專利名稱：Cm傳感器中的酶穩(wěn)定化的制作方法
CM傳感器中的酶穩(wěn)定化本發(fā)明涉及一種用于形成電極的組合物、包含它們的電化學(xué)傳感器、以及使用所述電化學(xué)傳感器測定分析物的方法。用于生化分析的測量系統(tǒng)是臨床上有關(guān)的分析方法的重要組分。這主要涉及在酶輔助下可以直接地或間接地測定的分析物的測量。通常使用體外分析系統(tǒng)，測定臨床上有用的參數(shù)的濃度。但是，當(dāng)測定它們的濃度在一天之中表現(xiàn)出顯著變化的分析物時，由于有限的時間分辨率和取樣時遇到的困難，體外分析是不適當(dāng)?shù)?。在該情況下，已經(jīng)證實(shí)生物傳感器(即配有生物組分的測量系統(tǒng)，其允許連續(xù)地或不連續(xù)地重復(fù)測量分析物，且可以離體以及在體內(nèi)使用)特別適用于測量分析物。離體生物傳感器通常用于流通池中，而體內(nèi)生物傳感器可以例如植入皮下脂肪組織。在這方面，可以區(qū)分僅短時間地導(dǎo)入組織中并與位于皮膚上的測量裝置直接接觸的經(jīng)皮植入物，和經(jīng)過外科手術(shù)與測量裝置一起插入組織中的全植入物。包含酶作為生物組分的電化學(xué)生物傳感器在工作電極內(nèi)或上含有酶，在該情況下，例如分析物可以用作酶的底物，且可以在該酶輔助下物理化學(xué)地改變(例如氧化)。在工作電極上的分析物轉(zhuǎn)化過程中釋放出的電子的流動引起的電測量信號，與測量的分析物的濃度相關(guān)聯(lián)，使得電測量信號可以用于測定樣品中分析物的存在和/或量。在實(shí)踐中，工作電極必須滿足許多要求，才能適用于電化學(xué)傳感器中 >工作電極應(yīng)當(dāng)具有低接觸電阻，并因而應(yīng)當(dāng)是高傳導(dǎo)性的。>工作電極不應(yīng)當(dāng)包含在選擇的極化電壓下會電化學(xué)地轉(zhuǎn)化的任何組分。這可以通過適當(dāng)?shù)剡x擇粘合劑和填充劑來實(shí)現(xiàn)。>■工作電極的電化學(xué)活性的表面積必須在它的整個運(yùn)行期內(nèi)保持恒定。為此目的，必須避免由于周圍的液體對組分的吸收引起的表面積減小。這通常通過施加一種或幾種高度生物相容的聚合物涂層來實(shí)現(xiàn)。^為了使分解電壓最小化，并因而實(shí)現(xiàn)參數(shù)的特異性轉(zhuǎn)化，應(yīng)當(dāng)在低過電位實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的電化學(xué)反應(yīng)。為此目的，應(yīng)當(dāng)提供電子從酶的輔基向轉(zhuǎn)向電極 (diverting electrode)白勺,工作電極應(yīng)當(dāng)包含足夠量的分析物-特異性的酶，該酶具有足夠的且恒定的活性，以便確保與電化學(xué)轉(zhuǎn)化重疊的酶反應(yīng)不受可利用的酶活性限制，而受可利用的分析物的量限制。換而言之，在整個運(yùn)行期中，必須維持靈敏度。也由于可能的酶毒性的原因，必須避免酶從工作電極向周圍組織中的擴(kuò)散。最后，必須保證，酶活性不會在儲存期間下降至低于預(yù)定的限度。已知許多電極組合物可用于使過電位最小化。關(guān)于H2O2，與單獨(dú)用葡萄糖氧化酶包被的碳纖維相比，通過使用銠-和葡萄糖氧化酶-包被的碳纖維，可以使氧化電位減少例如 450 mV [Wang 等人，Analytical Chemistry (1992)，64，456-459]。在 EP 0 603 154 A2中描述了更容易實(shí)現(xiàn)的方法，該文件提供了如下制備的電極復(fù)合物將周期表中第4周期的元素的氧化物和/或氫氧化物與石墨和粘合劑徹底混合，導(dǎo)致陽極的H2A氧化的過電壓減少> 200 mV。除了通常導(dǎo)入電極復(fù)合物的電學(xué)上非傳導(dǎo)性的和/或半傳導(dǎo)性的金屬氧化物以外，電學(xué)上傳導(dǎo)性的電催化劑(諸如碳納米管)是已知的，由于它們的小體積，它們可以排列在酶的修復(fù)中心(prosthetic centre)附近，具有高導(dǎo)電性，并實(shí)現(xiàn)電子的有效轉(zhuǎn)移[Wang 等人，Analyst (2003), 128，1382-1385; Wang 等人，Analyst (2004), 129，1-2; Wang 等人，Analytica Chimica Acta (2005), 539，209-213; Shobha Jeykumari 等人， Biosensors and Bioelectronics (2008), 23，1404-1411]。由于它們的高表面積，小量納米管足以達(dá)到分解電位的減小[US 2006/0021881 Al]。為了提供恒定的酶活性，不同的措施是本領(lǐng)域已知的。一種避免酶從工作電極的表面擴(kuò)散進(jìn)環(huán)境中的可能是，給工作電極提供合適的涂層，例如蓋膜。但是，這樣的涂層在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用伴有某些問題，諸如沉積無針孔的膜的必要性。其次，對于質(zhì)量轉(zhuǎn)移受限的系統(tǒng)，必須以高度可再現(xiàn)的層厚度沉積蓋膜。該需求代表著可能的涂層的廣闊限制， 因?yàn)殡y以實(shí)現(xiàn)表現(xiàn)出對質(zhì)量轉(zhuǎn)移的足夠高的屏障的非常薄的層。此外，用于測定不同分析物的電化學(xué)傳感器通常還必須含有不同的蓋膜，以便提供底物和協(xié)同底物向電極的不同質(zhì)量轉(zhuǎn)移速率。同時，必須確保，蓋膜對于體內(nèi)應(yīng)用是高度生物相容的。因?yàn)榧词鼓ぶ械淖钚∪毕菀沧阋詫?dǎo)致酶從電極滲漏到環(huán)境中，巨量的質(zhì)量控制是必要的，特別是在體內(nèi)生物傳感器的情況下，導(dǎo)致可觀的技術(shù)需求和增加的生產(chǎn)成本?；蛘撸ㄟ^將酶固定化在工作電極的電極基質(zhì)中，可以減少酶滲漏程度，這已經(jīng)導(dǎo)致對適當(dāng)?shù)拿冈陔娀瘜W(xué)生物傳感器中的固定化方法的集中搜索。在實(shí)踐中，可以將酶以化學(xué)共價方式偶聯(lián)到一種或更多種漿組分上，或物理地插入復(fù)合物中，使得所述酶吸附地鍵合到一種或幾種漿組分上，和/或摻入其中。關(guān)于吸附固定化，Rege等人[Nano Letters (2003), 3，擬9_832]公開了一種電極復(fù)合物，其包含單壁碳納米管(SWCNT)和/或石墨(作為傳導(dǎo)性的填充劑)和PMMA (作為粘合劑)，其中胰凝乳蛋白酶被物理地保留。在該背景下，發(fā)現(xiàn)含有SWCNT的復(fù)合物表現(xiàn)出比含有石墨的復(fù)合物更少的酶滲漏，這似乎是由于SWCNT比石墨更高的表面能。