(分別是SEQIDNo.1和2);人源化2C4型式574的VL和VH結(jié)構(gòu)域(分別是SEQIDNo.3和4);及人VL和VH共有框架(humk1，輕鏈k亞組I;humIII，重鏈亞組III)(分別是SEQIDNo.5和6)的氨基酸序列對(duì)比。星號(hào)標(biāo)示人源化2C4型式574和鼠單克隆抗體2C4之間或人源化2C4型式574和人框架之間的差異?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)包在括號(hào)中。圖3A和3B顯示了Pertuzumab輕鏈和重鏈的氨基酸序列(分別是SEQIDNo.13和14)。CDR以粗體顯示。輕鏈和重鏈的計(jì)算分子量是23,526.22Da和49,216.56Da(半胱氨酸為還原形式)。碳7JM匕合物模塊(m0iety)附著于重鏈的Asn299。圖4以圖描述了2C4在HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)處的結(jié)合，由此阻止與活化的EGFR或HER3的異二聚化。圖5描繪了HER2/HER3與MAPK和Akt途徑的偶聯(lián)。圖6比4交了Trastuzumab和Pertuzumab的各種活性。圖7A和7B分別顯示了Trastuzumab輕鏈(圖7A;SEQIDNo.15)和重鏈(圖7B;SEQIDNo.16)的氨基酸序列。圖8A和8B分別描繪了變體Pertuzumab輕鏈序列(圖8A;SEQIDNo.17)和變體Pertuzumab重鏈序列(圖8B;SEQIDNo.18)。圖9A和9B顯示了常常在IgG抗體中觀察到的寡糖結(jié)構(gòu)。圖10顯示了使用通過(guò)AFFYMETRIX⑥微陣列表達(dá)制譜測(cè)定的HER2、EGFR、HER3和betacellulin的mRNA表達(dá)值，對(duì)來(lái)自已知處于HER2磷酸化狀態(tài)的卵巢癌患者的25份腫瘤的等級(jí)簇集(hierarchicalclustering)。圖11描述了通過(guò)AFFYMETRIX⑧微陣列表達(dá)制鐠測(cè)定的HER2、EGFR、HER3和betacellulinmRNA表達(dá)用于預(yù)測(cè)HER2磷酸化狀態(tài)的用途。圖12描述了通過(guò)AFFYMETRIX⑧微陣列表達(dá)制語(yǔ)測(cè)定的betacellulinmRNA表達(dá)與HER2磷酸化狀態(tài)的相關(guān)性。圖13顯示了qRT-PCR測(cè)量法的測(cè)定特征。循環(huán)閾值(CycleThreshold,CT)定量絕對(duì)mRNA表達(dá)。圖14顯示了使用通過(guò)qRT-PCR測(cè)定的HER2、EGFR、HER3和betacellulin的mRNA表達(dá)值，對(duì)來(lái)自已知處于HER2磷酸化狀態(tài)的卵巢癌患者的25份腫瘤的等級(jí)簇集(hierarchicalclustering)。圖15描述了通過(guò)qRT-PCR測(cè)定的HER2、EGFR、HER3和betacellulinmRNA表達(dá)用于預(yù)測(cè)HER2磷酸化狀態(tài)的用途?；癄顟B(tài)的相關(guān)性。圖17描述了通過(guò)qRT-PCR測(cè)定的雙調(diào)蛋白mRNA表達(dá)與HER2磷酸化狀態(tài)的相關(guān)性。I.定義"HER受體"是屬于HER受體家族的受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、HER3和HER4受體。HER受體通常將包含胞外結(jié)構(gòu)域，它可結(jié)合HER配體和/或與另一HER受體分子二聚化；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和含有幾個(gè)可被磷酸化的酪氨酸殘基的氣基末端信號(hào)結(jié)構(gòu)域。HER受體可以是"天然序列"HER受體或其"氨基酸序列變體"。優(yōu)選的是，HER受體是天然序列人HER受體。術(shù)語(yǔ)"ErbBl"、"HER1"、"表皮生長(zhǎng)因子受體"和"EGFR"在本文中可互換孑吏用，指例如Carpenter"a/.，^朋.Aev.所oc/zem.56:881-914(1987)中公開的EGFR，包括其天然存在的突變體形式(例如如Humphrey&a/.,iWJ51(X/iS^87:4207-4211(1990)中的刪除突變體EGFR)。e^Bl指編碼EGFR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。表述"ErbB2，，和"HER2"在本文中可互換使用，指例如Semba&a/.,/WAS(^75^」82:6497-6501(1985)和YamamotoWa/"Atowe319:230-234(1986)中描述的人HER2蛋白(Genebank編號(hào)X03363)。術(shù)語(yǔ)"e^B2"指編碼人ErbB2的基因，而指編碼大鼠pl85,的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列人HER2。HER2的胞外結(jié)構(gòu)域包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域"結(jié)構(gòu)域I"(大約第1-195位氨基酸殘基；SEQIDNO:19)、"結(jié)構(gòu)域II"(大約第196-319位氨基酸殘基；SEQIDNO:20)、"結(jié)構(gòu)域III"(大約第320-488位氨基酸殘基；SEQIDNO:21)和"結(jié)構(gòu)域IV"(大約第489-630位氨基酸殘基；SEQIDNO:22)(殘基編號(hào)不包括信號(hào)肽)。參見Garrettaa/.,Mo/.Ce〃.11:495-505(2003);ChoWa/.,Atoww421:756-760(2003);Franklin"a/.，OwcerCe〃5:317-328(2004);Plowmando/.,Prac.AAw/.Jcad90:1746-1750(1993),以及本文圖1。"ErbB3"和"HER3"指例如美國(guó)專利第5,183,884和5,480,968號(hào)以及Krausa"/.，/WAS(775^86:9193-9197(1989)中公開的受體多肽。術(shù)語(yǔ)"ErbB4"和"HER4"在本文中指例如歐洲專利申請(qǐng)第599,274號(hào)；Plowmana/.，淑/.JcW.Sc/.,90:1746-1750(1993);Plowman&a/.,Atowe366:473-475(1993)中公開的受體多肽，包括其同種型(isoform),例如如1999年4月22日出版的WO99/19488中所公開的。"HER配體"指結(jié)合和/或活化HER受體的多肽。本文中特別感興趣的HER配體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)(Savageda/.,J!歷o/.Ozem.247:7612-7621(1972));轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a(TGF國(guó)a)(Marquardtda/.,Sc/e"ce223:1079-1082(1984));雙調(diào)蛋白，又稱為施旺細(xì)胞瘤(schwannoma)或角質(zhì)形成細(xì)月包自分泌生長(zhǎng)因子(Shoyabda/.,5Wewce243:1074-1076(1989);Kimura"淑廳348:257-260(1990);Cook&a/.，編.Ce〃.則.11:2547-2557(1991));betacellulin(Shingaa/.,5We"ce259:1604-1607(1993);Sasada<a/.，所oc/z縫所—,LCo國(guó)肌190:1173(1993));肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)(HigashiyamaW"/.,5We腳251:936-939(1991));印iregulin(Toyodada/.,■/S/o/.C/z艮270:7495-7500(1995);Komurasakida/.，(9"coge"e15:2841-2848(1997));a調(diào)蛋白(見下文)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway"a/"A^/ww387:512-516(1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG-3)(Zhanga/.,尸亂扁.JcW.5W.94:9562-9567(1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白畫4(NRG-4)(Hamrida/.，(9"coge恥18:2681-89(1999));和cripto(CR-1)(Kannan"a/.，《/Ao/.CAem,272(6):3330-3335(1997))。結(jié)合EGFR的HER配體包括EGF、TGF-a、雙調(diào)蛋白、betacellulin、HB-EGF和epiregulin。結(jié)合HER3的HER配體包括調(diào)蛋白。能夠結(jié)合HER4的HER配體包括betacellulin、epiregulin、HB誦EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和調(diào)蛋白。"調(diào)蛋白"(HRG)在用于本文時(shí)指由調(diào)蛋白基因編碼的多肽，如美國(guó)專利第5,641,869號(hào)或Marchionnia/"胸臟362:312-318(1993)中所公開的。調(diào)蛋白的例子包括調(diào)蛋白-oc、調(diào)蛋白-P1、調(diào)蛋白-p2和調(diào)蛋白-(33(Holmes"a/.，Sc/e"ce256:1205-1210(1992);美國(guó)專利第5,641,869號(hào))；"ew分化因子(NDF)(PelesdCW/69:205-216(1992));乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA)(Fallsaa/.,Ce〃72:801-815(1993));神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF)(Marchionnie/a/.，Atoww362:312-318(1993));感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元衍生因子(SMDF)(Ho。/.，J!脂.CW270:14523-14532(1995));Y-調(diào)蛋白(SchaeferWa/.，O"coge"e15:1385-1394(1997))。蛋白質(zhì)"表達(dá)"指基因中編碼的信息轉(zhuǎn)換成信使RNA(mRNA),然后轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)。在本文中，"表達(dá)"目的蛋白質(zhì)(諸如HER受體或HER配體)的樣品或細(xì)胞指其中測(cè)定出存在編碼該蛋白質(zhì)的mRNA或蛋白質(zhì)的樣品或細(xì)胞?？捎糜跇?biāo)準(zhǔn)化基因的例示性"持家"基因有葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、B-肌動(dòng)蛋白和PRL19，優(yōu)選GUS,因?yàn)樗诒疚闹兴鶞y(cè)試的樣品間展現(xiàn)出最小的表達(dá)變化。"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"或"PCR"技術(shù)在用于本文時(shí)通常指其中如1987年7月28日公告的美國(guó)專利第4,683,195號(hào)中所記載的，擴(kuò)增微量的核酸，RNA和/或DNA特定片段的流程。通常，需要獲知目的區(qū)域末端或以外的序列信息，從而可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物；這些引物在序列上將與待擴(kuò)增模板的對(duì)立鏈相同或相似。兩條引物的5'末端核苷酸可與所擴(kuò)增物質(zhì)的末端一致。PCR可用于從總基因組DNA和由總細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等擴(kuò)增特定RNA序列、特定DNA序列。一般參見MullisWa/.,CoWS/n'"gT/a^or5ymp.A'o/.51:263(1987);Erlich編，《PCRTechnology》，StocktonPress，NY,1989。在用于本文時(shí)，PCR被認(rèn)為是用于擴(kuò)增核酸測(cè)試樣品的核酸聚合酶反應(yīng)方法的一個(gè)，但非唯一的，例子，包括使用已知核酸(DNA或RNA)作為引物并利用核酸聚合酶來(lái)擴(kuò)增或生成核酸的特定片段或者擴(kuò)增或生成核酸的特定片段，它們與特定核酸互補(bǔ)。"定量實(shí)時(shí)聚合,式反應(yīng)"或"qRT-PCR"指PCR的一種形式，其中在PCR反應(yīng)的每個(gè)步驟測(cè)量PCR產(chǎn)物的量。這種技術(shù)已經(jīng)記載于多份出版物，包括Cronin"a/.,見上文和Ma"a/"見上文。術(shù)語(yǔ)"微陣列"指可雜交陣列元素，優(yōu)選多核苷酸纟笨針在基底上的有序排列。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"在以單數(shù)或復(fù)數(shù)使用時(shí)通常指任何多聚核糖核苦酸或多聚脫氧核糖核苷酸，可以是未經(jīng)修飾的RNA或DNA或者是經(jīng)過(guò)修飾的RNA或DNA。如此，例如，本文中所定義的多核苷酸包括^a不限于單鏈和雙鏈DNA、包含單鏈和雙鏈區(qū)的DNA、單鏈和雙鏈RNA、及包含單鏈和雙鏈區(qū)的RNA，包含DNA和RNA的雜合分子，它可以是單鏈的，更典型的是雙鏈的，或者包含單鏈和雙鏈區(qū)。另外，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"在用于本文時(shí)指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三鏈區(qū)。此類區(qū)中的鏈可來(lái)自同一分子或來(lái)自不同分子。所述區(qū)可包含一種或多種分子的整個(gè)，但更典型的是只包含有些分子的一個(gè)區(qū)。三股螺旋區(qū)的分子之一常常是寡核苷酸。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"明確包括cDNA。該術(shù)語(yǔ)包括包含一種或多種經(jīng)修飾石威基的DNA(包括cDNA)和RNA。如此，主鏈為穩(wěn)定性或其它原因而修飾的DNA或RNA也是"多核苦酸"該術(shù)語(yǔ)在本文中的意圖所在。此外，包含罕見堿基諸如肌苷或經(jīng)修飾堿基諸如氖化堿基的DNA或RNA也包括在本文中所定義的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"內(nèi)。一般而言，術(shù)語(yǔ)"多核苦酸"涵蓋未修飾多核苦酸的所有化學(xué)、酶學(xué)和/或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞，包括簡(jiǎn)單和復(fù)雜細(xì)胞的特征性的DNA和RNA的化學(xué)形式。術(shù)語(yǔ)"寡核普酸"指相對(duì)較短的多核苷酸，包括但不限于單鏈脫氧核糖核苷酸、單鏈或雙鏈核糖核苷酸、RNA:DNA雜合物、及雙鏈DNA。寡核苷酸，諸如單鏈DNA探針寡核苷酸，常常通過(guò)化學(xué)方法合成，例如使用商品化的自動(dòng)化寡核苷酸合成儀。然而，寡核香酸可通過(guò)多種其它方法制備，包括體外重組DNA介導(dǎo)的技術(shù)和通過(guò)DNA在細(xì)胞和生物體中的表達(dá)。短語(yǔ)"基因擴(kuò)增"指通過(guò)它在特定細(xì)胞或細(xì)胞系中形成基因或基因片段的多個(gè)拷貝的過(guò)程。所復(fù)制區(qū)域(一段擴(kuò)增的DNA)常常稱為"擴(kuò)增子"。通常，所生成信使RNA(mRNA)的量也按所表達(dá)特定基因生成的拷貝數(shù)的比例升高。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性"可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且通常根據(jù)探針長(zhǎng)度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。一般而言，較長(zhǎng)的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補(bǔ)鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時(shí)變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相對(duì)溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對(duì)溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubel等人，《CurrentProtocolsinMolecularBiology》，WileyIntersciencePublishers,1995。"嚴(yán)格條件"或"高嚴(yán)格性條件"，如本文中所定義的，通常(1)采用低離子強(qiáng)度和高溫進(jìn)行清洗，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，于50°C;(2)在雜交過(guò)程中釆用變性劑，諸如曱酰胺，例如50。/o(v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42。C;或(3)采用50%曱酰胺，5xSSC(0.75MNaCl,0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1%焦磷酸鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA(50嗎/ml)，0.1。/。SDS,和10%硫酸右旋糖苷，于42。C,及于42。C在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%曱酰胺中清洗，接著于55。C在含EDTA的O.lxSSC中進(jìn)行高嚴(yán)才各性清洗。"中等嚴(yán)格條件，，可以如Sambrook等人，《MolecularCloning:ALaboratoryManual》，NewYork,ColdSpringHarborPress,1989中所述鑒定，包括使用比上文所述較不嚴(yán)格的清洗溶液和雜交條件(例如溫度、離子強(qiáng)度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個(gè)例子是于37匸在含20°/。曱酰胺，5xSSC(150rnMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過(guò)夜，接著于約37-50。C在lxSSC中清洗濾膜。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到如何在必要時(shí)調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探針長(zhǎng)度等因素。"HER二聚體"在本文中指包含至少兩個(gè)不同HER受體的非共價(jià)結(jié)合二聚體。在表達(dá)兩種或多種HER受體的細(xì)胞暴露于HER配體時(shí)可形成此類復(fù)合物，可通過(guò)免疫沉淀分離并通過(guò)SDS-PAGE分析，如例如Sliwkowski"a/.,5/o/.CTzew.269(20):14661-14665(1994)中所述。此類HER二聚體的例子包括EGFR-HER2、HER2-HER3和HER3-HER4異二聚體。此外，HER二聚體可包含與不同HER受體諸如HER3、HER4或EGFR結(jié)合的兩個(gè)或多個(gè)HER2受體。其它蛋白質(zhì)，諸如細(xì)胞因子受體亞基(例如gpl30)可與二聚體結(jié)合。"HER抑制劑"指干擾HER活化或功能的藥劑。HER抑制劑的例子包括HER抗體(例如EGFR、HER2、HER3或HER4抗體)；EGFR靶向藥物；小分子HER拮抗劑；HER酪氨酸激酶抑制劑；反義分子(參見例如WO2004/87207);和/或結(jié)合下游信號(hào)分子諸如MAPK或Akt(見圖5)或干護(hù)L其功能的藥劑。優(yōu)選的是，HER抑制劑是結(jié)合HER受體的抗體或小分子。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"EGFR靶向藥物"指結(jié)合EGFR并任選抑制EGFR活化的治療劑。此類藥劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和'J、分子。結(jié)合EGFR的抗體的例子包括MAb579(ATCCCRLHB8506)、MAb455(ATCCCRLHB8507)、MAb225(ATCCCRL8508)、MAb528(ATCCCRL8509)(參見美國(guó)專利第4,943,533號(hào)，Mendelsohn等人)及其變體，諸如嵌合化225(C225或Cetuximab;ERBUTIX)和重構(gòu)人225(H225X參見WO96/40210,ImcloneSystemsInc.);結(jié)合II型突變體EGFR的抗體(美國(guó)專利第5,212,290號(hào))；結(jié)合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國(guó)專利第5,891,996號(hào)中所述；及結(jié)合EGFR的人抗體，諸如ABX-EGF(參見WO98/50433,Abgenix);EMD55900(Stragliottoefa/.,￡wJG3"cer32A:636-640(1996));及mAb806或人源化mAb806(Johns&乂編.C/zem.279(29):30375-30384(2004))?？笶GFR抗體可偶聯(lián)細(xì)胞毒劑，如此產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物(參見例如EP659，439A2,MerckPatentGmbH)。結(jié)合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSA;AstraZeneca);CP-358774或鹽酸Erlotinib(TARCEVA;Genentech/OSI);和AG1478、AG1571(SU5271;Sugen)。"酪氨酸激酶抑制劑"指抑制酪氨酸激酶諸如HER受體的酪氨酸激酶活性的分子。此類抑制劑的例子包括上一段中提到的EGFR靶向藥物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制劑，諸如可從Takeda購(gòu)買的TAK165;優(yōu)先結(jié)合EGFR但抑制HER2和EGFR二者過(guò)表達(dá)細(xì)胞的雙重HER抑制劑，諸如EKB-569(可從Wyeth購(gòu)買)；GW572016(可從Glaxo購(gòu)買)，一種口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制劑；PKI-166(可從Novartis購(gòu)買)；泛HER(pan-HER)抑制劑，諸如canertinib(CI-1033;Pharmacia);Raf-1抑制劑，諸如可從ISISPharmaceuticals購(gòu)買、抑制Raf-1信號(hào)傳導(dǎo)的反義劑ISIS-5132;非HER靶向TK抑制劑，i者如可/人Glaxo購(gòu)買的Imatinibmesylate(GLEEVAC);MAPK胞外調(diào)控激酶I抑制劑CI-1040(可從Pharmacia購(gòu)買)；喹唑啉類，諸如PD153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡，定并嘧咬類；嘧吱并嘧咬類；吡咯并嘧。定類，諸如CGP59326、CGP60261和CGP62706;吡唑并嘧，定類，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶；姜黃素(二阿魏酰曱烷，4,5-雙(4-氟笨胺基)-酞亞胺)；含硝基p羞吩模塊的tyrphostines;PD-0183805(Warner-Lambert);反義分子(例如那些結(jié)合HER編碼核酸的)；喹喔啉類(美國(guó)專利第5,804,396號(hào))；tryphostins(美國(guó)專利第5,804,396號(hào))；ZD6474(AstraZeneca);PTK-787(Novartis/ScheringAG);泛HER抑制劑，諸如CI-1033(Pfizer);Affinitac(ISIS3521;Isis/Lilly);Imatinibmesylate(Gleevac;Novartis);PKI166(Novartis);GW2016(GlaxoSmithKline);CI-1033(Pfizer);EKB-569(Wyeth);S謹(jǐn)xinib(Sugen);ZD6474(AstraZeneca);PTK-787(Novartis/ScheringAG);INC-1C11(Imclone);或如任何下列專利出版物中所記載的美國(guó)專利第5,804,396號(hào)；WO99/09016(AmericanCyanimid);WO98/43960(AmericanCyanamid);WO97/38983(WarnerLambert);WO99/06378(WarnerLambert);WO99/06396(WarnerLambert);WO96/30347(Pfizer，Inc.);WO96/33978(Zeneca);WO96/3397(Zeneca);WO96/33980(Zeneca)。"HER二聚化抑制劑"指抑制HER二聚體形成的藥劑。優(yōu)選的是，HER二聚化抑制劑是抗體，例如在HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合HER2的抗體。本文中最優(yōu)選的二聚化抑制劑是Pertuzumab或MAb2C4。2C4對(duì)HER2異二聚體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合圖示于圖4。HER二聚化抑制劑的其它例子包括結(jié)合EGFR并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體(例如EGFR單克隆抗體806，MAb806,它結(jié)合活化的或"未系住的"EGFR;參見Johns"a/.，乂CAem.279(29):30375-30384(2004));結(jié)合HER3并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體；結(jié)合HER4并抑制其與一種或多種其它HER受體二聚化的抗體；肽二聚化抑制劑(美國(guó)專利第6，417，168號(hào))；反義二聚化抑制劑；等。HER2上的"異二聚體結(jié)合位點(diǎn)"指在HER2與EGFR、HER3或HER4形成二聚體時(shí)，與EGFR、HER3或HER4胞外結(jié)構(gòu)域中某區(qū)域接觸或形成介面的HER2胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域。已發(fā)現(xiàn)所述區(qū)域在HER2的結(jié)構(gòu)域II中。Franklina/.，C露erCe〃5:317-328(2004)。"HER活化"指任何一種或多種HER受體的活化或磷酸化。通常，HER活化導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如由HER受體胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域引起的，磷酸化HER受體或底物多肽中的酪氨酸殘基)。HER活化可由結(jié)合包含目的HER受體的HER二聚體的HER配體介導(dǎo)。結(jié)合HER二聚體的HER配體可活化二聚體中一種或多種HER受體的激酶結(jié)構(gòu)域，由此導(dǎo)致一種或多種HER受體中酪氨酸殘基的磷酸化和/或其它底物多肽，諸如Akt或MAPK胞內(nèi)激酶中酪氨酸殘基的磷酸化。參見例如圖5。"磷酸化，，指向蛋白質(zhì)，諸如HER受體或其底物添加一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)。"天然序列，，多肽指與衍生自自然界的多肽(例如HER受體或HER配體)具有相同氨基酸序列的多肽。