專利名稱：具有降低的nocr表達(dá)的改良細(xì)胞系及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之領(lǐng)域。其系關(guān)于核糖體RNA(rRNA)表達(dá)增加之生產(chǎn)宿主細(xì)胞系，該種增加系透過減少NoCR蛋白質(zhì)(尤其系TIP-5)表達(dá)而達(dá)成。該等細(xì)胞系具有比對照細(xì)胞系改善之分泌及生長特性。
背景技術(shù)：
篩選出哺乳動物高效生產(chǎn)者細(xì)胞系仍然為生物醫(yī)藥制造工業(yè)中之主要挑戰(zhàn)。自 DNA至產(chǎn)物翻譯之過程為限制哺乳動物生產(chǎn)細(xì)胞系之比生產(chǎn)率之主要瓶頸。細(xì)胞能夠上調(diào)蛋白質(zhì)合成速率，其系藉由增加已存在之核糖體之翻譯效力，或透過生成新的核糖體 (核糖體生物合成)而使翻譯能力增加。由于約80%之核轉(zhuǎn)錄總量系用于合成核糖體 RNA(rRNA)，因此核糖體生物合成為哺乳動物細(xì)胞之其中一種主要新陳代謝活動。核糖體組裝發(fā)生于核內(nèi)，且需要四種rRNA05S前rRNA，其隨后加工成18S、5. 8S、28S及5S rRNA)及約80種核糖體蛋白質(zhì)(r-蛋白質(zhì))之協(xié)同表達(dá)。45S前rRNA系于核內(nèi)由聚合酶I (Pol I) 轉(zhuǎn)錄，5S RNA系于核周邊由Pol III轉(zhuǎn)錄且隨后進(jìn)入核內(nèi)，且r-蛋白質(zhì)系由PolII轉(zhuǎn)錄。 因此，核糖體生物合成需要在不同隔室由不同聚合酶進(jìn)行一系列轉(zhuǎn)錄。哺乳動物細(xì)胞中之該等過禾呈大體上未知(Santoro,R.及Grummt,I. (2001). Molecular mechanisms mediating methyIation-dependent silencing of ribosomal gene transcription. Mol Cell 8, 719-725)。45S前rRNA之轉(zhuǎn)錄為核糖體生物合成之關(guān)鍵步驟。哺乳動物單倍體基因組包含約 200個核糖體RNA基因，其中僅一部份于任一指定時間轉(zhuǎn)錄，而其余則保持沉默(Santoro， R.，Li，J.，及 Grummt, I. (2002). The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet. 32，393-396)。可根據(jù)染色質(zhì)構(gòu)造區(qū)分活性及沉默基因活性基因具有常染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，而沉默基因為異染色質(zhì)的?；钚詒RNA基因之啟動子無CpG甲基化，且系與乙?；M蛋白相連。沉默基因則相反。轉(zhuǎn)錄沉默rRNA基因之存在為合成rRNA及產(chǎn)生核糖體之限制因素。已經(jīng)建立假說認(rèn)為細(xì)胞可藉由改變各基因之轉(zhuǎn)錄活性及/或藉由改變活性基因之?dāng)?shù)目而調(diào)節(jié)rDNA之轉(zhuǎn)錄水平。然而，在45S前rRNA合成水平與rRNA基因數(shù)目之間還未發(fā)現(xiàn)令人滿意的相關(guān)性。 例如，于釀酒酵母(S. cerevisiae)中，使rRNA基因數(shù)目減少約三分之二不影響總rRNA生成。類似地，含有不同rRNA拷貝數(shù)目之玉米自交系及非整倍體雞細(xì)胞顯示出相同的rRNA 轉(zhuǎn)錄水平。由于rDNA代表核糖體之主要組分，該等基因之沉默導(dǎo)致核糖體生物合成受到限制，且蛋白質(zhì)翻譯因此受到限制，故而最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少。于生物醫(yī)藥生產(chǎn)細(xì)胞中，其對細(xì)胞之完全生產(chǎn)能力構(gòu)成限制，其意指治療用蛋白質(zhì)產(chǎn)物之比生產(chǎn)率減少。因此會導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)工藝之總蛋白質(zhì)產(chǎn)量減少。除比生產(chǎn)率O^spec)以外之決定工藝產(chǎn)量(Y)之另一因素為IVC，即在產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)之時間內(nèi)的活細(xì)胞之積分值。該關(guān)系系由如下公式表示Y = PSTC。*IVC。因此，迫切需要增強宿主細(xì)胞之生產(chǎn)能力或藉由改善細(xì)胞生長而增加生物反應(yīng)器中之活細(xì)胞密度，或最理想地，同時提高這兩個參數(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明解決上述問題，且顯示敲低TIP_5(NoRC (核仁重建復(fù)合物；McStay，B.及 Grummt, I. (2008). The epigenetics of rRNA genes from molecular to chromosome biology. Annu. Rev Cell Dev. Biol 24，131-157)之亞單位)可減少沉默rRNA基因之?dāng)?shù)目， 上調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)核糖體合成，并增加重組蛋白質(zhì)之生成。 