Tang 等人[Analytical Biochemistry (2004), 331，89-97]證實(shí)，通過使用 CNT-電極(其上面電化學(xué)地沉積了 Pt顆粒，且用葡萄糖氧化酶吸附地修飾過)，與常規(guī)石墨電極相比，可以顯著增加葡萄糖氧化酶的長期穩(wěn)定性。Tsai等人[Langmuir (2005), 21，3653-3658]公開了穩(wěn)定的葡萄糖傳感器，其包含用復(fù)合物包被的碳電極，所述復(fù)合物含有多壁碳納米管(MWCNT)、Nafion和葡萄糖氧化酶。基質(zhì)的固定化作用是指帶負(fù)電荷的MWCNT和Nafion (—方面)和帶正電荷的葡萄糖氧化酶(另一方面)之間的靜電相互作用。Guan 等人[Biosensors and Bioelectronics (2005), 21，508-512]通過將含有MWCNT的懸浮液和含有GOD和鐵氰化物的溶液分配在絲網(wǎng)印刷的碳電極上，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖傳感器。觀察到增加的響應(yīng)曲線線性，并歸因于MWCNT與常規(guī)碳電極相比增加的電子轉(zhuǎn)移速率。最后，Kurusu等人[Analytical Letters (2006), 39，903-911]公開了包含 MWCNT, GOD和礦物油的混合物的電極的應(yīng)用導(dǎo)致H2A的氧化分解電壓的顯著減小。但是，吸附固定化操作具有許多問題。物理固定化的一個主要缺點(diǎn)是，結(jié)合常數(shù)對
5在電極周圍的介質(zhì)的組成的依賴性，需要屏障膜來阻止酶滲漏。具體地，但是，物理偶聯(lián)對工作電極的有效表面的再現(xiàn)性(以及因而對其生產(chǎn))具有大量需要。如上所述，吸附固定化需要將含有酶的溶液和/或懸浮液施加于預(yù)加工的工作電極的表面上，或?qū)⒑忻傅娜芤汉?或懸浮液導(dǎo)入電極復(fù)合物中。但是，含有酶的溶液和/或懸浮液在工作電極表面上的分配應(yīng)用具有下述缺點(diǎn)小體積(例如在納升范圍內(nèi)的體積)的酶溶液的加入，對自動化計(jì)量裝置的精確度具有高要求。此外，酶在工作電極表面上的分布和酶向工作電極孔中的轉(zhuǎn)移，依賴于難以再現(xiàn)的電極表面的地形(topography )和能量°考慮到上述內(nèi)容，將酶混合進(jìn)電極復(fù)合物中是優(yōu)選的。但是，由于酶在主要疏水的復(fù)合物中的均勻分布的需要，不能避免由剪切造成的有效酶活性的損失、溶劑的影響和熱影響。此外，由于電極漿的沉積需要特定的流變學(xué)特征，必須考慮關(guān)于總漿電導(dǎo)率和在底物上的粘附的限制，同時在干酶均勻分布在復(fù)合物中以后，必須提供恒定的漿稠度。作為一個替代方案，可以將酶導(dǎo)入在水溶液或懸浮液中的復(fù)合物中，以便使變性最小化。但是，產(chǎn)生了以后去除溶劑或懸浮劑的必要性，所以復(fù)合物在生產(chǎn)期間推測不具有恒定的流變學(xué)特征。因此，考慮到吸附固定化的缺點(diǎn)，因而存在將酶固定化在電化學(xué)生物傳感器中的具體的需要，所述固定化通過共價鍵合電極基質(zhì)的至少一種組分來實(shí)現(xiàn)。EP 0 247 850 Al公開了用于分析物的電流分析檢測的生物傳感器。這些傳感器含有具有固定化的酶的電極，所述酶固定化或吸附在電學(xué)上傳導(dǎo)性的支持物的表面上，其中所述支持物由樹脂-結(jié)合的碳或石墨顆粒的鍍鉬多孔層組成，或含有這樣的層。為此目的，首先制備由鍍鉬的石墨和聚合的粘合劑制成的電極，隨后使它們接觸酶。在該情況下， 通過吸附在電極表面上，或通過使用合適的試劑使它偶聯(lián)到聚合粘合劑上，固定化酶。還在EP 0 603 154 A2中，描述了具有電極的電流分析生物傳感器，所述電極包含固定化或吸附在電學(xué)上傳導(dǎo)性的、多孔的電極材料上或內(nèi)的酶。為了生產(chǎn)酶電極，使起催化劑作用的、第4周期過渡金屬的氧化物或氧化物水合物(例如二氧化錳)與石墨和非傳導(dǎo)性的聚合粘合劑一起進(jìn)入漿中，并在第二步中，使干燥漿以后得到的多孔的電極材料接觸酶。 通過使用交聯(lián)劑諸如戊二醛，可以將酶固定化在多孔的電極材料上或內(nèi)。在EP 0 247 850 Al和EP 0 603 154 A2中描述的電化學(xué)生物傳感器的一個主要缺點(diǎn)是，首先將酶固定化在已經(jīng)預(yù)加工的沒有酶的電極上。結(jié)果，存在不能以受控的方式將酶偶聯(lián)到電極組分上的問題。因而，當(dāng)使用戊二醛作為交聯(lián)劑時，所述酶不僅以不受控的方式結(jié)合電極材料的任意反應(yīng)性組分，而且還相互交聯(lián)。此外，該操作會使所用的試劑污染電極，因此，必須再次徹底清潔電極，特別是在用于體內(nèi)生物傳感器之前，這會增加生產(chǎn)復(fù)雜性，并因而增加成本。Cho 等人[Biotechnology and Bioengineering (1977)，19，769-775]描述了通過共價偶聯(lián)，將酶固定化在活性炭上。更具體地，描述了如下將葡萄糖氧化酶固定化在基于石油的活性炭上(a)吸附酶，然后用戊二醛交聯(lián)，或(b)用二酰亞胺活化碳表面，隨后與酶反應(yīng)。通過該方式，可以證實(shí)與可溶性的酶相比，在有H2O2存在下酶的明顯更慢的滅活。Li 等人[Analytical and Bioanalytical Chemistry (2005), 383，918—922]公開了一種葡萄糖生物傳感器，其包含改良的玻璃碳電極作為工作電極。如下制備該改良的玻璃碳電極給商業(yè)的電極的表面涂布官能化的多壁碳納米管(MWCNT，其具有與其共價連接的氧化的葡萄糖氧化酶)在含有Nafion 和二茂鐵單羧酸的PBS緩沖溶液中的分散系。 特別強(qiáng)調(diào)了官能化的納米管對葡萄糖氧化的催化作用。US 2007/0029195 Al公開了諸如蛋白等生物分子的固定化，其中通過共價偶聯(lián)到用納米顆粒強(qiáng)化的傳導(dǎo)性的聚合基質(zhì)上，以改善機(jī)械穩(wěn)定性、導(dǎo)電性和生物分子的固定化。 所述基質(zhì)是納米復(fù)合物，其包含由吡咯和吡咯propylic acid形成的多吡咯包被的金納米顆粒，其中所述吡咯propylic acid會提供生物分子的共價連接。US 2008/0014471 Al公開了包含電極的電化學(xué)傳感器，所述電極采用固定化在碳納米管(CNT)上的交聯(lián)的酶簇。詳細(xì)地，固定化包括納米管表面的官能化，隨后借助于連接試劑，共價連接酶諸如葡萄糖氧化酶，以產(chǎn)生CNT-酶綴合物，用沉淀劑沉淀游離的酶，并最后用交聯(lián)劑處理，以形成交聯(lián)的酶簇，其通過CNT-酶綴合物共價地連接在CNT上。