專利名稱：：蛋白的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明關(guān)注以不同于高等植物的真核細(xì)胞和生物體作為宿主體系生產(chǎn)重組肽和蛋白。更具體地，將肽和蛋白融合到介導(dǎo)誘導(dǎo)重組蛋白體樣組裝體(recombinantproteinbody-likeassembly,RPBLA)形成的蛋白序列，用適合的載體轉(zhuǎn)化后在這些宿主體系中穩(wěn)定地表達(dá)和積聚。
背景技術(shù)：
：在過去十年，出于治療、營養(yǎng)或工業(yè)目的的重組蛋白生產(chǎn)已取得很大成功。已證實不同的真核細(xì)胞和生物體可生產(chǎn)基于活性蛋白的治療劑。遺憾的是，通常源于低的重組蛋白生產(chǎn)水平和/或蛋白分離和純化操作的高成本，使它們的工業(yè)應(yīng)用不能實現(xiàn)。已進(jìn)行了積極的研究，以通過不同的方法改進(jìn)生產(chǎn)水平和純化操作。已開發(fā)了基于將感興趣的蛋白與植物種子貯藏蛋白結(jié)構(gòu)域融合的新技術(shù)(WO2004/003207)，用于增強(qiáng)重組蛋白在高等植物中的穩(wěn)定性和積聚。這些貯藏蛋白為植物種子所特有，并以蛋白體穩(wěn)定的積聚在其中(Galilietal"1993,7>em^Ce/Z腺3:437-442)。所述貯藏蛋白通過信號肽插入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔中，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中組裝形成稱作ER衍生蛋白體(ER-PB)的特定細(xì)胞器，或在蛋白貯藏液泡(PSV)中組裝(OkitaandRogers1996Annu.Rev,PlantPhysiolMol.Biol.47:327-50;HermanandLarkins1999PlantCell11:601-613;SanderfootandRaikel1999PlantCell11:629-642)。也已描述了重組貝i藏蛋白在諸如爪蟾卵母細(xì)胞和酵母的非植物宿主體系的蛋白體樣(PB-like)細(xì)胞器中組裝。已描述了經(jīng)注射相應(yīng)的mRNA在爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)谷類醇溶谷蛋白(最豐富的谷類貯藏蛋白)。已將這種體系用作模型來研究這些貯藏蛋白的輩巴向特性(Simonetal.,1990,戶/a"fCe〃2:941-950;Altschuleretal"1993，Ce〃5:443-450;Torrentetal"1994，192:512-518),以及測試修飾19kDaa-玉米蛋白(一種玉米醇溶谷蛋白)而不改變其穩(wěn)定性的可能性，該修飾通過將必需氨基酸賴氨酸和色氨酸引入其序列中來進(jìn)行(Wallaceetal，1988,Scz'e"ce240:662-664)。出于不同目的，也已在酵母中生產(chǎn)了玉米蛋白類(玉米醇溶谷蛋白的復(fù)雜群)。Coraggioetal.，1988，五w/Ce〃歷o/47:165-172在酵母中表達(dá)天然和l務(wù)飾的a-玉米蛋白，以研究這種蛋白的耙向決定子。KimetaL2002,尸/a"fCe〃14:655-672研究了導(dǎo)致蛋白體形成的a-、j8-、r和S-玉米蛋白的可能的相互作用。為解決這個問題，他們用編碼這些蛋白'的cDNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。此外，這些作者構(gòu)建了玉米蛋白-GFP融合蛋白以確定玉米蛋白在酵母細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。接著，可將酵母細(xì)胞作為模型表達(dá)體系研究玉米蛋白的特性。值得注意的是，Kimetal.，2002,尸/a^Ce〃14:655-672得出結(jié)論為酵母不是研究玉米蛋白相互作用的好模型，因為玉米蛋白本身在轉(zhuǎn)化的酵母中極少積聚。也將酵母細(xì)胞用作模型研究調(diào)控稱作麥醇溶蛋白的小麥貯藏蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白體沉積的機(jī)制(Rosenbergetal,，1993，地W尸/—/102:61-69)。這里，我們證實介導(dǎo)重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)的誘導(dǎo)的蛋白序列，例如醇溶谷蛋白或醇溶谷蛋白結(jié)構(gòu)域，與感興趣的(目標(biāo))肽或蛋白的融合介導(dǎo)了那些RPBLA在諸如真菌(包括酵母)、藻類和動物的生物體的細(xì)胞中積聚。有趣的是，這些融合蛋白在動物細(xì)胞的蛋白體樣細(xì)胞器結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定積聚。發(fā)明的筒要概述本發(fā)明提供了在諸如動物、真菌和藻類的不同于高等植物的真核細(xì)胞中以及在培養(yǎng)的動物、真菌和藻類細(xì)胞中生產(chǎn)包含蛋白體誘導(dǎo)序列(PBIS)和感興趣肽或蛋白(本文常統(tǒng)稱為多肽)的融合蛋白的體系和方法，包含感興趣的肽或蛋白的融合蛋白以重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)在這些細(xì)胞中穩(wěn)定地積聚。