此類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可通過(guò)重組或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、鼠多肽、或來(lái)自任何其它哺乳類物種的多肽的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)"抗體"在本文中以最廣義使用，明確覆蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性。術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體，，在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體通常以極小量存在。與通常包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除它們的特異性外，單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)在于它們未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語(yǔ)"單克隆"指示抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過(guò)任何特定方法來(lái)生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過(guò)最初由Kohlerea/.,Atowe256:495(1975)記載的雜交瘤方法來(lái)制備，或者可通過(guò)重組DNA方法來(lái)制備(參見例如美國(guó)專利第4,816,567號(hào))。"單克隆抗體，，還可使用例如Clacksone^Z.,A^w^352:624-628(1991)和Marks/Mo/.B/o/.222:581-597(1991)中記載的技術(shù)從噬菌體抗體庫(kù)分離。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性(美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Morrison"a/.,Prac.A^".爿cac.Scz'.81:6851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長(zhǎng)類(例如舊大陸猴類(01dWorldMonkey)、猿等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的"靈長(zhǎng)類化"抗體。"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。"完整抗體，，在本文中指包含兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體具有一項(xiàng)或多項(xiàng)效應(yīng)器功能。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)氨基酸序列，完整抗體可歸入不同的"類"。完整抗體有五種主要的類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可進(jìn)一步分為"亞類"(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與抗體的不同類對(duì)應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作a、S、e、Y和p。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的?？贵w"效應(yīng)器功能"指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)下調(diào)；等。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"和"ADCC"指由細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcR)的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，隨后引起耙細(xì)胞溶解。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRffl。RavetchandKinet,」朋w,iev./mmw"o/.9:457-92(1991)第464頁(yè)表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國(guó)專利第5，500，362或5,821,337號(hào)中所記載的?？捎糜诖祟悳y(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes"iW^S(^X4」95:652-656(1998)中所披露的。"人效應(yīng)細(xì)胞，，指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcYRIII并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來(lái)源分離，例如血液或PBMC,如本文中所描述的。術(shù)語(yǔ)"Fc受體"或"FcR"用于描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(Y受體),包括FcyRI、FcyyRII和FcyRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體'，)，它們具有相似的氨基S吏序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?；罨荏wFcyRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氡酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcyRHB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述Dagron，iev./mmw"o/.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet，勘肌iev.7m羅no/.9:457-492(1991);CapelefImm圃methods4:25-34(1994);deHaas"a/.，/丄W.她d126:330-41(1995)。術(shù)語(yǔ)"FcR"在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來(lái)將會(huì)鑒定的。該術(shù)語(yǔ)還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer"/mmw"o/.117:587(1976)和Kimefa/.，/mmw"o/.24:249(1994))。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"指在存在補(bǔ)體時(shí)分子溶解靶物的能力。補(bǔ)體激活途徑是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復(fù)合的分子(例如抗體)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如Gazzano-Santoro/謹(jǐn)腸/.MeAo^s202:163(1996)中所記載的。"天然抗體"指通常由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過(guò)一個(gè)共價(jià)二疏鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VH),接著是多個(gè)恒定區(qū)(Ch)。每條輕鏈在一端具有一個(gè)可變區(qū)(VO，而另一端是一個(gè)恒定區(qū)(QJ。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認(rèn)為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。術(shù)語(yǔ)"可變的"指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個(gè)FR,它們大多采取p-折疊片構(gòu)象，通過(guò)形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成(3-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat等人,《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,1991)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"在用于本文時(shí)指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區(qū)中的殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD，1991)和/或那些來(lái)自"高變環(huán)"的殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk，/Mo/.5z'o/.196:901-917(1987))。"框架區(qū)"或"FR"殘基指可變區(qū)中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱作"Fab"片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，和一個(gè)殘余"Fc"片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab')2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。此區(qū)由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各可變區(qū)的三個(gè)高變區(qū)相互作用而在V『VL二聚體表面上確定了一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)高變區(qū)的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來(lái)自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)其中恒定區(qū)半胱氨酸殘基攜帶至少一個(gè)游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列，來(lái)自任何脊推動(dòng)物物種的抗體"輕鏈"可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡巾自(k)和4i姆達(dá)(X)。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，F(xiàn)v多肽在Vh和Vt結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pliickthun,在《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》中，第113巻，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork,第269-315頁(yè)，1994。HER2抗體scFv片段記載于WO93/16185;美國(guó)專利第5,571,894號(hào);美國(guó)專利第5，587，458號(hào)。術(shù)語(yǔ)"雙抗體"指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多狀鏈(VH-VJ中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VO。通過(guò)使用過(guò)短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如EP404,097;WO93/11161;Hollingerea/"尸rac.編.^c^/.固90:6444-6448(1993)。非人(例如嚙齒類)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒(méi)有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變區(qū)，其中整個(gè)或基本上整個(gè)高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個(gè)或基本上整個(gè)FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones"a/.,Atowe321:522-525(1986);Riechmannda/"胸歸332:323-329(1988);Presta，C匿(9/.2:593-596(1992)。人源化HER2抗體包括huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5畫5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或Trastuzumab(HERCEPTIN)，如美國(guó)專利第5,821,337號(hào)表3中所述，明確收入本文作為參考；人源化520C9(WO93/21319);及人源化2C4抗體，如本文所述。為了本發(fā)明的目的，"Trastuzumab"、"HERCEPTIN"和"huMAb4D5-8"指包含分別在SEQIDNo.15和16中的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。在本文中，"Pertuzumab，，和"OMNITARG"指包含分別在SEQIDNo.13和14中的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。Trastuzumab和Pertuzumab功能之間的差異圖示于圖6。"棵抗體(棵露的抗體)"指未偶聯(lián)異源分子，諸如細(xì)胞毒性模塊或放射性標(biāo)記物的抗體。"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會(huì)干擾該抗體的"^斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過(guò)95%,最優(yōu)選重量超過(guò)99%,(2)足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟來(lái)制備。"親和力成熟的"抗體指在其一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中具有導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力與沒(méi)有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的一處或多處改變的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾水平的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過(guò)本4頁(yè)i或已知流禾呈生成。Marksaa/.，5!'o/Tec/wo/ogy10:779-783(1992)記載了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域改組的親和力成熟。下列文獻(xiàn)記載了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas尸rac.Ato.」cad5W,f/5L491:3809-3813(1994);SchierWa/.,Ge"e169:147-155(1995);Yelton"a/"http://mm畫/.155:1994-2004(1995);Jackson"a/"乂/www"o/.154(7):3310-9(1995);Hawkinsa《/Mo/.226:889-896(1992)。"比Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化的"HER2抗體指比Trastuzumab更有效(例如功效提高至少約2倍)的減少或消除HER二聚體的抗體。優(yōu)選的是，這樣的抗體至少大約像選自下組的抗體那樣有效的抑制HER二聚化鼠單克隆抗體2C4、鼠單克隆抗體2C4的Fab片段、Pertuzumab、和Pertuzumab的Fab片段。可直接通過(guò)研究HER二聚體，或者通過(guò)評(píng)估由HER二聚化引起的HER活化或下游信號(hào)傳導(dǎo)，和/或通過(guò)評(píng)估抗體-HER2結(jié)合位點(diǎn)等來(lái)評(píng)估對(duì)HER二聚化的抑制。用于篩選有能力比Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化的抗體的測(cè)定法記載于Agus&"/.，awcwCe〃2:127-137(2002)和WO01/00245(Adams等人)。只是作為例示，可通過(guò)評(píng)估例如下列各項(xiàng)來(lái)分析對(duì)HER二聚化的抑制對(duì)HER二聚體形成的抑制(參見例如Agus"a/.，Ca"cerCe〃2:127-137(2002)的附圖1A-B和WO01/00245);表達(dá)HER二聚體的細(xì)胞中HER配體活化的降低(例如WO01/00245和Agus"a/.，C匿erCW/2:127-137(2002)的附圖2A-B);對(duì)HER配體結(jié)合表達(dá)HER二聚體的細(xì)胞的阻斷(例如WOO1/00245和Agus"a/.，CawcerCe〃2:127-137(2002)的附圖2E);在存在(或缺乏)HER配體時(shí)對(duì)表達(dá)HER二聚體的癌細(xì)胞(例如MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-l、MD-MB-175、T-47D細(xì)胞)的細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制(例如WOOl/00245和Agusa/.,OmcwCW/2:127-137(2002)的附圖3A-D);對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)的抑制(例如對(duì)HRG依賴性AKT磷酸化的抑制或者對(duì)HRG或TGFa依賴性MAPK磷酸化的抑制)(參見例如WOOl/00245和Agusa/.，OwcwCW/2:127-137(2002)的附圖2C-D)。還可通過(guò)研究抗體-HER2結(jié)合位點(diǎn)來(lái)評(píng)估抗體是否抑制HER二聚化，例如通過(guò)評(píng)估與HER2結(jié)合的抗體的結(jié)構(gòu)或模型，諸如晶體結(jié)構(gòu)(參見例如FranklinW"/.,Ca"cerCW/5:317-328(2004))。HER2抗體可以比Tmstuzumab更有效(例如功效提高至少2倍)的"抑制HRG依賴性AKT磷酸化"和/或抑制"HRG或TGFa依賴性MAPK磷酸化，，(參見例如Agus"a/.，Ca"cwCe〃2:127-137(2002)和WOOl/00245)。HER2抗體可以是"不抑制HER2胞外域切割，，的抗體(Molina&a/.,Qz"cwies.61:4744-4749(2001))。"結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)的"HER2抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基(且任選還結(jié)合HER2的胞外結(jié)構(gòu)域以外的其它結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基)，且至少在一定程度上可在空間上阻礙HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4異二聚體的形成。Franklinaa/.，OwcwCW/5:317-328(2004)表征了存放在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(IDCodeIS78)的HER2-Pertuzumab晶體結(jié)構(gòu)，舉例說(shuō)明了結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)的例示性抗體。"結(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域II的"抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基和任選HER2的其它結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基。優(yōu)選的是，結(jié)合結(jié)構(gòu)域II的抗體結(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域I、II和III之間的連接處。術(shù)語(yǔ)"主要種類抗體"在本文中指組合物中作為數(shù)量上主要抗體分子的抗體結(jié)構(gòu)。在一個(gè)實(shí)施方案中，主要種類抗體是HER2抗體，諸如結(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域II的抗體、比Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化的抗體、和/或結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點(diǎn)的抗體。本文中主要種類抗體的優(yōu)選實(shí)施方案是包含SEQIDNo.3和4中的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序列，最優(yōu)選包含SEQIDNo.13和14中的輕鏈和重鏈氨基ll/f"列的抗體(Pertuzumab)。"氨基酸序列變體"抗體在本文中指具有與主要種類抗體不同的氨基酸序列的抗體。通常，氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少約70%的同源性，而且優(yōu)選的是，它們將是與主要種類抗體至少約80%,更優(yōu)選至少約90%同源。氨基i^列變體在主要種類抗體氨基酉踏列內(nèi)部或鄰近的某些位置具有替代、刪除和/或添加。本文中氨基酸序列變體的例子包括酸性變體(例如脫酰胺抗體變體)、堿性變體、在其一條或兩條輕鏈上具有氨基末端前導(dǎo)延伸(例如VHS-)的抗體、在其一條或兩條重鏈上具有C-末端賴氨酸殘基的抗體、等，且包括重鏈和/或輕鏈氨基酸序列變異的組合。本文中特別感興趣的抗體變體是在其一條或兩條輕鏈上包含氨基末端前導(dǎo)延伸的抗體，任選相對(duì)于主要種類抗體還包含其它氨基酸序列和/或糖基化差異。"糖基化變體"抗體在本文中指附著有一種或多種碳水化合物模塊且所述碳水化合物與附著于主要種類抗體的一種或多種碳水化合物模塊不同的抗體。本文中糖基化變體的例子包括其Fc區(qū)附著有Gl或G2寡糖結(jié)構(gòu)代替G0寡糖結(jié)構(gòu)的抗體、其一條或兩條輕鏈附著有一種或兩種碳水化合物模塊的抗體、其一條或兩條重鏈沒(méi)有附著碳水化合物模塊的抗體、等，及糖基化改變的組合。若抗體具有Fc區(qū)，則抗體的一條或兩條重鏈，例如殘基299處(298,Eu殘基編號(hào))可附著有諸如本文圖9所示的寡糖結(jié)構(gòu)。對(duì)于Pertuzumab,G0是主要的寡糖結(jié)構(gòu)，而在Pertuzumab組合物中找到的其它寡糖結(jié)構(gòu)諸如G0-F、G-l、Man5、Man6、Gl-l、Gl(l陽(yáng)6)、Gl(l畫3)和G2的量豐支少。除非另有說(shuō)明，"G1寡糖結(jié)構(gòu)"在本文中包括Gl、Gl-l、Gl(l-6)和Gl(l-3)結(jié)構(gòu)。"氨基末端前導(dǎo)延伸"在本文中指在抗體的任何一條或多條重鏈或輕鏈的氨基末端存在的氨基末端前導(dǎo)序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。例示性的氨基末端前導(dǎo)延伸包含三個(gè)氨基酸殘基，VHS或由其組成，它們存在于抗體變體的一條或所有兩條輕鏈上。"脫酰胺"抗體指其中一個(gè)或多個(gè)天冬酰胺殘基4汙生成例如天冬氨酸、琥珀酰亞胺或異天冬氨酸的抗體。"同源性，，定義為對(duì)比序列并在必要時(shí)S1入缺口以獲取最大百分比同源性后，氨基酸序列變體中相同殘基的百分率。用于對(duì)比的方法和計(jì)算機(jī)程序是本領(lǐng)域眾所周知的。一種這樣的計(jì)算機(jī)程序是"Align2",由Genentech公司編寫，并且在1991年12月10日與用戶文檔一起提交給美國(guó)版權(quán)局(UnitedStatesCopyrightOffice,Washington,DC20559)。為了本發(fā)明的目的，"陽(yáng)離子交換分析"指基于電荷差異使用陽(yáng)離子交換劑將包含兩種或多種化合物的組合物分開的任何方法。陽(yáng)離子交換劑通常包含共價(jià)結(jié)合的，帶負(fù)電荷的基團(tuán)。優(yōu)選的是，本文中的陽(yáng)離子交換劑是弱陽(yáng)離子交換劑和/或包含羧酸(酯/鹽)官能團(tuán)，諸如Dionex出售的PROPACWCX-10TM陽(yáng)離子交換柱。"卵巢"指女性/雌獸中位于子宮兩側(cè)的兩個(gè)小型杏仁形器官之一。"輸卵管"或"法婁皮歐氏(Fallopian)管，，指從哺乳動(dòng)物雌獸的卵巢通向子宮的兩條細(xì)管之一。"腹膜"指體腔諸如腹腔的上皮襯里。術(shù)語(yǔ)"癌癥"和"癌性"指的是或描述哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞生長(zhǎng)不受調(diào)節(jié)的生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤(包括髓母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細(xì)胞肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(包括類癌腫瘤瘤、胃泌素瘤和胰島細(xì)胞癌)、間皮瘤、施旺細(xì)胞瘤(包括聽神經(jīng)瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌(例如上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌包括小細(xì)胞肺癌(SCLC)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鱗癌、腹膜癌癥、肝細(xì)胞癌癥、胃癌癥包括胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌)、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、膽門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤、以及頭和頸癌。"卵巢癌，，是在一個(gè)或兩個(gè)卵巢中形成的，可能危及生命的惡性腫瘤。在卵巢癌的癥狀出現(xiàn)時(shí)，卵巢腫瘤可能已經(jīng)生長(zhǎng)得足夠大以散發(fā)癌細(xì)胞至整個(gè)腹部。傳播至卵巢外的卵巢癌細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)移性卵巢癌。卵巢腫瘤趨向于傳播至膈、腸和/或網(wǎng)膜(在腹部覆蓋和襯墊器官的脂肪層)。癌細(xì)胞還可經(jīng)由淋巴管和血流傳播至其它器官。本文中待治療的卵巢癌包括三類主要的惡性卵巢腫瘤，即上皮腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤和基質(zhì)腫瘤。"原發(fā)性腹膜癌"指源自腹膜的癌癥。原發(fā)性腹膜癌在顯微:鏡表現(xiàn)、癥狀、傳播模式和預(yù)后方面可以與上皮卵巢癌非常相似。切除了卵巢的女性仍可患上原發(fā)性腹膜癌。"輸卵管癌"指輸卵管和/或?qū)掜g帶的癌癥。"上皮腫瘤"在圍繞卯巢外面、稱為生殖上皮的立方體細(xì)胞層中形成。上皮腫瘤可占到所有卵巢癌的90%。"生殖細(xì)胞腫瘤"是在卵巢的卵子成熟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。生殖細(xì)胞腫瘤，占所有卵巢癌的約3%,最常見的是在青少年和年輕女性中發(fā)生。"