US 2008/044911 Al公開了一種包含納米線(nanowire)的葡萄糖傳感器，所述納米線具有共價連接在它們的表面上的葡萄糖氧化酶，所述官能化的納米線如下制備通過使常規(guī)的納米線接觸連接試劑(例如硅烷)和酶。在要通過固定化在納米線表面上的葡萄糖氧化酶來檢查的樣品中的葡萄糖的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致試驗(yàn)溶液PH的變化，其中該pH變化會在納米線中產(chǎn)生信號，該信號可以通過適當(dāng)方式檢測到。本領(lǐng)域已知，酶與支持物(例如MANAE-瓊脂糖、活化的乙醛?；傊呛臀於┉傊?的共價偶聯(lián)會導(dǎo)致抗熱分解的酶穩(wěn)定化[Betancor等人，Journal of Biotechnology (2006), 121，284-289]。但是，除了熱分解以外，采用這樣的固定化的酶的生物傳感器也面臨著在生物傳感器儲存期間由有機(jī)溶劑造成的、或在操作期間由諸如 H2O2等氧化劑造成的酶分解問題。在實(shí)踐中，生物傳感器必須滿足多個要求，才能允許精確測量立即的或時間延遲的治療措施。具體地，最重要的是，可以以高特異性和靈敏度測定目標(biāo)分析物，以便測定低量的臨床上有關(guān)的參數(shù)。結(jié)果，當(dāng)儲存超過1個月時，通常在可商業(yè)得到的生物傳感器中觀察到的酶活性的顯著損失是診斷和/或臨床目的所不可接受的。因此，本發(fā)明的目的是，提供一種用于形成電極的組合物，其中至少部分地消除了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。具體地，所述組合物會確保酶的特異性的且持久的固定化，防止或至少減少在生產(chǎn)電極復(fù)合物以后酶活性的損失，保藏超過1個月的時期以及生物傳感器功能，并確保在整個工作期間的高靈敏度。借助于用于形成電極的組合物，根據(jù)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了該目的，所述組合物包含電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分，所述組分具有與其共價連接的分析物-特異性的酶，其中所述組合物另外包含至少一種電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物必須包含電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分，所述組分具有與其共價連接的分析物-特異性的酶。在本申請內(nèi)使用的術(shù)語“電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分”表示這樣的任意物質(zhì)其含有可自由移動的電荷，并具有P < ΙΟ"4 Ω cm的電阻率，因而允許電流的運(yùn)輸。電學(xué)上傳導(dǎo)性的物質(zhì)可以是電子導(dǎo)體(一級導(dǎo)體)或離子導(dǎo)體(二級導(dǎo)體)，其中電子導(dǎo)體是優(yōu)選的。優(yōu)選地，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分是H2O2-分解(decomposition)催化劑。這意味著，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分不僅運(yùn)輸電流，而且另外能夠催化過氧化氫的分解，所述過氧化氫存在于或形成在接觸電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分的樣品中。由于過氧化氫通常造成在臨床上有關(guān)的分析物的檢測中使用的大多數(shù)酶的破壞，且另外可以起分析物或協(xié)同底物(諸如氧) 的抑制劑的作用，生化試驗(yàn)元件中過氧化氫的分解是特別重要的。為此目的，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分可以，例如，催化過氧化氫化學(xué)轉(zhuǎn)化成化學(xué)上更低活性的或惰性的物質(zhì)，包括過氧化氫氧化成水。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分選自活性炭、碳黑、石墨、含碳的納米管、鈀、鉬和氧化鐵的氫氧化物例如!^eO(OH)，其中石墨和含碳的納米管是特別優(yōu)選的。本文使用的術(shù)語“含碳的納米管”表示所有種類的納米管，即具有< 1 ym的平均內(nèi)徑的管，其包含碳作為它們的組分之一。具體地，在本發(fā)明的含義上，含碳的納米管包括碳納米管(CNT)，其可以是下述形式，例如，單壁碳納米管(SWCNT)、雙壁碳納米管 (DWCNT)、多壁碳納米管(MWCNT)等。由于納米管通常會提供高有效表面，它們可以用要固定化在它們的表面上的適當(dāng)物質(zhì)(例如在分析物的檢測中采用的酶)充分修飾。在另一個實(shí)施方案中，除了具有與其共價連接的分析物-特異性的酶的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分以外，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含至少一種額外的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分。所述額外的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分可以是能夠運(yùn)輸電流的任意物質(zhì)，且優(yōu)選地選自活性炭、碳黑、石墨、含碳的納米管、鈀、鉬和氧化鐵的氫氧化物。原則上，該組分也可以借助于共價鍵與分析物-特異性的酶形成綴合物，但是優(yōu)選地，不是共價地連接在分析物-特異性的酶上。根據(jù)本發(fā)明，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分具有與其共價連接的分析物-特異性的酶。所述酶可以是對要檢測的分析物特異性的、且適合本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)希望的效果的任意酶。固定化在所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分上的酶優(yōu)選地是氧化酶，特別是醇氧化酶 (1. 1.3. 13)、芳基醇氧化酶(EC 1. 1.3. 7)、兒茶酚氧化酶(EC 1. 1. 3. 14)、膽固醇氧化酶 (EC 1. 1.3. 6)、膽堿氧化酶(1. 1.3. 17)、半乳糖氧化酶(EC 1. 1. 3. 9)、葡萄糖氧化酶(EC 1. 1. 3. 4)、甘油-3-磷酸氧化酶(EC 1. 1. 3. 21)、己糖氧化酶(EC 1. 1. 3. 5)、蘋果酸氧化酶 (EC 1. 1. 3. 3)、吡喃糖氧化酶(EC 1. 1. 3. 10)、吡多辛_4_氧化酶(EC 1. 1. 