本申請中之?dāng)?shù)據(jù)證實，能夠轉(zhuǎn)錄之rRNA基因之?dāng)?shù)目限制核糖體合成。后生遺傳工程處理核糖體RNA基因，為改善生物醫(yī)藥制造提供新的可能性，且提供了解主導(dǎo)翻譯機制之復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)之新觀點。本申請顯示，敲低TIP-5可誘發(fā)rDNA重復(fù)序列上之抑制性染色質(zhì)標(biāo)記喪失，促進(jìn) rDNA轉(zhuǎn)錄，改變核結(jié)構(gòu)，且促進(jìn)細(xì)胞生長及增殖。為確定活性rRNA基因之?dāng)?shù)目增加是否會影響細(xì)胞生長及增殖，我們藉由流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析數(shù)種shRNA-TIP5細(xì)胞。我們于本申請中首次令人驚奇地顯示，經(jīng)工程處理使沉默rRNA基因數(shù)目減少能與rRNA及核糖體之生產(chǎn)增加，且因此與哺乳動物細(xì)胞之生產(chǎn)力提高相關(guān)。出人意料地，本申請還提供數(shù)據(jù)顯示，于不同哺乳動物細(xì)胞系中敲低TIP-5均導(dǎo)致細(xì)胞周期行進(jìn)加快且促進(jìn)細(xì)胞增殖。此發(fā)現(xiàn)系與先前技術(shù)(W02009/017670)中所述者相反。先前技術(shù)曾判定TIP-5 之功能為在全面miRNA篩選中作為Fas的由Ras介導(dǎo)之后生遺傳沉默效應(yīng)器(RESE) (W02009/017670)。已知Ras為參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤生成之致癌基因，其在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變或過表達(dá)。因此，先前技術(shù)認(rèn)為，減少諸如TIP-5之Ras效應(yīng)器的表達(dá)導(dǎo)致抑制細(xì)胞增殖。為了確認(rèn)此點，我們藉由流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析兩種shRNA_TIP5細(xì)胞。然而，如圖4A、B所示，shRNA-TIP-5細(xì)胞中處于S期之shRNA_TIP_5細(xì)胞的數(shù)目顯著高于對照細(xì)胞。 與該等結(jié)果一致，shRNA TIP5細(xì)胞中顯示，摻入至新生DNA的5-溴去氧尿苷(BrdU)增加， 且細(xì)胞周期蛋白A水平更高(圖4C)。此外，我們已比較shRNA-TIP5細(xì)胞、shRNA-對照細(xì)胞及親本NIH3T3及CH0-K1 細(xì)胞之間細(xì)胞增殖速率(圖4D、F)。令人驚奇地出現(xiàn)與先前技術(shù)報導(dǎo)相反之結(jié)果，即表達(dá) miRNA-TIP5序列的NIH/3T3及CH0-K1細(xì)胞的增殖速率皆比對照細(xì)胞更快。因此，沉默rRNA 基因數(shù)目減少確實影響細(xì)胞之新陳代謝。令人驚奇地，本發(fā)明顯示，消減TIP5且因此導(dǎo)致 rDNA沉默降低，可加強細(xì)胞增殖。本申請證實，消減TIP5之細(xì)胞中之蛋白質(zhì)生成顯著高于對照細(xì)胞系(參見實施例 6，圖6)。消減TIP5之細(xì)胞中之蛋白質(zhì)生成比對照細(xì)胞系高2倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高6倍以上、高10倍以上、在2-10倍之間。該等數(shù)據(jù)顯示，消減TIP5會增加異源性蛋白質(zhì)生成。本申請顯示，減少沉默rRNA基因數(shù)目會促進(jìn)核糖體合成，并提高細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)之潛力。于本發(fā)明中，我們提供一種藉由減少TIP-5而促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄、核糖體生物合成及翻譯的新穎方法，其效益為最終促進(jìn)重組蛋白質(zhì)分泌。
此外，我們證實，TIP-5消減導(dǎo)致細(xì)胞周期行進(jìn)加快，且改善細(xì)胞生長。改善細(xì)胞生長對生物醫(yī)藥生產(chǎn)工藝之許多方面具有深遠(yuǎn)影響-細(xì)胞生成時間縮短，導(dǎo)致細(xì)胞系開發(fā)之時間線縮短。生成時間較佳少于M小時， 較佳20至M小時，更佳15至M小時或15至22小時，最佳10至M小時。-單細(xì)胞克隆之后之效力增加，且此后之生長更快速。-擴大規(guī)模期間之時間范圍縮短，尤其于大規(guī)模生物反應(yīng)器中接種體的情況。-由于IVC與產(chǎn)量之間具有成比例之相關(guān)性，隨每單位發(fā)酵時間之產(chǎn)量增加。相反，小的IVC導(dǎo)致產(chǎn)量較小及/或發(fā)酵時間較長。產(chǎn)量較佳增加10%，更佳增加20%，最佳增加30%。此舉使得基于真核細(xì)胞之生產(chǎn)工藝的蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加。