專利名稱：用于基于酶的傳感器應用的擴散和酶層的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及用于基于酶的傳感器應用的組合的擴散和酶層，以及包含其的傳感器。
基于酶的傳感器廣泛用于以定性和定量的方式測定血液和其他體液中的目的物質。基于酶的傳感器尤其用于測定酶底物。在基于酶的傳感器中，發(fā)生所稱作的化學轉換器反應，其中待測定的物質在至少一種酶的參與下轉變成另一種物質。許多基于酶的傳感器需要共底物的參與。直接或者間接檢測共底物的消耗或者其他物質的產(chǎn)生。
基于酶的傳感器通常包含幾層，其中有酶層和擴散層(蓋膜，外層)。該擴散層直接與樣品接觸并限制傳感反應必需的物質、特別是酶底物或共底物的擴散。
基于酶的傳感器可以作為電化學傳感器或者作為光學傳感器(光極)提供。例如在美國專利號6,107,083中描述了葡萄糖光極的構造和功能。
具體地，用于測定葡萄糖、乳酸或者肌酸酐的基于酶的傳感器優(yōu)選用氧化還原酶構造并且檢測是基于氧消耗的。在該情況中，傳感器必需多孔的蓋膜或者至少可滲透的聚合物膜，其控制酶底物和氧的滲透。
使用酶的葡萄糖傳感器是用于檢測糖類的最熟知的實際措施。該技術包括將樣品與傳感器接觸，使葡萄糖擴散到傳感器中，酶層內的酶(葡糖氧化酶)分解葡萄糖，并通過合適的工具如化學發(fā)光染料測量消耗的氧的量，或者通過合適的工具如電流分析電極測量產(chǎn)生的過氧化氫的量。
因此，基于酶的傳感器可以作為電化學傳感器(電極)或者作為光學傳感器(光極)提供。葡萄糖光極的構造和功能例如在美國專利號6,107,083(Collins等人)中描述。葡萄糖電極的構造和功能例如在美國專利號6,214,185(Offenbacher等人)中描述。
具體地，用于測定葡萄糖、乳酸或者肌酸酐的基于酶的光極優(yōu)選用氧化還原酶構造并且檢測主要基于氧消耗。基于發(fā)光的光極的基本設計概念按順序包括 a)光可透射的支持體， b)氧傳感層，其在光可透射的、氧可滲透的基質中含有發(fā)光染料， c)酶層，其含有固定在親水的水和氧可滲透的基質中的氧化還原酶或者酶級聯(lián)， d)擴散層，其限制酶底物和/或共底物擴散到酶層中，和任選地 e)光學隔離層，其不透光。
備選地，可以從不透光材料構造酶層或者擴散層以發(fā)揮光隔離層的功能。
在樣品測量前，將傳感器用水或者合適的鹽溶液和一定水平的O2(即，150mmHg)平衡。為了測量，將傳感器與樣品接觸。葡萄糖從樣品擴散到酶層中。酶層內的葡萄糖和氧消耗導致相鄰染料層中氧的耗盡。在發(fā)光染料的情況中，染料層內O2-耗盡的速率轉化成對應的增強的發(fā)光強度(即，表達為ΔI/Δt)。后者的值，即樣品接觸后某個時間間隔內測定的發(fā)光強度的值通過合適的相關函數(shù)與葡萄糖濃度關聯(lián)。在所有O2都在染料層中被消耗的情況中，ΔI/Δt將變?yōu)?，因為發(fā)光強度將不進一步增加。為了解釋染料加載的變動(即，傳感器到傳感器)或者光源的強度的變動(儀器到儀器)，優(yōu)選將強度改變表達為ΔI/(IΔt)，其中I是在已知的pO2下的強度(即，樣品接觸前測量的強度)。我們將后者的量稱作斜率，其中在樣品測量后給定的時間窗口中測定斜率。實際上，已知許多測定斜率的方法。除了發(fā)光強度外，也可以使用發(fā)光衰減時間(即，Δτ/Δt)，其通過本領域中已知的脈沖或者相方法測定。
形成酶層的聚合物的選擇取決于它的a)在水或者水性樣品中的不溶性，b)在不破壞酶的活性的溶劑中的溶解性和c)它對相鄰染料層的聚合物的粘附性質。許多非交聯(lián)的親水聚合物是潛在的候選材料。某些低水吸收聚醚-聚氨基甲酸酯(濕潤狀態(tài)水含量2.5％)在低級醇(如乙醇)或者醇水混合物中可溶，是對從某些硅氧烷生產(chǎn)的染料層提供良好粘附的優(yōu)選材料。
