生物傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種通過使酶層和介體層分別含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子而能夠簡單地制造可長期保存的生物傳感器的技術。由于酶層(106b)和介體層(106c)一起形成為反應層(106)，所以不需要像以往那樣將酶層(106b)和介體層分別形成于各覆蓋層(130)和電極層(110)，能夠簡單地形成反應層(106)，通過使酶層(106b)和介體層(106c)分別含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子，可在保存狀態(tài)下抑制酶與介體的反應，并且抑制介體層(106c)的介體被還原，因此能夠簡單地制作可長期保存的生物傳感器(100)。
【專利說明】生物傳感器的制造方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物傳感器的制造方法，該生物傳感器具備:電極層，設有含有工作電極和對電極的電極系；隔離層，形成有用于形成腔部的狹縫且被層疊于電極層；覆蓋層，形成與腔部連通的空氣孔且被層疊于隔離層；以及反應層，被設置于工作電極和對電極。

【背景技術】
[0002]已知有如下的物質(zhì)的測定方法，即，使用生物傳感器500，如圖10的以往的生物傳感器所示，該生物傳感器500具有電極系和反應層，上述電極系含有工作電極501和對電極(省略圖示)以及參比電極502，上述反應層由含有與測定對象物質(zhì)特異性反應的酶的酶層503a和含有介體的介體層503b構成，使試樣中含有的測定對象物質(zhì)與反應層反應，由此生成還原物質(zhì)，通過在工作電極501與對電極之間施加電壓對生成的還原物質(zhì)進行氧化而得到氧化電流，計量該氧化電流，由此進行測定對象物質(zhì)的定量(例如參照專利文獻I)。
[0003]圖10所示的生物傳感器500是層疊如下部件而形成的，即，電極層504，在聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚酰亞胺等絕緣性基板上設置電極而形成；絕緣體層505，設置于電極層且用于防止各電極間的短路；和覆蓋層506。另外，在電極層504設有介體層503b，在覆蓋層506設有酶層503a，通過利用由分別設置的雙面膠帶構成的粘接層508將電極層504和覆蓋層506彼此貼合,酶層503a和介體層503b分離而在相互隔離的狀態(tài)下配置。
[0004]另外，在電極層504設有工作電極501和對電極以及參比電極502，通過設置與這些電極501、502分別電連接的電極圖案而在電極層504形成電極系。
[0005]而且，當向酶層503a和介體層503b對置的空間內(nèi)供給由液體構成的試樣時,被供給的試樣與各電極501、502和反應層接觸,并且反應層溶解于試樣。
[0006]另外，在設置于覆蓋層506的酶層503a中含有與試樣中含有的葡萄糖特異性反應的葡萄糖氧化酶和親水性高分子。另外，在設置于工作電極501和對電極上的介體層503b中含有作為介體(電子受體)的鐵氰化鉀和親水性高分子。而且，利用酶層503a和介體層503b中分別含有的親水性高分子可防止各層503a、503b的剝離。
[0007]另外，鐵氰化鉀溶解于試樣而產(chǎn)生的鐵氰酸根離子被在葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應而被氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯時釋放的電子還原成作為還原體的亞鐵氰酸根離子。因此，當含有葡萄糖的試樣被供給至生物傳感器500時，鐵氰酸根離子被通過氧化葡萄糖而釋放的電子還原，因此僅以與在試樣中含有且因酶反應而被氧化的葡萄糖的濃度相應的量，生成作為鐵氰酸根離子的還原體的亞鐵氰酸根離子。
[0008]在這樣構成的生物傳感器500中，通過將酶反應的結(jié)果所產(chǎn)生的介體的還原體在工作電極501上氧化而得到的氧化電流成為依賴于試樣中的葡萄糖濃度的大小，因此能夠通過計量該氧化電流來進行試樣中含有的葡萄糖的定量。
[0009]專利文獻
[0010]專利文獻1:日本特開2009-244012號公報(第0016?0092段，圖1、2，摘要等)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]然而，酶層503a中含有的酶和介體層503b中含有的介體在生物傳感器500的保存狀態(tài)下發(fā)生反應，由此使介體被經(jīng)時還原，因此有可能使用了生物傳感器500的測定對象物質(zhì)的測定精度變差。因此，在上述生物傳感器500中，通過將形成反應層的酶層503a和介體層503b分離而在彼此被隔離的狀態(tài)下進行配置，可防止介體被酶還原。然而，如果這樣構成，則能夠防止由于長期保存生物傳感器500而導致酶與介體發(fā)生反應并使反應層變差，另一方面，必須要單獨地分別將介體層503b和酶層503a形成于電極層504和覆蓋層506而操作繁瑣，導致制造成本的增加。