因此，降低該等工藝之生產(chǎn)成本，且同時使為了產(chǎn)生供研究、診斷、臨床研究或市場供應(yīng)治療用蛋白質(zhì)所需材料而需制造的生產(chǎn)批數(shù)減少。此外，本發(fā)明加快藥物開發(fā)，因為產(chǎn)生供臨床前研究之足量材料通常成為與時間線相關(guān)之一套重要工作。本發(fā)明可用于改善所有用于產(chǎn)生一種或數(shù)種特定蛋白質(zhì)之真核細(xì)胞之性質(zhì)，該等蛋白質(zhì)系供診斷目的、研究目的(標(biāo)靶鑒定、先導(dǎo)鑒定、先導(dǎo)優(yōu)化)、或供制造用于出售或臨床開發(fā)之治療用蛋白質(zhì)。由本發(fā)明提供之細(xì)胞系/宿主細(xì)胞有助于增加基于真核細(xì)胞之生產(chǎn)工藝的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。其降低該等工藝之生產(chǎn)成本，且同時減少為了產(chǎn)生供研究、診斷、臨床研究或市場供應(yīng)治療用蛋白質(zhì)所需要產(chǎn)生之材料而需制造之生產(chǎn)批數(shù)。此外，本發(fā)明加快藥物開發(fā)，因為產(chǎn)生供臨床前研究之足量材料通常成為與時間
線相關(guān)之一套重要工作。TIP-5表達(dá)減少之優(yōu)化宿主細(xì)胞系可用于產(chǎn)生一種或多種特定蛋白質(zhì)，供用于診斷目的、研究目的(標(biāo)靶鑒定、先導(dǎo)鑒定、先導(dǎo)優(yōu)化)，或用于制造供出售或臨床開發(fā)之治療用蛋白質(zhì)。其同樣可應(yīng)用于表達(dá)或產(chǎn)生共享相同分泌途徑且同樣于脂質(zhì)囊泡中運送的分泌型或膜結(jié)合型蛋白質(zhì)，諸如表面受體、GPCR、金屬蛋白酶或受體激酶。該等蛋白質(zhì)隨后可用于研究目的，其致力于細(xì)胞表面受體之功能特征，例如用于產(chǎn)生及隨后純化、結(jié)晶及/或分析表面蛋白質(zhì)。其對開發(fā)新穎之人類藥物療法非常重要，因為細(xì)胞表面受體為主要類型之藥物標(biāo)靶。此外，其有利于研究與細(xì)胞表面受體相關(guān)之細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)復(fù)合物，或分析部分藉由可溶性生長因子與其在相同細(xì)胞或另一細(xì)胞上之對應(yīng)受體的相互作用所介導(dǎo)之細(xì)胞-細(xì)胞-交流(communication)。


圖1 于嚙齒動物及人類細(xì)胞系中敲低TIP-5(A、B)針對(A)穩(wěn)定表達(dá) shRNA-TIP5-l 及 TIP5-2 序列之 NIH/3T3 細(xì)胞中及(B) 穩(wěn)定表達(dá)miRNA-TIP5-l及TIP5-2序列之HEI^93T細(xì)胞中之TIP5mRNA所進(jìn)行之qRT-PCR。 數(shù)據(jù)系針對GAPDH mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。1(c)針對穩(wěn)定之 shRNA-TIP5-l/2NIH/3T3、miRNA-TIP5-l/2HEI^93T 及 miRNA-TIP5-l/2CH0-Kl 細(xì)胞中之 TIP5mRNA 所進(jìn)行之半定量 RT-PCR。出示 GAPDH mRNA 之qRT-PCR作為對照。圖2 敲低TIP-5導(dǎo)致rDNA甲基化減少(A-C)消減TIP5使rDNA啟動子之CpG甲基化減少。上圖包括所分析之HpaII (H) 位點的㈧小鼠、(B)人類及(C)中國倉鼠之rDNA啟動子區(qū)域的圖。黑色圓點指示CpG 二核苷酸。箭頭表示用于擴增被HpaII消化之DNA的引物。下圖于穩(wěn)定表達(dá)shRNA-及/或miRNA TIP5-1/2及對照序列的(A)NIH/3T3、⑶ HEK293T及(C)CHO-Kl細(xì)胞中所測定rDNA CpG甲基化水平。數(shù)據(jù)表示HpaII抗性rDNA之量，其已利用涵蓋缺少HpaII位點之DNA序列之引物及未消化之DNA進(jìn)行擴增，計算總rDNA 量來標(biāo)準(zhǔn)化。(D、E)消減TIP5減少rDNA CpG甲基化水平。分析(D)rDNA基因間及啟動子區(qū)域，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(+1)，及(E)編碼區(qū)內(nèi)之兩個區(qū)域。圖示代表單個小鼠rDNA重復(fù)序列及所分析之HpaII (H)位點。箭頭表示用于擴增被HpaII消化之DNA的引物。數(shù)據(jù)表示 HpaII抗性rDNA之量，其已利用涵蓋缺少HpaII位點之DNA序列之引物及未消化之DNA進(jìn)行擴增，計算總rDNA來標(biāo)準(zhǔn)化。圖3 敲低TIP-5之細(xì)胞中之rRNA水平增加(A)消減TIP5促進(jìn)rRNA合成。穩(wěn)定之NIH/3T3及HEK293T細(xì)胞系中基于qRT-PCR 之45S前rRNA水平已針對GAPDH mRNA水平標(biāo)準(zhǔn)化。(B)經(jīng)過相同暴露時間之后，于原位摻入BrUTP，檢測rDNA轉(zhuǎn)錄。于消減TIP-5之細(xì)胞中BrUTP信號(左圖)較強，且可于核中特異性檢測到(由相差影像(右圖)所示核內(nèi)之較暗區(qū)域)。