使用非常親水的聚合物(水含量50％或者更高)的一個缺點是高水溶性底物如葡萄糖和乳酸太快地滲透到酶層，從而使得轉換反應運行太快，從而導致染料層中O2耗盡太快(幾秒或者更短)。除了許多其他缺點外，快速率的測定變得不切實際。擴散層控制酶底物的滲透。
根據(jù)本領域中一種已知的方法，由聚合物如聚碳酸酯、聚丙烯和聚酯預先形成的由非水合的微孔結構組成的蓋膜用于控制酶底物的滲透。此類膜的孔隙率由物理手段，例如，通過中子或者氬徑跡蝕刻提供。葡萄糖主要通過裝滿液體的這些孔滲透這些膜。在與樣品接觸前，將共底物O2裝滿入傳感器層。共底物(即O2)滲透過孔和聚合物二者。滲透過聚合物的程度取決于它對O2的滲透性。
一個主要的缺點是預形成的薄膜必須附著到酶層。膜通常機械附著到酶層。機械附著是昂貴和在技術上復雜的。在難以在不產(chǎn)生氣泡的情況下將膜應用到下面的層上的情況下，發(fā)生了其他問題。當膜例如粘到下面的層上時，也發(fā)生類似的問題。
本領域中已知的另一種方法是通過對酶層應用聚合物溶液并通過蒸發(fā)溶劑形成擴散層。Offenbacher等人(美國專利號6,214,185)描述了由PVC共聚物制備的蓋膜，其由于存在親水共聚單體組分而允許相當滿意地調節(jié)滲透性。在暴露于水或者水性樣品后，親水區(qū)提供了膨脹的結構，其作為水溶性酶底物的滲透途徑。EP 0690134描述了一種電化學傳感器，其使用樹脂層中的攜帶酶的鍍鉑的碳顆粒。重要的是，酶層由單獨的擴散膜覆蓋，其優(yōu)選用陰離子穩(wěn)定化的、基于水的羥基端基封閉的包含膠態(tài)二氧化硅的聚二甲基硅氧烷彈性體旋轉涂布。
發(fā)明概述 與上面的背景相反，本發(fā)明提供了相對于現(xiàn)有技術的某些非顯而易見的優(yōu)點和進展。具體地，發(fā)明人已經(jīng)認識到需要對于基于酶的傳感器應用改進擴散層或者膜設計。
盡管本發(fā)明不限于特定優(yōu)點或者功能性，但是注意到本發(fā)明提供了具有快速的氧恢復時間的傳感器，其還用于在短的時幀內進行多次測量。此外，提供了具有短洗滌時間以除去酶促反應產(chǎn)物以及酶層的快速水合(“濕潤”)的傳感器。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了組合的擴散和酶層，其包含至少一種聚合物材料，和攜帶酶的顆粒。所述顆粒分散在至少一種聚合物材料中。顆?？梢允怯H水的。
本發(fā)明基于將擴散層和酶層組合成一個單層的想法。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，擴散和酶層可以還包含用于光學隔離的顆粒，例如，分散在至少一種聚合物材料中的顆粒。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，提供了基于酶的傳感器，其包含根據(jù)本發(fā)明的擴散和酶層，其可以是傳感器的覆蓋層。
根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方案，提供了包含至少一個染料層的基于酶的傳感器。
根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方案，傳感器是電化學傳感器或者光學傳感器。
本發(fā)明的另一方面是基于酶的傳感器用于檢測和/或定性和/或定量測定酶底物、尤其葡萄糖，和/或共底物的用途。本發(fā)明的基于酶的傳感器可以用于血液中，其中通常進行多次測量。
根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方案，提供了制備用于基于酶的傳感器的組合的擴散和酶層的方法，其包括(i)形成包含至少一種聚合物材料和攜帶酶的顆粒的分散體；(ii)將分散體直接應用于下面的層上以形成攜帶酶的擴散層；和(iii)干燥分散體。