基質(zhì)肺瘤"由將卵巢保持在一起和生成雌性激素，雌激素和孕酮的結(jié)締組織細(xì)胞形成。基質(zhì)腫瘤占所有卵巢癌的6%。在本文中，"患者，，指人患者?；颊呖梢允?癌癥患者"，即患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上癌癥的一種或多種癥狀的患者，或者將從HER二聚化抑制劑療法受益的其它患者。"生物學(xué)樣品，，指衍生自生物學(xué)來(lái)源的樣品，通常是細(xì)胞或組織。"患者樣品"指從患者，諸如癌癥患者獲得的樣品。"腫瘤樣品"在本文中指衍生自患者腫瘤或包含來(lái)自患者腫瘤的腫瘤細(xì)胞的樣品。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不限于腫瘤活檢、循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞、循環(huán)中的血漿蛋白質(zhì)、腹水、衍生自腫瘤或展現(xiàn)出腫瘤樣特性的原代細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定的、石蠟包埋的腫瘤樣品或冷凍的腫瘤樣品。"固定的"腫瘤樣品指已經(jīng)使用固定劑以組織學(xué)方法保存的樣品。"福爾馬林固定的"腫瘤樣品指使用曱酪作為固定劑保存的樣品。"包埋的，，腫瘤樣品指用堅(jiān)固的且通常是硬的介質(zhì)諸如石蠟、蠟、火棉或樹脂包圍的樣品。包埋使得有可能切出薄片供顯微鏡檢查或生成組織微陣列(TMA)。"石蠟包埋的，，肺瘤樣品指用衍生自石油的固體碳?xì)浠衔锏募兓旌衔锇鼑臉悠贰Ｔ诒疚闹校?冷凍的"腫瘤樣品指正在或曾經(jīng)冷凍的腫瘤樣品。"生長(zhǎng)抑制劑"在用于本文時(shí)指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞，尤其是表達(dá)HER的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物或組合物。如此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低處于S期的表達(dá)HER的細(xì)胞百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)Gl停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春藥類(vincas)(長(zhǎng)春新石威(vincristine)和長(zhǎng)春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博來(lái)霉素(bleomycin)。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴，秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見《TheMolecularBasisofCancer》，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs，，,Murakami等人,WBSaunders,Philadelphia,1995，尤其是第13頁(yè)。"生長(zhǎng)抑制性"抗體的例子是那些結(jié)合HER2并抑制it^達(dá)HER2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性HER2抗體在約0.5-30嗎/ml的抗體濃度對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中SK-BR-3乳瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制大于20%,優(yōu)選大于50%(例如約50°/。至約100%)，其中生長(zhǎng)抑制是在SK-BR-3細(xì)胞暴露于抗體后6天測(cè)定的(參見1997年10月14日公告的美國(guó)專利第5,677,171號(hào))。該專利及下文中更詳細(xì)的描述了SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制測(cè)定法。優(yōu)選的生長(zhǎng)抑制性抗體是鼠單克隆抗體4D5的人源化變體，例如Trastuzumab。"誘導(dǎo)凋亡"的抗體指根據(jù)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細(xì)胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細(xì)胞破裂、和/或膜嚢(稱作凋亡小體)形成的測(cè)定，誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的抗體。所述細(xì)胞通常是過(guò)表達(dá)HER2受體的細(xì)胞。優(yōu)選的是，所述細(xì)胞是肺瘤細(xì)胞，例如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰或膀胱細(xì)胞。在體外，所述細(xì)胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3細(xì)胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細(xì)胞。有多種方法可用于評(píng)估與凋亡有關(guān)的細(xì)胞事件。例如，可通過(guò)膜聯(lián)蛋白結(jié)合來(lái)測(cè)量磷脂酰絲氨酸(PS)易位；可通過(guò)DNA梯化(laddering)來(lái)評(píng)估DNA斷裂；可通過(guò)亞二倍體細(xì)胞的任何增加來(lái)評(píng)估伴隨著DNA斷裂的核/染色質(zhì)濃縮。優(yōu)選的是，誘導(dǎo)凋亡的抗體是在使用BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合測(cè)定法(見下文)中導(dǎo)致對(duì)膜聯(lián)蛋白的結(jié)合相對(duì)于未處理細(xì)胞誘導(dǎo)約2至50倍，優(yōu)選約5至50倍，最優(yōu)選約10至50倍的抗體。誘導(dǎo)凋亡的HER2抗體的例子有7C2和7F3。"表位2C4"指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中抗體2C4所結(jié)合的區(qū)域。為了篩選結(jié)合2C4表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷測(cè)定法，諸如《Antibodies,ALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow禾口DavidLane，1988中所記載的。優(yōu)選的是，抗體將2C4對(duì)HER2的結(jié)合阻斷約50%或更多。或者，可進(jìn)行表位作圖以評(píng)估抗體是否結(jié)合HER2的2C4表位。表位2C4包含來(lái)自HER2胞外結(jié)構(gòu)域中結(jié)構(gòu)域II的殘基。2C4和Pertuzumab在結(jié)構(gòu)域I、II和III的連接處結(jié)合HER2的胞外結(jié)構(gòu)域。FranklindCa"cwCW/5:317-328(2004)。"表位4D5"指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域中抗體4D5(ATCCCRL10463)和Trastuzumab所結(jié)合的區(qū)域。此表位接近HER2的跨膜結(jié)構(gòu)域，且在HER2的結(jié)構(gòu)域IV內(nèi)。為了篩選結(jié)合4D5表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷測(cè)定法,諸如《Antibodies,ALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane，1988中所記載的。或者，可進(jìn)行表位作圖以評(píng)估抗體是否結(jié)合HER2的4D5表位(例如HER2ECD的大約第529位殘基至大約第625位殘基區(qū)域內(nèi)的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，含兩端點(diǎn)，殘基編號(hào)包括信號(hào)肽)。"表位7C2/7F3"指HER2的胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域I內(nèi)N末端處7C2和/或7F3抗體(各自保藏于ATCC，見下文)所結(jié)合的區(qū)域。為了篩選結(jié)合7C2/7F3表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)的交叉阻斷測(cè)定法，諸如《Antibodies,ALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane,1988中所記栽的。或者，可進(jìn)行表位作圖以確定抗體是否結(jié)合HER2上的7C2/7F3表位(例如HER2ECD的大約第22位殘基至大約第53位殘基區(qū)域內(nèi)的任何一個(gè)或多個(gè)殘基，含兩端點(diǎn)，殘基編號(hào)包括信號(hào)肽)。"處置，，和"治療"(treatment)指治療性處理和預(yù)防性措施二者。需要治療的受試者包括那些早就患有疾病的以及要預(yù)防疾病的。因此，本文中待治療的患者可能已經(jīng)診斷為患有疾病或者可能有患上疾病的傾向性或易感性。術(shù)語(yǔ)"有效量"指在患者中有效治療癌癥的藥物量。有效量的藥物可減少癌細(xì)胞的lt目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩和優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤(rùn)到周圍器官中；抑制(即一定程度的減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度的抑制腫瘤生長(zhǎng)；和/或一定程度的減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀。藥物可阻止生長(zhǎng)和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度，它可以是抑制細(xì)胞的和/或毒害細(xì)胞的(細(xì)胞毒性的)。有效量可延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展存活(例如根據(jù)實(shí)體瘤的響應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)、RECIST或CA-125變化的測(cè)量)，導(dǎo)致客觀響應(yīng)(包括部分響應(yīng)，PR或完全響應(yīng)，CR),增加總體存活時(shí)間，和/或改善癌癥的一種或多種癥狀(例如根據(jù)FOSI的評(píng)估)。"總體存活"指在例如診斷或治療后限定的一段時(shí)間，諸如1年、5年等仍然活著的患者。"無(wú)進(jìn)展存活，，(progressionfreesurvival)指仍然活著、癌癥沒(méi)有惡化的患者。"客觀響應(yīng)"(objectiveresponse)指可測(cè)量的響應(yīng)，包括完全響應(yīng)(CR)或部分響應(yīng)(PR)。"完全響應(yīng)"或"完全消退"指癌癥的所有征候響應(yīng)治療而消失。這并不總是意味著癌癥已經(jīng)治愈。"部分響應(yīng)"指身體中一個(gè)或多個(gè)腫瘤或損傷的尺寸或者癌癥的程度響應(yīng)治療而縮小。"HER受體過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增"的癌癥是與同一組織類型的非癌細(xì)胞相比，具有顯著更高水平的HER受體蛋白質(zhì)或基因的癌癥。這樣的過(guò)表達(dá)可以是由基因擴(kuò)增或者轉(zhuǎn)錄或翻譯增加引起的。可在診斷或預(yù)后測(cè)定法中通過(guò)評(píng)估細(xì)胞表面上存在的HER蛋白質(zhì)水平的升高(例如通過(guò)免疫組化測(cè)定法；IHC)來(lái)確定HER受體的過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增?；蛘?另外，可測(cè)量細(xì)胞中編碼HER的核酸的水平，例如通過(guò)熒光原位雜交(FISH;參見1998年10月7>開的WO98/45479)、Southern印跡或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，諸如定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)。還可通過(guò)測(cè)量生物學(xué)流體諸如血清中的脫落抗原(例如HER胞外結(jié)構(gòu)域)來(lái)研究HER受體過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增(參見例如1990年6月12日公告的美國(guó)專利第4,933,294號(hào)；1991年4月18日公開的WO91/05264;1995年3月28日公告的美國(guó)專利第5,401,638號(hào)；Sias"a/.，J!/wmw"o/.Me^otfc132:73-80(1990))。除了上述測(cè)定法之外，熟練從業(yè)人員還可利用多種體內(nèi)測(cè)定法。例如，可將患者體內(nèi)細(xì)胞暴露于任選用可檢測(cè)標(biāo)記物例如放射性同位素標(biāo)記的抗體，并且可評(píng)估抗體與患者體內(nèi)細(xì)胞的結(jié)合，例如通過(guò)外部掃描放射性或通過(guò)分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活檢。相反，"HER受體不過(guò)表達(dá)或擴(kuò)增"的癌癥是與同一組織類型的非癌細(xì)胞相比，沒(méi)有高于正常水平的HER受體蛋白質(zhì)或基因的癌癥。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒劑，，在用于本文時(shí)指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語(yǔ)意圖包括^L射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9G、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);磺酉吏》充基酉旨類(alkylsulfonates),諸^口白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙p定類(aziridines),諸如苯佐替》泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替》泉(meturedepa)和烏瑞替;泉(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐石危代碌酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);TLK286(TELCYTATM);番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布4^也辛(bullatadn)和布4立《也辛酮(bullatacinone));S-9-四氫大麻酚(tetmhydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);p-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);《火水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinicacid);喜初t石威(camptothecin)(包4舌合成類似物才乇泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-ll(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東萊菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來(lái)新(adozelesin)、卡折來(lái)新(carzelesin)和比折來(lái)新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苦(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特另'J是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW畫2189和CB1畫TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛承卩素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards),諸長(zhǎng)o苯丁酉吏氮齊(chlorambucil)、茶氮芥(chlomaphazine)、月旦石粦醜胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧p定氮芥(uracilmustard);亞硝脲類(nitrosoureas),i者長(zhǎng)口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、4畐莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);二膦酸鹽類(bisphosphonates),諸如氯膦酸鹽(clodronate);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin),尤其是加利車霉素yll和加利車霉素。11(參見例如Agnew，CTzem.五d33:183-186(1994))和蒽環(huán)類抗生素(anthmcyclines)諸如annamycin、AD32、alcarubicin、柔紅霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-l、表柔比星(epirubicin)、GPX-IOO、伊達(dá)比星(idarubicin)、KRN5500、美諾立爾(menogaril)、dynemicin包括dynemicinA、埃斯波霉素(esperamicin)、新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來(lái)霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體和脫氧多柔比星)、依索比星(esombicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、蟲萊酰三谷氨酸(pteropterin)和三曱曲沙(trimetrexate);噪呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪噤呤(thiamiprine)和硫鳥嘌呤(thioguanine);嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他力食酉同(dromostanolonepropionate)、表石克iji西享(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinicacid)(leucovorin);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);抗葉酸(鹽/酯)抗瘤劑，諸如ALIMTA⑧、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氫葉酸還原酶抑制劑諸如曱氨喋呤(methotrexate)、抗代謝物類，諸如5-氟尿嘧啶(5-FU)及其前藥諸如UPT、S-l和卡培他濱(capecitabine),及胸苷酸合酶抑制劑和甘氨酰胺核糖核苷酸曱?；D(zhuǎn)移酶抑制劑諸如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEXTM，TDX);二氫嘧咬脫氫酶抑制劑諸如恩尿嘧咬(eniluracil);醛石粦酰胺壽唐苦(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安口丫口定(amsacrine);bestrabucil;t匕生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋4妄(elliptiniumacetate);i矣》皮零素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米4乇胍月宗(mitoguazone);米4乇蒽醌(mitoxantrone);莫p底達(dá)醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);他柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);螺旋鍺(spirogermanium);纟田交鏈孑包菌酮酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孑包菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);派泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿4唐月包香(arabinoside)("Ara-C");環(huán)石岸酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)和紫杉垸類(taxanes)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor),清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE多西他塞(docetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR);6-硫鳥嘌呤(thioguanine);5危基噪p令(mercaptopurine);柏；柏類4以物或基于柏的類4以物，諸如順柏(cisplatin)、奧沙利柏(oxaliplatin)和卡鉑(carboplatin);長(zhǎng)春石成(vinblastine)(VELBAN);依托泊苷(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽S昆(mitoxantrone);長(zhǎng)春新石成(vincristine)(ONCOVIN);長(zhǎng)春花生物石成類(vincaalkaloid);長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氛基蝶呤(aminopterin);希羅達(dá)(xeloda);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids)，諸如視黃酸(retinoicacid);任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可4妄受鹽、酸或書f生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON⑧托瑞米芬(toremifene);抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔哇(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來(lái)曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞才木(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制牽涉粘著細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R);疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUYECTIN⑧疫苗和VAXID㊣疫苗；PROLEUKINrlL-2;LURTOTECAN②拓樸異構(gòu)酶1抑制劑；ABARELIXrmRH;及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。"抗代謝物類化療劑"指在結(jié)構(gòu)上與代謝物相似但不能被身體以生產(chǎn)性方式利用的藥劑。許多抗代謝物類化療劑干擾核酸、RNA和DNA的生成?？勾x物類化療劑的例子包括吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(capecitabine)(XELODATM)、6-巰基嘌呤、曱氨喋呤(methotrexate)、鳥嘌呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞芬(arabinosylcytosineARA-Ccytarabine)(CYTOSAR-U)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC-DOME)、偶氮胞嘧啶(azocytosine)、脫氧胞嘧咬(deoxycytosine)、pyridmidene、氟達(dá)4立濱(fludarabine)(FLUDARA)、克4立屈濱(cladrabine)、2-脫氧-D-葡萄糖、等。優(yōu)選的抗代謝物類化療劑是吉西他濱。"吉西他濱"或"2'-脫氧-2',2'-二氟胞苷單鹽酸(b-異構(gòu)體)"M現(xiàn)出抗腫瘤活性的核苦類似物。鹽酸吉西他濱的經(jīng)-險(xiǎn)式是C9H11F2N30小HC1。鹽酸吉西他濱由EliLilly以商標(biāo)GEMZAR⑧銷售。"基于鉑的化療劑"包括包含鉑作為分子的主要部分的有機(jī)化合物?；阢K的化療劑的例子包括卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)和奧沙利鉑(oxaliplatinum)。"基于鉑的化療法"指使用一種或多種基于鉑的化療劑的療法，任選聯(lián)合一種或多種其它化療劑。"鉑耐受性，，癌癥指癌癥患者在接受基于鉑的化療法時(shí)(癌癥)有進(jìn)展(即患者"對(duì)鉑不應(yīng)")，或者患者在完成基于鉑的化療方案后12個(gè)月內(nèi)(例如6個(gè)月內(nèi))(癌癥)有進(jìn)展。"抗血管發(fā)生劑"指阻斷或一定程度的干擾血管發(fā)育的化合物?？寡馨l(fā)生因子可以是例如結(jié)合涉及促進(jìn)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體的小分子或抗體。在本文中優(yōu)選的抗血管發(fā)生因子是結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抗體，諸如Bevacizumab(AVASTIN)。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子"是由一種細(xì)胞群釋放，作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細(xì)胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細(xì)胞因子中包括生長(zhǎng)激素，諸如人生長(zhǎng)激素、N-曱硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長(zhǎng)因子；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-p;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子，諸如NGF-(3;血小板衍生生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF),諸如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II;紅細(xì)胞生成素(EPO);'骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactor);干擾素，諸如干擾素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF),諸如巨噬細(xì)胞CSF(M-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞CSF(G-CSF);白介素(IL),諸如IL-1、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-ll、IL-12;腫瘤壞死因子，諸如TNF-a或TNF-(3;及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性等效物。"