圖4 消減TIP-5導(dǎo)致促進(jìn)增殖及細(xì)胞生長(A) shRNA TIP5 細(xì)胞之 FACS 分析(B)處于各細(xì)胞周期階段之細(xì)胞百分比。于消減TIP5之細(xì)胞中，處于S期之細(xì)胞的數(shù)目或百分比增加，而處于Gl期之細(xì)胞的數(shù)目或百分比減少。增殖加強。(C) BrdU摻入測定法。細(xì)胞與10 μ M BrdU 一起溫育30min，利用針對BrdU之抗體染色，并估測處于S期之細(xì)胞百分比。BrdU測定法顯示TIP5細(xì)胞中之DNA合成增加。(D-F)穩(wěn)定表達(dá) miRNA-TIP5 及對照序列之(D)NIH/3T3、(E)HEK293T 及(F) CHO-Kl細(xì)胞的生長曲線。生長曲線證實，消減TIP-5之細(xì)胞之生長至少與對照細(xì)胞一樣快 (HEK293)，或甚至比對照細(xì)胞更快(NIH3T3及CH0-K1)。圖5 敲低TIP-5之細(xì)胞的核糖體分析(A-C) (A)穩(wěn)定之 NIH/3T3、(B)HEK293T 及(C)CHO-Kl 細(xì)胞中之細(xì)胞質(zhì) RNA/ 細(xì)胞的相對量。數(shù)據(jù)表示一式三份進(jìn)行之兩次實驗的平均值。(D)穩(wěn)定之HEK293T的核糖體曲線及(E)CHO-Kl 細(xì)胞系。敲低TIP5之細(xì)胞含有更多核糖體。圖6 敲低TIP-5導(dǎo)致促進(jìn)產(chǎn)生受體蛋白質(zhì)(A-C)經(jīng)組成性SEAP表達(dá)載體pCAG_SEAP工程處理之(A)穩(wěn)定之NIH/3T3、(B) HEK293T及(C)CHO-Kl細(xì)胞系的SEAP表達(dá)。(D、E)經(jīng)組成性螢光素酶表達(dá)載體pCMV-螢光素酶工程處理之⑶穩(wěn)定之NIH/3T3及(E)HEK293T細(xì)胞系的螢光素酶表達(dá)。發(fā)明詳述TIP-5 之敲低為了工程處理細(xì)胞，使其增加合成重組蛋白質(zhì)，我們需決定減少沉默rRNA基因數(shù)目是否會增加45S前rRNA合成，且因此亦刺激核糖體生物合成，并增加能夠翻譯之核糖體之?dāng)?shù)目。因此，我們利用特異針對TIP5之兩個不同區(qū)域(TIP5-1及TIP5D之shRNA/miRNA 序列進(jìn)行RNA干擾，敲低TIP5表達(dá)，并構(gòu)建經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因之表達(dá)shRNA之NIH/3T3或表達(dá) miRNA之HEK293T及CHO-Kl。使用表達(dá)混合shRNA及miRNA序列之穩(wěn)定細(xì)胞系作為對照。 利用表達(dá)shRNA-TIP5或miRNA-TIP5序列之質(zhì)粒產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞系而不是進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染有兩個理由。第一，諸如CpG甲基化之抑制性后生遺傳學(xué)標(biāo)記之喪失為一種被動機制，需要多次細(xì)胞分裂。第二，雖然可相對容易地轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，但是NIH/3T3及CHO-Kl細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效力差會妨礙隨后針對內(nèi)源性rRNA、核糖體水平及細(xì)胞生長性質(zhì)之分析。為了確定所選擇克隆中敲低TIP5之效力，我們藉由逆轉(zhuǎn)錄酶所介導(dǎo)定量性及半定量性PCR測定TIP5mRNA 水平(圖1)。與對照細(xì)胞比較，NIH/3T3/shRNA-TIP5-l及-2細(xì)胞中之TIP5表達(dá)減少約 70-80% (圖1A)。在穩(wěn)定之HEK293T中，觀察到類似的TIP5mRNA水平減少(圖1B)。僅可由半定量性PCR測得衍生自CHO-Kl之細(xì)胞中之TIP5mRNA水平(圖1C)，但其TIP5mRNA之減少類似穩(wěn)定之NIH/3T3及HEK293T細(xì)胞的。該等結(jié)果證實，經(jīng)建立之細(xì)胞系含有低水平之 TIP5。敲低TIP-5導(dǎo)致rDNA甲基化減少小鼠rDNA啟動子的CpG甲基化減少基本轉(zhuǎn)錄因子UBF之結(jié)合，且防止形成起始前復(fù)合物(Sani j, Ε. , Poortinga, G. , Sharkey, K. , Hung, S. , Holloway, Τ. P. , Quin, J. , Robb, Ε. , Wong, L. H. , Thomas, W. G. , Stefanovsky, V. , Moss, T. , RothbIum, L. , Hannan, K. Μ., McArthur,G. A. ,Pearson, R. B. ,^HannanjR. D. (2008). UBF levels determine the number of active ribosome RNA genes in mammals. J. Cell Biol 183,1259—1274)。于 NIH/3T3 細(xì)胞中，約40%至50%之rRNA基因含有CpG-甲基化序列，且呈轉(zhuǎn)錄沉默。