從下面本發(fā)明的詳細描述和所附的權利要求書，可以更完整地理解本發(fā)明的這些和其他特征和優(yōu)點。注意到權利要求的范圍通過其中的敘述而不是通過本說明書中給出的特征和優(yōu)點的特定討論限定。
附圖簡述 當與下面的附圖一起閱讀時可以最好地理解下面的本發(fā)明的實施方案的詳細描述，附圖中同樣的結構用同樣的參考數(shù)字指出，其中

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案顯示的光學測量系統(tǒng)的示意圖示； 圖2顯示了技術現(xiàn)狀葡萄糖傳感器的氧恢復時間； 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的葡萄糖傳感器的發(fā)光強度對比氧恢復時間(秒)； 圖4顯示了根據(jù)圖3的傳感器的動力學發(fā)光強度反應曲線； 圖5是從測量的發(fā)光強度計算的全血中計算葡萄糖濃度的比較；和 圖6是使用全血和分別含有30、70、150、300和400mg/dl葡萄糖的重量分析葡萄糖標準，從根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案(組合的擴散和酶層混合物B、C、D、E)的傳感器確定的計算斜率的比較。
技術人員理解圖中的元件僅為了簡單和清楚而闡明并且不一定按比例繪制。例如，圖中的一些元件的尺寸可以相對于其他元件放大以幫助理解本發(fā)明的實施方案。
本發(fā)明的一般實施方案的詳細描述 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了組合的擴散和酶層，其包含攜帶酶的顆粒和任選地分散在至少一種聚合物材料中的顆粒。顆?？梢允怯H水的。通過作為水溶性酶底物的可調節(jié)的滲透途徑的至少一種聚合物的膨脹結構和攜帶酶的顆粒的膨脹結構可以提供共底物層的滲透性。
用于本發(fā)明的層的聚合物材料可以一般是任一種聚合物材料或者聚合物材料的混合物，其具有可調節(jié)的膨脹結構，可溶于不破壞酶、無毒性、通常容易揮發(fā)和容易應用的溶劑或者溶劑混合物中。通常，聚合物包含親水的以及疏水的聚合物鏈序列。尤其適于本應用的聚合物的水吸收能力等于或者小于40％w/w，更一般地等于或者小于20％w/w。
根據(jù)本發(fā)明，還可能向低水吸收聚合物加入高水吸收聚合物，如聚氨基甲酸酯D4型聚合物(Tyndale Plains-Hunter Ltd.)(濕潤狀態(tài)水含量50％)。此類加入允許調節(jié)聚合物混合物的水含量。優(yōu)點是可調節(jié)的斜率(比較圖6)。酶可以摻入到此類層中，例如，固定到親水顆粒，該親水顆粒分散在形成酶層的聚合物中。
一般的聚合物材料可以選自非交聯(lián)的非水溶性聚合物，其特征是水吸收＜40％，通常為＜20％(按重量計)的相對小的水吸收。還可能的是聚合物是至少兩種可混溶的非交聯(lián)的和非水溶性聚合物的混合物，該至少兩種可混溶的非交聯(lián)的和非水溶性聚合物的一種具有小于40％w/w(優(yōu)選小于10％w/w)的水吸收能力，且該至少兩種可混溶的非交聯(lián)的和非水溶性聚合物的一種具有大于20％w/w(優(yōu)選大于40％w/w)的水吸收能力，從而聚合物層作為整體具有依賴于兩種聚合物的混合比率的水吸收能力。
由于關于聚合物材料的各種選擇可能性，所以可以容易地提供本發(fā)明的層，其可以通過溶液直接應用。該層可以例如涂布在下面的層上，通常在氧光極的氧敏感層上。本發(fā)明的層的優(yōu)點是可以容易地提供組合的擴散和酶層，其不溶于待測量的樣品(即，體液，如血清、血漿和血液)中。
