專利名稱：具有改良聚集特性的修飾蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白的化學(xué)修飾領(lǐng)域以及包含這些修飾蛋白的食品。本發(fā)明尤其涉及 制備陽離子強(qiáng)化食品，以及包含具備調(diào)節(jié)溶解的陽離子的增強(qiáng)的能力的蛋白或蛋白片 段的食品的方法。
背景技術(shù)：
在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域。已經(jīng)對(duì)蛋白質(zhì)聚集和影響蛋白質(zhì)聚集的因素有了廣泛的研 究。如升高的溫度(熱處理)，PH值和/或鈣離子的有效性等因素常常誘發(fā)蛋白質(zhì)聚集。 鈣離子的有效性被描述為影響天然乳清蛋白混合物的聚集(Barbut and Foegeding 1993, J Food Sci 5:867-871; Haggett 1976, J Dairy Sci and Technol 11: 244-250; Ju and Kilara 1998, J Dairy Sci 81: 925-931; Morrand Josephson 1968, J Dairy Sci 51: 1349-1451; Sherwin and Foegeding 1997， Milchwissenschaft 52:93-96; Varunsatian et al, 1983， J Food Sci 48: 42-47; Zhu and Damodaran 1994， J Agric and Food Chem 42: 856-862)，并且已經(jīng)表明它影響e—乳球蛋白的聚集性，這是乳清的一個(gè) 主要的蛋白成分(Simons et al. 2002, Arch Biochem Biophys 406(2): 143-152)。
在食品生產(chǎn)過程中，蛋白聚集對(duì)于生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的組合物有重要的意義。 已經(jīng)表明(Simons et al., Arch. Biochem. Biophys 2002 406(2): 143-52)蛋白聚集對(duì)鈣 存在的敏感度直接與蛋白質(zhì)中的羧基的有效性有關(guān)，例如可以通過蛋白的甲基化或者 琥珀?；@得。然而，可選擇的、更多的食物分級(jí)方法也是非常需要的。
為了在生產(chǎn)和儲(chǔ)藏過程中避免蛋白聚集或者蛋白沉降，在含有對(duì)鈣誘導(dǎo)聚集敏感 的蛋白質(zhì)的產(chǎn)品中，鈣應(yīng)該保持在較低的水平。然而這會(huì)導(dǎo)致低鈣水平的制品，比 如豆奶制品，并且可能導(dǎo)致受體體內(nèi)鈣的缺乏，例如一些人，其由于對(duì)牛勤敏感或者 乳糖不耐受等原因不能消耗奶制品。以前試圖提供含有高水平鈣的穩(wěn)定的豆奶，但是 由于蛋白一離子鈣的相互作用引起了豆蛋白的聚集和沉降。
已經(jīng)應(yīng)用了各種不同的化學(xué)藥品螯合鈣離子，阻止豆蛋白的沉降。
美國(guó)專利第1,210,667號(hào)和第1,265,227號(hào)提出了含有作為鈣離子螯合劑的磷酸 鈉的飲料。Weingartner等提出了檸檬酸鈣作為螯合劑(J Food Sci. 256-263(1983))。 Hirotsuka等人提出了一種加工工藝，在含有EDTA的溶液中使用卵磷脂(超)聲波降 解法來包裹存在于溶液中的鈣離子(丄Food Sci. 1111-1127 (1984))。 EP0195167公開 了在豆奶中添加多磷酸鹽會(huì)增加鈣的結(jié)合但避免豆蛋白一鈣復(fù)合物的沉降。WO
03/053995講授了豆蛋白磷酸化(作用)之后發(fā)生水解和鈣結(jié)合反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白高的鈣 結(jié)合能力并伴隨良好的水溶解性能。
以往使用的幾種螯合劑降低了奶溶液中鈣離子的生物利用率。因而，當(dāng)牛奶中 總鈣離子濃度增加并超過未強(qiáng)化豆奶時(shí)，增加的鈣中的大部分，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值還是不能 獲取到。
除了豆奶以外，其他許多食品也受益于豐富的鈣。例如，動(dòng)物的奶制品(尤其是 那些牛奶形成的產(chǎn)品)已經(jīng)被認(rèn)為是鈣的一個(gè)好的食物來源。然而在每一份中僅含有 有限的鈣的含量，這要求一般的人需要消費(fèi)大量的此類產(chǎn)品來獲得鈣的每日推薦需要 量(RDA)。而且， 一些人患有醫(yī)學(xué)疾病(例如骨質(zhì)疏松癥)，他們需要消耗比其他 的人更多的鈣。因此，那些增加每一份奶制品中鈣的含量并且對(duì)奶制品的質(zhì)量沒有 負(fù)面影響的補(bǔ)充的產(chǎn)品總是有需求。
健康的營(yíng)養(yǎng)除了鈣以外，還需要提供其他的必需元素。尤其是，考慮到需要強(qiáng)化 鈣，為了保持鈣/鎂比例的平衡，在食品中需要考慮鎂的含量，這引起了人們很大的 興趣。
因此，希望提供一種強(qiáng)化食品的方法，尤其是奶制品，例如含有陽離子的牛奶和 豆奶制品，尤其是含有鈣和鎂，但是不引起蛋白質(zhì)和陽離子的凝聚。更希望的是使 用一種方法防止凝聚，避免使用降低奶制品溶液中陽離子生物利用率的試劑，從而使 食品中的陽離子的生物利用率下降量達(dá)到最小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將蛋白處于美拉德反應(yīng)條件下會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)對(duì)誘導(dǎo)蛋白聚集的鈣 離子(Ca2+)的敏感性降低。也就是說，當(dāng)溶解鈣的濃度上升的時(shí)候，發(fā)生美拉德反 應(yīng)的蛋白質(zhì)保留在溶液中。在一個(gè)美拉德反應(yīng)中，糖的還原末端同伯胺基發(fā)生反應(yīng)。 特別的是，豆蛋白-大豆球蛋白(11S球蛋白)的賴氨酸殘基以及大豆蛋白分離物(SPI) 的賴氨酸殘基通過受控制的美拉德反應(yīng)進(jìn)行修飾，從而大大降低了鈣誘導(dǎo)的聚集發(fā) 生。如果乳清蛋白通過受控的美拉德反應(yīng)進(jìn)行修飾，就能獲取更好的效果。有效的 是，受控的美拉德反應(yīng)導(dǎo)致了賴氨酸殘基糖基化的蛋白產(chǎn)物。在沒有理論的支持下， 推測(cè)賴氨酸殘基的修飾導(dǎo)致了蛋白表面的早先離子配對(duì)的羧酸鹽處于"自由"狀態(tài)。 根據(jù)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，可能生產(chǎn)含有高水平陽離子如鈣鎂離子的產(chǎn)品，因?yàn)樾揎椀牡鞍自黾?了陽離子誘導(dǎo)蛋白聚集發(fā)生的閾值。由于在美拉德反應(yīng)時(shí)，沒有導(dǎo)入螯合劑，鈣和 /或鎂的生物利用率沒有受到負(fù)面的影響。
重要的是，營(yíng)養(yǎng)蛋白的修飾不會(huì)引起功能的損失。例如，在每個(gè)蛋白中引入2—3