人類、小鼠及中國倉鼠中之rDNA啟動子之序列及CpG密度差異顯著。人類之rDNA啟動子含有23個CpG， 而小鼠及中國倉鼠分別含有3個及8個CpG (圖2A-C)。為了證實敲低TIP5可影響rDNA沉默，我們測定CCGG序列中之meCpG量，以判定rDNA甲基化水平。以HpaII消化基因組DNA， 且利用涵蓋HpaII序列(CCGG)之引物進(jìn)行定量性實時PCR，測定對消化之抗性(亦即CpG 甲基化)。在所有敲低TIP5之細(xì)胞系中，大部份rRNA基因中之啟動子區(qū)域內(nèi)之CpG甲基化減少，證實TIP5對促進(jìn)rDNA沉默具有關(guān)鍵作用(圖2)。 注意，雖然TIP5結(jié)合及重新甲基化局限于rDNA啟動子序列內(nèi)，但是TIP-5減少之 NIH3T3細(xì)胞的整個rDNA基因(基因間、啟動子及編碼區(qū)域；圖2D、E)的CpG甲基化量均減少，說明一旦TIP5與rDNA啟動子結(jié)合，其即啟動在整個rDNA基因座建立沉默后生遺傳標(biāo)記的傳播機制。敲低TIP-5之細(xì)胞中之rRNA水平增加為了判定沉默基因數(shù)目之減少是否會影響rRNA轉(zhuǎn)錄物之量，我們藉由使用涵蓋第一 rRNA加工位點之引物之qRT-PCR(圖3A)且藉由活體內(nèi)BrUTP摻入(圖，測定45S 前rRNA合成。在兩個分析中皆測得，消減TIP5之NIH/3T3及HEK293T細(xì)胞的rRNA產(chǎn)生皆比對照細(xì)胞系高。消減TIP-5導(dǎo)致促進(jìn)增殖及細(xì)胞生長已知Ras為涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤形成之致癌基因，其在人類癌癥中經(jīng)常發(fā)生突變或過表達(dá)。Green等人，在W02009/017670中記載已鑒定TIP-5之功能為在全面miRNA篩選中作為Fas之由Ras所介導(dǎo)后生遺傳沉默效應(yīng)器(RESE)。該出版物記載，減少諸如TIP-5 之Ras效應(yīng)器之表達(dá)導(dǎo)致抑制細(xì)胞增殖。我們已藉由流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析兩種shRNA_TIP5細(xì)胞。如圖4A、B所示，兩種 shRNA-TIP5細(xì)胞中處于S期之細(xì)胞數(shù)目顯著高于對照細(xì)胞。NIH3T3細(xì)胞在感染逆轉(zhuǎn)錄病毒 (其表達(dá)針對TIP5序列之miRNA) 10天后，獲得類似曲線。與該等結(jié)果一致，shRNA TIP5細(xì)胞顯示，新生DNA的5-溴脫氧尿苷(BrdU)摻入增加，且細(xì)胞周期蛋白A水平較高(圖4C)。最后，我們比較shRNA-TIP5、shRNA-對照及親本 NIH3T3、HEK293 及 CHO-Kl 細(xì)胞之細(xì)胞增殖速率(圖4D-F)。令人驚奇地，與先前技術(shù)報導(dǎo)相反，表達(dá)miRNA-TIP5序列之 NIH/3T3及CHO-Kl細(xì)胞二者的增殖速率比對照細(xì)胞快，說明沉默rRNA基因數(shù)目之減少確實影響細(xì)胞新陳代謝。HEK293T中之TIP5消減并未顯著影響細(xì)胞增殖，此系因為該等細(xì)胞已到達(dá)彼等之最大增殖速率。令人驚奇地，該等數(shù)據(jù)顯示，TIP5消減及隨之rDNA沉默之減少會加快細(xì)胞增殖。敲低TIP-5之細(xì)胞之核糖體分析于哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中，蛋白質(zhì)合成速率為與產(chǎn)量直接相關(guān)的重要參數(shù)。為了確定TIP5消減及隨之rDNA沉默之減少是否會增加細(xì)胞中能夠翻譯之核糖體之?dāng)?shù)目，我們首先測定細(xì)胞質(zhì)rRNA水平。在細(xì)胞質(zhì)中，大多數(shù)RNA系由組裝成核糖體之經(jīng)加工rRNA組成。 如圖5A-C所示，所有消減TIP5之細(xì)胞系中之每一個細(xì)胞均含有更多之細(xì)胞質(zhì)RNA，說明該等細(xì)胞會產(chǎn)生更多核糖體。多核糖體曲線之分析亦顯示，消減TIP5之HEK293及CHO-Kl細(xì)胞所含有之核糖體亞單位G0S、60S及80 比對照細(xì)胞更多(圖5D)。敲低TIP-5促進(jìn)產(chǎn)生受體蛋白質(zhì)為了確定消減TIP5及減少rDNA沉默是否會促進(jìn)異源性蛋白質(zhì)產(chǎn)生，我們以促進(jìn)組成性表達(dá)人類胎盤分泌之堿性磷酸酶SEAP(pCAG-SEAP;圖6A-C)或螢光素酶(pCMV-螢光素酶；圖6D、Ε)之表達(dá)載體轉(zhuǎn)染穩(wěn)定之消減ΤΙΡ5之ΝΙΗ/3Τ3、ΗΕΚ293Τ及CHO-Kl衍生物。4 之后，定量蛋白質(zhì)生成，發(fā)現(xiàn)消減TIP5之細(xì)胞中之SEAP及螢光素酶生成皆比對照細(xì)胞系多二至四倍，說明消減TIP5使異源性蛋白質(zhì)生成增加。所有該等結(jié)果說明，減少沉默rRNA基因數(shù)目會促進(jìn)核糖體合成，并增強細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)之潛力。