PBIS能夠介導(dǎo)誘導(dǎo)RPBLA形成以及蛋白進(jìn)入這些細(xì)胞器和/或在這些細(xì)胞器中積聚，例如天然和^f務(wù)飾的貯藏蛋白序列連同感興趣(目標(biāo))肽或蛋白。本發(fā)明尤其提供了在作為宿主體系的不同于高等植物的真核細(xì)胞中以融合蛋白的形式生產(chǎn)感興趣的產(chǎn)物的方法，其中所述宿主體系被包含編碼PBIS的核酸部分和編碼感興趣多肽產(chǎn)物的核酸部分的核酸序列所轉(zhuǎn)化。在具體的實施方案中，用于轉(zhuǎn)化的核酸序列包含(i)編碼PBIS的核酸序列，以及(ii)包含編碼感興趣產(chǎn)物的核苷酸序列的核酸序列。在一個實施方案中，將核酸序列(i)的3'端連接到所述核酸序列(ii)的5，端。在另一個實施方案中，將核酸序列(i)的5'端連接到所述核酸序列(ii)的3，端。因此，PBIS序列可在融合蛋白的N末端或C末端。在另一具體實施方案中，除了前述核酸序列(i)和(ii)外，用于轉(zhuǎn)化的核酸序列還包含含有編碼間隔氨基酸序列的核苷酸序列的核酸序基酸序列。在一個具體的實施方案中，核酸序列(iii)位于核酸序列(i)和(ii)之間，例如，將核酸序列(iii)的3'端連接到所述核酸序列(ii)的5，端。在另一個實施方案中，將所述核酸序列(iii)的5'端連接到核酸序列(ii)的3'端。另外，在一個具體實施方案中，用于轉(zhuǎn)化目的的核酸序列編碼特定可斷開的序列，如才艮據(jù)專利申請WO2004003207所定義的，該申請與本申請一起轉(zhuǎn)讓。而且，在另外的實施方案中，所述核酸與專利申請WO2004003207—致，但其中缺少通過酶或化學(xué)方法可特異斷開的編碼氨基酸序列的核酸序列。在另一實施方案中，融合蛋白可為PBIS和感興趣肽或蛋白之間的直接融合。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法還包括分離和純化融合蛋白。在另一實施方案中，將感興趣蛋白融合到天然或修飾的貯藏蛋白，例如天然或修飾的醇溶谷蛋白或醇溶谷蛋白結(jié)構(gòu)域。感興趣蛋白的實例包括具有治療、營養(yǎng)、生物控制或工業(yè)用途的任何蛋白。示例性的蛋白和肽例如包括諸如降鈣素和生長激素等的激素、諸如單克隆抗體和其片段的抗體、諸如可用作針對人免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗的抗原、乙型肝炎表面或核心蛋白、胃腸炎冠狀病毒等、蛋白酶抑制劑、抗生素、膠原蛋白、人乳鐵蛋白、細(xì)胞因子、諸如水解酶、糖苷酶和氧化還原酶等的工業(yè)用酶。附圖簡要說明在形成本^^開內(nèi)容的一部分的附圖中圖1為SDS/PAGE分析照片，顯示融合蛋白在轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞中的積聚，所述融合蛋白包括作為各感興趣蛋白連接到7-玉米蛋白衍生的RX3蛋白體誘導(dǎo)序列的降鈣素(Ct)、人生長激素(hGH)和表皮生長因子(EGF)。顯示了融合蛋白RX3-Ct、RX3-hGH和RX3-EGF在轉(zhuǎn)化的293T、CHO和Cosl培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞中的積聚。轉(zhuǎn)染44小時后，提取等量的轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞，采用抗7"-玉米蛋白的抗體通過電泳和Western印跡分析相應(yīng)的總可溶蛋白。也包4舌了編碼RX3-Ct、RX3-hGH和RX3-EGF融合蛋白的構(gòu)建體的示意圖。"c"=細(xì)胞；"RX3"=無信號肽的N末端富集脯氨酸的，玉米蛋白序列；"m"=培養(yǎng)基。左邊標(biāo)明了分子量標(biāo)記(kDa)。圖2為照片，以六個圖(A-F)顯示了RPBLA中的融合蛋白在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)的定位。共焦顯微鏡法用于顯示表達(dá)RX3-CT的Cosl細(xì)胞(圖2A)、表達(dá)RX3-Ct的CHO細(xì)胞(圖2B)、表達(dá)RX3-EGF的CHO細(xì)胞(圖2C)以及共表達(dá)RX3-Ct和DsRed2-ER標(biāo)記蛋白的293T細(xì)月包(圖2D、圖2E和圖2F)。釆用抗7-玉米蛋白血清，RX3衍生的融合蛋白被免疫定位在蛋白體樣結(jié)構(gòu)(圖2A-2D)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(見圖2A中的箭頭)中。圖2E顯示用紅色熒光DsRed2-ER蛋白標(biāo)記染色的ER。圖2F顯示圖2D和圖2E的重疊，顯示RX3-Ct與DsRed2在ER和在PBLS中的共定位。圖2A和圖2C中的插圖顯示PBLS的高倍放大圖。標(biāo)尺條為1微米。圖3用兩個圖(A和B)顯示在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中融合蛋白的積聚。圖3A顯示RX3-EGF(道cll7)和RX3-hGH(道cll8)融合蛋白在轉(zhuǎn)化的Sacc/mram;;c^(酵母屬)中的積聚。采用特異性抗體通過免疫印跡分析來自細(xì)胞和培養(yǎng)基等量的總蛋白提取物。