個(gè)琥珀?；螅鞍椎溺牾；３：芸彀l(fā)生，引起結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性下降。伴隨這原 始結(jié)構(gòu)的失去，蛋白的功能也就失去了。但是，比如說，乳清的主要組成成分e—乳 球蛋白的16個(gè)賴氨酸殘基，在美拉德反應(yīng)的條件下會(huì)被糖基化，但是并未顯示出分 子原始結(jié)構(gòu)的缺失。因此，有利的是，美拉德反應(yīng)通常不會(huì)損害修飾蛋白的結(jié)構(gòu)完整 性。
因此，本發(fā)明涉及一種增加蛋白的陽離子結(jié)合能力的方法，所述的方法包括了使 蛋白處于美拉德反應(yīng)的條件。也就是說，本發(fā)明是關(guān)于一種修飾蛋白的制備，相對(duì)于 沒有修飾的蛋白來說，它能夠提高陽離子的結(jié)合能力，所述的方法包括使沒有修飾的 蛋白處于美拉德反應(yīng)的條件。陽離子結(jié)合能力的增加應(yīng)該是這樣，就是在陽離子濃度 增加后，蛋白的聚集并不發(fā)生。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，陽離子指的是二價(jià)的陽
離子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例子中，陽離子指的指的是CaS+和/或M^+。
通常，美拉德反應(yīng)可以描述為在水中溫和地加熱糖和氨基酸。在本發(fā)明中，美拉 德反應(yīng)條件是指未知的蛋白與包含有還原羰基部分的化合物發(fā)生的反應(yīng)，尤其是那種 可以和未知蛋白的伯胺基相互作用形成一個(gè)schiff base的羰基部分。'通常未知蛋白 的伯胺基是賴氨酸殘基的氨基。優(yōu)選的，包含羰基部分的化合物是一種糖，其可以一 種醛醣也可以是一種酮醣。在一個(gè)實(shí)施例中，所述糖是一種具有功能性的還原羰基的 單糖。單糖的例子包括甘油醛，赤蘚糖，蘇糖，核糖，阿拉伯糖，木糖，來蘇糖，阿 洛糖，阿卓糖，甘露糖，葡萄糖，古洛糖，艾杜糖，半乳糖，tallose， 二羥基丙酮， 赤蘚酮糖，核酮糖，木酮糖，阿洛酮糖，山梨糖，塔格糖，和果糖。二糖例如乳糖和 麥芽糖，以及較低程度的蔗糖，考慮到它的還原性能，或者更高的低聚糖也可以使用。 優(yōu)選的，包含還原羰基部分的化合物選自葡萄糖和果糖。
影響美拉德反應(yīng)的因素是溫度，水/濕度的存在和pH值。
通常啟動(dòng)美拉德反應(yīng)至少必須加熱反應(yīng)混合物?？梢允翘峁┳銐虻臒崃繂?dòng)這個(gè) 反應(yīng)后，然后反應(yīng)可以在室溫下繼續(xù)。然而，如實(shí)施例中所示，加熱也可以繼續(xù)。為 了防止蛋白的不可逆變性，應(yīng)該小心不要加熱過度。足夠的和適度的加熱程度取決于 未知蛋白以及用于修飾蛋白的糖。為了本發(fā)明的目的，反應(yīng)混合物應(yīng)該加熱到至少40 °C，并優(yōu)選不得超過比水溶液中蛋白變性溫度低5度的溫度。為了合理的控制美拉德 反應(yīng)，最好不要使用太高的溫度，例如不要加熱超過65X:。
美拉德反應(yīng)需要水分才可以繼續(xù)。方便的是，水以空氣中水分的形式存在，反應(yīng) 需要在潮濕的條件下進(jìn)行，合適的濕度至少是55%。這個(gè)反應(yīng)也可以在水溶液中進(jìn)行， 但是這通常重復(fù)性較小，認(rèn)為會(huì)引起蛋白的高度變性。
在pH低于6的條件下，美拉德反應(yīng)不能進(jìn)行，在接近中性或者堿性的條件下，
反應(yīng)更可能進(jìn)行。優(yōu)選的是在pH為6 — 9的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在7—8的范圍內(nèi)。
而且所用的含有還原羰基部分的化合物的類型會(huì)影響美拉德反應(yīng)。不同的化合物
具有不同的還原能力。尤其單糖的還原能力明顯不同；還原能力越強(qiáng)，反應(yīng)發(fā)生越快。 根據(jù)例如蛋白質(zhì)的理想的修飾程度，或者說是美拉德反應(yīng)，和/或者是可以反應(yīng)的時(shí) 間，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇一個(gè)合適的糖類物質(zhì)。具有還原能力的糖可以通過實(shí)
施例中描述的Luff試劑來確定。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在Luff分析中糖檢測(cè)為陽
性。尤其是優(yōu)先使用葡萄糖或果糖。
正如實(shí)施例中所顯示的那樣，通過改變反應(yīng)的時(shí)間，可以改變未知蛋白的修飾程 度，這由被修飾的賴氨酸殘基的數(shù)量來確定。根據(jù)未知蛋白的類型和該蛋白的理想的
陽離子耐受程度，對(duì)于熟悉本技術(shù)的人來說，在給定的條件，如溫度，水和pH值下，
這是一個(gè)常規(guī)的試驗(yàn)來確定美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度，也就是說要多久。典型的，對(duì)于
葡萄糖的孵化時(shí)間在55'C，PH為7的條件下，2 — 5小時(shí)足以獲得適合的修飾的程度。
在方便的條件下實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，在干燥或者固態(tài)時(shí)，陽離子結(jié)合蛋白的混 合物要增加，也就是說，需要修飾的蛋白，以及包含還原羰基部分的化合物在空氣濕 度大于55%的條件下至少加熱到4(TC。在這種情況下，干燥的混合物并不是說完全 的沒有水，而是說缺乏溶劑。優(yōu)選的，包含還原羰基部分的化合物選自葡萄糖和果糖。
優(yōu)選的，將所述蛋白置于美拉德反應(yīng)條件下并達(dá)到這樣一個(gè)程度，使得在熱誘導(dǎo) 展開過程中，相對(duì)于非美拉德反應(yīng)的蛋白來說，蛋白產(chǎn)物還會(huì)有最小90%的焓變。這 種標(biāo)準(zhǔn)的熱量測(cè)定在是在一個(gè)對(duì)于本技術(shù)熟練的人理解的范圍內(nèi)?；蛘撸谥車鷹l件 下，斯托克斯半徑的增加優(yōu)選不得超過5%。斯托克斯半徑可以在標(biāo)準(zhǔn)光散射試驗(yàn)下 來確定，這也在本技術(shù)熟練的人理解的范圍內(nèi)。
如前面所提到的那樣，控制的美拉德反應(yīng)有效地使蛋白產(chǎn)物的賴氨酸殘基糖基化。 除了美拉德反應(yīng)外，其他糖基化賴氨酸殘基的合成方法也是本領(lǐng)域所熟知，如以下所 描述，Christopher et al., 1980. Advances in Carbohydrate chem. Biochem. 37, 225-28, Caeretal.， 1990，丄Agric. Food Chem. 38, 1700-1706, Colas etal., 1993,丄 Agric. Food. Chem. 41, 1811-1815， Hattori etal., 1996,丄Food Sci. 61, 1171-1176.