敲除TIP5增加單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-I)之生物醫(yī)藥生成，并增加治療性抗體之生成a)以空載體(模擬對照)或設(shè)計用于敲低TIP-5表達(dá)之小型RNA (shRNA或RNAi) 轉(zhuǎn)染會分泌單核細(xì)胞趨化蛋白I(MCP-I)或治療性抗體之CHO細(xì)胞系(CHO DG44)。于TIP-5 消減效率最高之細(xì)胞群中觀察到最高之MCP-I滴度，而在模擬轉(zhuǎn)染之細(xì)胞或親本細(xì)胞系中，蛋白質(zhì)濃度顯著更低。b)首先以短RNA序列(shRNA或RNAi)轉(zhuǎn)染CHO宿主細(xì)胞(CHO DG44)，以減少 TIP-5表達(dá)，且產(chǎn)生穩(wěn)定之消減TIP-5宿主細(xì)胞系。隨后以編碼作為感興趣基因之單核細(xì)胞趨化蛋白I(MCP-I)或治療性抗體之載體轉(zhuǎn)染該等細(xì)胞系及平行之CHO DG44野生型細(xì)胞。于TIP-5消減效率最高之細(xì)胞群中觀察到最高M(jìn)CP-I滴度及生產(chǎn)率，而模擬轉(zhuǎn)染之細(xì)胞或親本細(xì)胞系中之蛋白質(zhì)濃度顯著較低。c)當(dāng)以a)或b)中所述相同細(xì)胞進(jìn)行分批或補料-分批發(fā)酵時，總MCP-I滴度或抗體滴度之差異甚至更顯著因為經(jīng)減少表達(dá)之TIP-5轉(zhuǎn)染之細(xì)胞更快速生長，且每單位細(xì)胞及每單位時間亦產(chǎn)生更多蛋白質(zhì)，因此其在相同時間內(nèi)具有更高IVC且顯示更高生產(chǎn)率。兩種性質(zhì)皆正面影響總工藝產(chǎn)量。因此，消減Tip5之細(xì)胞具有顯著更高之MCP-I或抗體收獲滴度，且導(dǎo)致更高效率之生產(chǎn)工藝。消減SNF2H之細(xì)胞同樣具有顯著更高之IgG收獲滴度，且導(dǎo)致更高效率之生產(chǎn)工藝。敲除TIP-5基因可最高效促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄且促進(jìn)增殖產(chǎn)生具有恒定降低水平之TIP-5表達(dá)之改良生產(chǎn)宿主細(xì)胞系的最有效方法為完全敲除TIP-5基因。為此，可利用同源性重組或利用鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù)破壞TIP-5基因，防止其表達(dá)。由于CHO細(xì)胞之同源性重組效率不高，因此我們設(shè)計一種在TIP-5基因內(nèi)部引入雙鏈斷裂之ZFN，藉此破壞功能。為了控制有效敲除TIP-5，利用抗TIP-5抗體進(jìn)行 Western印跡。在膜上，敲除TIP-5之細(xì)胞不會檢測到TIP-5表達(dá)，而親本CHO細(xì)胞系則顯示對應(yīng)于TIP-5蛋白質(zhì)之清晰信號。隨后，分析敲除TIP-5之CHO細(xì)胞及親本CHO細(xì)胞系之rRNA轉(zhuǎn)錄。該測定法證實， 敲除TIP-5之細(xì)胞中之rRNA合成水平及核糖體數(shù)目皆高于親本細(xì)胞及僅減少TIP-5表達(dá)水平之細(xì)胞。此外，在補料-分批工藝中，消減TIP-5之細(xì)胞增殖比TIP5野生型細(xì)胞及其中僅藉由引入干擾RNA (諸如shRNA或RNAi)而減少TIP-5表達(dá)之細(xì)胞系更快速，且細(xì)胞數(shù)目更
尚ο一般實施方案“包括”或“包含”涵蓋更特定之實施方案“由...組成”。此外，單數(shù)及復(fù)數(shù)形式之使用方式?jīng)]有限制。本發(fā)明過程中所用之術(shù)語具有如下含意。術(shù)語“后生遺傳工程”意指影響染色質(zhì)之后生遺傳修飾，而不影響核酸序列。后生遺傳修飾包括組蛋白或DNA核苷酸之甲基化或乙?；淖?、及烷基化。于本發(fā)明中，“后生遺傳工程”主要系指DNA甲基化之工程處理。“NoRC” (核仁重建復(fù)合物)為rDNA沉默之關(guān)鍵決定物，且系由TIP-5 (TTF-1-相互作用蛋白質(zhì)5)及ATP酶SNF^1組成。NoRC系與沉默基因之rDNA啟動子結(jié)合，且透過組蛋白修飾及DNA甲基化活性抑制rDNA轉(zhuǎn)錄。“TIP-5”或“TIP5”(轉(zhuǎn)錄終止因子I(TTFl)-相互作用蛋白質(zhì)5)為大于200kD之核仁蛋白質(zhì)，且系藉由與DNA-甲基-轉(zhuǎn)移酶(DNMT)及組蛋白去乙?；?HDAC)及其它染色質(zhì)修飾因子相互作用，為rDNA募集組蛋白去乙?；富钚浴Ｆ渌x詞為BAZ2A、 WALp3、FLJ13768、FLJ13780、FLJ45876、KIAA0314 及 DKFZp781B109?！?SNF濁”屬于SWI/SNF蛋白質(zhì)家族成員，且具有解螺旋酶及ATP酶活性。SNF濁為 NoRC之組分，且參與核小體轉(zhuǎn)移成封閉之異染色質(zhì)狀態(tài)。SNF^i之官方名稱為SMARCA5 (表示與SWI/SNF相關(guān)，與基質(zhì)相連，染色質(zhì)之肌動蛋白依賴性調(diào)節(jié)劑、a子家族、第五個成員)。 其它名稱為 ISWI、hISWI、hSNF2H 及 WCRF135。