用無插入物的pYX243質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作為對照(C)。每個圖的下面包括編碼RX3-hGH和RX3-EGF融合蛋白構(gòu)建體的示意圖。圖3B顯示使用兩種不同的信號肽時包含hGH和RX3-hGH的融合蛋白在/7Wto^(巴斯德畢赤酵母)中的積聚。采用特異性抗體通過免疫印跡分析來自轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和培養(yǎng)基等量的總蛋白提取物。C1和C2分別表示作為對照的pPIC9和pPIC3.5K質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在圖的下面示出了編碼RX3-hGH融合蛋白的構(gòu)建體cl35和c121以及編碼hGH的構(gòu)建體cl36的示意圖。圖的左邊表示分子量標(biāo)記(kDa)。"y"=酵母細(xì)胞；"m"=培養(yǎng)基；"SPg"=來自y玉米蛋白的信號肽；"RX3"=無信號肽的N末端富集脯氨酸的7-玉米蛋白序列；"EGF，，=表皮生長因子；"hGH"=人生長激素；"Afprepro"=a因子前體肽原(prepropeptide)。本發(fā)明具有一些好處和優(yōu)勢。一個好處為它的應(yīng)用使得可在選擇的非高等植物真核細(xì)胞中相對筒單和快速地表達(dá)所期望的重組蛋白。本發(fā)明的優(yōu)勢為由于以RPBLA形式表達(dá)而提供了可容易獲得和純化的重組蛋白的來源。由于下文的討論，其它的一些好處和優(yōu)勢對技術(shù)人員是顯而易見的。發(fā)明的詳細(xì)描述所關(guān)注的重組蛋白是在表達(dá)它們的宿主細(xì)胞中形成重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)的融合蛋白。該RPBLA形成由在細(xì)胞內(nèi)形成高密度沉積物的貯藏蛋白結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)。這些密集的沉積物在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)膜體系細(xì)胞器、線粒體、質(zhì)體中聚集或被分泌。重組蛋白體樣組裝體具有隨不同融合蛋白而不同的預(yù)定密度，但對于制備的特定融合蛋白是已知的。RPBLA的這種預(yù)定密度通常大于在勻漿中存在的幾乎所有內(nèi)源性宿主細(xì)胞蛋白的密度，并且通常在約1.1至1.35g/ml之間。這種新RPBLA的高密度是源自重組融合蛋白組裝為多聚體并積聚的一般能力。在非高等植物真核細(xì)胞中表達(dá)所關(guān)注的RPBLA，它們通常以如上所述的密度為特征。當(dāng)在動物細(xì)胞中表達(dá)時，RPBLA的形狀通常為J求形，具有約1微米(a0的直徑，并且具有環(huán)繞的膜。這些融合蛋白包含通過肽鍵直接或間接地連接在一起的兩種多肽序列，其中一種序列為連接到感興趣(目標(biāo))多肽產(chǎn)物(例如肽或蛋白)的蛋白體誘導(dǎo)序列(PBIS)。PBIS為介導(dǎo)誘導(dǎo)RPBLA形成以及蛋白進(jìn)入細(xì)胞器和/或在細(xì)胞器中積聚的蛋白或肽氨基酸序列。PBIS和宿主細(xì)胞優(yōu)選來自生物學(xué)上不同的門。因此，PBIS通常來自高等植物一種子植物，而宿主細(xì)胞為不同于種子植物的真核細(xì)胞，可以是動物細(xì)胞，例如哺乳動物或昆蟲細(xì)胞、真菌/酵母、或藻類細(xì)胞，所有這些都來自不同于種子植物的門。示例性、非限定性的PBIS的例子包括貯藏蛋白或修飾的貯藏蛋白，例如醇溶谷蛋白或修飾的醇溶谷蛋白、醇溶谷蛋白結(jié)構(gòu)域或修飾的醇溶谷蛋白結(jié)構(gòu)域。在Shewryetal.,2002/.五xp.53(370):947-958中綜述了醇溶谷蛋白。優(yōu)選的PBIS為那些醇溶谷蛋白化合物，如下述的7-玉米蛋白、a-玉米蛋白或稻米醇溶谷蛋白。7-玉米蛋白為玉米貯藏蛋白，下文示出了其DNA和氨基酸殘基序列，它是四種玉米醇溶谷蛋白中的一種，占玉米胚乳總蛋白的10-15%。和其它谷類醇溶谷蛋白一樣，a-和7-玉米蛋白在粗糙型ER細(xì)胞質(zhì)側(cè)的膜結(jié)合多核糖體中生物合成，在腔內(nèi)組裝，然后隔離到ER衍生的蛋白體中(Hermanetal.，1999尸/a"fCe〃11:601-613;Ludevidetal.，1984P/awf^fo/.5zo/.3:277-234;Torrentetal.，1986尸/awZAfo/.5zo/.7:93-403)。7-玉米蛋白由四種特征性結(jié)構(gòu)域組成i)19個氨基酸的肽信號；ii)包含八單位六肽PPPVHL(SEQIDNO:l)的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(53aa);iii)脯氨酸殘基與其它氨基酸交替的ProX結(jié)構(gòu)域(29aa);以及iv)疏水的半胱氨酸富集的C端結(jié)構(gòu)域(lllaa)。7-玉米蛋白在ER衍生的RPBLA中組裝的能力并不限于種子。實際上，當(dāng)7-玉米蛋白基因在轉(zhuǎn)基因的擬南齊(Arabidopsis)植物中組成型表達(dá)時，貯藏蛋白在葉肉細(xì)胞的ER衍生的PBLS中積聚(Gelietal.,1994P/aWCe〃6:1911-1922)。