[0012]另外，酶層503a和介體層503b中分別含有的親水性高分子具有如下功能，即，防止各層503a、503b的剝離，或者例如血液試樣被供給至生物傳感器500時，過濾血液試樣來阻止血細胞的移動，從而抑制血液試樣的紅細胞比容值對測定產(chǎn)生的影響。另一方面，已知親水性高分子會將介體層503b中含有的介體還原。例如由于長期保存生物傳感器500而使親水性高分子對介體的還原緩慢進行，在測定上述氧化電流時，因被親水性高分子還原的介體的還原體發(fā)生氧化而產(chǎn)生的氧化電流也作為背景電流與作為測定對象的氧化電流被一起測定，因此測定精度變差。
[0013]因此，以往對生物傳感器500設有使用期限，超過使用期限而被長期保存的生物傳感器500因測定精度變差而被廢棄，在試樣中含有的測定對象物質(zhì)的測定中，導致運行成本的增加。如上所述，以往，對于親水性高分子對介體產(chǎn)生的影響沒有進行充分的研究。
[0014]本發(fā)明是鑒于上述課題而進行的，其目的是提供一種通過使酶層和介體層分別含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子而能夠簡單地制造可長期保存的生物傳感器的技術。
[0015]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的生物傳感器的特征在于，具備:電極層，在絕緣性基板的一面設有含有工作電極和對電極的電極系；隔離層，形成有狹縫且被層疊于上述電極層的上述一面，上述狹縫被配置于上述工作電極和上述對電極的前端側(cè)；腔部，由上述電極層和上述狹縫形成而供給試樣；覆蓋層，形成與上述腔部連通的空氣孔，被覆上述腔部且被層疊于上述隔離層；以及反應層，被設置于在上述腔部露出的上述工作電極和上述對電極的前端側(cè)，在該生物傳感器的制造方法中具備反應層形成工序，該反應層形成工序具有如下工序:酶層形成工序，形成含有與測定對象物質(zhì)反應的酶和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的酶層；和介體層形成工序，形成含有介體和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的介體層(技術方案I)。
[0016]在這樣構成的發(fā)明中，在由隔離層的狹縫形成的腔部露出的工作電極和對電極的前端側(cè)設置的反應層由反應層形成工序形成，該反應層形成工序具有如下工序:酶層形成工序，形成含有與測定對象物質(zhì)反應的酶和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的酶層；和介體層形成工序，形成含有介體和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的介體層。因此，酶層和介體層在被設置于電極層的工作電極和對電極的前端側(cè)一起形成為反應層，所以不需要像以往那樣將酶層和介體層分別形成于各覆蓋層和電極層，能夠簡單地形成反應層。
[0017]另外，通過形成含有酶和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的酶層和含有介體和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的介體層，從而酶層中含有的酶和介體層中含有的介體的周圍被不具有氧原子雙鍵的親水性高分子包圍，并且在氧和介體被分離的狀態(tài)下形成反應層。本申請發(fā)明人經(jīng)過深入研究，結(jié)果認為當親水性高分子具有氧原子雙鍵時，具有氧結(jié)合的雙鍵的官能團通過對介體進行親核攻擊而將介體還原，因此如果這樣構成，則成為酶和介體的周圍被不具有氧原子雙鍵的親水性高分子包圍的狀態(tài)，能夠防止在生物傳感器的保存狀態(tài)下反應層中含有的介體與酶接觸，并且能夠抑制介體被親水性高分子還原。
[0018]因此，通過采用本試劑結(jié)構，能夠簡單地制造可長期保存的生物傳感器。
[0019]另外，在形成酶層之后形成介體層，酶層被配置在更靠近電極層的位置。由于酶的擴散速度小于介體，所以與酶被層疊于介體上的情況相比，電極附近的酶.介體量更多，傳感器的響應性和測定精度提高。
[0020]另外，上述反應層形成工序優(yōu)選進一步具有第I中間層形成工序，該第I中間層形成工序在上述酶層形成工序之后且在上述介體層形成工序之前實行，形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的第I中間層(技術方案2)。