自身免疫病"在本文中指源自且針對(duì)個(gè)體自身組織的疾病或紊亂或其共分離(co-segregate)或表現(xiàn)或由其導(dǎo)致的狀況。自身免疫性疾病或紊亂的例子包括但不限于關(guān)節(jié)炎(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼發(fā)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎)、銀屑病、皮炎包括特應(yīng)性皮炎、慢性特發(fā)性蕁麻瘆包拾f曼性自身免疫性蕁麻瘆、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病)、硬化諸如進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化、炎性腸病(IBD)(例如克羅恩氏(Crohn)病、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性炎性腸病)、壞疽性膿皮癥、結(jié)節(jié)性紅斑、原發(fā)性硬化性膽管炎、鞏膜外層炎、呼吸窘迫綜合征包括成人型呼吸窘迫綜合征(ARDS)、腦膜炎、IgE介導(dǎo)的疾病諸如過(guò)敏性和變應(yīng)性和特應(yīng)性鼻炎、腦炎諸如拉斯默森氏(Rasmussen)腦炎、葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎、結(jié)腸炎諸如微觀結(jié)腸炎(microsc叩iccolitis)和膠原性結(jié)腸炎、腎小球腎炎(GN)諸如膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN、膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急進(jìn)性GN、變應(yīng)性狀況、變應(yīng)性反應(yīng)、濕瘆、哮喘、牽涉T細(xì)胞浸潤(rùn)和慢性炎性應(yīng)答的狀況、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘙(SLE)(諸如皮膚SLE、亞急性皮膚紅斑狼瘡、狼瘡(包括狼瘡腎炎、狼瘡腦炎、兒科狼瘡、非腎狼癡、盤狀狼瘡、狼瘡脫發(fā))、幼發(fā)型(I型)糖尿病包括兒科胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、成年型糖尿病(II型糖尿病)、多發(fā)性硬化(MS)諸如脊髓-眼(spino-optical)MS、與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、肉芽腫病包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納氏(Wegener)肉芽腫病、粒細(xì)胞缺乏、血管炎(包括大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安氏(Takayasu))動(dòng)脈炎)、中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、CNS血管炎、系統(tǒng)性壞死性血管炎和ANCA相關(guān)血管炎諸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或綜合征(CSS))、顳動(dòng)脈炎、再生障礙性貧血、庫(kù)姆斯(Coombs)陽(yáng)性貧血、戴-布二氏(DiamondBlackfan)貧血、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、純紅細(xì)胞再生障礙(PRCA)、因子VIII缺陷、血友病A、自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥、全血細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少癥、牽涉白細(xì)胞滲出的疾病、CNS炎性紊亂、多器官損傷綜合征、抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體綜合征、變應(yīng)性神經(jīng)炎、貝切特氏(Behcet)病、卡斯?fàn)柭?Castleman)綜合征、古德帕斯丘氏(Goodpasture)綜合征、雷諾氏(Reynaud)綜合征、斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征、史-約二氏(Stevens-Johnson)綜合征、類天皰瘡諸如大皰性類天皰瘡、天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡和粘膜類天皰瘡型天皰瘡)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、萊特氏(Reiter)病、免疫復(fù)合物腎炎、慢性神經(jīng)病諸如IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病、血小板減少(如例如心肌梗死患者形成的)包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)和自身免疫性或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥諸如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP、睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性曱狀腺功能減退癥、曱狀旁腺功能減退癥、自身免疫性內(nèi)分泌病包括曱狀腺炎諸如自身免疫性曱狀腺炎、慢性曱狀腺炎(橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎)、或亞急性曱狀腺炎、自身免疫性曱狀腺疾病、特發(fā)性曱狀腺功能減退癥、阿狄森氏(Addison)病、格雷夫斯氏(Graves)病、多腺體綜合征諸如自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合4正)、瘤夕卜綜合^正(paraneoplasticsyndrome),包4舌神經(jīng)學(xué)瘤外綜合^正諸如蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無(wú)力綜合征或伊頓-蘭伯特綜合征、僵體(stiff-man)或僵人(stiff-person)綜合征、腦脊髓炎諸如變應(yīng)性腦脊髓炎、重癥肌無(wú)力、小腦變性、邊緣系和/或腦干腦炎、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)、和感覺(jué)神經(jīng)病、席漢氏(Sheehan)綜合征、自身免疫性肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎、淋巴樣間質(zhì)性肺炎、梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植)對(duì)NSIP、格-巴二氏(Guillain-Barr6)綜合征、貝格爾氏(Berger)病(IgA腎病)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)、頑固性口炎性腹瀉、皰滲樣皮炎、冷球蛋白血癥、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS;盧格里克氏(LouGehrig)病)、冠狀動(dòng)脈病、自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、或自身免疫性聽力損失、；現(xiàn)性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)、多軟骨炎諸如頑固性多軟骨炎、肺泡蛋白質(zhì)沉積癥、淀粉樣變、巨細(xì)胞性肝炎、鞏膜炎、非癌性淋巴細(xì)胞增多、原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多，包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多(例如良性單克隆丙種球蛋白病和性質(zhì)未確定的單克隆丙種球蛋白病，MGUS)、周圍神經(jīng)病、瘤外綜合征、通道病諸如癲癇、偏頭痛、心率失常、肌肉紊亂、耳聾、盲、周期性癱瘓、和CNS的通道病、？瓜獨(dú)癥、炎性肌病、病灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、內(nèi)分泌性眼病、葡萄膜視網(wǎng)膜炎、自身免疫性肝臟病學(xué)紊亂、纖維肌痛、多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭、施密特氏(Schmidt)綜合征、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫髓鞘病、德雷斯勒氏(Dressler)綜合征、斑禿、CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著、雷諾氏(Raynaud)現(xiàn)象、食道運(yùn)動(dòng)功能障礙、指端硬化、和毛細(xì)管擴(kuò)張)、男性和女性自身免疫性不孕不育、強(qiáng)直性脊柱炎、混合性結(jié)締組織病、恰加斯氏(Chagas)病、風(fēng)濕熱、習(xí)慣性流產(chǎn)、農(nóng)民肺、多形紅斑、心切開術(shù)后綜合征、柯興氏(Cushing)綜合征、鳥愛(ài)好者肺、阿爾波特氏(Alport)綜合征、肺泡炎諸如變應(yīng)性肺泡炎和纖維化肺泡炎、間質(zhì)性肺病、輸血反應(yīng)、麻風(fēng)、癥疾、矛M十曼病、4偉蟲病(kypanosomiasis)、血吸蟲病、蟲回蟲病、曲霉病、Sampter氏綜合征、卡普蘭氏(Caplan)綜合征、登革熱、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、眼內(nèi)炎、持久隆起性紅斑、胎兒成紅細(xì)胞增多癥、嗜曙紅筋膜炎(eosinophilicfaciitis)、舒爾曼氏(Shulman)綜合征、費(fèi)耳提氏(Felty)綜合征、flariasis、睫狀體炎諸如慢性睫狀體炎、異時(shí)性睫狀體炎、或福克斯氏(Fuch)睫狀體炎、亨諾-許蘭二氏(Henoch-Schonlein)紫癜、人免疫缺陷病毒(fflV)感染、艾柯病毒感染、心肌病、阿耳茨海默氏(Alzheimer)病、細(xì)小病毒感染、風(fēng)滲病毒感染、種痘后綜合征、先天性風(fēng)滲感染、愛(ài)潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎、埃文斯(Evan)綜合征、自身免疫性性腺衰竭、西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病、鏈球菌后腎炎、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、曱狀腺毒癥、脊髓癆、和巨細(xì)胞性多肌痛。"良性增殖性紊亂"指涉及細(xì)胞增殖且醫(yī)學(xué)界成員認(rèn)為其異常的患者狀態(tài)。異常狀態(tài)的特征在于某種特性的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與在未患該紊亂的生物體中觀察到的水平不同。細(xì)胞增殖指通過(guò)細(xì)胞倍增實(shí)現(xiàn)的生長(zhǎng)或擴(kuò)大，包括細(xì)胞分裂。細(xì)胞增殖的速率可通過(guò)對(duì)指定時(shí)間單位中所生成的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)量。良性增殖性紊亂的例子包括4艮屑病和息肉。"呼吸病"牽涉呼吸系統(tǒng)，包括慢性支氣管炎、哮喘包括急性嗜喘和變應(yīng)性哞喘、嚢性纖維化、支氣管擴(kuò)張、變應(yīng)性或其它鼻炎或鼻竇炎、al-抗胰蛋白酶缺陷、咳嗽、肺氣腫、肺纖維化或過(guò)度反應(yīng)性氣道、慢性阻塞性肺病、和慢性阻塞性肺紊亂。"銀屑病"指特征為有范圍限制的、離散的和匯合的、微紅的、銀色鱗狀斑丘瘆爆發(fā)的狀況。銀屑病損傷通常主要發(fā)生于肘、膝、頭皮、和軀干，在顯微鏡下顯示出特征性角化不全和表皮突延長(zhǎng)。該術(shù)語(yǔ)包括各種形式的銀屑病，包括紅皮性、膿皰性、中等-嚴(yán)重和頑固性4艮屑病。"子宮內(nèi)膜異位，，指子宮內(nèi)膜組織的異位發(fā)生，經(jīng)常形成含改變的血液的嚢腫。"血管疾病或紊亂，，在本文中指影響血管系統(tǒng)，包括心血管系統(tǒng)的各種疾病或紊亂。此類疾病的例子包括動(dòng)脈硬化、血管再阻塞、動(dòng)脈粥樣硬化、手術(shù)后血管狹窄、再狹窄、血管閉塞或頸動(dòng)脈阻塞性疾病、冠狀動(dòng)脈病、心絞痛、小血管病、高膽固醇血、高血壓、和牽涉血管上皮細(xì)胞增殖或功能異常的狀況。"狹窄"指身體中的中空通道(例如管或道)變窄或狹窄。術(shù)語(yǔ)"血管狹窄"指血管閉塞或變窄。血管狹窄常常源自脂肪沉積(如在動(dòng)脈粥樣硬化的情況中)或血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度遷移和增殖。動(dòng)脈特別易患狹窄。術(shù)語(yǔ)"狹窄"在用于本文時(shí)明確包括最初的狹窄和再狹窄。術(shù)語(yǔ)"再狹窄'，指最初狹窄的處置獲得表觀成功后狹窄的復(fù)發(fā)。例如，"再狹窄，，在血管狹窄的語(yǔ)境中指例如在通過(guò)血管成形術(shù)(例如經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù))、直接冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑切除術(shù)(directioncoronaryatherectomy)或支架等清除脂肪沉積而處置血管狹窄獲得表觀成功后它的復(fù)發(fā)。再狹窄的一個(gè)起作用的因素是內(nèi)膜增生。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)膜增生"，可與"新粘膜增生，，和"新內(nèi)膜形成"互換使用，指血管最內(nèi)層，內(nèi)膜由于血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)度增殖和遷移而變厚。再狹窄過(guò)程中發(fā)生的各種變化常常統(tǒng)稱為"血管壁再塑"。術(shù)語(yǔ)"氣嚢血管成形術(shù)，，和"經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)，，(PTCA)常?？苫Q使用，指非手術(shù)的基于導(dǎo)管的處置，以從冠狀動(dòng)脈清除斑塊。狹窄或再狹窄常常由于血流阻力升高而導(dǎo)致高血壓。術(shù)語(yǔ)"高血壓，，指異常高的血壓，即超過(guò)正常范圍的上方值。"息肉"指從正常表面水平向外或向上凸出或凸起，由此在宏觀上表現(xiàn)為從相對(duì)寬闊的基部或細(xì)長(zhǎng)主干長(zhǎng)出的半球體、類球體、或不規(guī)則堆樣結(jié)構(gòu)的組織塊。例子包括結(jié)腸、直腸和鼻息肉。"纖維腺瘤"指由腺上皮衍生的良性瘤(贅生物)，其中有正在增殖的成纖維細(xì)胞和結(jié)締組織成分的顯著基質(zhì)。這常常發(fā)生于乳房組織。"哮喘"指導(dǎo)致呼吸困難的一種狀況。支氣管哮喘指其中氣道普遍變窄的肺狀況，它可能是由于平滑肌收縮(痙攣)、粘膜水腫、或支氣管和細(xì)支氣管內(nèi)腔中的粘液。"支氣管炎"指支氣管粘膜的炎癥。II.基因表達(dá)分析本發(fā)明提供了用于為HER抑制劑療法選擇患者的方法，其中對(duì)來(lái)自患者的樣品測(cè)試兩種或多種HER受體(優(yōu)選選自EGFR、HER2和HER3)及一種或多種HER配體(優(yōu)選選自betacellulin、雙調(diào)蛋白、epiregulin和TGF-a,最優(yōu)選betacdlulin或雙調(diào)蛋白)的表達(dá)。例如，所述兩種或多種HER受體可以是EGFR和HER2，或者HER2和HER3。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定HER2和EGFR或HER3,以及betacdlulin或雙調(diào)蛋白的表達(dá)?？梢詫?duì)樣品單獨(dú)測(cè)試betacellulin或雙調(diào)蛋白的表達(dá)，或者聯(lián)合測(cè)試兩種或多種HER受體的表達(dá)。所鑒定基因的陽(yáng)性表達(dá)表明患者是HER抑制劑、HER二聚化抑制劑、或Pertuzumab療法的候選者。此外，所述基因的陽(yáng)性表達(dá)表明患者比沒(méi)有此類陽(yáng)性表達(dá)的患者更有可能有利的響應(yīng)HER抑制劑療法?？梢詮男枰狧ER抑制劑療法的患者獲得樣品。若受試者患有癌癥，則樣品是腫瘤樣品。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤樣品是卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)或非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腫瘤樣品。然而，HER抑制劑還有多種其它非惡性胂瘤治療適應(yīng)癥；本文有描述。若患者要治療的是那些非惡性胂瘤適應(yīng)癥，則可從患者獲得合適的樣品并如本文所述進(jìn)行基因表達(dá)分析。本文中的生物學(xué)樣品優(yōu)選是經(jīng)固定的樣品，例如福爾馬林固定的、石蠟包埋的(FFPE)樣品或冷凍的樣品。優(yōu)選的是,HER抑制劑是HER二聚化抑制劑和/或HER抗體(例如HER2抗體，諸如結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域II的HER2抗體，例如Pertuzumab)。下文更為詳細(xì)的描述了用于測(cè)定mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的多種方法。優(yōu)選的是，對(duì)mRNA定量。此類mRNA分析優(yōu)選使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)或通過(guò)微陣列分析來(lái)進(jìn)行。若采用PCR,則PCR的一種優(yōu)選形式是定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)。在一個(gè)實(shí)施方案中，若一種或多種上文所述基因的表達(dá)處于中值或以上，例如與相同腫瘤類型的其它樣品相比，則認(rèn)為它是陽(yáng)性表達(dá)。中值表達(dá)水平的測(cè)定本質(zhì)上可以與基因表達(dá)的測(cè)量同時(shí)進(jìn)行，或者可以預(yù)先測(cè)定。本發(fā)明的基因表達(dá)分析充當(dāng)HER磷酸化或活化的代替物。這在樣品是經(jīng)固定的樣品(例如石蠟包埋的、福爾馬林固定的腫瘤樣品)、HER磷酸化可能難以可靠定量時(shí)特別有用。如此，本發(fā)明提供了評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法，包括測(cè)定樣品中兩種或多種HER受體及一種或多種HER配體的表達(dá)，其中兩種或多種HER受體及一種或多種HER配體的表達(dá)表明樣品中的HER磷酸化或活化是陽(yáng)性的。本發(fā)明還提供了評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法，包括測(cè)定樣品中betacellulin和/或雙調(diào)蛋白的表達(dá)，其中betacellulin和/或雙調(diào)蛋白表達(dá)表明樣品中的HER磷酸化或活化是陽(yáng)性的。本發(fā)明提供了為HER抑制劑療法鑒定患者的方法，包括測(cè)定來(lái)自患者的樣品中兩種或多種HER受體及一種或多種HER配體的表達(dá)，其中HER受體及HER配體的表達(dá)表明患者有可能響應(yīng)HER抑制劑療法。所述患者可鑒定為比不表達(dá)兩種或多種HER受體及一種或多種HER配體的患者更有可能響應(yīng)HER抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為HER抑制劑療法鑒定患者的方法包括單獨(dú)測(cè)定樣品中betacellulin或雙調(diào)蛋白的表達(dá)，或者聯(lián)合測(cè)定兩種或多種HER受體的表達(dá)。本發(fā)明還提供了用于為HER抑制劑療法選擇卵巢癌患者的方法，通過(guò)單獨(dú)測(cè)定來(lái)自患者的卵巢癌樣品中betacellulin或雙調(diào)蛋白的表達(dá)，或者聯(lián)合測(cè)定兩種或多種HER受體的表達(dá)?，F(xiàn)在將更詳細(xì)的描述用于測(cè)定基因表達(dá)的各種例示性方法。(i)基因表達(dá)制譜一般而言，基因表達(dá)制譜方法可分成兩大組基于多核苷酸雜交分析的方法和基于多核苷酸測(cè)序的方法。本領(lǐng)域知道的用于對(duì)樣品中的mRNA表達(dá)定量的最常用方法包括northern印跡和原位雜交(Parker&Barnes,Md/zocfe/"Mo/ecM/w106:247-283(1999));RNA酶4呆護(hù)測(cè)定法(Hod,淑ec—臘13:852-854(1992));及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Weis"a/.,7>e"A&Ge恥f/cs8:263-264(1992))。或者，可采用可識(shí)別特定雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、及DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體?；跍y(cè)序的基因表達(dá)分析的代表性方法包括基因表達(dá)連續(xù)分析(SerialAnalysisofGeneExpression,SAGE)和通過(guò)大量平行簽名測(cè)序(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)進(jìn)4亍的基因表達(dá)分4斤。(ii)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)在上文所列技術(shù)中，PCR是一種靈敏且靈活的定量方法，它可用于比較經(jīng)過(guò)或未經(jīng)藥物處理的、正常和腫瘤組織中的、不同樣品群中的mRNA水平，以表征基因表達(dá)型式、區(qū)分密切相關(guān)的mRNA、及分析RNA結(jié)構(gòu)。第一步是從靶樣品分離mRNA。起始材料典型的是分別從人肺瘤或腫瘤細(xì)胞系及相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系分離的總RNA。如此，可從多種原發(fā)性腫瘤中分離RNA，包括乳房、肺、結(jié)腸、前列腺、腦、肝、腎、胰、脾、胸腺、睪丸、卵巢、子宮等腫瘤或腫瘤細(xì)胞系，及來(lái)自健康供體的合并DNA。如果mRNA的來(lái)源是原發(fā)性腫瘤，那么mRNA可從例如冷凍的或歸檔的石蠟包埋且固定(例如福爾馬林固定)的組織樣品提取。用于提取mRNA的通用方法是本領(lǐng)域眾所周知的，公開于分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書中，包括Ausubel等人，《CurrentProtocolsofMolecularBiology》，JohnWileyandSons，1997。用于從石蠟包埋組織提取RNA的方法z^開于侈'B口RuppandLocker,丄oZ/"veW.56:A67(1987);DeAndr6sa/.，5"rec/zm'^^18:42044(1995)。具體而言，RNA分離可使用來(lái)自商業(yè)制造商諸如Qiagen的純化試劑盒、緩沖液組和蛋白酶依照制造商的說(shuō)明書進(jìn)行。例如，來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA可使用QiagenRNeasy微型柱分離。其它商品化RNA分離試劑盒包括MASTERPURE㊣完整DNA和RNA純化試劑盒(EPICENTRE,Madison,Wis.)和石蠟塊RNA分離試劑盒(Ambion，Inc.)。來(lái)自組織樣品的總RNA可使用RNAStat-60(Tel-Test)分離。從腫瘤制備的RNA可通過(guò)例如氯化銫密度梯度離心來(lái)分離。由于RNA不能充當(dāng)PCR的模板，通過(guò)PCR進(jìn)行基因表達(dá)制語(yǔ)的第一步是將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,接著是它在PCR反應(yīng)中的指數(shù)式擴(kuò)增。最常用的兩種逆轉(zhuǎn)錄酶是禽類成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV-RT)。逆轉(zhuǎn)錄步驟典型的使用特異性引物、隨機(jī)六聚物或oligo-dT引物引發(fā)，取決于表達(dá)制譜的境況和目標(biāo)。例如，^是耳又的RNA可使用GENEAMPTMRNAPCR試劑盒(PerkinEhner，Calif.,USA)遵循制造商的說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄。然后可將衍生的cDNA作為模板用于后續(xù)PCR反應(yīng)。盡管PCR步驟可使用多種熱穩(wěn)定的DNA依賴性DNA聚合酶，典型的采用TaqDNA聚合酶，它具有5'-3'核酸酶活性但缺乏3'-5'校正內(nèi)切核酸酶活性。如此，TAQMANPCR典型的利用Taq或Tth聚合酶的5'-核酸酶活性來(lái)水解與其靶擴(kuò)增子結(jié)合的雜交探針，但是可使用具有等效5'核酸酶活性的的任何酶。使用兩種寡核苷酸引物來(lái)生成擴(kuò)增子，典型的是PCR反應(yīng)的。第三種寡核普酸或探針設(shè)計(jì)用于檢測(cè)位于前兩種PCR引物之間的核苦,列。探針是TaqDNA聚合酶不可延伸的且用報(bào)道熒光染料和淬滅熒光染料標(biāo)記。在兩種染料正如它們?cè)谔结樕系哪菢游恢每拷鼤r(shí)，任何激光誘發(fā)的來(lái)自報(bào)道染料的發(fā)射受到淬滅染料的淬滅。在擴(kuò)增反應(yīng)期間，TaqDNA聚合酶以模板依賴性方式切割探針。所得探針片段在溶液中解離，來(lái)自所釋放表達(dá)染料的信號(hào)不再受到第二熒光團(tuán)的淬滅效應(yīng)的作用。每合成一個(gè)新的分子就釋放一個(gè)分子的報(bào)道染料，未淬滅報(bào)道染料的檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)定量闡述的基礎(chǔ)。TAQMANPCR可使用商品化設(shè)備進(jìn)行，諸如例如ABIPRISM7700序列4企測(cè)系統(tǒng)(？6&^1-￡111^1"-AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,Calif.,USA)或Lightcycler(RocheMolecularBiochemicals,Mannheim,Germany)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在實(shí)時(shí)定量PCR裝置上運(yùn)行5'核酸酶流程，諸如ABIPRISM7700⑧序列檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)由熱循環(huán)儀、激光(器)、電荷耦合裝置(CCD)、照相機(jī)和計(jì)算機(jī)組成。該系統(tǒng)在熱循環(huán)儀上以96孔形式擴(kuò)增樣品。在擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)光線電纜實(shí)時(shí)收集所有96個(gè)孔的激光誘發(fā)的焚光信號(hào)，并在CCD處4企測(cè)。該系統(tǒng)包括用于運(yùn)行設(shè)備和分析數(shù)據(jù)的軟件。5'-核酸酶測(cè)定法數(shù)據(jù)最初表述為Ct,或循環(huán)閾值(thresholdcycle)。正如上文所討論的，在每個(gè)循環(huán)期間記錄菱光值并代表至擴(kuò)增反應(yīng)中該點(diǎn)時(shí)擴(kuò)增的產(chǎn)物的量。首次記錄到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的熒光信號(hào)的點(diǎn)即循環(huán)閾值(Ct)。為了將錯(cuò)誤和樣品間變異的影響降至最低，通常使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR。理想的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)在不同組織間以恒定水平表達(dá)，不受實(shí)驗(yàn)處理的影響。最頻繁的用于基因表達(dá)型式標(biāo)準(zhǔn)化的RNA是持家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和P-肌動(dòng)蛋白的mRNA。PCR技術(shù)的一種最新變異是定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR),它通過(guò)雙重標(biāo)記的熒光生成探針(即TAQMAN⑧探針)測(cè)量PCR產(chǎn)物積累。實(shí)時(shí)PCR與定量竟?fàn)幮訮CR(其中使用每種靶序列的內(nèi)部竟?fàn)幬飦?lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化)和定量比較性PCR(使用樣品內(nèi)包含的標(biāo)準(zhǔn)化基因或持家基因供PCR之用)都兼容。更多詳情參閱例如Heldef"/.,iasewc/26:986-994(1996)。多份發(fā)表的期刊論文給出了使用固定的、石蠟包埋的組織作為RNA來(lái)源用于基因表達(dá)制譜的代表性方案的步驟，包括mRNA分離、純化、引物延伸和擴(kuò)增(例如Godfrey^Afo/ecD/ag"os"o2:84-91(2000);Spechtda/.，爿w.J尸"Ao/.158:419-29(2001))。簡(jiǎn)單的說(shuō)，一種代表性方法由切出石蠟包埋的腫瘤組織樣品的約l(H敖米厚切片開始。然后，提取RNA,并除去蛋白質(zhì)和DNA。分析RNA濃度后，在必要時(shí)可包括RNA修復(fù)和/或擴(kuò)增步驟，并使用基因特異啟動(dòng)子逆轉(zhuǎn)錄RNA,隨后是PCR。依照本發(fā)明的一個(gè)方面，PCR引物和探針是基于待擴(kuò)增基因中存在的內(nèi)含子序列設(shè)計(jì)的。在這個(gè)實(shí)施方案中，引物/探針設(shè)計(jì)的第一步是描繪基因內(nèi)的內(nèi)含子序列。這可通過(guò)公眾可得到的軟件來(lái)進(jìn)行，諸如由Kent,W.，/仏12(4):656-64(2002)開發(fā)的DNABLAT軟件或BLAST軟件，包括其變異。后續(xù)步驟遵循完全建立的PCR引物和探針設(shè)計(jì)方法。為了避免非特異性信號(hào)，重要的是在設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)掩蓋(mask)內(nèi)含子內(nèi)的重復(fù)序列。這可容易的通過(guò)^f吏用RepeatMasker程序來(lái)實(shí)現(xiàn)，該程序可通過(guò)貝勒醫(yī)學(xué)院(BaylorCollegeofMedicine)在線獲得，它針對(duì)重復(fù)元件文庫(kù)篩選DNA序列并返回其中掩蓋了重復(fù)元件的查詢序列。然后可使用任何商品化或通過(guò)其它途徑公眾可獲得的51物/探針設(shè)計(jì)包將掩蓋后的內(nèi)含子序列用于i殳計(jì)引物和才笨4十序列，諸如PrimerExpress(AppliedBiosystems);MGBassay勿-design(AppliedBiosystems);Primer3(RozenandSkaletsky(2000)Primer3在萬(wàn)維網(wǎng)上供一4殳用戶和生物學(xué)家編程員使用。在KrawetzS,MisenerS編的《BioinformaticsMethodsandProtocols:MethodsinMolecularBiology》中，HumanaPress,Totowa,N丄，第365-386頁(yè))。PCR引物設(shè)計(jì)中考慮的因素包括引物長(zhǎng)度、解鏈溫度(meltingtemperature,Tm)、G/C含量、特異性、互補(bǔ)引物序列、和3'-末端序列。一般而言，最佳的PCR引物通常長(zhǎng)17-30個(gè)堿基，包含約20-80%諸如例如約50-60%G+C堿基。典型的優(yōu)選Tm在50和80。C之間，例如約50-70°C。關(guān)于PCR引物和探針設(shè)計(jì)的進(jìn)一步指導(dǎo)參見例如Dieffenbach等人，"GeneralConceptsforPCRPrimerDesign"(PCR引物設(shè)計(jì)的一般概念)，在《PCRPrimer,ALaboratoryManual》中,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1995,第133-155頁(yè)；Innis和Gdfand，"OptimizationofPCRs"(PCR的優(yōu)化)，在《PCRProtocols,AGuidetoMethodsandApplications》中，CRCPress,London,1994，第5-11頁(yè)；及Plasterer,T.N.,Primerselect:Primerandprobedesign.MethodsMol.Biol.70:520-527(1997)，將其完整/>開內(nèi)容明確收入本文作為參考。(iii)微陣列差別基因表達(dá)也可使用微陣列技術(shù)來(lái)鑒定或驗(yàn)證。如此，可使用微陣列技術(shù)在新鮮的或石蠟包埋的腫瘤組織中測(cè)量乳腺癌相關(guān)基因的表達(dá)譜。在這種方法中，在微芯片基片上涂布(plate)或排列(array)目的多核香酸序列(包括cDNA和寡核苦酸)。然后使排列的序列與來(lái)自目的細(xì)胞或組織的特異性DNA探針雜交。正如在PCR方法中一樣，mRNA的來(lái)源典型的是從人腫瘤或胂瘤細(xì)胞系及相應(yīng)的正常組織或細(xì)胞系分離的總RNA。如此，RNA可從多種原發(fā)性腫瘤或腫瘤細(xì)胞系分離。如果mRNA的來(lái)源是原發(fā)性腫瘤，那么mRNA可從例如冷凍的或歸檔的石蠟包埋且固定(例如福爾馬林固定)的組織樣品提取，所述組織樣品是日常臨床實(shí)踐中常規(guī)制備和保存的。在樣O車列技術(shù)的一個(gè)具體實(shí)施方案中，將PCR擴(kuò)增的cDNA克隆的插入物以密集陣列應(yīng)用至基片。優(yōu)選的是，將至少10,000種核苷酸序列應(yīng)用至基片。以每種10,000個(gè)成分固定在微芯片上的微陣列基因適于在嚴(yán)格條件下雜交。熒光標(biāo)記的cDNA探針可通過(guò)從目的組織提取的RNA的逆轉(zhuǎn)錄中摻入熒光核苷酸來(lái)生成。應(yīng)用至芯片的經(jīng)標(biāo)記cDNA探針與陣列上的每個(gè)DNA斑點(diǎn)以特異性發(fā)生雜交。嚴(yán)格清洗以除去非特異性結(jié)合的探針后，通過(guò)共聚焦激光顯微鏡檢術(shù)或通過(guò)其它檢測(cè)方法諸如CCD照相機(jī)掃描芯片。每種陣列成分的雜交的定量容許評(píng)估相應(yīng)mRNA的豐度。憑借雙重有色熒光，將從兩種RNA來(lái)源生成的分開標(biāo)記的cDNA探針與陣列成對(duì)雜交。如此同時(shí)測(cè)定來(lái)自對(duì)應(yīng)于每種指定基因的兩種來(lái)源的轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)豐度。小型化規(guī)模的雜交提供了大量基因表達(dá)型式的便利且快速評(píng)估。此類方法已經(jīng)顯示出檢測(cè)以每個(gè)細(xì)胞少數(shù)拷貝表達(dá)的罕見轉(zhuǎn)錄物所要求的靈敏度及可再現(xiàn)的檢測(cè)表達(dá)K平的至少約24咅差異(Schena&a/.，尸rac.7Vw/.Jcad>SW.93(2):106-149(1996))。微陣列分析可使用商品化設(shè)備遵循制造商的方案進(jìn)行，諸如使用AffymetrixGENCHIPTM技術(shù)或Incyte的微陣列技術(shù)。為大規(guī)模分析基因表達(dá)而開發(fā)的微陣列方法使得有可能系統(tǒng)搜索多種腫瘤類型中的癌癥分類和后果預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物。(iv)基因表達(dá)連續(xù)分析(SAGE)基因表達(dá)連續(xù)分析(SAGE)是容許同時(shí)且定量分析大量基因轉(zhuǎn)錄物且不需要為每種轉(zhuǎn)錄物提供個(gè)別雜交探針的一種方法。首先，生成包含足以唯一鑒定一種轉(zhuǎn)錄物的信息的一種短序列標(biāo)簽(約10-14bp),倘若該標(biāo)簽是從每種轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的一個(gè)唯一位置得到的。然后，將許多轉(zhuǎn)錄物連接起來(lái)以形成長(zhǎng)、連續(xù)分子，它們可測(cè)序，以同時(shí)揭示多種標(biāo)簽的身份(identity)。任何轉(zhuǎn)錄物群的表達(dá)型式可通過(guò)測(cè)定個(gè)別標(biāo)簽的豐度并鑒定與每種標(biāo)簽對(duì)應(yīng)的基因來(lái)定量評(píng)估。更多詳情參見例如Velculescu&a/.,Sc/e"ce270:484-487(1995);Velculescuefa/.,Ce〃88:243-51(1997)。(v)MassARJRAY技術(shù)MassARRAY(Sequenom，SanDiego,Calif.)技術(shù)是將質(zhì)譜(MS)用于檢測(cè)的一種自動(dòng)化、高通量的基因表達(dá)分析方法。依照這種方法，在分離RNA、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增之后，將cDNA進(jìn)行引物延伸。將cDNA衍生的引物延伸產(chǎn)物純化，并分配到預(yù)先加載了MALTI-TOFMS樣品制備所需要的成分的芯片陣列上。通過(guò)分析所得質(zhì)譜中的峰面積，對(duì)反應(yīng)中存在的各種cDNA定量。(vi)通過(guò)大量平行簽名測(cè)序(MPSS)進(jìn)行的基因表達(dá)分析由Brennerda/.，iVa加w5r-c^c/zwo/ogy18:630-634(2000)i己載的這種方法是將不基于凝膠的簽名測(cè)序與數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的模板在分開的5微米直徑微珠上的體外克隆聯(lián)合起來(lái)的一種測(cè)序方法。首先，通過(guò)體外克隆構(gòu)建DNA模板的微珠庫(kù)。接著，在流動(dòng)槽中以高密度(典型的是大于3xl(^微珠/cm2)裝配含模板微珠的平面陣列。使用不要求將DNA片段分開的基于熒光的簽名測(cè)序方法，同時(shí)分析每個(gè)微珠上克隆的模板的游離末端。這種方法已經(jīng)顯示出在單次操作中同時(shí)且精確的提供來(lái)自酵母cDNA文庫(kù)的數(shù)以十萬(wàn)計(jì)的基因簽名序列(vii)免疫組化用對(duì)每種標(biāo)志物特異的抗體或抗血清，優(yōu)選多克隆抗血清，最優(yōu)選單克隆抗體來(lái)檢測(cè)表達(dá)?？贵w可通過(guò)直接標(biāo)記抗體自身來(lái)檢測(cè)，例如用放射性標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、半抗原標(biāo)記物諸如生物素、或酶諸如辣一艮過(guò)氧化物酶或^U生磷酸酶?；蛘撸礃?biāo)記一抗與經(jīng)標(biāo)記二抗聯(lián)合使用，包括對(duì)一抗特異的抗血清、多克隆抗血清或單克隆抗體。免疫組化方案和試劑盒是本領(lǐng)域眾所周知的，而且可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。(viii)蛋白質(zhì)組學(xué)術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)組，，定義為某一時(shí)間點(diǎn)樣品(例如組織、生物體或細(xì)胞培養(yǎng)物)中存在的蛋白質(zhì)的全體。蛋白質(zhì)組學(xué)包括研究樣品中蛋白質(zhì)表達(dá)的全局變化(也稱為"表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)")等。蛋白質(zhì)組學(xué)典型的包括下列步驟(1)通過(guò)二維凝膠電泳(2-DPAGE)將樣品中的各種蛋白質(zhì)分開；(2)鑒定從凝膠中回收的各種蛋白質(zhì)，例如通過(guò)質(zhì)譜或N-末端測(cè)序；及(3)使用生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)方法是其它基因表達(dá)制譜方法的有用補(bǔ)充，可以單獨(dú)使用或聯(lián)合其它方法，用于檢測(cè)本發(fā)明的預(yù)后標(biāo)志物的產(chǎn)物。(ix)mRNA分離、純化和擴(kuò)增的一般性描述多份發(fā)表的期刊論文給出了使用固定的、石蠟包埋的組織作為RNA來(lái)源用于基因表達(dá)制譜的代表性方案的步驟，包括mRNA分離、純化、引物延伸和擴(kuò)增(例如Godfreyea/"/7Wo/ec2:84-91(2000);Spechte/a/.，J!PaAo/.158:419-29(2001))。簡(jiǎn)單的說(shuō)，一種代表性方法由切出石蠟包埋的腫瘤組織樣品的約IO微米厚切片開始。然后，提取RNA，并除去蛋白質(zhì)和DNA。分析RNA濃度后，在必要時(shí)可包括RNA修復(fù)和/或擴(kuò)增步驟，并使用基因特異啟動(dòng)子逆轉(zhuǎn)錄RNA,隨后是PCR。最后，根據(jù)在所檢驗(yàn)?zāi)[瘤樣品中鑒定的特征性基因表達(dá)型式，分析數(shù)據(jù)以鑒定對(duì)患者有用的最佳處理選項(xiàng)。III.抗體的生成在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HER抑制劑是HER抗體。下文描述了用于生成依照本發(fā)明使用的抗體的例示性技術(shù)。用于生成抗體的HER抗原可以是例如可溶形式的HER胞外結(jié)構(gòu)域或其包含期望表位的部分?；蛘?，在其細(xì)胞表面表達(dá)HER的細(xì)胞(例如經(jīng)轉(zhuǎn)化而過(guò)表達(dá)HER2的NIH-3T3細(xì)胞；或癌細(xì)胞系，諸如SK-BR-3細(xì)胞，參見StancovskiWa/.,尸A^5"(T7&4」88:8691-8695(1991))可用于生成抗體。可用于生成抗體的其它形式HER受體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是將顯而易見的。^多^發(fā)在傳多克隆抗體優(yōu)選通過(guò)在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來(lái)生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來(lái)酰亞胺苯曱?；腔牾啺孵?通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCb或R^NONR，其中R和Ri是不同的烴基，將相關(guān)抗原與在待免疫物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔蟲戚血藍(lán)蛋白、血清清蛋白、牛曱狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。通過(guò)將例如100嗎或5嗎蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和并將該溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位，將動(dòng)物針對(duì)抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進(jìn)行免疫。一個(gè)月后，通過(guò)多個(gè)部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中初始量1/5-1/10的肽或偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，采集動(dòng)物的血液，并測(cè)定血清的抗體滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度達(dá)到穩(wěn)定(plateau)。優(yōu)選的是，將動(dòng)物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過(guò)不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。偶聯(lián)物還可在重組細(xì)胞培養(yǎng)中作為蛋白質(zhì)融合物來(lái)制備。同樣，適當(dāng)使用凝聚劑諸如明礬來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。卓義發(fā)我沐本領(lǐng)域有多種方法可用于制備本文中的單克隆抗體。例如，單克隆抗體可使用最初由Kohler"a/.，A^w^256:495(1975)描述的雜交瘤方法、通過(guò)重組DNA方法(美國(guó)專利第4,816,567號(hào))來(lái)制備。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物，諸如倉(cāng)鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。或者，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》，第59-103頁(yè)，AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃噤呤鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃噪呤、氨基喋呤和胸香(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，California,USA)獲4f的MOPC-21和MPC-11小鼠胂瘤及可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系用于生成人單克隆抗體也已有記載(Kozbor,乂/mm柳o/.D3:3001(1984);Brodeur等人，《MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications》,第51-63頁(yè)，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1987)?？蓪?duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基測(cè)定針對(duì)抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過(guò)免疫沉淀或通過(guò)體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射性免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA),測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過(guò)例如Munsonaa/.,^""/.B/0c/2em.107:220(1980)的Scatchard分析來(lái)測(cè)定。在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，所述克隆可通過(guò)有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding,《MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice》,第59-103頁(yè),AcademicPress，1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另夕卜，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)抗體純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)流程分離和測(cè)序(例如通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細(xì)胞作為此類DNA的優(yōu)選來(lái)源。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外生成抗體蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述'l"生i侖文包4舌Skerraga/"Cm/t:Qp/"/o"/wmw"o/.5:256-262(1993)及Pliickthun,/mmw"o/.130:151-188(1992)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可從使用McCaffertyWo/.，Mm^e348:552-554(1990)所述技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)中分離單克隆抗體或抗體片段。CIacksonda/"淑,352:624-628(1991)及Marksaa/"J!Mo/.脂.222:581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫(kù)分離鼠和人抗體。后續(xù)出版物記載了通過(guò)鏈改組(Marksea/.,Ao/rec/mo/ogy10:779-783(1992)),以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫(kù)的策略(Waterhouseaa/.,M/c.^c/Ai^y.21:2265-2266(1993))，生成高親和力(nM范圍)的人抗體。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替4義方法。還可以修飾DNA，例如通過(guò)替代即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源鼠序列(美國(guó)專利第4,816,567號(hào)；Morrisona/"尸rac.扁.Jo^.t/5L481:6851(1984)),或通過(guò)將非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價(jià)接合。典型的，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區(qū)，或者用它們替代抗體的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變區(qū)，以產(chǎn)生嵌合二價(jià)抗體，它包含對(duì)一種抗原具有特異性的一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)和對(duì)不同抗原具有特異性的另一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。(^;)乂源化^脊體具有一個(gè)或多個(gè)從非人來(lái)源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作"輸入"殘基，它們典型的取自"輸入，，可變區(qū)。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jonesda/"7Vart^321:522-525(1986);Riechmannefa/.，iVa/^e332:323-327(1988》Verhoeyena/"5Wewce239:1534-1536(1988)),通過(guò)用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此類"人源化"抗體是嵌合抗體(美國(guó)專利第4,816,567號(hào))，其中本質(zhì)上少于整個(gè)人可變區(qū)用來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體典型的是其中一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來(lái)自嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基替代的人抗體。用于構(gòu)建人源化抗體的人可變區(qū)的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，對(duì)于降低抗原性非常重要。依照所謂的"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變區(qū)序列對(duì)已知的人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims"a/.,J！/wmw"o/.151:2296(1993);Chothia"/Mo/.腺.196:901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter"a/.，尸rac.A^/.Jcad89:4285(1992);PrestaeM/"/附mwwo/.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對(duì)抗原的高親和力及其它有利的生物學(xué)特性。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，依照一種優(yōu)選的方法，通過(guò)使用親本和人源源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進(jìn)行組合，從而獲得期望抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力提高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。WO01/00245記載了結(jié)合HER2并阻斷HER受體的配體活化的例示性人源化HER2抗體的生成。本文中特別感興趣的人源化抗體基本上像鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效的阻斷EGF、TGF-a和/或HRG介導(dǎo)的MAPK激活，和/或基本上像鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效的結(jié)合HER2。本文中的人源化抗體可例如包含摻入人重鏈可變區(qū)的非人高變區(qū)殘基，而且還可在選自69H、71H和73H的位置包含框架區(qū)(FR)替代，采用的是Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5片反，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD，1991中列出的可變區(qū)編號(hào)系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體在69H、71H和73H的兩個(gè)或所有位置包含F(xiàn)R替代。本文中感興趣的例示性人源化抗體包含重鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定殘基GFTFTDYTMX，其中X優(yōu)選是D或S(SEQIDNO:7);DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQIDNO:8);和/或NLGPSFYFDY(SEQIDNO:9)，任選包含那些CDR殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗體的親和力。例如，目的抗體變體可在上述重鏈可變區(qū)CDR序列中具有約1個(gè)至約7個(gè)或者約5個(gè)氨基酸替代。此類抗體變體可通過(guò)親和力成熟來(lái)制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQIDNO:4中的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。例如，在前一段中的那些重鏈可變區(qū)CDR殘基之外，人源化抗體還可包含輕鏈可變區(qū)互補(bǔ)決定殘基KASQDVSIGVA(SEQIDNO:10);SASYX、ZX3，其中XM尤選是R或L,XM尤選是Y或E,而X^尤選是T或S(SEQIDNO:11);和/或QQYYIYPYT(SEQIDNO:12)。此類人源化抗體任選包含上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗體的親和力。