為了尋找負(fù)責(zé)，玉米蛋白沉積到ER衍生的蛋白體中的信號(醇溶谷蛋白沒有KDEL信號)，已證實包括串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的脯氨酸富集的N末端結(jié)構(gòu)域是ER駐留所必需的，而C端結(jié)構(gòu)域涉及蛋白體形成。然而，仍不知道這些結(jié)構(gòu)域促使蛋白體組裝的機(jī)制。由于蛋白體是僅在種子中的合適命名，那么在其它植物器官和在非高等植物中產(chǎn)生的同樣的結(jié)構(gòu)通常就稱為重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)。下表示出了示例性的其他有用的醇溶谷蛋白型序列以及它們的GenBank標(biāo)識。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通過在所有非冗余GenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRF(排除環(huán)境樣品)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)4亍BLAST查詢還可獲得有用的序列，如Altschuletal.,1997M/c/dc爿c^y25:3389-3402中所描述的采用如下所示的查詢RX3查詢SEQIDNO:2;a-玉米蛋白SEQIDNO:3;以及稻米醇溶谷蛋白查詢SEQIDNO:4。示例性的修飾的醇溶谷蛋白包括(a)信號肽序列，(b)—個或多個拷貝的Y-玉米蛋白的重復(fù)結(jié)構(gòu)域六肽PPPVHL(SEQIDNO:l)的序列，整個結(jié)構(gòu)域包含八個六肽單元；以及(c)y-玉米蛋白的ProX結(jié)構(gòu)域的全部或部分序列。示例性的具體的修飾的醇溶谷蛋白包括以下鑒定為R3、RX3和P4的多肽，下文也示出了其DNA和氨基酸殘基序列。具體的優(yōu)選的醇溶谷蛋白包括公開在已公布的申請WO2004003207中的y-玉米蛋白及其組成部分、稻米rP13蛋白和22kDa玉米a-玉米蛋白以及其N末端片段。y-玉米蛋白(27kD)、稻米和a-玉米蛋白的DNA和氨基酸序列顯示于SEQIDNO:5(DNA序列)和SEQIDNO:6(蛋白序列)；SEQIDNO:7(RX3DNA序列)和SEQIDNO:8(蛋白序列)；SEQIDNO:9(R3DNA序列)和SEQIDNO:10(蛋白序列)；SEQIDNO:11(P4DNA序歹'J)和SEQIDNO12(蛋白序列)；SEQIDNO:13(X10DNA序歹寸)和SEQIDNO:14(蛋白序列)；rP13:(蛋白序列SEQIDNO:15和DNA序列SEQIDNO:16)—與克隆AB016504同源的13kD稻米醇溶谷蛋白。Shaeta1.,1996所oscz'.5zo&c/mo/.5zoc/^附.60(2):335-337;Wenetal"1993P/awf戶/^wo/.101(3):1115-1116;Kawagoeetal.,2005PlantCell17(4):1141-1153;Mullinsetal"2004丄々nc.CA亂52(8):2242-2246;Mitsukawaetal.，1999所osc/.5Zo&c/mo/.歷ocAem.63(11):1851畫1858;22aZt(蛋白序列全長SEQIDNO:17和DNA序列全長SEQIDNO:18)，22kD-V01475玉米a-玉米蛋白的N末端片段。Kimetal.，2002P/a"ZCe〃14(3):655-672;Wooetal.，2001尸/a"fCe〃13(10):2297畫2317;Matsushimaetal.，19975zoc/nm.5zop/^s.爿"a1339(l):14-22;Thompsonetal"1992編.18(4):827-833。感興趣蛋白的實例包括具有治療、營養(yǎng)、生物控制或工業(yè)用途的任何蛋白，例如單克隆抗體(諸如IgG、IgM、IgA等的mAbs)及其片段、用于疫苗(人免疫缺陷病毒HIV;乙型肝炎前表面、表面和核心抗原；胃腸炎冠狀病毒等)的抗原、激素(降鈣素、生長激素等)、蛋白酶抑制劑、抗生素、膠原蛋白、人乳鐵蛋白、細(xì)胞因子、工業(yè)用酶(水解酶、糖苷酶和氧化還原酶等)。提供了示例性感興趣蛋白的示例性DNA和氨基酸殘基序列Salmon降鈣素BAC57417(蛋白序列SEQIDNO:19和DNA序列SEQIDNO:20);hEGF—基于AAF85790的無信號肽的構(gòu)建體(蛋白序列SEQIDNO:21和DNA序列SEQIDNO:22);hGH—基于P01241的無信號肽的構(gòu)建體(蛋白序列SEQIDNO:23和DNA序列SEQIDNO:24)。在另一實施方案中，重組融合蛋白除了包含PBIS和感興趣產(chǎn)物的序列外，還包含間隔氨基酸序列。間隔氨基酸序列可以為通過酶或化學(xué)方法可斷開或不可斷開的氨基酸序列。在具體的實施方案中，間隔氨基酸序列位于PBIS和目標(biāo)產(chǎn)物之間。示例性氨基酸序列可被蛋白酶斷開，這些蛋白酶如腸激酶、Arg-C內(nèi)蛋白酶、Glu-C內(nèi)蛋白酶、Lys-C內(nèi)蛋白酶、因子Xa等。作為選擇，可編碼通過諸如溴化氰(在甲硫氨酸殘基處斷開)的化學(xué)試劑可特異性斷開的氨基酸序列。在另一個實施方案中，用于轉(zhuǎn)化目的的核酸序列如根據(jù)一起轉(zhuǎn)讓的專利申請WO2004003207所公開的。