[0021]如果這樣構成，則在酶層與介體層之間，利用第I中間層形成工序形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的第I中間層，所以利用第I中間層可進一步防止酶層中含有的酶與介體層中含有的介體接觸，因此能夠進一步抑制酶層中含有的酶與介體層中含有的介體反應。
[0022]另外，上述反應層形成工序優(yōu)選進一步具有親水層形成工序，該親水層形成工序在上述酶層形成工序之前實行，形成含有具有氧原子雙鍵的親水性高分子的親水層(技術方案3)。
[0023]如果這樣構成，則在形成酶層之前，利用親水層形成工序形成含有具有氧原子雙鍵的親水性高分子的親水層，但通常具有氧原子雙鍵的親水性高分子與不具有氧原子雙鍵的親水性高分子相比，阻止血細胞等的移動的效果高。因此，由于在被設置于電極層的親水層中含有具有氧原子雙鍵的親水性高分子，所以例如血液試樣被供給至生物傳感器的腔部時，血液試樣被親水層的親水性高分子高效率地過濾而阻止血液試樣中含有的血細胞的移動，因此能夠減少與血液試樣的紅細胞比容值的差異伴隨的對測定精度產(chǎn)生的影響。因此，能夠提供準確且可靠性高的生物傳感器。
[0024]另外，上述反應層形成工序優(yōu)選進一步具有第2中間層形成工序，該第2中間層形成工序在上述親水層形成工序之后且在上述酶層形成工序之前實行，形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的第2中間層(技術方案4)。
[0025]如果這樣構成，則在親水層與酶層之間，利用第2中間層形成工序形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的第2中間層，所以利用第2中間層可防止親水層中含有的具有氧原子雙鍵的親水性高分子與介體層中含有的介體接觸，因此能夠進一步抑制介體層中含有的介體被親水層的親水性高分子還原。
[0026]另外，上述不具有氧原子雙鍵的親水性高分子優(yōu)選含有羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇中的至少一種(技術方案5)。
[0027]如果這樣構成，則通過在試劑層中含有羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇中的至少一種作為不具有氧原子雙鍵的親水性高分子，能夠防止試劑層中含有的介體被還原，并且能夠防止試劑層從親水層剝離，因此能夠提供實用構成的生物傳感器。
[0028]另外，上述具有氧原子雙鍵的親水性高分子優(yōu)選至少含有羧甲基纖維素(技術方案6)。
[0029]如果這樣構成，則通過在電極層上設置至少含有羧甲基纖維素作為具有氧原子雙鍵的親水性高分子的親水層，能夠防止被層疊于親水層的試劑層發(fā)生剝離。另外，例如血液試樣被供給至生物傳感器的腔部時，血液試樣被親水層的親水性高分子過濾而阻止血液試樣中含有的血細胞的移動，因此能夠減少與血液試樣的紅細胞比容值的差異伴隨的對測定精度產(chǎn)生的影響。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，由于酶層和介體層在被設置于電極層的工作電極和對電極的前端側(cè)一起形成為反應層，所以不需要像以往那樣將酶層和介體層分別單獨地形成于各覆蓋層和電極層，能夠簡單地形成反應層，通過使酶層和介體層分別含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子，能夠抑制在保存狀態(tài)下酶層中含有的酶與介體層中含有的介體接觸，抑制介體層的介體被還原，因此能夠簡單地制造可長期保存的生物傳感器。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是表示本發(fā)明的第I實施方式涉及的生物傳感器的圖，圖1(a)是分解立體圖，圖1 (b)是立體圖。
[0032]圖2是圖1的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。
[0033]圖3是表示本發(fā)明的第I實施方式涉及的生物傳感器的制造方法的圖，圖3(a)、(b)分別表示不同的工序。
[0034]圖4是表示生物傳感器的保存期間與背景電流的關系的圖。
[0035]圖5是本發(fā)明的第2實施方式涉及的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。
[0036]圖6是本發(fā)明的第3實施方式涉及的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。