根據(jù)本發(fā)明的組合的擴散和酶層包含分散在形成聚合物材料的層中的親水的攜帶酶的顆粒。顆粒和聚合物兩者都提供了對共底物的滲透性并從而提供了傳感器的快速氧恢復。
酶層對酶底物具有確定的滲透性，其由底物可滲透的顆粒的密度提供，所述密度由根據(jù)本發(fā)明的顆粒大小和量形成。根據(jù)該層的應用，可以改變顆粒的大小和量。
為了用作膜中的顆粒，基本上所有穩(wěn)定親水顆粒和此類顆粒的混合物都是有用的，其具有固有的和確定的水吸收和酶加載。根據(jù)所希望的應用和/或水吸收和酶加載，可以選擇合適的顆粒。
合適的顆粒的實例包括凝膠顆粒。一般的顆?；诰郾０?、聚丙烯酰胺和N-丙烯酰琥珀酰亞胺(N-acryloxysuccinimide)共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯和瓊脂糖珠。設想可以使用基本上所有具有表面結合的酶的穩(wěn)定的非親水顆粒和此類顆粒的混合物。此類顆粒的實例包括玻璃、石英、纖維素、聚苯乙烯、尼龍和其他聚酰胺。
根據(jù)本發(fā)明的酶層還可以包含用于光學隔離和光學傳感器的改進的緩和性質的其他成分，如炭黑和二氧化鈦。
可以關于所希望的用途靈活地選擇本發(fā)明酶層的厚度。厚度取決于攜帶酶的顆粒的大小。合適的的厚度為約1到約100μm，通常約1到約50μm，更通常約1到約20μm。
在根據(jù)本發(fā)明的酶層的一個實施方案中，顆粒的大小至少對應于層的厚度。在另一實施方案中，以這樣的方式選擇顆粒的大小，從而使得單個顆?；蛘邌蝹€顆粒聚簇的大小小于層的厚度。
本發(fā)明的基于酶的傳感器可以還包含至少一個下面的染料層或者基電極。取決于傳感器的類型，其他層可以是例如干擾阻斷層、光學隔離層、導電層或者基電極。
因為可以根據(jù)需要調節(jié)組合的擴散和酶層的滲透性，所以酶層提供了傳感器的快速再生。在基于例如氧的消耗的傳感器反應的情況中，可以以使傳感器再生，例如，氧儲庫的再生非?？斓姆绞秸{節(jié)氧滲透。從而，本發(fā)明的傳感器還可以用于多次測量。
基于酶的傳感器的組合的擴散和酶層可以例如包含氧化酶，如葡糖氧化酶、膽固醇氧化酶或者乳酸氧化酶。組合的擴散和酶層還可以包含酶混合物，如酶級聯(lián)，其使得可能檢測不能直接檢測(通過一次酶反應)的分析物，如肌酸。肌酸不能被簡單的酶酶促氧化，而是需要幾個酶促步驟來產(chǎn)生分析物衍生物，其可以通過光學或者電流分析手段檢測。用于檢測和/或測定肌酸酐的合適的酶級聯(lián)系統(tǒng)包括例如，肌酸酐酰胺水化酶(amidohydrase)、肌酸酐酰胺水解酶和肌氨酸氧化酶。
在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的傳感器中，酶層通常作為覆蓋層沉積。在該情況中，分散體的溶劑蒸發(fā)后，形成穩(wěn)定覆蓋層。酶層還通常直接涂布在下面的層上，通常是染料層或者電極。通過直接涂布酶層，通常，酶層通過物理粘附附著到下面的層而不使用機械固定和/或使用膠層。
本發(fā)明的基于酶的傳感器可以代表任一種類的生物傳感器。合適的生物傳感器的實例為例如，光學傳感器。使用一般的光學傳感器，由于酶促反應引起的氧消耗可以用合適的染料檢測，所述染料對氧敏感，例如，通過氧可猝滅的發(fā)光染料。
用于本發(fā)明的傳感器中的合適的染料選自與2，2’-聯(lián)吡啶、1，10-菲咯啉、4，7-二苯基-1，10-菲咯啉、4，7-二甲基-1，10-菲咯啉、4，7-二磺酸酯化-二苯基-1，10-菲咯啉、5-溴-1，10-菲咯啉、5-氯-1，10-菲咯啉、2，2’-二-2-噻唑啉、2，2’-二噻唑絡合的釕(II)、鋨(II)、銥(III)、銠(III)和鉻(III)離子，與卟啉、氯和酞菁絡合的VO2+、Cu2+、Zn2+、Pt2+和Pd2+，和其混合物。在一般實施方案中，發(fā)光染料是[Ru(二苯基菲咯啉)3]、八乙基-Pt-卟啉、八乙基-Pt-卟啉酮、或者四苯并-Pt-卟啉。