表述“減少核糖體RNA基因(rDNA)沉默”意指影響編碼核糖體RNA的DNA或該特定區(qū)域中之染色質(zhì)的甲基化及/或乙?；?，導(dǎo)致rRNA基因轉(zhuǎn)錄解除抑制。更特定言之， 于本發(fā)明中，該術(shù)語系指減少rRNA基因甲基化之方法，導(dǎo)致基因更易于獲得轉(zhuǎn)錄因子，且使相應(yīng)基因合成更多rRNA。文中之“rDNA沉默”明確言之系指rRNA基因沉默。其不包括不受NoRC所介導(dǎo)之非特異性、全基因組沉默機制(genome-wide silencing mechanism)。可藉由如下測定法測定/監(jiān)測rDNA沉默rDNA沉默導(dǎo)致減少rRNA轉(zhuǎn)錄，其可由定量性或半定量性PCR分析(例如，如材料及方法部份所述，利用針對45S前RNA之寡核苷酸引物)。rDNA基因啟動子之甲基化之分析方法為以甲基化敏感性限制酶消化基因組DNA， 且隨后進(jìn)行Southern印跡，產(chǎn)生甲基化及未甲基化狀態(tài)的差異性條帶樣式。或者，可由如下定量由甲基化誘導(dǎo)之rDNA沉默利用甲基化敏感性限制酶消化基因組DNA，且隨后利用橫跨裂解位點之引物進(jìn)行qPCR(如材料及方法部份中所述，且示于圖 2)。如文中所用，關(guān)于基因表達(dá)之術(shù)語“敲低”或“消減”系指導(dǎo)致指定基因之表達(dá)比對照細(xì)胞表達(dá)減少之實驗方法?？山逵啥喾N實驗方法達(dá)成基因敲低，諸如向細(xì)胞引入會與基因之部份mRNA雜交之核酸分子，導(dǎo)致其降解(例如shRNA、RNAi, miRNA)，或以一種導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄減少、mRNA穩(wěn)定性降低或mRNA翻譯減少之方式改變基因序列。完全抑制指定基因表達(dá)系稱為“敲除”。敲除基因意指該基因不會合成功能性轉(zhuǎn)
錄物，導(dǎo)致該基因正常提供之功能喪失。敲除基因之方法為改變DNA序列，導(dǎo)致該基因或
其調(diào)節(jié)序列被破壞或刪除。敲除技術(shù)包括使用同源性重組技術(shù)，以置換、間斷或刪除關(guān)鍵部
份或整段基因序列，或使用諸如鋅指核酸酶之DNA修飾酶，在標(biāo)靶基因之DNA中引入雙鏈斷 m農(nóng)。有許多種監(jiān)測/證實基因之敲低或敲除之測定法例如，采用Northern印跡雜交、核糖核酸酶RNA保護(hù)、與細(xì)胞RNA原位雜交、或藉由PCR定量所選擇基因中轉(zhuǎn)錄之mRNA減少/流失?？山逵啥喾N方法定量選擇之基因所編碼對應(yīng)蛋白質(zhì)的減少/流失，例如ELISAJestern印跡、放射免疫測定法、免疫沉淀、測定蛋白質(zhì)之生物學(xué)活性、對蛋白質(zhì)免疫染色后進(jìn)行FACS分析、或均相時間分辨熒光(HTRF)測定法。如本發(fā)明所用術(shù)語“衍生物”意指與原始序列或其互補序列具有至少70%序列一致性之多肽分子或核酸分子。較佳地，多肽分子或核酸分子與原始序列或其互補序列具有至少80%之序列一致性。更佳地，多肽分子或核酸分子與原始序列或其互補序列具有至少 90%序列一致性。最佳地，多肽分子或核酸分子與原始序列或其互補序列具有至少95%序列一致性，且對分泌顯示與原始序列相同或類似之影響。序列差異可源自不同生物體同源性序列之間的差異。序列差異亦可源于由于置換、插入或刪除一個或多個核苷酸或氨基酸(較佳1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)，對序列進(jìn)行之靶定修飾?？衫梦稽c特異性誘變及/或基于PCR之誘變技術(shù)產(chǎn)生刪除、插入或置換突變體。相關(guān)方法說明于(Lottspeich及hrbas，1998)之第36. 1章中及其它參考文獻(xiàn)。于本發(fā)明中，“宿主細(xì)胞”意指真核細(xì)胞，較佳為哺乳動物細(xì)胞，最佳為嚙齒動物細(xì)胞，諸如倉鼠細(xì)胞。較佳細(xì)胞為 BHK21、BHK ΤΓ、CHO、CHO-KU CHO-DUKX, CHO-DUKX Bi、 及CH0-DG44細(xì)胞或其中任一種細(xì)胞系之衍生物/后代。特別佳者為CH0-DG44、CH0-DUKX、 CHO-Kl及BHK21，且更佳者為CH0-DG44及CHO-DUKX細(xì)胞。最佳者為CH0-DG44細(xì)胞。于本發(fā)明之一項特定實施方案中，宿主細(xì)胞意指鼠科動物骨髓瘤細(xì)胞，較佳為NSO及Sp2/0細(xì)胞或其中任一種細(xì)胞系之衍生物/后代?？捎糜诒景l(fā)明含意的鼠科動物及倉鼠細(xì)胞實例亦概括于表1中。然而，該等細(xì)胞之衍生物/后代、其它哺乳動物細(xì)胞(包括但不限于人類、小鼠、大鼠、猴、及嚙齒動物細(xì)胞系)、或真核細(xì)胞(包括但不限于酵母、昆蟲及植物細(xì)胞)亦可用于本發(fā)明之含意，特定言之用于產(chǎn)生生物醫(yī)藥蛋白質(zhì)。表1 真核生產(chǎn)細(xì)胞系
細(xì)胞系訂購號NSOECACC No. 85110503Sp2/0-Agl4ATCC CRL-1581BHK21ATCC CCL-IOBHK TK"ECACC No. 85011423HaKATCC CCL-152254-62.2 (BHK-21 衍生物)ATCC CRL-8544CHOECACC No. 8505302CHO野生型ECACC 00102307CHO-KlATCC CCL-61CHO-DUKX (=CHO duk", CHO/dhfr")ATCC CRL-9096CHO-DUKX BllATCC CRL-9010CHO-DG44(Urlaub et al., 1983)