[0037]圖7是生物傳感器的變型例的腔部部分的橫截面圖。
[0038]圖8是本發(fā)明的第4實施方式涉及的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。
[0039]圖9是生物傳感器的變型例的腔部部分的橫截面圖。
[0040]圖10是表示以往的生物傳感器的圖。

【具體實施方式】
[0041]<第I實施方式>
[0042]參照圖1?圖4對本發(fā)明的第I實施方式涉及的生物傳感器和該生物傳感器的制造方法進行說明。
[0043](生物傳感器的構成和制造方法)
[0044]圖1是表示本發(fā)明的第I實施方式涉及的生物傳感器的圖，圖1(a)是分解立體圖，圖1(b)是立體圖。圖2是圖1的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。圖3是表示本發(fā)明的第I實施方式涉及的生物傳感器的制造方法的圖，圖3(a)、(b)分別表示不同的工序。
[0045]本發(fā)明的生物傳感器100具有含有工作電極101和對電極102的電極系以及含有介體和與測定對象物質(zhì)反應的酶的反應層106，被安裝于測定器(省略圖示)而進行使用。SP，被供給至在安裝于測定器的生物傳感器100的前端側(cè)設置的腔部103的血液等試樣中含有的葡萄糖等的測定對象物質(zhì)與被設置于生物傳感器100的反應層106發(fā)生反應而生成還原物質(zhì)，通過在工作電極101與對電極102之間施加電壓而對生成的還原物質(zhì)進行氧化而得到氧化電流，計量該氧化電流，由此進行試樣中含有的測定對象物質(zhì)的定量。
[0046]S卩，如圖1和圖2所示，生物傳感器100是以下部件在設有試樣導入口 103a的前端側(cè)整齊的狀態(tài)下層疊并粘接而形成的，上述部件如下:電極層110，由陶瓷、玻璃、塑料、紙、生物降解性材料、聚對苯二甲酸乙二醇酯等絕緣性材料形成，設有含有工作電極101和對電極102的電極系；覆蓋層130，形成與腔部103連通的空氣孔105 ;隔離層120，形成有用于形成腔部103的狹縫104，且被電極層110和覆蓋層130夾持地配置。另外，在工作電極101和對電極102上設有反應層106，該反應層106含有與試樣中含有的葡萄糖等測定對象物質(zhì)反應的酶。而且，通過從后端側(cè)被插入到測定器的規(guī)定的插入口而進行安裝，從而生物傳感器100被安裝于測定器。
[0047]在該實施方式中，電極層110由絕緣性基板形成，該絕緣性基板由聚對苯二甲酸乙二醇酯等絕緣性材料構成。另外，在形成電極層110的絕緣性基板的一面利用網(wǎng)版印刷、濺射蒸鍍法形成有由鉬、金、鈀等貴金屬或碳、銅、鋁、鈦、ΙΤ0, ZnO等導電性物質(zhì)構成的導電層。而且，通過對形成于絕緣性基板的一面的導電層實施利用激光加工或光刻法進行的圖案形成，從而形成電極系，該電極系含有工作電極101和對電極102以及電極圖案101a、102a，該電極圖案101a、102a在生物傳感器傳感器芯片100被安裝于測定器時，使工作電極101和對電極102分別與測定器電連接。
[0048]另外，工作電極101和對電極102以各自的前端側(cè)在腔部103中露出的方式配置。另外，工作電極101和對電極102各自的后端側(cè)的電極圖案101a、102a延伸至與試樣導入口 103a相反一側(cè)的電極層110的邊緣、即未層疊隔離層120的電極層110的邊緣而形成。
[0049]接下來，在如上所述形成的電極層110上層疊隔離層120。隔離層120由基板形成，該基板由聚對苯二甲酸乙二醇酯等絕緣性材料構成，在基板的前端邊緣部的大致中央形成用于形成腔部103的狹縫104。而且，狹縫104被配置在工作電極101和對電極102的前端側(cè)，隔離層120以局部地被覆電極層110的一面的方式被層疊，由此由電極層110和狹縫104形成供給試樣的腔部103。
[0050]接著，利用等離子體對在電極層110層疊隔離層120而形成的腔部103部分進行清洗處理后，形成反應層106。應予說明，等離子體清洗工序中使用的等離子體可使用在利用氧等離子體、氮等離子體、氬等離子體等等離子體的金屬活化處理中使用的各種等離子體，可以是減壓等離子體也可以是大氣壓等離子體。
[0051]如圖3(a)、(b)所示，反應層106通過如下方式形成，即，在將覆蓋層130層疊于隔離層120之前，在腔部103中露出的工作電極101和對電極102的前端側(cè)依次滴加含有酶和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的試劑202以及含有介體和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的203。另外，為了順利地向腔部104供給血液等試樣，在腔部104內(nèi)壁涂布表面活性劑、磷脂質(zhì)等親水化劑。