而且，在另一實施方案中，核酸序列如根據(jù)專利申請WO2004003207所公開的，但是缺少編碼可斷開氨基酸序列的核酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)包括如下步驟的方法制備融合蛋白用包含(i)編碼PBIS的第一核酸序列和(ii)包含編碼感興趣多肽產(chǎn)物的核苷酸序列的第二核酸序列的核酸(DNA或RNA)序列轉(zhuǎn)化諸如動物、動物細(xì)胞培養(yǎng)物、真菌/酵母、昆蟲或藻類的非高等植物真核宿主細(xì)胞體系，其中第一核酸序列同框(inframe)可操作地連接到第二核酸序列；即，編碼PBIS的核酸序列化學(xué)鍵合(肽鍵合)到編碼感興趣多肽的序列，以至于兩種多肽可它們適合的讀碼框處表達(dá)。將宿主細(xì)l包在適于表達(dá)融合蛋白以及將表達(dá)的融合蛋白組裝進(jìn)重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)的培養(yǎng)條件下維持一段時間。表達(dá)后，得到的融合蛋白在轉(zhuǎn)化的宿主體系中積聚為高密度重組蛋白體樣組裝體。隨后可從宿主細(xì)胞中回收融合蛋白，或者，如果需要，將包含融合蛋白的宿主細(xì)胞用作含有添加了營養(yǎng)物或補(bǔ)充劑的動物食品。融合蛋白可作為RPBLA的一部分,皮分離或也與RPBLA分離。適合表達(dá)融合蛋白的培養(yǎng)條件通常對每一類型的宿主細(xì)胞是不同的。然而，這些條件為技術(shù)人員所公知并且容易確定。同樣地，培養(yǎng)時間隨宿主細(xì)胞和所期望制備的融合蛋白的量而不同。而且，這些條件是熟知的并且在特定情形下容易確定。另外，從本文的引文中可獲得特定的培養(yǎng)條件。在一個實施方案中，第一核酸序列(i)的3，端連接G定合)到第二核酸序列(ii)的5，端。在其他實施方案中，將第一核酸序列(i)的5'端連接(鍵合)到第二核酸序列(ii)的3，端。在另一個實施方案中，PBIS包括貯藏蛋白或修飾的貯藏蛋白、其片段或修飾的片段。在另一具體實施方案中，根據(jù)包括如下步驟的方法制備融合蛋白用除了包含前述核酸序列(i)和(ii)之外還包含編碼間隔氨基酸序列的同框核酸序列(iii)的核酸序列轉(zhuǎn)化諸如動物、動物細(xì)胞培養(yǎng)物、真菌/酵母或藻類的宿主細(xì)胞體系。間隔氨基酸序列可以為通過酶或化學(xué)方法可斷開或不可裂開的氨基酸序列，如上所述。在一個具體實施方案中，核酸序列(iii)置于所述核酸序列(i)和(ii)之間，例如，將第三核酸序列(iii)的3'端連接到第二核酸序列(ii)的5，端。在另一個實施方案中，將第三核酸序列(iii)的5'端連接到第二核酸序列(ii)的3，端。本發(fā)明還關(guān)注編碼前述融合蛋白分子的核酸序列(片段)或該編碼序列的互補(bǔ)物。在一些優(yōu)選的實施方案中，這種核酸片段以分離的或純化的形式存在。在活的生物體中，蛋白或多肽的氨基酸殘基序列通過遺傳密碼與編碼該蛋白的基因的脫氧核糖核酸(DNA)序列直接相關(guān)。因此，如果需要，可通過熟知的遺傳密碼簡并性制備其它的DNA和相應(yīng)的RNA序列(核酸)，它們編碼相同的融合蛋白氨基酸殘基序列，但與前述基因序列足夠不同以至于兩個序列不以高嚴(yán)緊型雜交，但可以中等嚴(yán)緊型雜交。高嚴(yán)緊型條件可定義為包括在溫度約50。-55°C下在6XSSC中的雜交，以及在溫度68。C下在l-3XSSC中的最終洗滌。中等嚴(yán)緊條件包括在溫度約50°C至65°C下在0.2至0.3MNaCl中的雜交，以及隨后在溫度約50。C至55°C下在0.2XSSC和0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)中的洗滌。本發(fā)明還關(guān)注本身編碼或其互補(bǔ)物編碼包含蛋白體誘導(dǎo)序列(PBIS)和感興趣多肽的核酸序列(DNA序列或RNA序列)。眾所周知，當(dāng)諸如所關(guān)注核酸序列的核酸序列可操作地連接到本文其它地方所述的適合的表達(dá)體系中的適合的啟動子時，該序列就可表達(dá)。不同的宿主常常偏愛特定的密碼子用于編碼特定的氨基酸殘基。這種密碼子偏愛是熟知的，編碼所期望融合蛋白序列的DNA序列可以改變，例如應(yīng)用體外突變，可使得待表達(dá)融合蛋白的特定宿主利用宿主偏愛的密碼子。本發(fā)明還關(guān)注包含載體的諸如DNA分子的重組核酸分子，所述載體包含適于在適合的真核宿主細(xì)胞生物體中啟動基因表達(dá)的諸如啟動子的一個或多個調(diào)控序列(控制元件)，該調(diào)控序列可操作地連接到確定編碼所關(guān)注的融合蛋白的基因的外源核酸片段(例如DNA片IS:或序列)，如上所述。更具體地，還關(guān)注包含載體的重組DNA分子，所述載體包含適于在宿主生物體細(xì)胞中啟動融合蛋白表達(dá)的啟動子，該啟動子可操作地連接到確定編碼連接到感興趣多肽的蛋白體誘導(dǎo)序列(PBIS)的DNA片段。在宿主真核細(xì)胞中適當(dāng)轉(zhuǎn)染和表達(dá)后，該重組DNA分子以RPBLA提供所關(guān)注的融合蛋白。本領(lǐng)域眾所周知，只要存在所需的核酸(例如DNA序列)(包4舌起始和終止信號)，那么其它的堿基對通常可存在于該DNA片段的任一端，并且該片段仍可被用于表達(dá)蛋白。