因此，上文描述的受到控制的美拉德反應(yīng)或者其他使賴氨酸殘基糖基化的合成方 法,提供了修飾過的蛋白。在本發(fā)明中， 一種修飾過的蛋白質(zhì)產(chǎn)物定義為富含賴氨酸的 蛋白，其中至少20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%的賴氨酸殘基被糖基化。富 含賴氨酸定義為包含賴氨酸殘基的蛋白，優(yōu)選每克蛋白至少含有4.5重量％的賴氨酸。 這些定義與非修飾蛋白中可糖基化的賴氨酸殘基有關(guān)，可以通過OPA試驗(yàn)來確定。 因此在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種修飾蛋白產(chǎn)物組合物，其包含基于物質(zhì)干重至少是80%，優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%的糖基化富含賴氨酸蛋白，在所述的每
一克蛋白中，所述的富含賴氨酸蛋白優(yōu)選包含至少4.5重量％的賴氨酸，其中至少20 %，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%的存在于富含賴氨酸蛋白中的賴氨酸殘基已經(jīng) 糖基化。在一個(gè)實(shí)施例中，修飾的蛋白產(chǎn)物組合物實(shí)際上是干物形式，比如說冷凍 干燥后的干物質(zhì)。
在本發(fā)明的前提下， 一個(gè)修飾蛋白定義為其中至少20%，或者至少30%或者至 少40%的可利用的賴氨酸殘基被修飾的蛋白，也就是說，與非修飾蛋白相比較，許多 賴氨酸殘基不再存在，其由OPA測(cè)試確定，參見實(shí)施例。在其他的實(shí)施例中，至少 45%，或者至少50%或者至少55%,例如達(dá)到60%或者65%的賴氨酸殘基被修飾。 而且有更高比例的賴氨酸殘基可能被修飾。然而優(yōu)選的，蛋白結(jié)構(gòu)完整性并未損害 和/或蛋白功能沒有喪失。應(yīng)當(dāng)注意的是，由于美拉德反應(yīng)，結(jié)構(gòu)的完整性受到影響， 但是在腸胃處理過程中，所述修飾的蛋白保持或者重新獲得功能(營(yíng)養(yǎng))特性，或者 至少是部分獲得。然而如上述描述的那樣，在熱誘導(dǎo)展開中，這些蛋白可能不符合焓 變的原則，但可以理解的是，這類修飾的蛋白還是落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在這個(gè)特定的例子糖基化中，基于鄰苯二甲醛(OPA)與蛋白質(zhì)中自由伯胺基之 間的特異反應(yīng)，OPA測(cè)試適合確定蛋白修飾的程度，其記載于Church et al. (1983) Dairy Sd, 66， 1219-1227。
簡(jiǎn)單來說，OPA試劑是通過在1毫升的甲醇中溶解40mg的OPA制備而成的， 然后加入25ml0.1 M的Borax緩沖液，200mg的DMA和5巾110%的SDS。在2 —(二甲基氨基)乙硫醇(DMA)存在的情況下，蛋白中的伯胺基與340nm顯示有吸 收的垸基一異吲哚的衍生物反應(yīng)。用去離子水調(diào)節(jié)體積到50ml。用石英比色皿裝入 3ml的這種試劑，確定在340nm處的吸光度。然后，加入15pl樣品^液(通過測(cè) 定在280nm處的吸光度，確定蛋白的濃度，s 280=o.712ml*mg-1*cm-1)，然后在室溫 下孵育30min后，再在340nm處測(cè)定吸光度。通過添加10， 20， 30， 40， 80， 100和150ul的2mML-亮氨酸溶液到3ml的OPA—試劑中，得到其校準(zhǔn)曲線，得到 6.6-95.0pML-亮氨酸范圍內(nèi)的濃度。所有的測(cè)量至少要兩份，最好是3份。
或者，除了賴氨酸修飾的百分比外，這項(xiàng)發(fā)明的一種修飾蛋白是一種蛋白質(zhì)，在 95X:下加熱60分鐘，最好在至少55%濕度的空氣下，使蛋白褐化。這種褐化能夠通 過測(cè)定'514nm的吸光度來量化。由此知道，在濃度為5mg/ml的情況下，修飾后的蛋 白顯示每cm光程至少0. 10吸光單位的吸光度。
同樣，蛋白中賴氨酸殘基的修飾引起了蛋白等電點(diǎn)(IEP)的改變。因此，除了 賴氨酸修飾和/或進(jìn)一步受熱產(chǎn)物在514nm處的吸光度，在本發(fā)明中，修飾的蛋白是
這樣一種蛋白，他們呈現(xiàn)出來的蛋白等電點(diǎn)比未修飾的蛋白的等電點(diǎn)低，可以通過 凝膠電泳來確定。優(yōu)選的，等電點(diǎn)至少低0.2 pKa，但是不得超過1. OpKa。
一旦蛋白中可利用的賴氨酸殘基的數(shù)目確定，例如通過OPA檢測(cè)，修飾的百分比 也可以通過質(zhì)譜分析來確定，例如MALDI-T0F MS?？梢灶A(yù)計(jì)，蛋白修飾后質(zhì)量的增 加與使用的糖分子總數(shù)目有關(guān)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種修飾蛋白產(chǎn)物，當(dāng)增加食品到一定的數(shù)量 時(shí)，食品中的陽離子的耐受性的能力顯著增加。為了應(yīng)用或者增加到食品中，有必要 從美拉德反應(yīng)中純化和/或分離已修飾的蛋白。純化和/或分離的方法可以是本技術(shù)領(lǐng) 域內(nèi)的常規(guī)的方法，例如透析，離心，層析，結(jié)晶，冷凍干燥，低壓凍干等，只要 在過程中材料不會(huì)失去功能就可以。因此這項(xiàng)發(fā)明也涉及富含賴氨酸的蛋白的應(yīng)用， 在制備水性的陽離子強(qiáng)化食品中，其中至少20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40 %的賴氨酸殘基已經(jīng)糖基化，糖基化的富含賴氨酸的蛋白充分溶解，未糖基化的富含 賴氨酸的蛋白隨著陽離子復(fù)合蛋白鹽沉淀，在每克所述的蛋白中，所述的富含賴氨酸 的蛋白優(yōu)選包含至少4.5重量％的賴氨酸。在一個(gè)實(shí)施例中，陽離子是二價(jià)的陽離子。 在一個(gè)特定的例子中，陽離子是Ca"或Mg2+，或者是(^2+與Mg"的混合。
在此所理解的"食物"或者"食品"或"食物原料"，指的是固體，半固體或者 液體的營(yíng)養(yǎng)組合物或者營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑，比如， 一種飲料，如食用/健康飲料以及運(yùn)動(dòng)飲