3. 12)或硫胺素氧化酶(EC 1. 1. 3. 23)。更優(yōu)選地，所述酶是葡萄糖氧化酶。優(yōu)選地，所述分析物-特異性的酶選擇性地共價地結(jié)合在所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分上。酶與所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分的共價結(jié)合，會確保包含本發(fā)明的組合物的電極的功能的恒定性，因?yàn)樵诘湫偷臏y量條件(生理電解質(zhì)濃度、生理pH、體溫)下，可以排除酶的脫離。因而，包含這樣的電極的電化學(xué)傳感器可以在長時間段內(nèi)工作，且基本上沒有漂移地工作。為了使分析物-特異性的酶共價地結(jié)合到所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分上，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)見到，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分具有這樣的表面，其包含所述酶所結(jié)合的官能團(tuán)。所述表面可以，例如，表現(xiàn)出羥基、羧基或氨基官能度。或者，可以如下官能化所述表面給所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分涂布適合形成官能團(tuán)的試劑，由此，所述酶可以共價地結(jié)合在所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分的表面上。在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的涂布劑是這樣的物質(zhì)一方面，其與所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分發(fā)生共價結(jié)合，另一方面，其含有至少一種官能團(tuán)，用于共價地結(jié)合酶。這意味著，所述涂布劑是至少雙功能的，即包含至少2個官能團(tuán)，所述官能團(tuán)可以是相同的或不同的。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酶直接地共價地結(jié)合在所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分的表面上，這意味著，在酶的官能團(tuán)和所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分的表面上的官能團(tuán)之間形成至少一個共價鍵。所述酶可以以任意方式偶聯(lián)在表面上，且可以包含預(yù)先活化在所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分表面上的官能團(tuán)和/或酶。通過例如使官能化的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和/或酶與合適的活化劑反應(yīng)，可以活化官能團(tuán)。優(yōu)選的活化劑包括碳二亞胺例如二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)以及碳二亞胺和琥珀酰亞胺的組合。 特別適用于本發(fā)明目的的活化劑包括1-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺(MB)的組合。適用于將分析物-特異性的酶共價地結(jié)合到、特別是選擇性地共價地結(jié)合到所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分上的其它方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且描述在，例如，H. ffeetall, Methods of Enzymology (1976)， 33， 134-148。根據(jù)本發(fā)明，所述組合物另外包含電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分。在本申請內(nèi)使用的術(shù)語“電學(xué)上非傳導(dǎo)性的組分”表示具有P > IO9 Ω cm的電阻率且不能運(yùn)輸電流的任意物質(zhì)。相反，本文使用的術(shù)語“電學(xué)上半傳導(dǎo)性的組分”表示具有 ο—4 < P < IO9 Ω cm的電阻率的任意物質(zhì)。術(shù)語“酶-穩(wěn)定化的”表示，所述非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的組分能夠穩(wěn)定化分析物-特異性的酶，這如下實(shí)現(xiàn)通過與分析物-特異性的酶反應(yīng)，與酶形成復(fù)合物或綴合物，或通過轉(zhuǎn)化化學(xué)物質(zhì)，造成酶的分解。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分是 H2O2-分解催化劑，這意味著，所述電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分會分解過氧化氫，例如通過化學(xué)轉(zhuǎn)化，從而防止對在根據(jù)本發(fā)明的組合物中采用的分析物-特異性的酶的破壞。所述電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分優(yōu)選地選自H2O2-降解 (degrading)金屬氧化物和H2O2-降解酶。為了本發(fā)明的目的，所述H2O2-降解金屬氧化物可以是能夠催化過氧化氫的分解的任意金屬氧化物，例如通過氧化它們，其中Ag2CKAl2O3或周期表第4周期的金屬的氧化物已經(jīng)被證實(shí)是特別有益的。周期表第4周期的金屬的氧化物優(yōu)選地是Mn的氧化物、CuO或&ι0，其中Μη02、Μη304或Mn5O8是特別優(yōu)選的。H2O2-降解酶可以是已知會分解過氧化氫的任意酶，具體地包括過氧化物酶和過氧化氫酶。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物另外包含，共價地連接到電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分上的分析物-特異性的酶。