例如，目的抗體變體可在上述輕鏈可變區(qū)CDR序列中具有約1個(gè)至約7個(gè)或者約5個(gè)氨基酸替代。此類抗體變體可通過(guò)親和力成熟來(lái)制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQIDNO:3中的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。本申請(qǐng)還設(shè)想了親和力成熟的抗體，它結(jié)合HER2并阻斷HER受體的配體活化。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如包含輕鏈和/或重鏈可變區(qū)序列分別為SEQIDNO:3和4的抗體(即變體574)。親和力成熟的抗體優(yōu)選以優(yōu)于鼠2C4或變體574的親和力結(jié)合HER2受體(例如根據(jù)使用HER2胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)ELISA的評(píng)估，例如親和力提高約2倍或約4倍至約100倍或約1000倍)。例示性的用于替代的重鏈可變區(qū)CDR殘基包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99，或者兩個(gè)或多個(gè)的組合(例如這些殘基中的2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)或7個(gè))。用于改變的輕^^可變區(qū)CDR殘基的例子包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97，或者兩個(gè)或多個(gè)的組合(例如這些殘基中的2個(gè)至3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)或直到約10個(gè))。設(shè)想了各種形式的人源化抗體或親和力成熟的抗體。例如，人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，諸如Fab，它任選與一種或多種胞毒劑偶聯(lián)以產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物?；蛘?，人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是完整抗體，諸如完整的IgGl抗體。優(yōu)選的完整IgGl抗體包含SEQIDNO:13中的輕鏈序列和SEQIDNO:14中的重鏈序列。(7v,乂在傳作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時(shí)生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊時(shí)生成人抗體。參見例如Jakobovitse/a/"尸rac.淑/.加d90:2551(1993);Jakobovits自/.:淑置362:255-258(1993);Brugge畫nn"a/"腸r/"/匿w肌7:33(1993);及美國(guó)專利第5,591,669號(hào)、第5,589,369號(hào)和第5，545，807號(hào)?；蛘撸澗w展示技術(shù)(McCaffertya/.，Atowe348:552-553(1990))可用于在體外從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)(V)基因全集生成人抗體和抗體片段。依照這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀碼框的方式克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因?yàn)榻z狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行；有關(guān)綜述參見例如Johnson,KevinS.andChiswell,DavidJ.,C群ew一m.owS歐/廳/5油gy3:564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來(lái)源可用于噬菌體展示。Clackson"a/.,A^ww352:624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機(jī)組合文庫(kù)中分離得到大量不同的抗d惡哇酮抗體?？杀举|(zhì)上遵循Marks"a/.，/Mo/.所o/.222:581-597(1991)或Gri伍th&a/.,￡Affi(9J.12:725-734(1993)所述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和分離針對(duì)大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國(guó)專利第5,565,332號(hào)和第5,573,905號(hào)。如上所述，還可通過(guò)體外激活B細(xì)胞來(lái)生成人抗體(參見美國(guó)專利第5,567,610號(hào)和第5,229,275號(hào))。1998年6月30日公告的美國(guó)專利第5,772,997號(hào)和1997年1月3曰公開的WO97/00271中記載了人HER2抗體。)戎沐W度已經(jīng)開發(fā)了用于生成包含一個(gè)或多個(gè)抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過(guò)蛋白水解消化完整抗體來(lái)衍生這些片段(參見例如Morimotoefa/"/ow"a/o/5/oc/2ew/ca/a"d^/op/yAsz.ca/Afe決oc^24:107-117(1992》Brennan&a/.，5We"ce229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫(kù)中分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter&a/.,5/o/rec/z"o/ogy10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab')2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國(guó)專利第5,571,894號(hào)；美國(guó)專利第5,587,458號(hào)?？贵w片段還可以是"線性抗體"，例如如美國(guó)專利第5,641,870號(hào)中所述。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。雙#一弄#拔舉雙特異性抗體指具有對(duì)至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合HER2蛋白質(zhì)的兩種不同表位。其它此類抗體可將HER2結(jié)合位點(diǎn)與EGFR、HER3和/或HER4的結(jié)合位點(diǎn)組合在一起?；蛘?，可將HER2臂與結(jié)合白細(xì)胞上觸發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcyR)，諸如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)的臂組合在一起，使得細(xì)胞防御機(jī)制聚焦于HER2表達(dá)細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)HER2的細(xì)胞。這些抗體擁有HER2結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-a、長(zhǎng)春花生物堿類、蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。WO96/16673記載了一種雙特異性HER2/FcyRIII抗體，美國(guó)專利第5,837,234號(hào)公開了一種雙特異性HER2/FcyRI抗體IDM1(Osidem)。WO98/02463顯示了一種雙特異性HER2/Fca抗體。美國(guó)專利第5,821,337號(hào)教導(dǎo)了一種雙特異性HER2/CD3抗體。MDX-210是一種雙特異性HER2-FcyRin抗體。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域知道的。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生成基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millsteinda/.,AA加we305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成IO種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過(guò)親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。WO93/08829及Traunecker"a/.,五MB(9J10:3655-3659(1991)中公開了類似的流程。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中，第一重鏈恒定區(qū)(CH1)包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比率沒(méi)有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個(gè)表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法公開于WO94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Suresh"a/.，她f/zoA五"z，o/ogy121:210(1986)。依照美國(guó)專利第5,731,168號(hào)中記載的另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子之間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過(guò)將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生針對(duì)大側(cè)鏈的相同或相似大小的補(bǔ)償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專利第4,676,980號(hào))，及用于治療HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來(lái)制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國(guó)專利第4,676,980號(hào)。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來(lái)制備雙特異性抗體。Brennan"5We"ce229:81(1985)記載了通過(guò)蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的流程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸綍跛狨?TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過(guò)巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'^克醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌中直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學(xué)偶耳關(guān)以形成雙特異性抗體。Shalabya/.,￡x/.175:217-225(1992)記載了生成完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子。每個(gè)Fab'片段由大腸桿菌分開分泌，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過(guò)表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已^f吏用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny"a/.,//wmw"o/.148(5):1547-1553(1992)。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過(guò)基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接?？贵w同二聚體在鉸鏈區(qū)還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollingerefa/.,尸rac.A^/.Jcadt/&490:6444-6448(1993)描述的"雙抗體"技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片段包含通過(guò)接頭相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VO，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的Vh和Vt結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)Vl和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過(guò)使用單鏈Fv(sFv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>設(shè)想了具有超過(guò)兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tuttw<formula>formulaseeoriginaldocumentpage59</formula>設(shè)想了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過(guò)將適宜的核苷酸改變引入抗體核酸或者通過(guò)肽合成來(lái)制備抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如抗體氨基^列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有期望特性，可進(jìn)行刪除、插入和替代的任意組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可改變抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置?？捎糜阼b定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱作"丙氨酸掃描誘變，，，如CunninghamandWells，5We"ce244:1081-1085(1989)所述。這里，鑒定了一個(gè)殘基或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸).，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過(guò)在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲那些對(duì)替代展現(xiàn)出功能敏感性的氨基酸位置。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在給定位點(diǎn)處的突變的后果，在耙密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對(duì)所表達(dá)的抗體變體篩選期望活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長(zhǎng)度范圍從一個(gè)殘基至包含上百個(gè)或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端曱硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用不同殘基替換。最感興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但也設(shè)想了FR改變。保守替代在表l中顯示在標(biāo)題"優(yōu)選替代"下。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的改變，那么可以引入表l中稱為"例示替代"的更實(shí)質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>:以—卜萬(wàn)面的効著不同的替代來(lái)完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)其側(cè)鏈特性的相似性，可將氨基酸如下分組(A.L.Lehninger,在《Biochemistry》中，第2版，第73-75頁(yè)，WorthPublishers,NewYork,1975):(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不帶電荷的、極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)石成性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，基于共同的側(cè)鏈特性，可將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性的Asp、Glu;(4)i威'性的His、Lys、Arg;(5)影響鏈耳又向的殘基Gly、Pro;(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代將需要用這些類別之一中的一個(gè)成員替換另一個(gè)類別的。任何不牽涉保持抗體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨酸，以改進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體是抗體片段諸如Fv片段時(shí))。特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改進(jìn)的生物學(xué)特性。產(chǎn)生此類替代變體的一種便利方法牽涉使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在每個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此產(chǎn)生的抗體變體以單價(jià)形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與每個(gè)顆粒內(nèi)包裝的M13基因m產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體和人HER2之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。此類接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生此類變體，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)?？贵w的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。改變意味著刪除在抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)?？贵w的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-x-蘇氨酸(其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中這兩種三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過(guò)改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通過(guò)向原始抗體的序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來(lái)進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。若抗體包含F(xiàn)c區(qū)，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)US2003/0157108Al(Presta，L.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)附著于抗體Fc區(qū)的抗體。還可參見US2004/0093621Al(KyowaHakkoKogyoCo"Ltd,)。WO03/011878(Jean誦Mairet等人)和美國(guó)專利第6,602,684號(hào)(Umana等人)中提到了在—附著于抗體Fc區(qū)的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO97/30087(Patel等人)中報(bào)告了在附著于抗體Fc區(qū)的寡糖中有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于有更改碳水化合物附著于其Fc區(qū)的抗體還可參見WO98/58%4(Raju,S.)和WO99/22764(Raju，S.)?？赡芟Ｍ谛?yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如增強(qiáng)抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過(guò)在抗體Fc區(qū)中引入一個(gè)或多個(gè)M酸替代來(lái)實(shí)現(xiàn)?；蛘?另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而容許在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改進(jìn)的內(nèi)在化能力和/或提高的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caronda/.,/Med176:1191-1195(1992)和Shopes，B.，J/mmwwo/,148:2918-2922(1992)。具有增強(qiáng)的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff""/.,Owceri&searc/z53:2560-2565(1993)中記載的異雙功能交聯(lián)劑來(lái)制備。或者，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強(qiáng)的補(bǔ)體溶解和ADCC能力。參見Stevenson顛-C認(rèn)wDragZ)e一3:219-230(1989)。WO00/42072(Presta,L.)記載了在存在人效應(yīng)細(xì)胞時(shí)具有改進(jìn)的ADCC功能的抗體，其中所述抗體在其Fc區(qū)中包含氨基酸替代。優(yōu)選的是，具有改進(jìn)的ADCC的抗體在Fc區(qū)的位置298、333和/或334包含替代。優(yōu)選的是，改變的Fc區(qū)是在這些位置中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)處包含替代或由其組成的人IgGlFc區(qū)。WO99/51642、美國(guó)專利第6,194,551Bl號(hào)、美國(guó)專利第6,242,195Bl號(hào)、美國(guó)專利第6'528，624B1號(hào)和美國(guó)專利第6,538,124號(hào)(Idusogie等人)中記載了具有改變的Clq結(jié)合和/和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的抗體。所述抗體在其Fc區(qū)的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334中的一個(gè)或多個(gè)處包含氨基酸替代。為了延長(zhǎng)抗體的血清半衰期，可如例如美國(guó)專利第5,739,277號(hào)中所述將補(bǔ)救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)救受體結(jié)合表位"指IgG分子(例如IgG!、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。WO00/42072(Presta,L.)中記載了具有改進(jìn)的對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的結(jié)合和延長(zhǎng)的半衰期的抗體。這些抗體包含其中具有一處或多處改進(jìn)Fc區(qū)對(duì)FcRn結(jié)合的替代的Fc區(qū)。例如，F(xiàn)c區(qū)可在一個(gè)或多個(gè)下列位置具有替代238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434。優(yōu)選的具有改進(jìn)的FcRn結(jié)合的含F(xiàn)c區(qū)抗體變體在其Fc區(qū)的位置307、380和434中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)處包含氨基酸替代。還設(shè)想了具有三個(gè)或更多(優(yōu)選四個(gè))功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)的工程改造抗體(美國(guó)申請(qǐng)?zhí)朥S2002/0004587Al,Miller等人)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過(guò)本領(lǐng)域知道的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來(lái)源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過(guò)對(duì)早期制備的變體或非變體型式的抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來(lái)制備。叫謬遶^l癡皇斧絲的在伴上文已經(jīng)描述了用于生成抗體的技術(shù)。如果需要，還可以選擇具有某些生物學(xué)特性的抗體。為了鑒定阻斷HER受體的配體活化的抗體，可測(cè)定抗體阻斷HER配體結(jié)合表達(dá)HER受體(例如偶聯(lián)另一種HER受體，該HER受體與目的HER受體形成HER異寡聚體)的細(xì)胞的能力。例如，可將天然表達(dá)或者經(jīng)轉(zhuǎn)染而表達(dá)HER異寡聚體的HER受體的細(xì)胞與抗體一起溫育，然后暴露于經(jīng)標(biāo)記的HER配體。然后可評(píng)估抗體阻斷配體結(jié)合HER異寡聚體中的HER受體的能力。例如，可以基本上如WO01/00245中所述，以24孔板的形式在冰上使用單層MCF7培養(yǎng)物進(jìn)行HER2抗體對(duì)HRG結(jié)合MCF7乳瘤細(xì)胞系的抑制?？蓪ER2單克隆抗體添加到每個(gè)孔中并溫育30分鐘。然后可加入125I標(biāo)記的rHRGpi177.224(25pm),并可繼續(xù)溫育4-16小時(shí)?？衫L制劑量-應(yīng)答曲線，并可計(jì)算目的抗體的ICs。值。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷HER受體的配體活化的抗體在此測(cè)定法中抑制HRG結(jié)合MCF7細(xì)胞的ICso為約50nM或更低，更優(yōu)選10nM或更低。若抗體是抗體片段諸如Fab片段，則在此測(cè)定法中抑制HRG結(jié)合MCF7細(xì)胞的ICso可以是例如約lOOnM或更低，更優(yōu)選50nM或更低?；蛘?另外，—可評(píng)估抗體阻斷HEH異寡聚體中存在的HER受體的HER配體刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可將內(nèi)源表達(dá)或者經(jīng)轉(zhuǎn)染而表達(dá)HER受體的細(xì)胞與抗體一起溫育，然后使用抗磷酸酪氨酸單克隆(任選偶聯(lián)有可4企測(cè)標(biāo)記物)測(cè)定HER配體依賴性酪氨酸磷酸化活性。