由此可以認(rèn)為如果在所述片,爻中缺乏抑制表達(dá)的可操作連接的DNA序列，就可表達(dá)耗費(fèi)所期望表達(dá)的融合蛋白的其它產(chǎn)物、表達(dá)耗費(fèi)由期望的融合蛋白產(chǎn)生的期望反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)物，或者要不然就干擾該DNA片段表達(dá)該基因。因此，只要所述DNA片段沒有這些干擾DNA的序列，本發(fā)明的DNA片段約為500至15,000堿基對長度。如果需要，一旦復(fù)制和表達(dá)所需的所有最小的DNA序列存在時，重組DNA分子，特別是表達(dá)載體的最大尺寸大多情況下由便利性和宿主細(xì)胞所容納的載體尺寸來確定。最小載體尺寸是熟知的。這些長的DNA片段不是優(yōu)選的，但L可以使用?？赏ㄟ^化學(xué)方法合成編碼前述融合蛋白的DNA片段，例如Matteuccietal.(1981)/.C/zem.Soc.，103:3185中的石舞酸三酯方法。當(dāng)然，通過化學(xué)合成編碼序列，通過適合的堿基置換編碼天然氨基酸殘基序列的那些堿基可容易地實現(xiàn)任意期望的修改。然而，優(yōu)選包含本文具體討論的序列的DNA片段。包含編碼融合蛋白的基因的DNA片段優(yōu)選從包含該基因的重纟且DNA分子(質(zhì)粒載體)獲得。在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)融合蛋白基因的載體在本文稱為"表達(dá)載體"。表達(dá)載體包含包括啟動子在內(nèi)的表達(dá)控制元件。融合蛋白編碼基因可操作地連接到表達(dá)載體，使得啟動子序列指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合并表達(dá)融合蛋白編碼基因?？捎糜诒磉_(dá)多肽編碼基因的啟動子是那些可誘導(dǎo)的、病毒的、合成的、組成型的啟動子，如Poszkowskietal.(1989)五M5(9丄，3:2719和Odelletal.(1985)iVa^re,313:810中所述，以及可時間上調(diào)節(jié)、空間上調(diào)節(jié)以及時空上調(diào)節(jié)的啟動子，如Chuaetal.(1989)Sc/e"ce,244:174-181中所述。本發(fā)明關(guān)注適合于真核細(xì)胞的表達(dá)載體，如適合于酵母細(xì)胞的表達(dá)載體或適合于哺乳動物、藻類或昆蟲等的細(xì)胞的表達(dá)載體。這些表達(dá)載體還可用于形成本發(fā)明的重組DNA分子。用于諸如&cen'v&'ae或P/c/nVzpaeon's的酵母中的載體可以是游離基因的或是整合的，這是眾所周知的。真核細(xì)胞表達(dá)載體在本領(lǐng)域是熟知的，并且可從一些商業(yè)來源獲得。通常，這些載體包含一個或多個方便的限制性位點(diǎn)以插入所期望的DNA片段和啟動子序列。任選地，這些載體包含特意用于真核細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。用于S.cen'v/w'ae中的示例性啟動子包括「S.cwev&ae石壽酸甘油酸激酶(PGK)啟動子和異向啟動子(divergentpromoters)GAL10和GAL1，然而醇氧化酶基因(AOXl)是尸z'c/j/a的有用的啟動子。下文顯示了在S.cm'vz'57'ae和尸/c/n'a戸Wo/^s中示例性地表達(dá)融合蛋白。下文示例性地說明了在哺乳動物細(xì)胞中通過表達(dá)重組DNA產(chǎn)生融合蛋白，其中采用了在中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細(xì)胞、Cosl猴宿主和人293T宿主細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白基因的重組DNA載體。這通過采用本領(lǐng)域熟知的方法來完成，詳細(xì)描述見于Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實-驗室手冊)，2nded"ColdSpringHarborLaboratories(1989)。昆蟲細(xì)胞體系也可用于表達(dá)所關(guān)注的融合蛋白。例如，在一個這樣的體系中，將苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)或桿狀病毒作為載體在草地貪夜蛾(Spocb/^ra/n^z》e^a)細(xì)胞或4分蚊夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達(dá)外源基因?？蓪⒕幋a融合蛋白的序列克隆到病毒的諸如多角體蛋白基因的非必需區(qū)域，并放置在調(diào)控多角體蛋白啟動子之后。成功地插入融合蛋白序列致使多角體蛋白基因失活，產(chǎn)生缺乏外殼蛋白的重組病毒。重組病毒隨后可用于例如感染&/h^z》en/a細(xì)胞或并分蚊夜蛾幼蟲，在這些細(xì)胞中就可表達(dá)融合蛋白。E.Engelhardetal.(1994)Ato/.JcaASc/.,91:3224-3227;以及V.Luckow,InsectCellExpressionTechnology(昆蟲纟田胞表達(dá)4支術(shù))，pp.183-218，ProteinEngineering:PrinciplesandPractice(蛋白質(zhì)工禾呈原理和實踐)，J丄.Clelandetal.eds.,Wiley-Liss,Inc,1996)。