此外，電化學傳感器適于用于本發(fā)明中。
本發(fā)明的另一方面是如上述基于酶的傳感器用于檢測或者定量測定物質、通常酶底物的用途。
在醫(yī)學領域，可能的用途是例如測定生理學參數(shù)?？梢栽谌我庖后w，如各種體液如血液、血清、血漿、尿等等中進行測定和/或檢測。傳感器的一般的用途是檢測和/或測定血液中的分析物。
根據(jù)本發(fā)明的傳感器的可能的用途是例如測定糖尿病患者中的血糖。可以用根據(jù)本發(fā)明的基于酶的傳感器測定的其他代謝產(chǎn)物是例如膽固醇或者尿素。
本發(fā)明的基于酶的傳感器的另一可能的用途是在環(huán)境分析學、生物技術中的過程控制和食品控制領域。
使用根據(jù)本發(fā)明的基于酶的傳感器，可以測定和/或檢測許多種物質，例如，酶底物和/或共底物。合適的酶底物是例如膽固醇、蔗糖、谷氨酸、乙醇、抗壞血酸、果糖、丙酮酸、葡萄糖、乳酸或者肌酸酐。通常，進行葡萄糖、乳酸或者肌酸酐的測定和/或檢測。待檢測和/或測定的更一般的物質是葡萄糖。
因為基于酶的傳感器的再生可以受到調節(jié)滲透的影響，所以再生足夠快以允許多次測量。在傳感器的一般的用途中，進行多次測量。此外，基于酶的傳感器可以用于本領域中已知的每種傳感器應用，如單次使用應用、多次使用應用。
根據(jù)本發(fā)明的再一個實施方案，提供了制備如上述的用于基于酶的傳感器的組合的擴散和酶層的方法。該方法包括 (i)形成分散體，其包含 (a)至少一種聚合物材料，和 (b)通常為親水性質的攜帶酶的顆粒， (ii)直接在下面的層上應用所述分散體以形成攜帶酶的擴散層；和 (iii)干燥所述分散體。
由于聚合物材料的多種選擇，根據(jù)本發(fā)明的方法允許層的直接澆鑄。此外，可以以不必需分散體的加熱的方式選擇材料。從而，通過根據(jù)本發(fā)明的方法，提供了容易的處理。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，分散體通常通過物理粘附附著到下面的層。同樣，干燥分散體可以包括從分散體除去溶劑。
為了更容易地理解本發(fā)明，參考下面的實施例，它們意在闡明本發(fā)明，但是不限定其范圍。
實施例 實施例1氧染料顆粒的制備 根據(jù)O.S.Wolfbeis，M.J.P.Leiner和H.E.Posch，“A newsensing material for optical oxygen measurement with the indicatorembedded in an aqueous phase”，Microchim.Acta，III(1986)359中公開的方法將染料氯化三(1，10-菲咯啉)釕(II)吸附到硅膠顆粒上。
實施例2氧層混合物的制備 向壓敏粘合劑加入甲苯并混合直到均勻。將該溶液加入O2指示劑染料并混合16小時。
實施例3制備攜帶酶的親水顆粒 表1葡糖氧化酶固定化 將高碘酸鈉加入5ml 100mM磷酸鹽緩沖液中并攪拌10分鐘。向該溶液中加入葡糖氧化酶，將該溶液在室溫下攪拌30分鐘。移取該溶液并加入預裝的(pre-filled)聚丙烯酰胺脫鹽柱。在合適的容器中收集脫鹽的葡糖氧化酶。將柱用10ml 100mM磷酸鹽緩沖液洗滌以洗除剩余的葡糖氧化酶。然后將葡糖氧化酶加入5g CarboLink偶聯(lián)凝膠并在溫和混合下在室溫溫育24小時。然后向10ml 100mM磷酸鹽緩沖液加入葡糖氧化酶-瓊脂糖珠。離心溶液并倒出上層。
實施例4組合的擴散和酶層混合物A 向聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。向該溶液中加入炭黑并混合24小時。向該溶液中加入葡糖氧化酶-瓊脂糖珠并混合直到均勻。