料和維生素飲料，復(fù)原乳，UHT牛乳，煉乳，乳清蛋白水解產(chǎn)物和分離產(chǎn)物，酸乳酪， 甜點(diǎn)心，醬油等，以液體形式的，舉例來說，包括臨床的營(yíng)養(yǎng)物，例如用于管喂養(yǎng)物， 凝膠物，粉狀物(例如牛奶配方)，如，速溶奶粉，嬰兒奶粉，片劑，膠囊等。特別 感興趣的是基于大豆的乳制品，尤其是豆奶和其衍生產(chǎn)品。更有興趣的是基于乳清蛋 白的乳制品和其衍生物?？紤]到陽離子耐受的增強(qiáng)，根據(jù)所述的修飾蛋白成分中陽離 子誘導(dǎo)的聚集特性，熟悉技術(shù)的人能很容易確定所使用的修飾蛋白成分的合適的用 量。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，涉及一種基于陽離子強(qiáng)化水的食品，所述食品 包含占水重量至少0.2%的富含賴氨酸蛋白，其中在每克所述的蛋白質(zhì)中，富含賴氨酸 的蛋白含有至少4.5重量％的賴氨酸，并且其中至少20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至 少40%的存在于富含賴氨酸的蛋白中的賴氨酸殘基已經(jīng)糖基化，所述的食品實(shí)質(zhì)上是 不存在不溶解的陽離子復(fù)合物的富含賴氨酸的蛋白鹽，并且含有一定的數(shù)量的溶解的 陽離子會(huì)導(dǎo)致非糖基化形式的富含賴氨酸的蛋白沉淀為陽離子復(fù)合蛋白鹽。在一個(gè)實(shí) 施例中，陽離子是二價(jià)的陽離子。在具體的實(shí)施例中，陽離子是Ca2—或Mg"，或者Ca" 與Mg"的混合。
在進(jìn)一步的實(shí)施例中，陽離子強(qiáng)化基于水的食品包含基于水重的至少0. 4%,或者 至少0. 6%，或者至少0. 8%,或者至少1. 0%， 或者至少1. 5%,或者至少2. 0%,或者至少 2. 5%，或者至少3%，或者至少3. 5%，或者至少4. 0%直至5. 0%的富含賴氨酸蛋白。
優(yōu)選的，陽離子強(qiáng)化基于水的食品含有一定數(shù)量的溶解的Ca2+離子，并且比非修 飾的蛋白在其中形成沉淀的(^2+濃度高至少5%，優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少15%， 進(jìn)一步優(yōu)選至少20%?；蛘撸栯x子強(qiáng)化基于水的食品含有一定數(shù)量的溶解的Ca2+和 Mg2+離子，并且比非修飾的蛋白在其中形成沉淀的Ca2+和Mg2+濃度高至少5X，優(yōu)選至 少10%，更優(yōu)選至少15%，進(jìn)一步優(yōu)選至少20%。在另一選擇中，陽離子強(qiáng)化基于 水的食品含有一定數(shù)量的溶解的Mg2+，并且比非修飾的蛋白在其中形成沉淀的Mg"濃 度高至少5%，優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少15%，進(jìn)一步優(yōu)選至少20%?；蛘?，根 據(jù)本發(fā)明，陽離子強(qiáng)化基于水的食品中，陽離子的增加可調(diào)節(jié)并表達(dá)為ppm。例如， 含有2重量％的富含賴氨酸的蛋白的食品，其中存在于富含賴氨酸蛋白的至少20%的 賴氨酸殘基已經(jīng)被糖基化，與非修飾蛋白在其中形成沉淀的二價(jià)陽離子的濃度相比， 所述食品優(yōu)選含有多100ppm的二價(jià)的陽離子，優(yōu)選至少多150ppm，更優(yōu)選至少多 200ppm的二價(jià)陽離子，尤其是Ca2+和Mg2+或者是他們的混合。具有高水平的賴氨酸修 飾的富含賴氨酸的蛋白也是這種情況，例如富含賴氨酸蛋白，其中至少30%，或者至 少40%的存在于富含賴氨酸蛋白中的賴氨酸殘基已糖基化。
在一個(gè)實(shí)施例中，陽離子強(qiáng)化基于水的食品含有溶解的Ca2+離子和/或Mg2+離子， 其濃度至少是2%，或者至少是4% (以富含賴氨酸蛋白重量計(jì)算)。在另外一個(gè)實(shí) 施例中，尤其是在具有較高的修飾度的富含賴氨酸的蛋白中，陽離子強(qiáng)化基于水的食 品含有溶解鈣離子和/或鎂離子的濃度至少是5%，或者至少是6%，甚至至少是7% 或者超過8% (以富含賴氨酸蛋白重量計(jì)算)。在一個(gè)有利的實(shí)施例中，陽離子強(qiáng)化基 于水的食品含有溶解的鈣離子和鎂離子。在這個(gè)實(shí)施例子中，含有鈣離子和鎂離子的
摩爾比率在范圍為l: 1到6: 1之間有益的，更適合是2: 1到4: 1之間，例如摩 爾比率為3: 1。
在一個(gè)實(shí)施例中，陽離子強(qiáng)化基于水的食品含有至少50重量％，優(yōu)選至少80重
量％的水。通過OPA分析確定的情況，與非修飾的蛋白比較而言，至少20%，優(yōu)選至
少30%，更優(yōu)選至少40%的富含賴氨酸蛋白中的賴氨酸殘基已經(jīng)被修飾。例如，至
少是45%或50%，或者至少是55%直到60%或65%的賴氨酸殘基已經(jīng)被修飾。進(jìn)一
步的實(shí)施例中，其中富含賴氨酸的蛋白在變性過程中發(fā)生焓變，為其非修飾的類似物
的至少90%。在一個(gè)實(shí)施例中，富含賴氨酸的蛋白是豆蛋白，任意地選自大豆球蛋白
及豆蛋白分離物。在另一個(gè)實(shí)施例中，富含賴氨酸蛋白是乳清蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明是關(guān)于一種陽離子強(qiáng)化基于水的食品，在食品的總重 量中含有至少0. 2%的富含賴氨酸蛋白，以及至少0. 05%的溶解的Ca2+離子和/或Mg"離 子，所述的食品實(shí)質(zhì)上不存在不溶解的陽離子復(fù)合物的富含賴氨酸的蛋白鹽，其中在 每克所述的蛋白中，富含賴氨酸的蛋白優(yōu)選含有至少4.5重量％的賴氨酸，其中至少 是20%，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%的存在于富含賴氨酸蛋白中的賴氨酸殘基 被糖基化。優(yōu)選的，所述食品中含有占食品總重量的至少0. 02重量％，更優(yōu)選至少0. 04 重量％的溶解的Ca"離子和/或Mg2+離子。在一個(gè)實(shí)施例子中，所述食品中含有占食品 總重量的至少0. 06重量%，或者至少0. 08重量％的溶解的&2+離子和/或Mg"離子。
在一個(gè)實(shí)施例中，陽離子強(qiáng)化基于水的食品是牛奶或者他們的派生的食品，或者 其他的派生的奶制品，包括乳清蛋白，例如復(fù)原乳，UTH牛乳，煉乳，乳清蛋白水解 產(chǎn)物及分離物，以及含有乳清蛋白水解產(chǎn)物及分離物的制品，酸乳酪，速溶奶粉，嬰 兒奶粉等。在一個(gè)實(shí)施例中，鈣強(qiáng)化水產(chǎn)品是豆奶或者豆奶的衍生品。