[0052]具體而言,反應層106具備:酶層106b,位于電極層110上且含有酶和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子；和介體層106c，層疊于酶層106b且含有介體和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子，該反應層106利用反應層形成工序通過如下方式形成。
[0053]S卩，如圖3(a)所示，從滴加裝置200向腔部103中滴加規(guī)定量的含有酶和作為不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的甲基纖維素的試劑202并干燥，由此形成酶層106b (酶層形成工序)。接下來，如圖3(b)所示，從滴加裝置200向腔部103中滴加規(guī)定量的含有介體和作為不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的羥丙基甲基纖維素的試劑203并干燥，由此形成介體層106c (介體層形成工序)，從而形成反應層106。
[0054]如上所述，在該實施方式中，由酶層形成工序和介體層形成工序構成本發(fā)明的“反應層形成工序”。
[0055]另外，作為酶，可使用葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、膽固醇氧化酶、醇氧化酶、肌氨酸氧化酶、果糖胺氧化酶、丙酮酸氧化酶、葡萄糖脫氫酶、乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、羥丁酸脫氫酶、膽固醇酯酶、肌酐酶、肌酸酶、DNA聚合酶等，可根據(jù)要檢測的測定對象物質(zhì)(葡萄糖、乳酸、膽固醇、醇、肌氨酸、果糖胺、丙酮酸、羥丁酸等)選擇這些酶，從而形成各種傳感器。
[0056]例如，如果使用葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶，則可形成檢測血液試樣中的葡萄糖的葡萄糖傳感器，如果使用醇氧化酶或醇脫氫酶，則可形成檢測血液試樣中的乙醇的醇傳感器，如果使用乳酸氧化酶，則可形成檢測血液試樣中的乳酸的乳酸傳感器，如果使用膽固醇酯酶與膽固醇氧化酶的混合物，則可形成總膽固醇傳感器。
[0057]另外，作為介體，可使用鐵氰化鉀、二茂鐵、二茂鐵衍生物、苯醌、醌衍生物、鋨配合物、釕配合物等。
[0058]另外，作為不具有氧原子雙鍵的親水性高分子，可使用羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇等。應予說明，在各試劑202、203中，與酶和介體一起混合的不具有氧原子雙鍵的親水性高分子作為增粘劑而發(fā)揮功能。另外，不具有氧原子雙鍵的親水性高分子可以組合2種以上使用。
[0059]另外，作為親水化劑，可使用TritonXlOO (Sigma-Aldrich公司制),Tween20 (東京化成工業(yè)社制)、雙(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉等表面活性劑、卵磷脂等磷脂質(zhì)。親水化劑除了如上所述涂布于腔部104以外，也可以分別與試劑202、203混合而滴加于腔部104中，或者在形成試劑層之后滴加于腔部104中。另外，為了減少試樣中含有的離子濃度的偏差，可以設置磷酸等緩沖劑。
[0060]接下來，在腔部103形成反應層106之后，在隔離層120上層疊覆蓋層130，由此形成生物傳感器100，上述覆蓋層130由基板形成，該基板由聚對苯二甲酸乙二醇酯等絕緣性材料構成。如圖1(a)、(b)所示，在被層疊于隔離層120時，在覆蓋層130形成與腔部103連通的空氣孔105，覆蓋層130通過被覆腔部103而層疊于隔離層120。
[0061]應予說明，在該實施方式中，生物傳感器100是以進行血液中的葡萄糖的定量為目的而形成的，將反應層106設置于在腔部103中露出的工作電極101和對電極102的前端側(cè)，反應層106含有以FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)為輔酶的GDH(葡萄糖脫氫酶)(以下，標記為FAD-GDH)作為酶且含有鐵氰化鉀作為介體，上述酶與作為測定對象物質(zhì)的葡萄糖特異性反應，上述介體被由作為測定對象物的葡萄糖與FAD-GDH的反應生成的電子還原而成為還原物質(zhì)。