實施例5組合的擴散和酶層混合物B 向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接著向該溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向該溶液中加入炭黑并混合24小時。向該溶液中加入葡糖氧化酶-瓊脂糖珠并混合直到均勻。
實施例6組合的擴散和酶層混合物C 向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接著向該溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向該溶液中加入炭黑并混合24小時。向該溶液中加入葡糖氧化酶-瓊脂糖珠并混合直到均勻。
實施例7組合的擴散和酶層混合物D 向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接著向該溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向該溶液中加入炭黑并混合24小時。向該溶液中加入葡糖氧化酶-瓊脂糖珠并混合直到均勻。
實施例8組合的擴散和酶層混合物E 表2 向138-03型聚氨基甲酸酯加入乙醇并混合直到溶解。接著向該溶液中加入聚氨基甲酸酯D4型并混合直到溶解。向該溶液中加入炭黑并混合24小時。向該溶液中加入葡糖氧化酶-瓊脂糖珠并混合直到均勻。
實施例9氧敏感層的構建 將含有氧敏感的熒光染料(實施例2)的硅氧烷粘合劑刮涂(刀高設置120um)在126um Melinex 505聚酯基質頂上。將氧敏感層干燥到33um的厚度。
實施例10組合的擴散和酶層的構建 為了構建組合的擴散和酶層，將混合物A、B、C、D和E分別刮涂(刀高設置120μm)在干燥的氧敏感層(實施例9)上面。1小時后，組合的擴散和酶層具有38μm的厚度。
實施例11 制備、切割和測量傳感器盤的一般方法由Trettnak等人在Analyst，113(1988)1519-1523(“Optical sensors”)；Moreno-Bondi等人在Anal.Chem.，62(1990)2377-2380(“Oxygen optode for use ina fiber-optic glucose biosensor”)；M.J.P.Leiner和P.Hartmann在Sensors and Actuators B，11(1993)281-289(“Theory and practice inoptical pH sensing”)中描述。
從各薄片(實施例10)沖壓出本發(fā)明的傳感器盤并用于加熱到37℃的氣密的流通室，其包含透明壁、通道和用于導入氣體和溶液的進口和出口(未圖解)。
用附圖1-6可以看出實驗結果。
圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的一般實施方案的光學測量系統(tǒng)的圖解。R表示作為光源的藍色LED，S是作為檢測器的光電二極管，A和B是濾光器，分別用于檢測激發(fā)和發(fā)射波長，鏡片排列用于將激發(fā)光傳導到染料層L和將發(fā)射光傳導到光測器S以及用于電信號加工的裝置(未圖解)。在激發(fā)端，使用干涉濾光器A(480nm的峰值傳導)，并在發(fā)射端使用520nm截止濾光器B。E表示酶層，其包含攜帶酶的顆粒P和D(炭黑)。L表示染料層，O是氧敏感染料，且T是光可透射的支持體。