這意味著，在本發(fā)明的組合物中采用的分析物-特異性的酶不僅可以共價地連接到所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分上，而且可以另外共價地連接到電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分上，這借助于在酶和例如位于電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分的表面上的官能團(tuán)之間形成的共價鍵來實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明可以以微粒形式提供電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和/或電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分，其中粒度可以根據(jù)各個需要而變化。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含納米顆粒形式(即具有< ι μ m的平均直徑的顆粒)的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和/或電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分。在本發(fā)明范圍內(nèi)，90% 的納米顆粒通常具有10 nm-100 nm的直徑，已經(jīng)證實(shí)15 nm-30 nm的直徑是特別優(yōu)選的。借助于粒度來控制電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和/或電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分的有效表面的能力是特別重要的，例如，關(guān)于用化學(xué)物質(zhì)官能化。更具體地， 更高效的表面可以增加酶的負(fù)載，因而，可以產(chǎn)生更高的酶活性，表述為單位/毫克酶-負(fù)載的組分。用于本發(fā)明目的的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分通常具有約10 mU/mg至約5 U/mg的酶活性，已經(jīng)證實(shí)約100 mU/mg至約1 U/mg的酶活性是特別有益的。在本申請范圍內(nèi)使用的術(shù)語“單位”表示在標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1 Mfflol底物所需的酶的量。除了電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分以外， 根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含常規(guī)地用于形成電極的其它組分，例如，粘合劑、填充劑等。 關(guān)于粘合劑，所述組合物優(yōu)選地包含至少一種選自下述的粘合劑氟化的烴諸如TeflorA 聚碳酸酯、聚異戊二烯、聚氨酯、丙烯酸樹脂、聚乙烯樹脂和硅氧烷，其中聚氨酯、丙烯酸樹脂和聚乙烯樹脂是更優(yōu)選的。為了形成電極，徹底混合具有與其共價連接的分析物-特異性的酶的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分、電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分和形成電極基質(zhì)所需的所有其它組分，并隨后干燥，使得電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和/或電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分優(yōu)選地均勻地分散在組合物中。根據(jù)要形成的電極的具體要求，技術(shù)人員能夠沒有任何困難地確定提供根據(jù)本發(fā)明的組合物所需的不同組分的量。但是，關(guān)于電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分，已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)所述組合物含有量為0.5-10% (按重量計(jì)算，基于組合物的干重)的由電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和分析物-特異性的酶形成的綴合物時，是有利的。另一方面，所述組合物優(yōu)選地含有量為5-50% (按重量計(jì)算，基于組合物的干重)的電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分。本文所述的組合物會顯著地減少借助于生物傳感器檢測目標(biāo)分析物所需的分析物-特異性的酶的活性的損失，所述生物傳感器例如電化學(xué)傳感器，包括使用根據(jù)本發(fā)明的組合物的電極。具體地，在4°C溫度儲存所述組合物至少4周、優(yōu)選至少12周、更優(yōu)選至少觀周以后，在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，所述酶具有至少90%的殘余活性，這基于儲存之前的總酶活性，即基于剛剛制備完成后組合物中的總酶活性。在另一個方面，本發(fā)明因而涉及用于測定分析物的電化學(xué)傳感器，所述傳感器包含至少一個工作電極和至少一個參比電極，其中所述工作電極包含根據(jù)本發(fā)明的組合物。盡管根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的工作電極用于轉(zhuǎn)化要測定的分析物，參比電極允許調(diào)節(jié)工作電極的極化電位，且可以由適合本發(fā)明目的的任意物質(zhì)組成。金屬/金屬離子電極，特別是銀/氯化銀電極，優(yōu)選地用作參比電極。除了至少一個工作電極和至少一個參比電極以外，所述電化學(xué)傳感器還可以包含至少一個對應(yīng)電極，其優(yōu)選地是貴金屬電極的形式，特別是金電極或石墨電極。根據(jù)本發(fā)明，所述電化學(xué)傳感器優(yōu)選地包含覆蓋至少一個工作電極的生物相容的涂層、至少一個參比電極和任選的對應(yīng)電極。所述生物相容的涂層允許分析物滲入電極基質(zhì)，但是阻止電極組分進(jìn)入含有目標(biāo)分析物的周圍介質(zhì)中?？紤]到下述事實(shí)，即由于酶與電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分的共價結(jié)合，所述酶不會流出工作電極或電化學(xué)傳感器，生物相容的涂層對于許多應(yīng)用而言不是絕對必需的。因而，當(dāng)生