有待于修飾的蛋白可以是任何蛋白，例如從天然資源中分離的蛋白，合成的或者 使用重組DNA技術(shù)表達(dá)的蛋白，并且是本文所定義的富含賴氨酸的蛋白。應(yīng)用于陽離 子強(qiáng)化產(chǎn)品的蛋白的例子有雞蛋，乳清，大豆和豌豆蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施例中，所述蛋白是大豆蛋白，尤其是選自大豆球蛋白和大豆蛋白分離物或者它們的 組合。大豆蛋白本質(zhì)上呈現(xiàn)出水溶性的問題。因此，更優(yōu)選使用水溶性的大豆蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施例中，所述蛋白是e -乳球蛋白或者更普通的乳清蛋白。
注意到在本發(fā)明中，二價(jià)的陽離子，例如鈣，并不能認(rèn)為他們是蛋白聚集的驅(qū)動(dòng) 力，而是認(rèn)為他們是誘發(fā)劑或引發(fā)劑。認(rèn)為鈣離子，屏蔽了蛋白質(zhì)的電荷，導(dǎo)致了排 斥力較小的品種間碰撞和/或發(fā)生疏水作用。這些相同的作用歸功于鎂。通過美拉德 反應(yīng)的蛋白修飾可以說是屏蔽了蛋白質(zhì)形成沉淀，這在未修飾的蛋白中，卻會(huì)有過量 的或者過度的鈣和/或鎂。
盡管美拉德反應(yīng)在食品的顏色，香氣和口味中可能有負(fù)面影響，本發(fā)明的方法并 沒有引起不能被自然或者人工香氣克服的有害的影響。


圖1為由鈣引發(fā)的大豆球蛋白聚集。 圖2為由鈣誘發(fā)的SPI聚集。
實(shí)施例
通過OPA確定自由伯胺基 原理
為了確定賴氨酸修飾的程度，采用了 Church et al. (1983) Dairy Sd， 66,
1219-1227中描述的方法。這種方法是基于在2— (二甲基氨基)鹽酸乙硫醇(DMA) 存在的情況下，在鄰苯二甲醛(OPA)和蛋白中自由伯胺基之間的特定的反應(yīng)，并給 予在340nm處顯示吸光的垸基一異吲哚衍生物其。這能特異地確定賴氨酸和精氨酸 蛋白N—末端的基團(tuán)。
材料
0. 1M Borax:溶解19.07克十水硼酸二鈉(Na2B407 10H2O)至U 500毫升的 M川i-Q純凈水中。
10%SDS:溶解10克的十二垸基硫酸鈉到100ml的Milli-Q純凈水中。(戴上細(xì) 小的防塵手套)。
OPA試劑OPA試劑的制備溶解40mg的OPA (Sigma，P-0657)到1ml甲 醇中，然后添加25ml的0.1M的Borax緩沖液，200mg的DMA (Aldrich， D14，-3)和5ml的腦SDS..用Milli-Q純凈水調(diào)節(jié) 體積到50ml 。
2mM L-亮氨酸:溶解13.1mg的L-亮氨酸(Pierce, Mw.131.18)到50ml的 Milli-Q純凈水中。計(jì)算準(zhǔn)確的濃度。
過程
校準(zhǔn)曲線
1:用六個(gè)石英比色皿分別裝入3ml的OPA試劑，稱重并確定340nm處的吸光度
2:向3ml的OPA—試劑中加入10， 20， 40， 80， 120和150一的2mM的L一亮氨 酸儲(chǔ)備液(全部稱重)，產(chǎn)生濃度范圍從0.0066到0.095mM的L一亮氨酸溶液。 3: 在室溫下孵育10min. 4:確定在340nm處的吸光度。
5.用線性回歸處理數(shù)據(jù)。計(jì)算烷基一異u引哚衍生物的摩爾消光系數(shù)(e )(=線性函 數(shù)的斜率，應(yīng)該是7000±5001/|-1*0^1)
樣品的測(cè)量
1. 用石英比色皿裝入3ml的OPA試劑，稱重并確定340nm處的吸光度(A^nce)。
2:加入50一的5mM的NH2-溶液(大約10mg/ml的蛋白溶液)，稱重并混合。
3:在室溫下孵育10min.
4:確定在340nm處的吸光度(Asample)。
5:計(jì)算NH2的摩爾濃度AA340/ e
6:采用分光光度法確定在280nm處的摩爾蛋白濃度。
7:通過NH2的摩爾濃度除以摩爾蛋白濃度，計(jì)算蛋白中自由NH2基團(tuán)的數(shù)量。
注
所有的測(cè)量至少進(jìn)行兩次。
如果在添加蛋白前，OPA試劑變?yōu)榉奂t色而不是黃色，很可能DMA被仲胺污染。 豆蛋白 大豆球蛋白
大豆球蛋白(ca. 12克；PR004，參見以下)在4。C下深度透析(4X12 L millQ 純凈水)(終體積是235mLl)。用0. 1M的氫氧化鈉調(diào)節(jié)淺棕色/淺褐色蛋白溶液的pH 到8.0。等分試樣( 58ml; ca.3克)作為對(duì)照，在剩余的蛋白溶液中(ca.9克)， 添加果糖(3. 3克，Merck reinst)，并將溶液分為3個(gè)58ml的部分。冷凍干燥后， 在一個(gè)孵化器中加熱(55°C)褐色的易脆蛋白片，孵化器中含有飽和的NaN02以確保 整個(gè)美拉德反應(yīng)在濕度為65%的條件下。在2， 5及26小時(shí)后，大豆球蛋白樣品冷 卻至4'C。所有的蛋白樣品用milliQ純凈水溶解(60ml;如果需要，樣品調(diào)節(jié)到PH 為8.0來溶解蛋白)，用milliQ純凈水透析(4X12L)，冷凍干燥，儲(chǔ)藏在一20。C的條 件下待用。
美拉德反應(yīng)后，賴氨酸的修飾由OPA測(cè)試來確定(WCFS協(xié)議，版本為B — 009/B-010，AP12j，第30頁，也可參見以下)。對(duì)照定義為0%的修飾。大豆球蛋白中， 2小時(shí)后3%， 5小時(shí)后14%, 26小時(shí)后54%的可利用賴氨酸已經(jīng)被修飾了。
(修飾的)大豆球蛋白溶解(2mg/mL)在20mMBisTrispH為7. 0和20mMTris/HCL pH為8.0的溶液中，反復(fù)攪拌。在環(huán)境溫度(22°C)，在540nm處，在lmL的一次 性比色皿中，測(cè)定鈣依賴性聚集。對(duì)于蛋白溶液來說，加入100mM在各緩沖液中的 氯化鈣溶液的等分溶液。
由鈣引發(fā)的大豆球蛋白聚集如圖1所示。
大豆蛋白分離物
在室溫下，用去離子水透析大豆蛋白分離物(12克，SPI,見下文，管4于200ml20% 的甘油)。用1M的氫氧化鈉將水的PH值調(diào)節(jié)到8.0。透析液中，添加4.4克的果糖 (Merck， reinst)，將混濁的褐色蛋白溶液冷凍和冷凍干燥。干燥的蛋白放入55°C 的孵化器中的飽和硝酸鈉的上方，以保證65%的濕度。在3， 6和24小時(shí)后取出樣品 (每個(gè)3克)。樣品用去離子水(3X12L)在4'C中透析，隨后冷凍干燥。
SPI樣品溶解(2mg/mL)于p朋.5的20mM的Tris/HCL。在更低的pH值時(shí)，蛋白 不可溶解。在pH為8. 5時(shí)，24小時(shí)的樣品不可溶解，將PH調(diào)節(jié)到10時(shí)，溶解所有 的材料。在以后的制備中，沒有觀察到鈣誘導(dǎo)聚集，甚至在30mM氯化鈣的濃度的 情況下。由于聚集可能受到PH值的影響，這些數(shù)據(jù)沒有包括在圖2中。SPI制劑的 修飾程度未測(cè)定。