在感染的晚期階段通常高水平表達(dá)位于苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)的多角體蛋白啟動子控制下的異源基因。采用商業(yè)上以Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)體系(LifeTechnologies)銷售的桿狀病毒穿梭載體體系構(gòu)建包含融合蛋白基因的重組桿狀病毒(Luckowetal.(1993)J.Kra/.，67:4566-4579)。制備原種重組病毒，通過標(biāo)準(zhǔn)方法4全測重組蛋白的表達(dá)(O'Reillyetal.，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual(桿狀病毒表達(dá)載體實驗室手冊)，W.H.FreemanandCompany,NewYork,1992;以及Kingetal.，TheBaculovirusExpressionSystem:ALaboratoryGuide(軒狀病毒表達(dá)體系實驗室指南)，Chapman&Hall,London,1992)。選擇哪種表達(dá)載體以及融合蛋白編碼基因最終可操作地連接到哪種啟動子上直接決定于所期望的功能特性(例如蛋白表達(dá)的位置和時間)和^皮轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。這些是本領(lǐng)域構(gòu)建重組DNA分子公知的固有限制。然而，用于實施本發(fā)明的載體可指導(dǎo)復(fù)制，優(yōu)選還指導(dǎo)包括在DNA片段內(nèi)并與其可操作地連接的融合蛋白基因的表達(dá)(對于表達(dá)載體)。通過用于生物化學(xué)或生物學(xué)回收的常規(guī)方法從表達(dá)宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)的RPBLA及其融合蛋白。由于RPBLA相對于存在于宿主細(xì)月包中的其他蛋白是密集的，因此RPBLA尤其適于通過離心細(xì)胞勻漿物進(jìn)行收集。通過在包含諸如2-巰基乙醇的還原劑的緩沖液中溶解環(huán)繞的膜從收集的RPBLA中獲得融合蛋白。無需進(jìn)一步詳細(xì)描述，可相信本領(lǐng)域技術(shù)人員采用前面的敘述以及以下詳細(xì)的實施例可最大程度實現(xiàn)本發(fā)明。因此，以下優(yōu)選的具體實施方案僅作為示例性的解釋，并不以任何方式對公開內(nèi)容其余部分的限制。實施例1:融合蛋白在轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞中的積聚將對應(yīng)于成熟降鈣素(Ct)和EGF序列以及編碼hGH序列的cDNA的合成基因融合到N末端7-玉米蛋白編碼序列RX3(WO2004003207)上，并引入載體pcDNA3.1(Invitrogen)中獲得構(gòu)建體p3.1RX3Ct、p3.1RX3EGF和p3.1RX3hGH。通過基于lipofectamine的轉(zhuǎn)染方法(Invitrogen)將這些編碼融合蛋白RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH的構(gòu)建體引入293T、Cosl和CHO哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞中。將質(zhì)粒pECFP-Nl(Clontech)轉(zhuǎn)染的293T和Cosl細(xì)胞作為對照，該質(zhì)粒pECFP-Nl包含增強(qiáng)型綠色熒光修飾的GFP的基因序列。采用針對7-玉米蛋白產(chǎn)生的抗體通過Western印跡分析在瞬時專爭染的細(xì)胞中融合蛋白的積聚。轉(zhuǎn)染44小時后，用緩沖液A(100mMTris-HClpH8.0，150mMNaCl,5mMEDTA，0.5%SDS,0.5%TritonX-100,2%2-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑)提取全部可溶蛋白。將等個分的細(xì)胞孵育介質(zhì)沉淀并保存在-20。C。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離從等量的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取的蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜上。從圖1描述的結(jié)果中可以看出所分析的RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH三種融合蛋白可非常有效地積聚，與所選擇表達(dá)的培養(yǎng)細(xì)胞類型無關(guān)比較在293T和CHO培養(yǎng)細(xì)胞中積聚的RX3-hGH圖和在CHO和Cosl細(xì)胞中積聚的RX3-EGF圖。在對應(yīng)于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的蛋白提取物中觀察到融合蛋白(道c)，而在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)沒有免疫反應(yīng)帶(道m(xù))。