10物相容的涂層不是酶的屏障時，根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器也可以用于體內(nèi)用途。在這樣的情況下，可以選擇這樣的生物相容的涂層，其提供與周圍組織和/或血液或血清的最佳相互作用。生物相容的涂層可以以不同的方式來制備。一種優(yōu)選的方法是，使用預(yù)加工的膜， 其施加于電化學(xué)傳感器上。所述膜可以通過不同的技術(shù)固定化在傳感器上，而粘合或激光焊接被視作優(yōu)選的?；蛘?，可以在原位制備生物相容的涂層，其中將合適的聚合物的溶液施加于電化學(xué)傳感器上，隨后干燥它。優(yōu)選地，通過噴霧、浸涂或分散聚合物在低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑中的稀溶液，將聚合物施加在生物傳感器上，但是不限于這些方法。適合這些目的的聚合物具體地包括具有兩性離子結(jié)構(gòu)并模仿細(xì)胞表面的聚合物，例如2-異丁烯?；跻一?磷?；憠A-共聚-正丁基-甲基丙烯酸酯(MPC-共聚-BMA)。得到的生物相容的涂層通常具有約1 μ m至約100 μ m、優(yōu)選約3 μ m至約25 μ m的厚度。根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器優(yōu)選地設(shè)計(jì)用于多次測量，即所述傳感器能夠重復(fù)測量要測定的分析物。在需要在長時間段內(nèi)(例如1天或更長，特別是1周或更長)恒定地(即連續(xù)地或不連續(xù)地)控制分析物的存在和/或量的用途中，這是特別合乎需要的。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器因而可以完全地或部分地植入，且可以植入到例如脂肪組織或血管中?；蛘撸景l(fā)明允許將電化學(xué)傳感器設(shè)計(jì)成流通池，含有分析物的流體樣品從其中穿過。本文所述的電化學(xué)傳感器可以用于測定流體介質(zhì)中的分析物，所述流體介質(zhì)可以源自任意來源。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述電化學(xué)傳感器用于測定體液中的分析物，所述體液包括但不限于全血、血漿、血清、淋巴液、膽汁、腦脊液、胞外組織液、尿以及腺體分泌物諸如唾液或汗液，其中全血、血漿、血清和胞外組織流體被認(rèn)為是特別優(yōu)選的。進(jìn)行分析所需的樣品的量通常是約0.01 μ 1至約100 μ 1，優(yōu)選約0.1 μ 至約2 μ L·要定性地和/或定量地測定的分析物可以是要借助于還原氧化反應(yīng)檢測的任意生物或化學(xué)物質(zhì)。所述分析物優(yōu)選地選自蘋果酸、醇、銨、抗壞血酸、膽固醇、半胱氨酸、葡萄糖、谷胱甘肽、甘油、脲、3-羥基丁酸鹽、乳酸、5’ -核苷酸酶、肽、丙酮酸鹽、水楊酸鹽和甘油三酯。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，要借助于根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器測定的分析物是葡萄糖。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于測定分析物的方法，所述方法包括下述步驟
(a)使含有分析物的樣品接觸根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器，和
(b)測定分析物的存在和/或量。為了測定分析物，可以以允許電化學(xué)傳感器和含有分析物的樣品之間發(fā)生接觸的任意方式，設(shè)計(jì)電化學(xué)傳感器。因而，可以將傳感器設(shè)計(jì)為流通池，含有分析物的介質(zhì)從其中流過。另一方面，也可以將傳感器設(shè)計(jì)為擴(kuò)散傳感器，其中通過擴(kuò)散發(fā)生傳感器和介質(zhì)之間的接觸。同樣地，可以將電化學(xué)傳感器設(shè)計(jì)為這樣的裝置，其意圖完全地或部分地植入患者體內(nèi)，在該情況下，它植入到血管或組織中，特別是皮下脂肪組織中。根據(jù)分析物的存在和/或量，由傳感器產(chǎn)生可測量的信號。該信號優(yōu)選地是電信號，例如電流、電壓、電阻等，其使用合適的裝置進(jìn)行評價或讀出。所述電化學(xué)傳感器優(yōu)選地是電流分析傳感器。
下面的附圖和實(shí)施例意在進(jìn)一步解釋本發(fā)明。


圖1 相對于時間[S]繪制的根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的測量信號[nA]，依賴于葡萄糖濃度
，所述傳感器采用這樣的工作電極，其包含由碳納米管和葡萄糖氧化酶形成的綴合物(CNT-G0D; 1.75%，按重量計(jì)算)，并包含MnA (20%，按重量計(jì)算)作為半傳導(dǎo)性的H2O2-分解催化劑。極化電壓350 mV。圖2 在4°C溫度儲存28周時段的根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的測量信號[nA/ mM]，所述傳感器采用這樣的工作電極，其包含由碳納米管和葡萄糖氧化酶形成的綴合物 (CNT-G0D; 2.4%，按重量計(jì)算)，并包含胞仏(19.5%，按重量計(jì)算)作為半傳導(dǎo)性的H2O2-分解催化劑。圖3 在MES緩沖液(pH 7. 4)中，在含有H2O2 (5%溶液)的MES緩沖液中，和在含有H2A (5%溶液)和500 U/ml過氧化氫酶的MES緩沖液中，由碳納米管和葡萄糖氧化酶形成的綴合物(CNT-GOD)的酶活性[mU/mg低壓凍干的綴合物]。圖4:由不同的電學(xué)上傳導(dǎo)性的和電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的物質(zhì)造成的 H2O2的分解速率[mM/mg/h]。4A:由不同的可商業(yè)得到的碳造成的H2O2的分解速率[mM/mg/h]。4B:由不同的可商業(yè)得到的金屬氧化物造成的H2O2的分解速率[mM/mg/h]。4C:由2種不同的氧化錳造成的H2O2的分解速率[mM/mg/h]。圖5 相對于遞增的葡萄糖濃度[mg/dl]繪制的不同電化學(xué)傳感器的測量信號 [nA]。極化電壓350 mV。5A 8個電化學(xué)傳感器的測量信號[nA]，所述電化學(xué)傳感器采用這樣的工作電極， 其包含由碳納米管和葡萄糖氧化酶形成的綴合物(CNT-G0D ；2%，按重量計(jì)算)。5B:8個根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的測量信號[nA]，所述傳感器采用這樣的工作電極，其包含由碳納米管和葡萄糖氧化酶形成的綴合物(CNT-G0D; 2%，按重量計(jì)算)，并包含Mr^2 (20%，按重量計(jì)算)作為半傳導(dǎo)性的H2O2-分解催化劑。圖6 根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的示意圖。
實(shí)施例實(shí)施例1 由碳納米管和葡萄糖氧化酶形成的綴合物(CNT-GOD)的制備