權(quán)利要求
1.一種于細(xì)胞中增加重組蛋白質(zhì)表達(dá)之方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，及c.該細(xì)胞于允許蛋白質(zhì)表達(dá)之條件下培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1之方法，其中該細(xì)胞中之重組蛋白質(zhì)表達(dá)比未減少rDNA沉默之細(xì)胞增加，該增加較佳為20 %至100 %，更佳為20 %至300 %，最佳大于20 %。
3.如權(quán)利要求1或2之方法，其中步驟b)包含敲低或敲除核仁重建復(fù)合物(NoRC)之一種組分。
4.如權(quán)利要求3之方法，其中該NoRC組分為TIP-5或SNF2H，以TIP-5較佳。
5.如權(quán)利要求1至4任一之方法，其中敲除TIP-5。
6.如權(quán)利要求5之方法，其中TIP-5沉默載體包含a.如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 之 shRNA，或b.如SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID N0:11 之 miRNA。
7.如權(quán)利要求1至4任一之方法，其中敲除SNF2H。
8.一種于細(xì)胞中產(chǎn)生感興趣蛋白質(zhì)的方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，c.該細(xì)胞于允許該感興趣蛋白質(zhì)表達(dá)之條件下培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求8之方法，其中該方法另外包含d.純化該感興趣蛋白質(zhì)。
10.如權(quán)利要求8或9之方法，其中步驟b)包含敲低或敲除核仁重建復(fù)合物(NoRC)之一種組分。
11.如權(quán)利要求10之方法，其中該NoRC組分為TIP-5或SNF2H，以TIP-5較佳。
12.—種產(chǎn)生用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)之宿主細(xì)胞的方法，包含a.提供一種細(xì)胞，b.減少該細(xì)胞中之核糖體RNA基因(rDNA)沉默，c.視需要選擇單一細(xì)胞克隆，d.獲得宿主細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12之方法，其中步驟b)包含敲低或敲除核仁重建復(fù)合物(NoRC)之一種組分。
14.如權(quán)利要求13之方法，其中該NoRC組分為TIP-5或SNF2H，以TIP-5較佳。
15.一種如權(quán)利要求12至14中任一項之方法產(chǎn)生之細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15之細(xì)胞，其中該細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，較佳為CH0-DG44、 CHO-Kl、CHO-S 或 CH0-DUKXB11，該細(xì)胞最佳為 CH0-DG44 細(xì)胞。
17.一種TIP-5沉默載體，包含a.如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 之 shRNA，或b.如SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:10 或 SEQ ID N0:11 之 miRNA。
18.一種細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求17之TIP-5沉默載體，及視需要含有一種包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因之表達(dá)盒之載體。
19. 一種細(xì)胞，其中已敲除TIP-5，及視需要包含一種載體，其包括一種包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因之表達(dá)盒。
全文摘要
本發(fā)明系關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)之領(lǐng)域。其系關(guān)于經(jīng)由減少NoCR蛋白質(zhì)(尤其TIP-5)表達(dá)而達(dá)成核糖體RNA(rRNA)表達(dá)增加之生產(chǎn)宿主細(xì)胞系。該等細(xì)胞系具有比對照細(xì)胞系改善之分泌及生長特性。本發(fā)明另外關(guān)于一種利用所述方法產(chǎn)生之細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)之方法。
文檔編號C12N15/11GK102414320SQ201080019611
公開日2012年4月11日 申請日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者B.埃南克爾, H.考夫曼, L.弗洛林, M.弗瑟尼格, R.桑托羅 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司