圖2顯示了技術現(xiàn)狀葡萄糖傳感器的氧恢復時間。將含水樣品導入含有技術現(xiàn)狀光學葡萄糖傳感器的測量室中，該測量室使用附著到酶層頂部上的RoTrac-毛細管孔膜控制葡萄糖和氧向傳感器的擴散。酶層由含有親水葡萄糖珠的親水聚合物與固定化的酶(葡糖氧化酶)組成。測量前，酶層用水活化(水合)并用含有100mmHg O2分壓的氣體平衡(未顯示)。將含有200mg/dl葡萄糖的樣品導入小室中并測量熒光60秒。酶層中的葡糖氧化酶將樣品的葡萄糖轉化為葡糖酸內酯，從而消耗作為共底物的氧。O2的消耗導致耗盡相鄰染料層中的氧。染料層中存在的O2敏感發(fā)光染料以增強的發(fā)光強度響應。然后用pH7.4的緩沖液洗滌葡萄糖傳感器2分鐘以除去未消耗的葡萄糖。然后將含有90mmHg氧的氣體泵過小室并且發(fā)光強度恢復到最初強度水平(對應于100mmHg O2)。圖2顯示了相對于時間(秒)的測量的發(fā)光強度。氧恢復時間大于4分鐘。
圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖傳感器的發(fā)光強度對比氧恢復時間(秒)。根據(jù)實施例9和10，使用組合的擴散和酶層混合物A制備傳感器?；€1表示根據(jù)最初O2含量的發(fā)光。
然后將含有200mg/dL葡萄糖的樣品導入本發(fā)明的葡萄糖傳感器中。測量發(fā)光強度60秒并根據(jù)線2增加；傳感器中的酶(葡糖氧化酶)將樣品中所含的葡萄糖轉變?yōu)槠咸撬醿弱?，消耗氧，并從而耗盡傳感器中的氧儲庫，從而導致發(fā)光強度增加。
然后，將葡萄糖傳感器用pH7.4的緩沖液洗滌2分鐘以除去未消耗的葡萄糖。向傳感器泵過100托氧并進行監(jiān)控直到氧熒光強度恢復到與最初相同的熒光強度(線1’)。重復該程序兩次以觀察氧恢復一致性(線2’；1”和2”)。本發(fā)明葡萄糖傳感器顯示出小于120秒的洗滌時間的氧恢復時間。
圖4顯示了使用根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖傳感器，對于30到400mg/dL葡萄糖的含水樣品，根據(jù)圖3的傳感器的動力學發(fā)光強度反應曲線。
圖5是從用與圖3和4中相同類型的傳感器得到的測量的發(fā)光強度計算的全血中計算葡萄糖濃度與使用Yellow Springs電化學葡萄糖儀器通過電化學參比方法得到的葡萄糖濃度的比較。該圖顯示了參比儀器和根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖傳感器之間的良好一致(R2＝0.9949)。
圖6是使用分別含有30、70、150、300和400mg/dl葡萄糖的全血重量分析葡萄糖標準，從根據(jù)本發(fā)明的傳感器(組合的擴散和酶層混合物B(干燥狀態(tài)中3.9％w/wD4)、C(干燥狀態(tài)中4.2％w/wD4)、D(干燥狀態(tài)中4.6％w/wD4)、E(干燥狀態(tài)中5.0％w/wD4))確定的計算斜率的比較。表1顯示了聚合物混合物A到E的水含量和水吸收值。最后一行顯示了高親水聚氨基甲酸酯D4型(＞50水吸收)的各自的值。
表10 考慮到表1，如從圖6可以看出的，聚合物混合物中高水吸收聚合物(D4)的比例越高(即，形成聚合物的組合的擴散和酶層的水吸收能力越高，且從而該層的水含量越高)，在其他方面基本相同的條件(聚合物和顆粒的總量)下斜率越高。水吸收能力的進一步增加將產(chǎn)生甚至更高的斜率。關于給定的選擇的時間窗口(樣品接觸后7-13秒)，對于允許的最大斜率存在限制。
為了確定斜率，在傳感器與樣品接觸前，測量用90mmHg平衡的傳感器的發(fā)光強度Ical。然后，導入樣品并記錄在樣品接觸后在t1＝7、t2＝9、t3＝11、t4＝13秒時的四種強度I1、I2、I3、I4。為了解釋染料加載(傳感器與傳感器之間)的變化，將4種強度每種除以Ical以得到強度I1c、I2c、I3c、I4c。使用數(shù)據(jù)對(t1I1；t2I2；t3I3；t4I4)，根據(jù)等式y(tǒng)＝a+bx進行線性回歸，其中b表示斜率。