為了制備具有與其共價連接的酶的電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分，將2. 5 g碳納米管(CNT， Nanolab)加入480 mg葡萄糖氧化酶(GOD, Roche) ,9. 6 g 1_乙基_3_ (3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC，Sigma)和7. 2 g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS, Sigma)在480 ml Millipore水中的溶液中。在實(shí)驗(yàn)室搖床上在室溫溫育混合物6小時以后，使混合物穿過膜濾器，由此從反應(yīng)液分離綴合物。用PBS緩沖液(3 X 120 ml)、Millip0re水(1 X 120 ml)洗滌綴合物，并在真空下干燥過夜，得到3.0 g CNT-GOD綴合物。實(shí)施例2 =CNT-GOD綴合物的酶活性的測定
為了測定在實(shí)施例1中制備的CNT-GOD綴合物的酶活性，將5 mg低壓凍干的綴合物懸浮于1 ml MES緩沖液中，并在室溫?cái)嚢?小時。平行地，將Toyobo溶液(GL0-201 ；30 ml MES緩沖液(79 mM) ；6 ml葡萄糖溶液(131 mM) ；0. 3 ml 4-氨基安替比林溶液(0.2 mM)； 0.3 ml N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-間甲苯胺溶液(0.3 mM) ；0. 3 ml過氧化物酶溶液(約4 U/ml))吸入比色皿中，并在37°C緩沖10分鐘。將綴合物加入緩沖的Toyobo 溶液以后，使用陽5 nm的波長，測量如此得到的混合物的吸收。通過該方式，測得酶活性為 870 mU/mg綴合物。實(shí)施例3 采用包含CNT-GOD綴合物和H2O2-分解催化劑的工作電極的電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性
為了測定根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性，制備了工作電極，其包含由78. 25%(按重量計(jì)算)的電極漿(Acheson)、1. 75% (按重量計(jì)算)的實(shí)施例1的CNT-GOD綴合物和20% (按重量計(jì)算)的MnA (Merck)組成的電極基質(zhì)。隨后，使電化學(xué)傳感器接觸含有0、2、4、6、8、12、17、23、26、20、15、10、7、5、3 和 0. 8
mM濃度的葡萄糖的溶液，所述濃度在5天時段內(nèi)定期地變化。從圖1可以看出，該電化學(xué)傳感器在整個階段沒有表現(xiàn)出任何靈敏度損失，這是由與碳納米管的共價結(jié)合造成的酶滲漏防止和由MnO2催化的H2A分解的結(jié)果。實(shí)施例4 采用包含CNT-GOD綴合物和H2O2-分解催化劑的工作電極的電化學(xué)傳感器的長期穩(wěn)定性
為了測定根據(jù)本發(fā)明的電化學(xué)傳感器的長期穩(wěn)定性，制備了工作電極，其包含由78% (按重量計(jì)算)的電極漿(Acheson)、2. 4% (按重量計(jì)算)的實(shí)施例1的CNT-GOD綴合物和 19.5% (按重量計(jì)算)的MnA (Merck)組成的電極基質(zhì)。隨后，在4°C溫度儲存該電化學(xué)傳感器觀周的時段。從圖2可以看出，該電化學(xué)傳感器的測量信號在它制備后的第4周至第觀周之間保持不變。在第O周至第4周之間的靈敏度損失歸因于電極基質(zhì)的調(diào)節(jié)作用。實(shí)施例5 包含CNT-GOD綴合物和H2O2-分解催化劑的組合物的酶活性的測定
為了測定根據(jù)本發(fā)明的組合物的酶活性，將10 mg低壓凍干的CNT-GOD-綴合物懸浮于1 ml MES緩沖液(pH 7. 4)中，并在室溫溫育1小時。隨后，使用可商業(yè)得到的H2A試驗(yàn)(Toyobo)，測量CNT-GOD綴合物的殘余酶活性，測得為約600 mU/mg低壓凍干的綴合物(參見圖2)。平行地，測定了在含有HA (5%溶液)的MES緩沖液中的CNT-GOD綴合物的殘余酶活性，以及在含有H2A (5%溶液)和500 U/ml過氧化氫酶的MES緩沖液中的CNT-GOD的殘余酶活性。 從圖3可以看出，當(dāng)在樣品中存在H2A時(CNT-GOD + H2O2)，CNT-GOD綴合物的殘余酶活性降低至小于100 mU/mg低壓凍干的綴合物。另一方面，H2A溶液和H2O2-分解催化劑過氧化氫酶的加入，導(dǎo)致約650 mU/mg低壓凍干的綴合物的殘余酶活性(CNT-GOD + H2O2 +過氧化氫酶)，指示H2A對GOD變性的完全抑制。實(shí)施例6 =H2O2-分解催化劑的測定
為了測定起H2O2-分解催化劑作用的化合物，已經(jīng)關(guān)于它們的有效催化H2A分解的能力，評價了許多碳和金屬氧化物。詳細(xì)地，測試 Carbon Black Acetylene (Strem Chemicals)、Spheron 6400 (Cabot Corporation)、Mogul E (Cabot Corporation)、Carbon Black Acetylene (AlfaAesar)、Mogul L (Cabot Corporation)、Nanofibers (Electrovac)>Vulcan Black XC-605 (Cabot Corporation) > Black Pearls 2000 (Cabot Corporation； ground for 60 min) > Black Pearls 2000 (Cabot Corporation; ground for 120 min)禾口納米管(Nanolab) 為電學(xué)上傳導(dǎo)性的碳物質(zhì)。在該背景下，碳納米管(Nanolab)和Black Pearls 2000 (Cabot Corporation; ground for 120 min)被證實(shí)是特別適合的，分別會提供0. 00126 和0. 00098 mM/mg催化劑/h的H2O2-分解速率(參見圖4A)。關(guān)于金屬氧化物，從圖4B和4C顯而易見，在試驗(yàn)中采用的不同化合物會提供十分不同的分解速率。然而可商業(yè)得到的Al2O3 (Sigma-Aldrich,產(chǎn)品號229423)、Al2O3 (Aldrich,產(chǎn)品號551643)和!^0(OH) (Fluka,產(chǎn)品號71063)的催化作用相當(dāng)差，Ag2O (Riedel-de Haen,產(chǎn)品號 10228)和 Mn3O4 (Strem Chemicals,產(chǎn)品號 93-2513)被證實(shí)為非常有效的H2O2-分解催化劑(參見圖4B)。另一種非常有效地催化H2A分解的化合物是如下得到的Mn5O8 在25V _430°C加熱可商業(yè)得到的Mn3O4 (Strem Chemicals,產(chǎn)品號93-2513) 6小時，保持該溫度12小時， 隨后冷卻至25°C。從圖4C可以看出，在有通過上述方法得到的Mn5O8存在下，觀察到的H2A 分解速率顯著優(yōu)于Mn3O4的催化作用。實(shí)施例7 采用包含CNT-GOD綴合物和H2O2-分解催化劑的工作電極的電化學(xué)傳感器中過電位的降低