美國(guó)專利第5,766，863號(hào)中記載的激酶受體活化測(cè)定法也可用于測(cè)定HER受體活化和抗體對(duì)該活性的阻斷。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以基本上如WO01/00245中所述，篩選在MCF7細(xì)胞中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抗體。例如，可將MCF7細(xì)胞鋪到24孔板中，并將HER2的單克隆抗體加入每個(gè)孔中，于室溫溫育30分鐘；然后可向每個(gè)孔中加入rHRGpi口7.244至終濃度0.2nM，并可繼續(xù)溫育8分鐘。從每個(gè)孔中吸走培養(yǎng)基，通過(guò)加入100^1SDS樣品緩沖液(5%SDS,25mMDTT,25mMTris-HCl,pH6.8)來(lái)終止反應(yīng)?？稍?-12。/。梯度凝膠(Novex)上對(duì)每一份樣品(25|al)進(jìn)行電泳，然后通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上?？蓪?duì)抗磷酸酪氨酸(以l嗎/ml)免疫印跡顯影，并通過(guò)反射密度法(reflectancedensitometry)對(duì)Mr約180,000的主要反應(yīng)性條帶的強(qiáng)度定量。在此測(cè)定法中，所選抗體優(yōu)選將HRG刺激p180酪氨Si磷酸化顯著抑制至對(duì)照的約0-35%?？衫L制通過(guò)反射密度法測(cè)定的對(duì)HRG刺激pl80酪氨酸磷酸化的抑制作用的劑量-應(yīng)答曲線，并可計(jì)算目的抗體的IC5Q。在一個(gè)實(shí)施方案中，阻斷HER受體的配體活化的抗體在此測(cè)定法中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的ICso為約50nM或更低，更優(yōu)選10nM或更低。若抗體是抗體片段諸如Fab片段，則在此測(cè)定法中抑制HRG刺激pl80酪氨酸磷酸化的ICso可以是例如約lOOnM或更低，更優(yōu)選50nM或更j氐。還可評(píng)估抗體對(duì)MDA-MB-175細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，例如基本上如Schaeferda/.，O"coge"e15:1385-1394(1997)中所述。依照此測(cè)定法，可將MDA-MB-175細(xì)胞用HER2單克隆抗體(10pg/mL)處理4天，并用結(jié)晶紫染色。與HER2抗體的溫育對(duì)此細(xì)胞系顯示的生長(zhǎng)抑制作用可能與使用單克隆抗體2C4所展示的相似。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，外源HRG不會(huì)顯著逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。優(yōu)選的是，存在和缺乏外源HRG時(shí)，該抗體都將能夠以大于單克隆抗體4D5的程度(并且任選以大于單克隆抗體7F3的程度)抑制MDA-MB-175細(xì)胞的細(xì)胞增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，諸如WO01/00245中所記載的，目的HER2抗體可在MCF7和SK-BR-3細(xì)胞中阻斷調(diào)蛋白依賴性的HER2與HER3結(jié)合，實(shí)質(zhì)上比單克隆抗體4D5更有效，且優(yōu)選實(shí)質(zhì)上比單克隆抗體7F3更有效。為了鑒定生長(zhǎng)抑制性HER2抗體，可篩選抑制過(guò)表達(dá)HER2的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，在約0.5-30fig/ml的抗體濃度，所選生長(zhǎng)抑制性抗體能夠?qū)⒓?xì)胞培養(yǎng)中的SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制約20-100%,優(yōu)選約50-100%。為了鑒定此類抗體，可進(jìn)行美國(guó)專利第5,677,171號(hào)中記載的SK-BR-3測(cè)定法。依照此測(cè)定法，在F12和補(bǔ)充有10%胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的1:1混合液中培養(yǎng)SK-BR-3細(xì)胞。將SK-BR-3細(xì)胞以20,000個(gè)細(xì)胞鋪入35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(2ml/35mm培養(yǎng)皿)。每個(gè)培養(yǎng)皿加入0.5-30嗎/mlHER2抗體。6天后，使用電子COULTERtm細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，與未處理細(xì)胞比較?？蛇x擇那些將SK-BR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制約20-100%或約50-100%的抗體作為生長(zhǎng)抑制性抗體。關(guān)于用于篩選生長(zhǎng)抑制性抗體諸如4D5和3E8的測(cè)定法，參見美國(guó)專利第5,677,171號(hào)。為了選擇誘導(dǎo)凋亡的抗體，可利用使用BT474細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合測(cè)定法。如前一^1所討論的，在培養(yǎng)i中培養(yǎng)和接種BT474細(xì)胞。然后除去培養(yǎng)基，只用新鮮培養(yǎng)基或者含有10嗎/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基替換。在3天溫育期后，用PBS洗滌細(xì)胞單層，通過(guò)胰蛋白酶消化脫離。然后如上文關(guān)于細(xì)胞死亡測(cè)定法所討論的，離心細(xì)胞，重懸于Ca"結(jié)合緩沖液中，并等分到試管中。然后往試管中加入經(jīng)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(例如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(l嗎/ml)?？墒褂肍ACSCANTM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和FACSCONVERTCellQuest軟件(BectonDickinson)來(lái)分析樣品。選擇那些相對(duì)于對(duì)照誘導(dǎo)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體作為誘導(dǎo)凋亡的抗體。在膜聯(lián)蛋白結(jié)合測(cè)定法之外，還可利用使用BT474細(xì)胞的DNA染色測(cè)定法。為了進(jìn)行此測(cè)定法，將已經(jīng)如前面兩段所述用目的抗體處理過(guò)的BT474細(xì)胞與9pg/mlHOECHST33342TMf37。C溫育2小時(shí)，然后在EPICSELITETM流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(CoulterCorporation)上使用MODFITLTTM軟件(VeritySoftwareHouse)進(jìn)行分析?？蛇x擇在此測(cè)定法中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞百分比變化為未處理細(xì)胞的2倍或更高(優(yōu)選3倍或更高)(直到100%凋亡細(xì)胞)的抗體作為促凋亡抗體。用于篩選誘導(dǎo)凋亡的抗體諸如7C2和7F3的測(cè)定法參見WO98/17797。為了篩選結(jié)合HER2上目的抗體所結(jié)合的表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)交叉阻斷測(cè)定法，諸如《Antibodies,ALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane,1988中所記載的，以評(píng)估所述抗體是否交叉阻斷諸如2C4或Pertuzumab等抗體與HER2的結(jié)合?；蛘?另外，可通過(guò)本領(lǐng)域知道的方法進(jìn)行表位作圖和/或可研究抗體-HER2結(jié)構(gòu)(FranklindCa"cwCW/5:317-328(2004))以了解抗體結(jié)合HER2的哪個(gè)/哪些結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，HER2抗體組合物包含主要種類Pertuzumab抗體及其一種或多種變體的混合物。本文中Pertuzumab主要種類抗體的優(yōu)選實(shí)施方案是包含SEQIDNo.3和4中的輕鏈和重鏈可變區(qū)氨基酸序歹'j，最優(yōu)選包含選自SEQIDNo.13和17的輕鏈氨基酸序列及選自SEQIDNo.14和18的重鏈氨基酸序列的抗體(包括那些序列的脫酰胺和/或氧化變體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含主要種類Pertuzumab抗體及其包含氨基末端前導(dǎo)延伸的氨基S臾序列變體的混合物。優(yōu)選的是，所述氨基末端前導(dǎo)延伸位于抗體變體的輕鏈上(例如位于抗體變體的一條或兩條輕鏈上)。所述主要種類HER2抗體或抗體變體可以是全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如Fab或F(ab，)2片段)，但優(yōu)選二者都是全長(zhǎng)抗體。本文中的抗體變體可以在其任何一條或多條重鏈或輕鏈上包含氨基末端前導(dǎo)延伸。優(yōu)選的是，所述氨基末端前導(dǎo)延伸位于抗體的一條或兩條輕鏈上。所述氨基末端前導(dǎo)延伸優(yōu)選包含VHS-或由其組成。組合物中氨基末端前導(dǎo)延伸的存在可通過(guò)多種分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)，包括但不限于N-末端序列分析、電荷異質(zhì)性的測(cè)定法(例如陽(yáng)離子交換層析或毛細(xì)管區(qū)帶電泳)、質(zhì)譜等。組合物中抗體變體的量通常在如下范圍內(nèi)，從構(gòu)成用于檢測(cè)變體的任何測(cè)定法(優(yōu)選N-末端序列分析)的檢出限的量至少于主要種類抗體量的量。通常，組合物中約20%或更少(例如從約1%至約15%,例如從5%至約15%)的抗體分子包含氨基末端前導(dǎo)延伸。這樣的百分比量?jī)?yōu)選使用定量N-末端序列分析或陽(yáng)離子交換分析(優(yōu)選使用高分辨率、弱陽(yáng)離子交換柱，諸如PROPACWCX-10TM陽(yáng)離子交換柱)來(lái)測(cè)定。在氨基末端前導(dǎo)延伸變體之外，還設(shè)想了主要種類抗體和/或變體的氨基酸序列改變，包括但不限于在其一條或所有兩條重鏈上包含C-末端賴氨酸殘基的抗體、脫酰胺抗體變體、等。此外，主要種類抗體或變體還可包含糖基化變異，其非限制性例子包括包含附著于其Fc區(qū)的Gl或G2寡糖結(jié)構(gòu)的抗體、包含附著于其輕鏈的碳水化合物模塊的抗體(例如一種或兩種碳水化合物模塊，諸如葡萄糖或半乳糖附著于抗體的一條或兩條輕鏈，例如附著于一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基)、包含一條或兩條非糖基化重鏈的抗體、或包含附著于其一條或兩條重鏈的唾液酸化寡糖的抗體等。組合物可從表達(dá)HER2抗體的基因工程細(xì)胞系回收，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系，或者可通過(guò)肽合成來(lái)制備。名瘦偶農(nóng)參本發(fā)明還涉及包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的抗體的免疫偶聯(lián)物，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑。本文還設(shè)想了抗體與一種或多種小分子毒素的偶聯(lián)物，諸如加利車霉素、美登素(美國(guó)專利第5,208,020號(hào))、單端孢菌毒素和CC1065。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將抗體與一個(gè)或多個(gè)美登素分子偶聯(lián)(例如每個(gè)抗體分子偶聯(lián)約1個(gè)至約IO個(gè)美登素分子)。例如，可將美登素轉(zhuǎn)變?yōu)镸ay-SS-Me，后者可還原為May-SH3并與經(jīng)修飾抗體反應(yīng)(Charida/.，OwcerA^earc/52:127-131(1992))以生成美登木素生物堿-抗體免疫偶聯(lián)物。另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子的抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于Yi1、a、ct31、N-乙?；?Yi1、PSAG和eVHinmanefa/"C鍵erie廳w/253:3336-3342(1993)和Lode^a/.:C麵wie織W58:2925-2928(1998))。還可參見美國(guó)專利第5,714,586號(hào)；第5,712,374號(hào)；第5,264,586號(hào)和第5，773，001號(hào)，明確收入本文作為參考?？墒褂玫拿富疃舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來(lái)自銅綠假單孢菌CP杧i^owo"osaen^/"osa))、荒麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、a-帚曲毒素(sarcin)、油4同(^/ewn'fes/ora^')毒蛋白、香石斗f(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(尸/z;/to/aca」wen'cawa)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicEicharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草(sapaonariaofficinalis)才中制物、白杉十毒素(gelonin)、絲才朱霉素(mitogellin)、局卩艮曲菌素(restrictocin)、盼霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孑包菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的WO93/21232。DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。有多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)的HER2抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素。可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來(lái)制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺曱基)環(huán)己胺-l-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞胺二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二趁)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)疊氮苯曱酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)重氮苯曱酰基)己二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaefa/.,5Wewce238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核素與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒性藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶壽文感接頭、二曱基接頭或含二石?；锝宇^(Chari"a/.，Owcwi^匿/z52:127-131(1992))。或者，可例如通過(guò)重組技術(shù)或肽合成來(lái)制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。本文還設(shè)想了其它免疫偶聯(lián)物。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物中的一種連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。還可將抗體包載于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸甲酯)微膠嚢)、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.編，1980。本文公開的抗體還可配制成免疫脂質(zhì)體。可通過(guò)本領(lǐng)域知道的方法來(lái)制備包含抗體的脂質(zhì)體，諸如Epstein"a/.,尸rac.A^/.5W.82:3688(1985);Hwang&a/"尸rac.A^/.爿cad5W.t/W77:4030(1980);美國(guó)專利第4,485,045號(hào)和第4,544,545號(hào)；1997年10月23日公開的WO97/38731中所記載的。美國(guó)專利第5,013,556號(hào)中公開了循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可用含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物通過(guò)反相蒸發(fā)法生成。將脂質(zhì)體擠過(guò)具有限定孔徑的濾器，以產(chǎn)生具有期望直徑的脂質(zhì)體。可如MartinWa/.，乂歷o/.(》em.257:286-288(1982)中所記載的，將本發(fā)明抗體的Fab，片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見Gabizonaa/.,JA^"o加/Omcer/"W.81(19):1484(1989)。IV.藥用配制劑通過(guò)將具有期望純度的抗體與任選的藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定齊寸(《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.編，1980)混合，以凍干配制劑或水溶液的形式，制務(wù)農(nóng)照本發(fā)明使用的抗體的治療用配制劑供貯存?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基節(jié)基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對(duì)羥基苯曱酸烷基酯，諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間笨二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約IO個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENtm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。凍干的抗體配制劑記載于WO97/04801，明確收入本文作為參考。用于治療用途的優(yōu)選Pertuzumab配制劑在pH6.0的20mM醋酸組氨酸、120mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯20中含有30mg/mlPertuzumab。備選的Pertuzumab配制劑含有25mg/mlPertuzumab、lOmM組氨酸-HCl緩沖液、240mM蔗糖、0.02%聚山梨醇酯20,pH6.0。本文中的配制劑還可含有超過(guò)一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒(méi)有不利影響的?？梢耘cHER抑制劑聯(lián)合的各種藥物記載在下文治療方法部分中。合適的是，此類分子以對(duì)于預(yù)定目的有效的量組合?；钚猿煞诌€可包載于例如通過(guò)凝聚技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于例如《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.編，1980?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酉旨)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國(guó)專利第3,773,919號(hào))、l-谷氨酸和l-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如luprondepot(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可容易的通過(guò)使用無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。V.^使用HER抑制劑的治療具有如上所述表達(dá)譜的患者是使用HER抑制劑諸如Pertuzumab的療法的候選者。上文定義部分列出了可治療的各種癌癥的例子。認(rèn)為所述方法特別適用于治療卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌；乳腺癌，包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)、非HER2過(guò)表達(dá)乳腺癌；及非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所治療的癌癥是化療耐受性癌癥或鉑耐受性癌癥。對(duì)具有表達(dá)語(yǔ)的患者的治療將導(dǎo)致癌癥的征候或癥狀改善。例如，此類療法可導(dǎo)致相對(duì)于沒(méi)有表達(dá)譜的患者，存活(總體存活和/或無(wú)進(jìn)展存活)有所提高，和/或可導(dǎo)致客觀臨床響應(yīng)(部分的或完全的)。疾病或紊亂。此類非惡性疾病或紊亂包括自身免疫性疾病(例如4艮屑病；見上文定義)；子宮內(nèi)膜異位癥；硬皮??；再狹窄；息肉，諸如結(jié)腸息肉、鼻息肉或胃腸息肉；纖維腺瘤；呼吸疾病(見上文定義)；膽嚢炎；神經(jīng)纖維瘤?。欢鄧靶阅I??；炎性疾病；皮膚紊亂，包括銀屑病和皮炎；脈管疾病(見上文定義)；牽涉血管上皮細(xì)胞異常增殖的狀況；胃腸潰瘍；門內(nèi)特里埃氏(Menetrier)病，分泌型腺瘤或蛋白質(zhì)流失綜合征(proteinlosssyndrome);腎紊亂；血管發(fā)生性紊亂；眼病，諸如年齡相關(guān)黃斑變性、々支定的(presumed)目艮組織胞漿菌病綜合癥、來(lái)自增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜血管形成、糖尿病性視網(wǎng)膜病或年齡相關(guān)黃斑變性的視網(wǎng)膜新血管形成；骨相關(guān)病理學(xué)，諸如骨關(guān)節(jié)炎、佝僂病和骨質(zhì)疏松；腦缺血事件后的損傷；纖維變性或水腫疾病，諸如肝硬化、肺纖維化、結(jié)節(jié)病(carcoidosis)、甲狀腺炎(throiditis)、系統(tǒng)性高粘滯綜合癥、奧斯勒-韋伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu)病、慢性阻塞性肺病，或者燒傷、創(chuàng)傷、輻射、中風(fēng)、組織缺氧或缺血后的水腫；皮膚的超敏感性反應(yīng)；糖尿病性視網(wǎng)膜病和糖尿病性腎病；格-巴二氏(Guillain-Barre)綜合征；移;f直物抗宿主病或移植排斥；佩吉特氏(Paget)??；骨或關(guān)節(jié)炎癥；光老化(例如由UV照射人皮膚引起的)；良性前列腺肥大；某些微生物感染，包括選自腺病毒、漢坦病毒(hantaviruses)、布氏疏螺旋體(5o;re"aZmrgcfor/en')、耶爾森氏菌(l^w'm'a)和百日咳博德特氏菌(5orafe&〃apeww^)的微生物病原體；由血小板聚集引起的血栓；生殖狀況，諸如子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢過(guò)度刺激綜合征、先兆子癇、功能障礙性子宮出血或月經(jīng)頻多；滑膜炎；粥樣斑；急性和慢性腎病(包括增生性腎小球腎炎和糖尿病誘發(fā)的腎病)；濕疹；肥厚性瘢痕形成；內(nèi)毒素性休克和真菌感染；家族性^^瘤息肉?。簧窠?jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默氏(Alzheimer)病、AIDS相關(guān)癡呆、帕金森氏(Parkinson)病、肌萎縮側(cè)索硬化、色素性視網(wǎng)膜炎、脊髓性肌萎縮和小腦變性)；骨髓增生異常綜合癥(myelodysplasticsyndrome);再生障礙性貧血；缺血性損傷；肺、腎或肝的纖維化；T細(xì)胞介導(dǎo)的超敏感性疾?。粙雰悍屎裥杂拈T狹窄；泌尿阻塞綜合癥；銀屑病關(guān)節(jié)炎；和橋本氏(Hasimoto)曱狀腺炎。本文療法優(yōu)選的非惡性適應(yīng)癥包括^^艮屑病、子宮內(nèi)膜異位癥、硬皮病、脈管疾病(例如再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈病或高血壓)、結(jié)腸息肉、纖維腺瘤或呼吸疾病(例如譯喘、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張或嚢性纖維化)。優(yōu)選的是，所施用的抗體是棵抗體。然而，所施用的抗體可偶聯(lián)細(xì)胞毒劑。優(yōu)選的是，免疫偶聯(lián)物和/或其所結(jié)合的抗原受到細(xì)胞的內(nèi)在化，導(dǎo)致免疫偶聯(lián)物殺傷其所結(jié)合的癌細(xì)胞的治療功效提高。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞毒劑靶向或干擾癌細(xì)胞中的核酸。此類細(xì)胞毒劑的例子包括美登木素生物;威類、加利車霉素、核糖核酸酶和DNA內(nèi)切核酸酶。依照已知方法對(duì)人類患者施用HER2抑制劑，諸如靜脈內(nèi)施用，例如推注或一段時(shí)間的連續(xù)輸注，通過(guò)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口月良、局部或吸入路徑。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用抗體。對(duì)于疾病的預(yù)防或治療，HER抑制劑的適宜劑量將取決于如上定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)程、施用藥物是為了預(yù)防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對(duì)藥物的響應(yīng)、及主治醫(yī)師的判斷。適當(dāng)?shù)脑谀骋粫r(shí)間或者通過(guò)一系列治療對(duì)患者施用HER抑制劑。4艮據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，對(duì)患者施用的初始候選劑量是約l嗎/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)HER抑制劑，無(wú)論是通過(guò)例如一次或多次分開的施用，或者通過(guò)連續(xù)輸注。優(yōu)選的HER抗體劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍內(nèi)。如此，可對(duì)患者施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一劑或多劑。此類劑量可間歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受約2劑至約20劑，例如約6劑HER抗體)。可以首先施用較高的加載劑量，后續(xù)較低的一劑或多劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，首先以約840mg的加載劑量施用HER抗體，后續(xù)大約每三周施用約420mg。