由鈣誘發(fā)的SPI聚集如圖2所示。 SPI儲(chǔ)藏測(cè)試
SPI樣本須進(jìn)行儲(chǔ)藏測(cè)試。儲(chǔ)藏測(cè)試的結(jié)果表明，在儲(chǔ)藏前后幾乎沒有明顯的自 由伯胺基的數(shù)目的變化。這表明，在溶解狀態(tài)下的美拉德產(chǎn)物在4'C下至少可以穩(wěn)定 一周。
大豆蛋白分離物的純化，分離的大豆球蛋白以及從全豆中分離的去大豆球蛋白的 大豆蛋白
選擇了一種特定的大豆品種(Williams' 82; 1994收獲)來確保分離的蛋白質(zhì) 組分的組合物的重復(fù)再現(xiàn)。大豆儲(chǔ)藏在一40 'C下，在使用前需要直接的解凍。Thanh, V.H.， and Shibasaki K. (1976),丄勿打c. Foocf C/ em. 24, 1117-1121中已經(jīng)描述了分 餾的原理，但是在不同的階段這個(gè)過程都適用。以下給出了分批的大豆蛋白分離物 (PR001),分離的大豆球蛋白(PR002)，去大豆球蛋白的大豆蛋白分離物(PR003) 以及分離的大豆球蛋白(PR004)的、分離過程的詳細(xì)描述。
方法說明
1: 60kg的全豆用削片滾筒在2(TC下破碎，使用空氣篩去除外殼。 2:破碎的豆在4'C下旋轉(zhuǎn)研磨。
3:然后，大豆粗粉用不銹鋼的圓筒分為2等分，每份士25kg(圓筒的大小士 30X150cm),在10—15t下用3倍的60升的己烷反復(fù)沖洗圓筒，提取油和脂肪。然后， 大豆粗粉在10—15。C的空氣中干燥24小時(shí)。4:在l(TC下，通過連續(xù)不斷的攪拌，脫脂的豆粉(43kg)用含有10mM 2—巰基 乙醇的575升的30mM的Tris/HCl (PH=8. 0)抽提1. 5小時(shí)。使用4M的氫氧化鈉使 PH值持續(xù)保持在8.0。懸浮液在4'C下儲(chǔ)藏過夜，不攪拌。然后，在一個(gè)水冷的溫度 設(shè)定為15。C以下的連續(xù)離心機(jī)(Westfalia S印arator AG，類型BKAS-85-076)中將 懸浮液離心(9000g)。然后分為8和35kg兩個(gè)部分，混合上清液。
5:使用6M的鹽酸將上清液(蛋白提取物)的PH調(diào)低至4. 8，然后材料在4'C下 攪拌2小時(shí)。然后，通過上述離心去除顆粒狀的物質(zhì)。共有18.8千克的材料是顆粒 狀的。
大約2kg的這種材料，在10mM的2-巰基乙醇和20X的甘油存在的情況下，溶解 在4'C， 8.5升的10mM的磷酸緩沖液中，然后將他們以17等份、每份500ml儲(chǔ)藏在 一40。C。這種樣品定義為大豆蛋白的分離物(批號(hào)PR001， 土519g蛋白/8500ml)。
6:在5中獲得的12.4 kg的顆粒狀物質(zhì)，在10mM 2—巰基乙醇存在的情況下， 于4t;并通過攪拌2小時(shí)，溶解于120L的10mM的磷酸緩沖液(PH7.8)。然后，使用 6M的鹽酸將溶液的ra值調(diào)低至PH為6.4，然后這些材料在4。C下再攪拌2小時(shí)。顆 粒物質(zhì)再通過連續(xù)的離心收集(9000g)。
7:在10mM 2—巰基乙醇存在的情況下，在4。C中，用12升lOmM的磷酸緩沖液 (PH7.8)將轉(zhuǎn)子里面的顆粒物質(zhì)(大約3.5升的材料)懸浮。加入硫酸銨，得到百 分比為50%飽和的溶液。4。C攪拌1小時(shí)后將懸浮液離心(Sorvall GSA轉(zhuǎn)子，30min， 12000g)。然后，又加入硫酸銨到上清液中，達(dá)到飽和程度為70%，攪拌1小時(shí)后， 上清液再次離心(Sorvall GSA轉(zhuǎn)子，30min， 12000g)，收集顆粒狀的物質(zhì)。
在10mM的2-巰基乙醇和20%的甘油存在的情況下，在4'C中，用1升的10niM的 磷酸緩沖液(PH7.8)溶解這些顆粒狀的物質(zhì)，并且以4等分、每份250ml儲(chǔ)藏在一 40°C。這個(gè)樣品定義為分離的大豆球蛋白(批號(hào)PR002, 土56克蛋白/1000ml)。
8:在5中獲取的剩余的4.4kg的顆粒物質(zhì)同其它所有的在步驟6中獲得的顆粒 組分混合，然后在10mM的2—巰基乙醇存在的情況下，用120升lOraM的磷酸緩沖液 (PH7. 8)溶解。用6M的鹽酸將溶液的PH值調(diào)低至6. 0 (而不是步驟6的6. 4)，在 不斷攪拌的情況下在4 'C下孵育2小時(shí)。按照上述的相同的連續(xù)離心的步驟收集沉 淀的物質(zhì)，這次的顆粒物質(zhì)更固體化。
9:在10mM2 —巰基乙醇存在的情況下，在4。C中，用16升的lOmM的磷酸緩沖液
(pH7.8)溶解顆粒物質(zhì)(大約4kg)，在溶液中加入硫酸銨，獲得飽和百分比為45
%。在4。C中孵育1小時(shí)后，離心懸浮液(Sorvall GSA轉(zhuǎn)子，30min， 12000g)，然
后在上清液中加入硫酸銨使得飽和度達(dá)到75%。在4'C中孵育1小時(shí)后，材料被再次離心(Sorvall GSA轉(zhuǎn)子，30min， 12000g)，收集顆粒物質(zhì)。
這些顆粒物質(zhì)在IO函的2-巰基乙醇和20%的甘油的存在的情況下，溶解在4°C， 3. 5升的10mM的磷酸緩沖液(PH7. 8)中，將他們以17等份、每份500ml儲(chǔ)藏在 一40。C。該樣品定義為分離的大豆球蛋白(批號(hào)PR004, 土472.5g蛋白/3500ml)。
10:將步驟8中獲得的大約120升的上清液的PH值從6.0降低到4.8，在不攪拌 的情況下，在4。C中孵化72小時(shí)。然后，輕輕的除去頂部的上清液，沉淀物質(zhì)(3.5 升)儲(chǔ)藏在一40。C的溫度下。懸浮液然后解凍和離心(Beckman JA14, 30min, 4'C， 18000g)。收集顆粒物質(zhì)，用lOraM的磷酸緩沖液(PH7. 6)溶解4小時(shí)，用2N的氫 氧化鈉保持PH值為7.6。
這些顆粒物質(zhì)在20%的甘油存在的情況下，溶解在2. 1升的lOmM的磷酸緩沖液 (PH7. 6)中，將他們以44等份的ca. 50ml儲(chǔ)藏在一4CTC。該后者的材料定義為去 大豆球蛋白的大豆蛋白分離物(批號(hào)PR003,150.4g蛋白/2191ml g)。
乳清蛋白 材料
實(shí)驗(yàn)采用乳清蛋白分離物(Bipro Davisco)和Hiprotal 580G(由Friesland食 品公司提供)。
美拉德反應(yīng)
用去離子水透析27克乳清蛋白分離物(WPI; Bipro)。 一個(gè)樣品(對(duì)應(yīng)于總蛋白 的1/9，也就是3克)作為對(duì)照，剩余的蛋白分為兩個(gè)部分。果糖加入到其中一個(gè) 部分中，葡萄糖加入到另一個(gè)部分(4.5克)的蛋白中，并且PH值調(diào)節(jié)到5或者8。 然后混合物被凍干。