[0062]在這樣構成的生物傳感器100中，通過使由血液構成的試樣與前端的試樣導入口103a接觸，利用毛細管現(xiàn)象將試樣向空氣孔105吸引而將試樣供給至腔部103。而且，通過使反應層106溶解于被供給至腔部103的試樣，從而利用試樣中的作為測定對象物質(zhì)的葡萄糖與FAD-GDH的酶反應而釋放電子，鐵氰酸根離子被釋放的電子還原而生成作為還原物質(zhì)的亞鐵氰酸根離子。然后，在生物傳感器100的工作電極101與對電極102之間施加電壓(例如0.3V)，對由反應層106溶解于試樣所發(fā)生的氧化還原反應而生成的還原物質(zhì)進行電化學氧化，計量在工作電極101與對電極102之間流通的氧化電流，由此在測定器中進行試樣中的葡萄糖的定量。應予說明，在生物傳感器100的工作電極101與對電極102之間施加電壓后，計量3?5秒后的電流值作為氧化電流。
[0063](背景電流的比較例)
[0064]圖4是表示生物傳感器的保存期間與背景電流的關系的圖，橫軸表示保存期間(h)，縱軸表示背景電流的大小(PA)。另外，該圖中的?表示酶層106b和介體層106c不含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的以往的生物傳感器的背景電流，該圖中的.表示本實施方式的生物傳感器100的背景電流。應予說明，背景電流的測定通過將背景電流測定用的試樣供給至腔部103后，與通常的步驟同樣地計量氧化電流而進行。
[0065]如圖4所示，伴隨著生物傳感器的保存期間的延長，以往的生物傳感器中背景電流經(jīng)時增大，與此相對，本實施方式的生物傳感器100中，背景電流的增大被抑制。
[0066]如上所述，根據(jù)該實施方式，在由隔離層120的狹縫104形成的腔部103中露出的工作電極101和對電極102的前端側(cè)設置的反應層106利用反應層形成工序形成，該反應層形成工序具有如下工序:酶層形成工序，形成含有與作為測定對象物質(zhì)的葡萄糖反應的酶和不具有氧原子雙鍵的甲基纖維素的酶層106b ;和介體層形成工序，形成含有介體和不具有氧原子雙鍵的羥丙基甲基纖維素的介體層。因此，酶層106b和介體層106c在設置于電極層110的工作電極101和對電極102的前端側(cè)一起形成為反應層106，所以不需要像以往那樣將酶層106b和介體層106c分別形成于各覆蓋層130和電極層110，能夠簡單地形成反應層106。
[0067]另外，通過形成含有酶和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的酶層106b以及含有介體和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的介體層106c，從而酶層106b中含有的酶和介體層106c中含有的介體的周圍被不具有氧原子雙鍵的親水性高分子包圍，并且以氧和介體被分離的狀態(tài)形成反應層106。本申請發(fā)明人經(jīng)過深入研究，結(jié)果認為親水性高分子具有氧原子雙鍵時，具有氧結(jié)合的雙鍵的官能團通過對介體進行親核攻擊而將介體還原，因此如果這樣構成，則成為酶和介體的周圍被不具有氧原子雙鍵的親水性高分子包圍的狀態(tài)，因此能夠防止在生物傳感器100的保存狀態(tài)下反應層106中含有的介體與酶接觸，能夠抑制介體被親水性高分子還原。
[0068]因此，通過使酶層106b和介體層106c分別含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子，可抑制在保存狀態(tài)下酶層106b含有的酶與介體層106c含有的介體的反應，并且可抑制介體層106c的介體被還原，因此能夠簡單地制造可長期保存的生物傳感器。
[0069]另外，在形成酶層106b之后形成介體層106c，由于酶層106b被配置于更靠近電極層110的位置，所以當溶解于被供給至腔部103的試樣的介體向電極層110擴散時，作為酶反應的結(jié)果，因試樣中的葡萄糖等的測定對象物質(zhì)被氧化而釋放的電子通過豐富的酶層106b，因此向電極層110擴散的介體被高效率地還原，因而實用。
[0070]另外，通過在試劑層中含有羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇中的至少一種作為不具有氧原子雙鍵的親水性高分子，能夠防止試劑層中含有的介體被還原，并且能夠防止試劑層從電極層110或親水層106a剝離，因此能夠提供實用構成的生物傳感器110。
[0071]<第2實施方式>
[0072]參照圖5對本發(fā)明的第2實施方式涉及的生物傳感器的制造方法進行說明。圖5是本發(fā)明的第2實施方式涉及的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。該實施方式與上述第I實施方式的不同之處在于，如圖5所示，在酶層形成工序之后且在介體層形成工序之前實行的第I中間層形成工序中，向腔部103中滴加規(guī)定量的含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的試劑并干燥，由此在酶層106b在介體層106c之間進一步形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的中間層106d(第I中間層)。其它構成與上述第I實施方式相同，因此，其構成和動作的說明通過標記相同的符號而省略。