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大約每3周以約1050mg的一劑施用HER抗體。若疾病是癌癥，優(yōu)選用HER抑制劑和一種或多種化療劑的組合來(lái)治療患者。優(yōu)選的是，至少一種化療劑是抗代謝物化療劑，諸如吉西他濱。聯(lián)合施用包括使用分開的配制劑或單一的藥用配制劑的共施用或同時(shí)施用，以及任一次序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選有一段時(shí)間所有兩種(或多種)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性。如此，可在施用HER抑制劑之前或之后施用抗代謝物化療劑。在此實(shí)施方案中，至少一次抗代謝物化療劑的施用和至少一次HER抑制劑的施用之間的計(jì)時(shí)優(yōu)選為約1個(gè)月或更短，最優(yōu)選約2周或更短。或者，以單一的配制劑或分開的配制劑同時(shí)對(duì)患者施用抗代謝物化療劑和HER抑制劑?；焺?例如抗代謝物化療劑，諸如吉西他濱)和HER抑制劑(例如Pertuzumab)的聯(lián)合治療可對(duì)患者產(chǎn)生協(xié)同的、或者大于累加的治療效益。抗代謝物化療劑，如果施用的話，通常以其已知?jiǎng)┝渴┯茫蛘呷芜x由于藥物的聯(lián)合作用或者由于施用抗代謝物化療劑造成的不良副作用而降低。可依照制造商的說(shuō)明書使用此類化療劑的制備和劑量給藥時(shí)間表，或者由熟練從業(yè)人員憑經(jīng)驗(yàn)確定。若抗代謝物化療劑是吉西他濱，優(yōu)選的是，例如在三周循環(huán)的第1天和第8天施用約600mg/n^至1250mg/rr^之間(例如約1000mg/m2)的一劑。在HER抑制劑和抗代謝物化療劑之外，還可聯(lián)合其它治療方案。例如，可施用第二(第三、第四、等等)化療劑，其中第二種化療劑或是另一種不同的抗代謝物化療劑，或是非抗代謝物的化療劑。例如，第二種化療劑可以是紫杉烷(諸如Paclitaxel或Docetaxel)、卡培他濱或基于鉑的化療劑(諸如卡柏、順鉑和奧沙利鉑)、蒽環(huán)類抗生素(諸如多柔比星，包括多柔比星脂質(zhì)體)、托泊替康、培美曲塞、長(zhǎng)春花生物堿類(諸如長(zhǎng)春瑞濱)和TLK286。可以施用不同化療劑的"雞尾酒"?？膳cHER抑制劑聯(lián)合的其它治療劑包括以下任一種或多種第二種不同的HER抑制劑(例如生長(zhǎng)抑制性HER2抗體諸如Trastuzumab或誘導(dǎo)HER2過(guò)表達(dá)細(xì)胞凋亡的HER2抗體諸如7C2、7F3或其人源化變體)；針對(duì)不同腫瘤相關(guān)抗原諸如EGFR、HER3、HER4的抗體；抗激素化合物，例如抗J難激素化合物諸如他莫昔芬，或芳香酶抑制劑；心臟保護(hù)劑(以預(yù)防或減輕與治療有關(guān)的任何心肌功能障礙)；細(xì)胞因子；EGFR靶向藥物(諸如TARCEVA、IRESSA⑧或Cetuximab);抗血管發(fā)生劑(尤其是Genentech以商標(biāo)AVASTINTM銷售的Bevacizumab);酪氨酸激酶抑制劑；COX抑制劑(例如C0X-1或COX-2抑制劑)；非類固醇抗炎藥，Celecoxib(CELEBREX);法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如可從JohnsonandJohnson購(gòu)買的Tipifamib/ZARNESTRARl15777或可從Schering-Plough購(gòu)買的LonafamibSCH66336);結(jié)合癌胚蛋白CA125的抗體，諸如Oregovomab(MoAbB43.13);HER2疫苗(諸如Pharmexia的HER2AutoVac疫苗，或Dendreon的APC8024蛋白質(zhì)疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；其它HER靶向療'法(侈'H口trastuzumab、cetuximab、gefitinib、erlotinib、CI1033、GW2016等)；Raf和/或ras抑制劑(參見例如WO2003/86467);Doxil;托泊替康；紫杉烷；GW572016;TLK286;EMD-7200;治療惡心的藥物，諸如血清素拮抗劑、類固醇或苯并二氮卓；預(yù)防或治療皮疹的藥物或標(biāo)準(zhǔn)痤瘡療法，包括局部或口服抗生素；降體溫藥物，諸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或麥口定(meperidine);造血生長(zhǎng)因子，等等。任何上述共施用藥劑的合適劑量就是那些目前所使用的劑量，而且可由于該藥劑與HER抑制劑的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)而降低。在上述治療方案之外，還可對(duì)患者進(jìn)行手術(shù)去除癌細(xì)胞和/或放療。在對(duì)患者施用抗體蛋白質(zhì)之外，本申請(qǐng)?jiān)O(shè)想了通過(guò)基因療法來(lái)施用抗體或蛋白質(zhì)抑制劑。參見例如1996年3月14日^^布的WO96/07321，它關(guān)注使用基因療法來(lái)生成胞內(nèi)抗體。有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進(jìn)入患者的細(xì)胞，即體內(nèi)和回體(exWvo)。對(duì)于體內(nèi)投遞，通常在需要抗體的部位將核酸直接注射到患者體內(nèi)。對(duì)于回體治療，采集患者的細(xì)胞，將核酸導(dǎo)入這些分離的細(xì)胞，并將經(jīng)過(guò)修飾的細(xì)胞或是直接施用于患者，或是例如裝入多孔膜內(nèi)并植入患者體內(nèi)(參見例如美國(guó)專利第4,892,538號(hào)和第5,283,187號(hào))。有多種技術(shù)可用于將核酸導(dǎo)入可存活細(xì)胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)細(xì)胞還是目的宿主的體內(nèi)細(xì)胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞融合、DEAE-右旋糖苦、磷酸釣沉淀法等。常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰滲病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染。在有些情況中，希望與靶向靶細(xì)胞的試劑一起提供核酸源，諸如對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白或靶細(xì)胞特異的抗體、靶細(xì)胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時(shí)，與胞吞作用相關(guān)細(xì)胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝入，例如對(duì)特定細(xì)胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、和靶向細(xì)胞內(nèi)定位和增加細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。例如Wue^/.,J!B/o/.C/7em.262:4429-4432(1987);Wagneraa/"淑/.v4ow/,5W.園87:3410-3414(19卯)中記載了受體介導(dǎo)的胞吞技術(shù)。關(guān)于目前已知的基因標(biāo)記和基因治療方案的綜述參見Anderson"a/.，5We"ce256:808-813(1992)。還可參見WO93/25673及其引用的參考文獻(xiàn)。VI.保藏以下雜交瘤細(xì)胞系已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209USA)(ATCC):抗體名稱7C27F34D52C4ATCC編號(hào)ATCCHB-12215ATCCHB-12216ATCCCRL10463ATCCHB國(guó)12697保藏日期1996年10月17日1996年10月17曰19卯年5月24曰1999年4月8曰以下非限制性實(shí)施例例示了本發(fā)明的進(jìn)一步詳情。將說(shuō)明書中所有引文的公開內(nèi)容明確收入本文作為參考。實(shí)施例實(shí)施例l:與HER2磷酸化有關(guān)的基因表達(dá)i普使用AFFYMETRIX⑧微陣列分析，將來(lái)自用Pertuzumab治療的卵巢癌患者的新鮮卵巢腫瘤標(biāo)本對(duì)一小組選定基因進(jìn)行基因表達(dá)制譜。分析微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)以鑒定將與HER2磷酸化狀態(tài)有關(guān)的基因型式。值得注意的是，出現(xiàn)了這樣的型式，其中具有相對(duì)較高水平的EGFR、HER2、HER3、和HER配體betacelullin表達(dá)的腫瘤對(duì)HER2磷酸化也是陽(yáng)性的。圖10顯示了具有上述基因的腫瘤的無(wú)監(jiān)督簇集(aunsupervisedclustering),導(dǎo)致6個(gè)磷酸化陽(yáng)性肺瘤中的6個(gè)簇集到一起。圖11顯示了可通過(guò)使用這樣的算法來(lái)預(yù)測(cè)卵巢腫瘤的磷酸化狀態(tài)，其中betacellulin和HER2表達(dá)處于中值或以上和/或EGFR和/或HER3表達(dá)處于中值或以上的樣品預(yù)測(cè)是陽(yáng)性的。使用微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)作為算法的基礎(chǔ)，6個(gè)HER2磷酸化陽(yáng)性案例的6個(gè)中的相關(guān)性是陽(yáng)性的，而HER2磷酸化陰性案例都沒(méi)有預(yù)測(cè)為陽(yáng)性的。在第二項(xiàng)分析中，HER2磷酸化狀態(tài)的預(yù)測(cè)是通過(guò)只使用單一基因，即betacellulin實(shí)現(xiàn)的。圖12顯示了所有6個(gè)HER2磷酸化陽(yáng)性胂瘤具有超過(guò)中值的betacellulin表達(dá)，再次使用微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。實(shí)施例2:供測(cè)量基因表達(dá)的微陣列分析和qRT-PCR的比較在本實(shí)施例中，使用對(duì)基因表達(dá)定量的第二種方法，定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)來(lái)驗(yàn)證微陣列數(shù)據(jù)并與其進(jìn)行比較。qRT-PCT將是用于測(cè)量可從臨床背景中獲得的典型患者樣品中的基因表達(dá)的優(yōu)選方法。早就建立了這種方法的診斷技術(shù)平臺(tái)。qRT-PCR如Cronin^a/.,/尸a組164(1):35-42(2004)及Ma"a/"Ca"cwCe〃5:607-616(2004)中所述進(jìn)行。使用來(lái)自Qiagen(Valencia,Califomia)的商品化試劑從冷凍的卵巢腫瘤中提取RNA。用于TAQMANqRT-PCR分析的引物和探針設(shè)計(jì)成產(chǎn)生長(zhǎng)度為約100個(gè)堿基或更少的擴(kuò)增子。使用TAQMANTM設(shè)備(AppliedBioSystems)通過(guò)qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄物定量，將測(cè)試基因的表達(dá)水平對(duì)參照基因的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。圖13顯示了已建立qRT-PCR測(cè)定法的基本特征。選擇"持家"基因GUS作為對(duì)照基因，因?yàn)樗淖儺惖秃捅磉_(dá)高。首先為了驗(yàn)證;徵陣列測(cè)量結(jié)果，將qRT-PCR結(jié)果與通過(guò)^t陣列獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，以評(píng)估是否存在密切相關(guān)性及確定是否也可通過(guò)這種備選方法來(lái)預(yù)測(cè)HER2磷酸化。對(duì)于上文討論的基因的所有比較，得到了較好的相關(guān)性。圖14顯示了具有EGFR、HER2、HER3和betacellulin的腫瘤的無(wú)監(jiān)督蔟集(aunsupervisedclustering)。使用qRT-PCR數(shù)據(jù)，6個(gè)磷酸化陽(yáng)性腫瘤中的5個(gè)簇集到一起。圖15顯示了可通過(guò)使用這樣的算法來(lái)預(yù)測(cè)卵巢肺瘤的磷酸化狀態(tài)，其中betacellulin和HER2表達(dá)處于中值或以上和/或EGFR和/或HER3表達(dá)處于中值或以上的樣品預(yù)測(cè)是陽(yáng)性的。在6個(gè)HER2磷酸化陽(yáng)性案例中的4個(gè)中相關(guān)性是陽(yáng)性的。使用qRT-PCR表達(dá)數(shù)據(jù)作為算法的基礎(chǔ)，19個(gè)HER2磷酸化陰性案例中只有5個(gè)預(yù)測(cè)為陽(yáng)性。在圖16描述的第二項(xiàng)分析中，HER2磷酸化狀態(tài)的預(yù)測(cè)是只使用單一基因，即betacellulin實(shí)現(xiàn)的。如此圖所示，6個(gè)HER2磷酸化陽(yáng)性腫瘤中有5個(gè)具有超過(guò)中值的betacellulin表達(dá)，再次使用qRT-PCR表達(dá)數(shù)據(jù)。通過(guò)評(píng)估其它HER配體，即epireguiin、雙調(diào)蛋白和TGF-a,雙調(diào)蛋白鑒定為在與HER2磷酸化狀態(tài)的關(guān)聯(lián)方面具有與betacellulin相似的效用的第二配體。見圖17。實(shí)施例3:具有HER2磷酸化相關(guān)基因表達(dá)語(yǔ)的患者的療法上文實(shí)施例1和2論證了基因表達(dá)譜可用作HER2磷酸化的代替物。在本實(shí)施例中，用HER抑制劑Pertuzumab治療所患腫瘤具有與HER2磷酸化有關(guān)的特定基因表達(dá)譜的患者。^口Croninefa/"^w.乂尸W/zo/.164(1):35-42(2004)及Mad<a/.，CawcerCW/5:607-616(2004)中所述進(jìn)行qRT-PCR。使用來(lái)自Qiagen(Valencia,California)的商品化試劑從冷凍的卵巢腫瘤中提取RNA。用于TAQMANqRT-PCR分析的引物和探針設(shè)計(jì)成產(chǎn)生長(zhǎng)度為約100個(gè)堿基或更少的擴(kuò)增子。使用TAQMANTM設(shè)備(AppliedBioSystems)通過(guò)qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄物定量，將測(cè)試基因的表達(dá)水平對(duì)參照基因標(biāo)準(zhǔn)化。憑借通過(guò)ELISA得出的已知HER2磷酸化狀態(tài)，基于實(shí)施例1和2中腫瘤的基因表達(dá)制譜數(shù)據(jù)已經(jīng)建立了一種算法。對(duì)于betacellulin或雙調(diào)蛋白和HER2表達(dá)處于中值或以上和/或EGFR和/或HER3表達(dá)處于中值或以上的，與HER2磷酸化有關(guān)的基因表達(dá)譜，認(rèn)為腫瘤是陽(yáng)性的?；蛘撸赏ㄟ^(guò)qRT-PCR來(lái)測(cè)量betacellulin或雙調(diào)蛋白的單獨(dú)表達(dá)以鑒定具有預(yù)測(cè)HER2磷酸化的腫瘤。在接受基于鉑的化療方案時(shí)有進(jìn)展的患者或者在完成基于鉑的方案后6個(gè)月內(nèi)有進(jìn)展的患者將符合此項(xiàng)研究的條件?；颊邔㈦S機(jī)接受或是吉西他濱與Pertuzumab的組合或是吉西他濱與安慰劑的組合。在21天循環(huán)的第1和8天以1000mg/m2施用吉西他濱，最多8個(gè)循環(huán)。首先輸注吉西他濱持續(xù)30分鐘。由于毒性問(wèn)題允許降低劑量。在21天循環(huán)的第1天施用安慰劑或Pertuzumab。隨機(jī)接受Pertuzumab的受試者將施用840mg的起始加載劑量(initialloadingdose)(循環(huán)1)，隨后在循環(huán)2和后續(xù)循環(huán)中施用420mg。隨機(jī)接受安慰劑的受試者將在循環(huán)1、循環(huán)2及后續(xù)循環(huán)中以與Pertuzumab組相同的體積施用安慰劑。8個(gè)循環(huán)的吉西他濱后，Pertuzumab或安慰劑將可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)另外9個(gè)循環(huán)(總共1年)。由于血細(xì)胞減少，患者將降低標(biāo)準(zhǔn)吉西他濱劑量和維持劑量(helddoses)。針對(duì)任何第1天吉西他濱的維持劑量，Pertuzumab也將維持。后續(xù)劑量將是降低的劑量并且不再升高。如果超過(guò)4次需要降低劑量或維持劑量，或者如果維持劑量超過(guò)3周，那么將停用吉西他濱，并且經(jīng)主治醫(yī)師和醫(yī)療監(jiān)控者同意，可繼續(xù)施用盲試藥物直至病情進(jìn)展(diseaseprogression)。如果第8天吉西他濱劑量是維持的，那么該第8天的劑量可省略，后續(xù)處理將從下一個(gè)循環(huán)開始(前一循環(huán)的第22天)。如下表所推薦的，維持和降低吉西他濱的劑量:<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>需要降低劑量的任何患者的后續(xù)劑量將是降低的劑量。如果由于血細(xì)胞減少，維持劑量超過(guò)3周，將假設(shè)患者具有無(wú)法接受的毒性并將停用吉西他濱。如果沒(méi)有其它另外的m級(jí)或iv級(jí)毒性，根據(jù)醫(yī)師和醫(yī)療監(jiān)控者的判斷將繼續(xù)施用盲試藥物。吉西他濱的血液學(xué)毒性與施藥速率有關(guān)。不管總劑量如何，吉西他濱的給藥都應(yīng)持續(xù)30分鐘。根據(jù)主治醫(yī)師的判斷可對(duì)NCI-CTC2級(jí)血細(xì)胞減少使用集落刺激劑。還將4是供與單一藥劑pertuzumab交換(crossover)的選項(xiàng)。還將在下一個(gè)循環(huán)時(shí)施用840mg的加載劑量，每21天的后續(xù)循環(huán)以420mg繼續(xù)。在第3、5、7、9、13和17個(gè)循環(huán)時(shí)評(píng)估響應(yīng)。通過(guò)臨床評(píng)估和CT掃描或等效手段，用實(shí)體瘤響應(yīng)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)(ResponseEvaluationCriteriaforSolidTumors,RECIST)來(lái)評(píng)估可測(cè)量的疾病。根據(jù)CA-125變化及疾病的臨床和放射學(xué)證據(jù)，評(píng)估患可評(píng)估疾病的受試者的響應(yīng)。應(yīng)當(dāng)在最初記錄響應(yīng)后4-8周確認(rèn)響應(yīng)。將評(píng)估下列結(jié)果測(cè)量值。主要功效終點(diǎn)(PrimaryEfficacyEnd。oint)無(wú)進(jìn)展存活，根據(jù)調(diào)查人員使用RECIST或CA-125變化進(jìn)行的評(píng)估確定，在各組所有受試者中開始指定的研究治療后進(jìn)行。次要功歲文終點(diǎn)(SecondaryEfficacyEndpoints)客，見響應(yīng)(部分響應(yīng)PR或完全響應(yīng)CR)響應(yīng)持續(xù)時(shí)間存活時(shí)間4個(gè)月沒(méi)有進(jìn)展癥狀改善的時(shí)間，通過(guò)FOSI評(píng)估為了預(yù)防或治療可能的惡心和嘔吐，可對(duì)患者前驅(qū)用藥血清素拮抗劑、類固醇和/或苯并二氮卓。為了預(yù)防或治療可能的皮滲，可使用標(biāo)準(zhǔn)痤瘡療法，包括局部和/或口服抗生素。其它可能的伴隨藥療有任何處方藥物或非處方藥制劑，由受試者在間隔中使用，在第1天之前7天開始并持續(xù)至隨訪期的最后一天。發(fā)生輸注相關(guān)的溫度升高至〉38.5。C或其它輸注相關(guān)癥狀的受試者可用醋氛酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或麥口定(meperidine)進(jìn)行對(duì)癥處理?？蓪?duì)NCI-CTC2級(jí)血細(xì)胞減少施用非實(shí)驗(yàn)性造血生長(zhǎng)因子。根據(jù)任何一項(xiàng)或多項(xiàng)主要或次要功效終點(diǎn)的評(píng)估，如上所述治療的患者顯示出卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌或輸卵管癌的征候或癥狀的改善。與不具有這種表達(dá)譜的患者相比，具有與HER2磷酸化有關(guān)的基因表達(dá)譜的患者顯示出來(lái)自Pertuzumab治療的更大臨床效益。權(quán)利要求1.用于治療癌癥的方法，包括對(duì)患者施用有效治療癌癥量的HER抑制劑，其中來(lái)自患者的腫瘤樣品表達(dá)兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體。2.權(quán)利要求1的方法，其中HER受體選自EGFR、HER2和HER3。3.權(quán)利要求2的方法，其中HER受體是EGFR和HER2。4.權(quán)利要求2的方法，其中HER受體是HER2和HER3。5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中HER配體選自betacellulin、雙調(diào)蛋白、epiregulin和TGF-a。6.權(quán)利要求5的方法，其中HER配體是betacellulin。7.權(quán)利要求5的方法，其中HER配體是雙調(diào)蛋白。8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中腫瘤樣品表達(dá)HER2和EGFR或HER3，以及betacellulin或雙調(diào)蛋白。9.權(quán)利要求8的方法，其中腫瘤樣品表達(dá)HER2和EGFR，以及betacellulin。10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中HER抑制劑是HER二聚化抑制劑。11.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中HER抑制劑是HER抗體。12.權(quán)利要求11的方法，其中HER抗體是HER2抗體。13.權(quán)利要求12的方法，其中HER2抗體結(jié)合HER2胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域n。14.權(quán)利要求13的方法，其中HER2抗體是Pertuzumab。15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的方法，其中HER抗體是棵抗體。16.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法，其中HER抗體是完整抗體。17.權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的方法，其中HER2抗體是包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。18.權(quán)利要求l的方法，其中表達(dá)是通過(guò)定量編碼HER受體或配體的mRNA來(lái)測(cè)定的。19.權(quán)利要求18的方法，其中mRNA是使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)定量的。20.權(quán)利要求19的方法，其中PCR是定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)。21.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中腫瘤樣品是固定后的腫瘤樣品。22.權(quán)利要求21的方法，其中腫瘤樣品是福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的腫瘤樣品。23.權(quán)利要求l-20任一項(xiàng)的方法，其中腫瘤樣品是冷凍的腫瘤樣品。24.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中HER受體和HER配體的表達(dá)處于中值或以上。25.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中癌癥是卵巢癌、腹膜癌或輸卵管癌。26.權(quán)利要求l-24任一項(xiàng)的方法，其中癌癥是轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)。27.權(quán)利要求l-24任一項(xiàng)的方法，其中癌癥是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。28.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，還包括對(duì)患者施用化療劑。29.權(quán)利要求28的方法，其中化療劑是抗代謝物化療劑。30.權(quán)利要求29的方法，其中抗代謝物化療劑是吉西他濱。31.用于治療癌癥的方法，包括對(duì)患者施用有效治療癌癥量的HER抑制劑，其中來(lái)自患者的腫瘤樣品表達(dá)betacellulin或雙調(diào)蛋白。32.權(quán)利要求31的方法，其中HER抑制劑抑制HER2與EGFR或HER3異二聚化。33.用于治療癌癥的方法，包括對(duì)患者施用有效治療癌癥量的結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域II的HER2抗體，其中來(lái)自患者的腫瘤樣品表達(dá)HER2和EGFR或HER3,以及betacellulin或雙調(diào)蛋白。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述HER2抗體結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域I、II和III之間的連接處。35.評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法，包括測(cè)定樣品中兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體的表達(dá)，其中兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體表達(dá)指示樣品中有HER磷酸化或活化。36.權(quán)利要求35的方法，其中樣品是石蠟包埋、福爾馬林固定的腫瘤樣品。37.評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法，包括測(cè)定樣品中betacellulin或雙調(diào)蛋白的表達(dá)，其中betacellulin或雙調(diào)蛋白表達(dá)指示樣品中有HER磷酸化或活化。38.鑒定HER二聚化抑制劑療法的患者的方法，包括測(cè)定來(lái)自患者的樣品中兩種或多種HER受體和一種或多種HER配體的表達(dá)，其中HER受體和HER配體表達(dá)指示患者有可能響應(yīng)HER二聚化抑制劑療法。39.權(quán)利要求38的方法，其中患者是癌癥患者。40.用于治療卵巢癌的方法，包括對(duì)患者施用有效治療卵巢癌量的HER抑制劑，其中來(lái)自患者的腫瘤樣品表達(dá)betacellulin或雙調(diào)蛋白。41.權(quán)利要求40的方法，其中腫瘤樣品還表達(dá)兩種或多種HER受體。全文摘要描述了基于基因表達(dá)分析來(lái)選擇HER抑制劑療法的患者的方法，所述HER抑制劑諸如Pertuzumab。還描述了通過(guò)基因表達(dá)分析來(lái)評(píng)估生物學(xué)樣品中的HER磷酸化或活化的方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101115849SQ200580047862公開日2008年1月30日申請(qǐng)日期2005年12月6日優(yōu)先權(quán)日2004年12月7日發(fā)明者盧卡斯·C·阿姆勒,托馬斯·E·賈紐埃里奧申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司