在4。C用5mM PH8. 0的Tris-HCl透析15克Hiprotal 。 5. 3g葡萄糖加入到423ml 的透析液中。調(diào)節(jié)透析液的PH值為8，然后冷凍干燥蛋白。
美拉德反應(yīng)
使樣品發(fā)生美拉德反應(yīng)如下冷凍干燥的蛋白一糖混合物在weiss箱中在5(TC， 相對(duì)濕度為65%的條件下孵育。取出樣品(0， 1， 2， 5， 8和/或24小時(shí))，儲(chǔ)藏在 一2(TC中待用。然后，產(chǎn)品用去離子水重新溶解和透析。然后冷凍干燥，儲(chǔ)藏待用 (4或一2(TC)。0PA分析
修飾的程度由OPA分析的方式確定。
鈣誘導(dǎo)的聚集分析研究
為了確定美拉德產(chǎn)物的鈣誘導(dǎo)的聚集特征，用10mM的PH6. 7+50mM H印es溶解 10mg/ml的樣品。加熱后(60 — 75'C，加熱步驟的長(zhǎng)度可以參看各自的試驗(yàn))樣品的 混濁度可以通過在500nm由分光光度法來核定，其為增加的鈣濃度的作用。這作為所 有制劑的一個(gè)終點(diǎn)測(cè)定(Pharmacia Ultrospec4000)來執(zhí)行。通過使用Varian Cary (于10mMH印es pH6. 7+50mM的NaCl中的10mg/ml的溶液)以基于乳清的美拉德產(chǎn) 物進(jìn)行聚集動(dòng)力學(xué)的研究。
儲(chǔ)藏時(shí)間測(cè)試
用溶液中的美拉德產(chǎn)物進(jìn)行簡(jiǎn)單的儲(chǔ)藏時(shí)間測(cè)試。SPI和WPI: 10—40mg/ml的 美拉德產(chǎn)物溶解在50mM的PH為7的Tris-HC1溶液中，或者在PH為4. 5的琥珀酸緩 沖液中。在樣品中加入不同數(shù)量的氯化鈣，在所有的樣品中含有50mM的氯化鈉。在 樣品儲(chǔ)藏前后(4 °C)用OPA分析來確定美拉德反應(yīng)的程度。然后進(jìn)行樣品受熱測(cè) 試(類似于巴氏滅菌法；短時(shí)間的75t)以確定樣品的熱穩(wěn)定性/鈣一誘導(dǎo)聚集。用 SPI-W和Hiprotal來進(jìn)行一個(gè)比較的測(cè)試。在這種情況下，PH為6. 7 (50mM H印es + 50mMNaCl)，溫度在4。C。另外， 一個(gè)測(cè)試在F>H為8 (50mMTris-HCl+50mMNaCl)， 儲(chǔ)藏溫度為30。C。
結(jié)果
WPI (Bipro)
比較而言，在葡萄糖存在的情況下比在果糖存在的情況下，WPI的美拉德反應(yīng)具 有更快的動(dòng)力學(xué)以達(dá)到大范圍的修飾。對(duì)于葡萄糖，孵化8小時(shí)后，大約20%的可利 用賴氨酸被修飾，24小時(shí)后，超過80%的賴氨酸被修飾。
Bipro的鈣誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)
從終點(diǎn)測(cè)試中我們了解到，在6(TC時(shí)，與未處理的樣品比較而言，經(jīng)美拉德處
理過的WPI(用葡萄糖；24小時(shí))對(duì)于50mM的鈣具有明顯更低的敏感性。具有較高
程度美拉德反應(yīng)的樣品，尤其是含有葡萄糖的WPI樣品，在孵化24小時(shí)后，對(duì)鈣誘
導(dǎo)的聚集反應(yīng)具有較低的敏感性。最大的聚集發(fā)生時(shí)的鈣轉(zhuǎn)移到更高的氯化鈣的濃 度下(從大約10到大約25mM).
含有葡萄糖的WPI的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，在孵化24小時(shí)后，在加熱到6(TC時(shí)，對(duì) 于達(dá)到100mM的氯化鈣的濃度表現(xiàn)出不敏感。而且在這個(gè)例子中，試驗(yàn)在7(TC下進(jìn)行， 相對(duì)于非美拉德的對(duì)照來說，在WPI/葡萄糖/24小時(shí)的美拉德產(chǎn)物中，觀察到鈣誘導(dǎo) 的聚集明顯的下降。
來自WPI的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的儲(chǔ)藏測(cè)試
在選擇WPI美拉德產(chǎn)物時(shí)，要進(jìn)行儲(chǔ)藏測(cè)試(PH7，溫度4'C)。這些樣品含有不 同數(shù)量，可達(dá)到100mM的氯化鈣。增加鈣是為了看他們是否對(duì)美拉德產(chǎn)物有穩(wěn)定的效 應(yīng)。儲(chǔ)存樣本，并于一周后通過OPA試驗(yàn)進(jìn)行分析。
已經(jīng)表明，24小時(shí)的樣品在溶液中至少穩(wěn)定一周的時(shí)間。氯化鈣的存在好像并 不會(huì)影響美拉德產(chǎn)物的穩(wěn)定性。在PH為4的情況下，儲(chǔ)藏測(cè)試中也可以觀察到類似 的趨勢(shì)。3周后，樣品中仍然觀察到大量的美拉德產(chǎn)物的存在。
Hiprotal 580G
為了確認(rèn)由Bipro建立的結(jié)果，使用Hiprotal進(jìn)行第二系列的研究。有一個(gè)樣 品比現(xiàn)在的樣品給與了更長(zhǎng)的孵育的時(shí)間，并保留在Weiss箱中進(jìn)行4天的美拉德反 應(yīng)(3天在50'C/相對(duì)濕度為6596;然后一天為55。C/相對(duì)濕度為65《)。在美拉德反應(yīng) 后樣品沒有透析，因此未結(jié)合的葡萄糖還是存在，并未進(jìn)行以確定自由伯胺基數(shù)量的 0PA的試驗(yàn)。這個(gè)樣品為Hiprotal "長(zhǎng)期"。
通過0PA試驗(yàn)，存在于Hiprotal試樣中的自由伯胺基的確定表明，相對(duì)于Bipro 而言，在蛋白試樣中伯胺基數(shù)量下降相對(duì)較少(美拉德反應(yīng)程度低)。8小時(shí)的孵育 后，大約20%的可利用賴氨酸發(fā)生美拉德反應(yīng)。24小時(shí)后，大約40%的發(fā)生反應(yīng)。
Hiprotal的巴斯德殺菌試驗(yàn)
在Hiprotal/葡萄糖24小時(shí)的情況下，最大混濁度曲線轉(zhuǎn)移至50mM的氯化鈣。 Hiprotal "長(zhǎng)期"樣品幾乎對(duì)氯化鈣不敏感。
由鈣一引發(fā)聚集的動(dòng)力學(xué)測(cè)試
Hiprotal的美拉德產(chǎn)物進(jìn)行鈣依賴性的聚集的動(dòng)力學(xué)研究。Hiprotal24小時(shí)的
樣品在6(TC幾乎沒有任何的聚集，這比對(duì)照組對(duì)鈣的敏感性有明顯的下降。Hiprotal