為了測定電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分對在電化學(xué)傳感器的工作電極處觀察到的過電壓的影響，制備了 8個采用包含m (按重量計(jì)算)的實(shí)施例1的CNT-GOD 綴合物的工作電極的電化學(xué)傳感器，和8個采用包含洲(按重量計(jì)算)的實(shí)施例1的CNT-GOD 綴合物和20% (按重量計(jì)算)的MnA (Merck)的工作電極的電化學(xué)傳感器。從圖5A可以看出，僅包含CNT-GOD綴合物的工作電極的應(yīng)用，導(dǎo)致0.01 士 0.03 nA/mM葡萄糖溶液的低靈敏度，其中施加350 mV的極化電壓(相對于Ag/AgCl參比電極)，并測量依賴于葡萄糖濃度的電流。相反，在相同的反應(yīng)條件下，包含與MnO2相組合的CNT-GOD綴合物的工作電極的應(yīng)用，導(dǎo)致0. M 士 0.11 nA/mM葡萄糖溶液的顯著增加的靈敏度，這指示在工作電極處的過電壓的顯著降低(參見圖5B)。
權(quán)利要求
1.用于形成電極的組合物，所述組合物包含電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分，所述組分具有與其共價連接的分析物-特異性的酶，其特征在于，所述組合物另外包含至少一種電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物， 其特征在于，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分是H2O2-分解催化劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物， 其特征在于，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分選自活性炭、碳黑、石墨、含碳的納米管、鈀、鉬和氧化鐵的氫氧化物，特別地選自石墨和含碳的納米管。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合物， 其特征在于，所述酶是氧化酶、特別是葡萄糖氧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的組合物， 其特征在于，所述電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分是H2O2-分解催化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物， 其特征在于，所述電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分選自=H2O2-降解金屬氧化物、特別是Ag2CKAl2O3或周期表中第4周期的金屬的氧化物和H2O2-降解酶、特別是過氧化物酶或過氧化氫酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物， 其特征在于，所述周期表第4周期的金屬的氧化物是Mn的氧化物、尤其是Mn02、Mn3O4或Mn508、CuO 或 ZnO0
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的組合物， 其特征在于，它另外包含分析物-特異性的酶，該酶共價地連接到電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的組合物， 其特征在于，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和/或所述電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分以納米顆粒形式提供。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的組合物， 其特征在于，它另外包含至少一種粘合劑，所述粘合劑選自氟化的烴、聚碳酸酯、聚異戊二烯、聚氨酯、丙烯酸樹脂、聚乙烯樹脂和硅氧烷，特別是選自聚氨酯、丙烯酸樹脂和聚乙烯樹脂。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述電學(xué)上傳導(dǎo)性的組分和/或所述電學(xué)上非傳導(dǎo)性的或半傳導(dǎo)性的酶穩(wěn)定化組分均勻地分散在所述組合物中。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，在4°C溫度儲存所述組合物至少4周、優(yōu)選至少12周、更優(yōu)選至少觀周以后，所述酶具有至少90%的殘余活性，這基于儲存之前的總酶活性。
13.用于測定分析物的電化學(xué)傳感器，所述傳感器包含至少一個工作電極和至少一個參比電極，其特征在于，所述工作電極包含根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的組合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于，它包含生物相容的涂層，所述涂層覆蓋工作電極和參比電極。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的電化學(xué)傳感器，其用于測定體液、特別是全血、血漿、 血清或胞外組織液中的分析物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的電化學(xué)傳感器，其用于測定選自下述的分析物蘋果酸、醇、銨、抗壞血酸、膽固醇、半胱氨酸、葡萄糖、谷胱甘肽、甘油、脲、3-羥基丁酸鹽、乳酸、 5’ -核苷酸酶、肽、丙酮酸鹽、水楊酸鹽和甘油三酯，特別是葡萄糖。
17.用于測定分析物的方法，所述方法包括下述步驟a 使含有分析物的樣品接觸根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的電化學(xué)傳感器，和b 測定分析物的存在和/或量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于形成電極的組合物、包含它們的電化學(xué)傳感器、以及使用所述電化學(xué)傳感器測定分析物的方法。
文檔編號C12Q1/00GK102439164SQ201080019693
公開日2012年5月2日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者蓋斯勒-迪切 C., 奧維爾克 G. 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司