[0073]如果這樣構成，則在酶層106b與介體層106c之間，利用第I中間層形成工序形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的中間層106d，因此利用中間層106d可防止酶層106b中含有的酶與介體層106c中含有的介體接觸，因此能夠進一步抑制酶層106b中含有的酶與介體層106c中含有的介體發(fā)生反應。
[0074]〈第3實施方式〉
[0075]參照圖6對本發(fā)明的第3實施方式涉及的生物傳感器的制造方法進行說明。圖6是本發(fā)明的第3實施方式涉及的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。該實施方式與上述第I實施方式的不同之處在于，如圖6所示，在酶層形成工序之前實行的親水層形成工序中，向腔部103中滴加規(guī)定量的含有作為具有氧原子雙鍵的親水性高分子的羧甲基纖維素(CMC)的試劑并干燥，由此在形成酶層106b之前，在電極層110上形成親水層106a。其它構成與上述第I實施方式相同，因此，其構成和動作的說明通過標記相同的符號而省略。
[0076]如果這樣構成，則在形成酶層106b之前，利用親水層形成工序形成含有具有氧原子雙鍵的親水性高分子(CMC)的親水層106a，但通常，具有氧原子雙鍵的親水性高分子阻止血細胞等的移動的效果高于不具有氧原子雙鍵的親水性高分子。因此，由于在設置于電極層110的親水層106a中含有具有氧原子雙鍵的親水性高分子，所以例如血液試樣被供給至生物傳感器100的腔部103時，血液試樣被親水層106a的親水性高分子高效率地過濾而阻止血液試樣中含有的血細胞的移動，因此能夠減小與血液試樣的紅細胞比容值的差異伴隨的對測定精度產(chǎn)生的影響。
[0077]因此，能夠提供準確且可靠性高的生物傳感器100。另外，通過在電極層110上設置含有具有氧原子雙鍵的親水性高分子的親水層106a，能夠防止層疊于親水層106a的酶層106b發(fā)生剝離。
[0078]應予說明，作為具有氧原子雙鍵的親水性高分子，可使用具有羰基、?；?、羧基、醛基、橫基、橫酸基、亞諷基、甲苯橫酸基、硝基、亞硝基、酷基、麗基、稀麗基等的聚合物。另外，具有氧原子雙鍵的親水性高分子可以組合2種以上使用。
[0079]另外，如圖7的生物傳感器的變型例的腔部部分的橫截面圖所示，在圖5的生物傳感器100中，可以在形成酶層106b之前，利用親水層形成工序在電極層110上形成親水層106a。即使這樣構成也能夠起到相同的效果。
[0080]〈第4實施方式〉
[0081]參照圖8對本發(fā)明的第4實施方式涉及的生物傳感器的制造方法進行說明。圖8是本發(fā)明的第4實施方式涉及的生物傳感器的腔部部分的橫截面圖。該實施方式與上述第3實施方式的不同之處在于，如圖8所示，在親水層形成工序之后且在酶層形成工序之前實行的第2中間層形成工序中，向腔部103中滴加規(guī)定量的含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的試劑并干燥，由此在親水層106a與酶層106b之間進一步形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的中間層106d(第2中間層)。其它構成與上述第I實施方式相同，因此，其構成和動作的說明通過標記相同的符號而省略。
[0082]如果這樣構成，則在親水層106a與酶層106b之間，利用第2中間層形成工序形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的中間層106d，因此利用中間層106d可防止親水層106a中含有的具有氧原子雙鍵的親水性高分子與介體層106c中含有的介體接觸，因此能夠抑制介體層106c中含有的介體被親水層106a的親水性高分子還原。
[0083]另外，如圖9的生物傳感器的變型例的腔部部分的橫截面圖所示，在圖7的生物傳感器100中，可以在形成酶層106b之前，利用第2中間層形成工序在親水層106a上形成中間層106d。即使這樣構成也能夠起到相同的效果。
[0084]應予說明，本發(fā)明并不限定于上述實施方式，在不脫離其主旨的范圍內(nèi)，除上述方式以外還可進行各種變更，例如，通過將多種不具有氧原子雙鍵的親水性高分子組合并適當?shù)鼗旌?，能夠有效阻止血液試樣中的血細胞的移動，或者能夠減少酶層和介體層的擴散、混合而起到抑制介體的還原的抑制效果。