注意到術語像“優(yōu)選地”、“通?！焙汀耙话愕亍辈辉诒疚闹杏糜谙拗扑蟊Ｗo的本發(fā)明的范圍或者暗示某些特征對于所要求保護的本發(fā)明的結構或功能是關鍵的、必須的、或甚至重要的。相反，這些術語僅僅意在強調可以用于或不用于本發(fā)明的具體實施方案的備選或者額外的特征。
對于描述和定義本發(fā)明的目的，注意到術語“基本上”在本文中用于代表內在的不確定性程度，其可以歸因于任何定量比較、值、測量或者其他代表。術語“基本上”也在本文中用于代表定量代表可以從所述的參比改變的程度，而不導致所討論的主題的基本功能的改變。
已經(jīng)詳細地并參考本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，將明白可以在不背離所附權利要求限定的本發(fā)明的范圍的情況下做出修飾或者改變。更具體地，盡管本發(fā)明的的一些方面在本文中鑒定為優(yōu)選的或者尤其有利的，但是預期本發(fā)明不一定受到本發(fā)明的這些優(yōu)選方面的限制。
權利要求
1.組合的擴散和酶層，其包含
至少一種聚合物材料，和
攜帶酶的顆粒，其中所述顆粒分散在所述至少一種聚合物材料中。
2.權利要求1的擴散和酶層，其中所述顆粒是親水的。
3.權利要求1的擴散和酶層，其還包含用于光學隔離的顆粒，其中所述用于光學隔離的顆粒分散在所述至少一種聚合物材料中。
4.權利要求1的擴散和酶層，其中所述擴散和酶層具有約1到約100μm的厚度。
5.權利要求1的擴散和酶層，其中所述擴散和酶層具有約1到約50μm的厚度。
6.權利要求1的擴散和酶層，其中所述擴散和酶層具有約1到約20μm的厚度。
7.權利要求1的擴散和酶層，其中所述聚合物包含親水的以及疏水的聚合物鏈序列。
8.權利要求1的擴散和酶層，其中所述聚合物是非交聯(lián)的和非水溶性聚合物。
9.權利要求1的擴散和酶層，其中所述聚合物是低水吸收聚合物，優(yōu)選低水吸收聚醚-聚氨基甲酸酯共聚物。
10.權利要求9的擴散和酶層，其還包含高水吸收聚合物，優(yōu)選高水吸收聚醚-聚氨基甲酸酯共聚物。
11.基于酶的傳感器，其包含根據(jù)權利要求1的擴散和酶層。
12.權利要求11的基于酶的傳感器，其包含至少一個染料層。
13.權利要求11的基于酶的傳感器，其中所述根據(jù)權利要求1的擴散和酶層是覆蓋層。
14.權利要求11的基于酶的傳感器，其中所述傳感器是電化學傳感器或者光學傳感器。
15.根據(jù)權利要求11的基于酶的傳感器用于檢測和/或定性和/或定量測定酶底物和/或共底物的用途。
16.根據(jù)權利要求15的用途，其中所述酶底物是葡萄糖。
17.根據(jù)權利要求15的用途，其中所述測定在血液中進行。
18.根據(jù)權利要求15的用途，其中進行多次測量。
19.制備用于基于酶的傳感器的組合的擴散和酶層的方法，其包括
(i)形成包含至少一種聚合物材料和攜帶酶的顆粒的分散體；
(ii)直接在下面的層上應用所述分散體以形成攜帶酶的擴散層；和
(iii)干燥所述分散體。
20.權利要求19的方法，其中所述干燥包括從分散體除去溶劑。
全文摘要
提供了用于基于酶的傳感器應用的組合的擴散和酶層，其中該擴散和酶層包含(a)至少一種聚合物材料，和(b)攜帶酶的顆粒，一般地為親水顆粒，該親水顆粒分散在至少一種聚合物材料中。
文檔編號C12Q1/00GK101128599SQ200580047626
公開日2008年2月20日 申請日期2005年12月2日 優(yōu)先權日2004年12月3日
發(fā)明者M·麥克因蒂爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司