8小時(shí)的樣品在60。C實(shí)驗(yàn)時(shí)比對(duì)照效果好。但是Hiprota124小時(shí)更好。最終，用
Hiprotal "長(zhǎng)期"樣品獲得了最吸引人的結(jié)果。動(dòng)力學(xué)測(cè)試表明，在75。C時(shí)，幾乎 不能測(cè)量到混濁度。同樣，在任何濃度的鈣的樣本中，都沒有觀察到沉淀。對(duì)比而 言，在75'C的對(duì)照的樣本中和(相同的程度)在1 = 8小時(shí)的樣本中觀察到了混濁。
可以清楚看到的是，在6(TC的試驗(yàn)中，與對(duì)照比較而言(25mM)，在t = 8和t =24小時(shí)的樣本中(50mM)，最大的混濁出現(xiàn)在較高的鈣濃度下。這進(jìn)一步的表明美 拉德反應(yīng)會(huì)降低對(duì)于鈣的敏感性。隨著鈣濃度達(dá)到100mM時(shí)候，大程度的美拉德反 應(yīng)的Hiprotal在75 。C時(shí)沒有呈現(xiàn)出明顯的混濁。
Hiprotal儲(chǔ)藏測(cè)試
Hiprotal美拉德產(chǎn)物在4°C/PH6. 7的情況下可以至少穩(wěn)定一周。
使用Luff試劑確定還原性糖
以下描述的過程可以用于確定還原性糖的存在。方法是定性的。
Luff試劑
溶液A用100ml的去離子水配制的含有25g硫酸銅的溶液(CuS04 5H20) B 用50ml的去離子水配制的含有50g檸檬酸的溶液 C用400ml溫水配制的含有143. 8g碳酸鈉的溶液
在平衡上述的溶液到室溫后，溶液B和C添加到一起。然后，添加溶液A。然后 添加去離子水定容到1升。這個(gè)試劑可以使用2天。
步驟
1. 配制lwt^的糖溶液。
2. 用移液管移走1ml的糖溶液(稀釋到0. 1%(V/V))到2個(gè)反應(yīng)管中。
3. 每次向第一管中添加0. 5ml的去離子水，向第二管中添加0. 5ml 0. IN的碘溶 液和2—3滴的1N的氫氧化鈉。混合這些溶液，然后在室溫下放置15分鐘。
4. 根據(jù)Luff，用移液管向所有的管中移入2ml的銅試劑。混合并且放置所有的管 到沸騰的水浴中，加熱5 — 10分鐘。
5. 出現(xiàn)紅色的沉淀表明還原性糖的存在。
權(quán)利要求
1.一種二價(jià)陽離子強(qiáng)化基于水的食品，所述食品以水的重量計(jì)包含至少0.2％的富含賴氨酸的蛋白，其中每克所述的蛋白中，富含賴氨酸的蛋白含有至少4.5重量％的賴氨酸，其中，通過OPA試驗(yàn)確定，至少20％的存在于富含賴氨酸的蛋白中的賴氨酸殘基被糖基化，所述的食品本質(zhì)上不含有不溶解的二價(jià)陽離子復(fù)合的富含賴氨酸的蛋白鹽，并且含有溶解的二價(jià)陽離子，導(dǎo)致非糖基化形式的富含賴氨酸的蛋白沉淀為二價(jià)陽離子復(fù)合蛋白鹽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的食品，其中所述食品包含至少50重量％，優(yōu)選至少80重量 %的水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項(xiàng)所述的食品，其中所述富含賴氨酸蛋白在變性過程 中至少90%的非修飾部分發(fā)生焓變。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3任意一項(xiàng)所述的食品，所述的食品含有一定數(shù)量的溶解的二價(jià) 陽離子，在超過該數(shù)量至少5%的二價(jià)陽離子的濃度下，非修飾的蛋白會(huì)發(fā)生沉淀。
5. 根據(jù)前述的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的食品，所述的食品包含溶解的二價(jià)陽離子，以 所述富含賴氨酸蛋白的重量計(jì)，濃度至少為2%。
6. 根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的食品，其中所述富含賴氨酸蛋白是大豆蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的食品，其中所述食品是豆奶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l一5中的任意一項(xiàng)所述的食品，其中所述富含賴氨酸的蛋白是乳清 蛋白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的食品，其中所述食品是牛乳或者它的衍生物。
10. 根據(jù)前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的食品，其中所述的二價(jià)陽離子包括Ca"和/或 Mg2+。
11. 富含賴氨酸的蛋白的應(yīng)用，其中在制備基于水的二價(jià)陽離子強(qiáng)化食品中至少20% 的賴氨酸殘基已經(jīng)被糖基化，糖基化的富含賴氨酸的蛋白充分溶解，而非糖基化形式 的富含賴氨酸的蛋白會(huì)成為二價(jià)陽離子復(fù)合的富含賴氨酸的蛋白鹽而沉淀下來，在每 克所述的蛋白中，所述的富含賴氨酸的蛋白含有至少4. 5重量％的賴氨酸。
12. —種增加二價(jià)陽離子的蛋白結(jié)合能力的方法，所述的方法包括使蛋白質(zhì)處于美拉 德反應(yīng)的條件。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的方法包括提供干燥或固態(tài)的蛋白以 及含有還原羰基部分的化合物的混合物的步驟，，以及在相對(duì)濕度至少為55%的環(huán)境下 加熱所述混合物到溫度至少為4(TC。
14. 一種修飾的蛋白產(chǎn)品組合物，以糖基化的富含賴氨酸的蛋白干物質(zhì)的重量計(jì)，所 述組合物包含至少80%，在每克所述的蛋白中，所述的富含賴氨酸的蛋白含有至少4. 5 重量％的賴氨酸，其中存在于富含賴氨酸蛋白中至少有20%的賴氨酸殘基被糖基化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有結(jié)合二價(jià)陽離子的增強(qiáng)的能力的修飾蛋白的制備方法。例如通過使蛋白質(zhì)處于美拉德反應(yīng)的條件下，鈣離子誘導(dǎo)聚集發(fā)生時(shí)的鈣離子的濃度增加。這種修飾蛋白用于制備鈣強(qiáng)化食品。
文檔編號(hào)A23C9/152GK101098631SQ200580046252
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月15日
發(fā)明者亨瑞克·艾伯特斯·科斯特, 赫曼·亨利·雅各布斯·德喬格 申請(qǐng)人:荷蘭Csm公司