[0085]另外，也可以通過變更上述生物傳感器100的反應層106中含有的酶和介體的組合而形成乙醇傳感器、乳酸傳感器等。
[0086]另外，在上述實施方式中，生物傳感器100形成為具有工作電極101和對電極102的二極電極結(jié)構，但也可以通過進一步設置參比電極而將生物傳感器100形成為三極電極結(jié)構。此時，在將對電極102接地并利用電壓輸出部對參比電極施加參比電位的狀態(tài)下，對工作電極101施加以對電極102為基準的規(guī)定電位即可。
[0087]另外，在上述實施方式中，通過在工作電極101與對電極102之間施加規(guī)定電壓，并通過監(jiān)視在工作電極101與對電極102之間流通的電流來檢測腔部103中的血液試樣的供給，但也可以進一步設置用于檢測腔部103中的試樣的供給的檢測用電極。此時，通過在對電極102與檢測用電極之間施加規(guī)定電壓，并通過監(jiān)視在對電極102與檢測用電極之間流通的電流來檢測腔部103中的試樣的供給即可。
[0088]另外，優(yōu)選形成生物傳感器100的電極層110、隔離層120和覆蓋層130中的至少覆蓋層130由透明的部件形成，以能夠看到腔部103中的血液試樣的供給。
[0089]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0090]可將本發(fā)明廣泛應用于具備如下部件的生物傳感器:電極層，設有含有工作電極和對電極的電極系；隔離層，形成有用于形成腔部的狹縫且被層疊于電極層；覆蓋層，形成與腔部連通的空氣孔且被層疊于隔離層；以及反應層，設置于工作電極和對電極。
[0091]符號說明
[0092]100生物傳感器
[0093]101工作電極
[0094]102對電極
[0095]103 腔部
[0096]104 狹縫
[0097]105空氣孔
[0098]106反應層
[0099]106a 親水層
[0100]106b 酶層
[0101]106c 介體層
[0102]106d中間層(第I中間層、第2中間層)
[0103]110電極層
[0104]120隔離層
[0105]130覆蓋層
【權利要求】
1.一種生物傳感器的制造方法，其特征在于，所述生物傳感器具備: 電極層，在絕緣性基板的一面設有含有工作電極和對電極的電極系， 隔離層，形成有狹縫且被層疊于所述電極層的所述一面，所述狹縫被配置于所述工作電極和所述對電極的前端側(cè)， 腔部，由所述電極層和所述狹縫形成而供給試樣， 覆蓋層，形成與所述腔部連通的空氣孔，被覆所述腔部且被層疊于所述隔離層，以及 反應層，被設置于在所述腔部露出的所述工作電極和所述對電極的前端側(cè)； 所述生物傳感器的制造方法具備反應層形成工序，該反應層形成工序具備如下工序: 酶層形成工序，形成含有與測定對象物質(zhì)反應的酶和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的酶層，和 介體層形成工序，形成含有介體和不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的介體層。
2.根據(jù)權利要求1所述的生物傳感器的制造方法，其特征在于，所述反應層形成工序進一步具有第I中間層形成工序，該第I中間層形成工序在所述酶層形成工序之后且在所述介體層形成工序之前實行，形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的第I中間層。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的生物傳感器的制造方法，其特征在于，所述反應層形成工序進一步具有親水層形成工序，該親水層形成工序在所述酶層形成工序之前實行，形成含有具有氧原子雙鍵的親水性高分子的親水層。
4.根據(jù)權利要求3所述的生物傳感器的制造方法，其特征在于，所述反應層形成工序進一步具有第2中間層形成工序，該第2中間層形成工序在所述親水層形成工序之后且在所述酶層形成工序之前實行，形成含有不具有氧原子雙鍵的親水性高分子的第2中間層。
5.根據(jù)權利要求1?4中任一項所述的生物傳感器的制造方法，其特征在于，所述不具有氧原子雙鍵的親水性高分子含有羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇中的至少一種。
6.根據(jù)權利要求1?5中任一項所述的生物傳感器的制造方法，其特征在于，所述具有氧原子雙鍵的親水性高分子至少含有羧甲基纖維素。
【文檔編號】G01N27/327GK104169715SQ201380013703
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權日:2012年3月15日
【發(fā)明者】高木純, 大江秀明, 橫山憲二, 平塚淳典, 佐佐木典子 申請人:株式會社村田制作所