這些觀察數(shù)據(jù)提示RX3結(jié)構(gòu)域能夠在內(nèi)膜區(qū)室中組裝并保留融合蛋白。這些結(jié)果說明了RX3衍生的融合蛋白如何在所分析的三種類型的哺乳動物細(xì)胞(人293T細(xì)胞、猴Cosl細(xì)胞和倉鼠CHO細(xì)胞)中的內(nèi)膜體系中組裝和積聚，提示通過與RX3結(jié)構(gòu)域融合可在任何所選擇的哺乳動物細(xì)胞或有機(jī)體中實現(xiàn)所期望蛋白的有效積聚。實施例2:在轉(zhuǎn)化的哺乳動物細(xì)胞中融合蛋白的亞細(xì)胞定位在確定N末端7-玉米蛋白序列RX3是否能誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中的重組蛋白體樣組裝體時，采用共焦顯微鏡法通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析了RX3-Ct和RX3-EGF融合蛋白的定位。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在3.7%多聚甲醛中固定IO分鐘，用磷酸鹽緩沖液洗滌后，將其與7-玉米蛋白抗血清(稀釋度1/700)—起孵育1小時。非免疫血清作為對照。采用偶聯(lián)到AlexaFluor488或AlexaFluor555染誶牛(MolecularProbes)的抗兔4元體斗企測初級抗體。鏡(LeicaTCSSP，Heidelberg,Germany)可獲得轉(zhuǎn)染細(xì)胞的顯微照片。釆用495-535nm的發(fā)射窗口，用氬離子激光器在488nm激發(fā)獲得綠色熒光圖4象。用HeNe激光器在543nm激發(fā)后采用550-600的發(fā)射窗口獲得紅色熒光圖像。光學(xué)切片厚度為0.5/mi。采用共聚焦顯微鏡軟件記錄數(shù)字圖像和影像。圖2顯示了p3.1Ct和p3.1RX3EGF轉(zhuǎn)染細(xì)胞的共聚焦影像。如圖所示，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER，圖2A中的箭頭)中發(fā)現(xiàn)了對應(yīng)的融合蛋白RX3-Ct和RX3EGF，表明了7-玉米蛋白信號肽在哺乳動物細(xì)胞中具有功能，其中它介導(dǎo)了融合蛋白轉(zhuǎn)移進(jìn)ER。作為對照的與非免疫血清一起孵育的樣品沒有顯示出任何顯著的熒光(未示出)。值得注意的是融合蛋白令人驚訝地優(yōu)先積聚在明顯被膜環(huán)繞的大斑點(diǎn)中(見圖2A中的插圖)。這些結(jié)構(gòu)在非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中不存在，其大小與植物蛋白體相似，直徑約1微米(A和C中的插圖)。這些結(jié)果令人驚訝，不僅在于動物細(xì)胞可再現(xiàn)植物中描述的PB貯藏細(xì)胞器的事實，而且還在于在所有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到大量的RPBLA,表明了這些細(xì)胞的有效積聚能力。另外，不同的轉(zhuǎn)染細(xì)胞類型顯示了類似的融合蛋白定位和積聚模式(見圖2A、2B和2D),這種模式顯示與融合到PBIS的目標(biāo)無關(guān)(圖2B和2C)。將細(xì)胞用包含焚光蛋白序列的質(zhì)粒pDsRed2-ER(Clontech)共轉(zhuǎn)染，以分析誘導(dǎo)的PBLS的亞細(xì)胞起源，所述熒光蛋白可用作ER標(biāo)記。有趣的是，如圖2D、2E和2F中所看到的，RX3-Ct和ER標(biāo)記共定位在ER和PB樣組裝體中，表明了哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)的RPBLA的ER起源，如同在植物細(xì)胞中發(fā)生的。實施例3:在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中融合蛋白的積聚將編碼EGF和hGH的序列融合到N末端7-玉米蛋白編碼序列RX3(WO2004003207),并將其引入到載體pYX243(R&D體系)中獲得構(gòu)建體cll7和c118。將編碼融合蛋白RX3-EGF和RX-hGH的這些構(gòu)建體引入到SaccAaramycesce/^v/w'ae(酉良酒酵母)中。通過在含有半乳糖的培養(yǎng)基中培育轉(zhuǎn)化體進(jìn)行表達(dá)分析，采用4十對重組表達(dá)蛋白的特異性抗體通過SDS-PAGE和免疫印跡分析等量的細(xì)胞和培養(yǎng)基。如圖3A所示，RX3-EGF(道cll7)和RX3-hGH(道c118)融合蛋白都在酵母細(xì)胞中積聚，在培養(yǎng)基中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)蛋白。還在用構(gòu)建體c135和cl21(編碼融合的RX3-hGH蛋白)和cl36(編碼hGH蛋白，見圖3B中的示意圖)轉(zhuǎn)化的酵母P/c/n'apa^on、中研究了hGH和hGH衍生的融合蛋白的積聚。選擇積聚最高水平重組蛋白的轉(zhuǎn)化體。用兩種不同的信號肽表達(dá)融合蛋白7-玉米蛋白信號肽(圖3B,SPg)和酵母a因子前體肽原(圖3B，Afprepro)。此外，也分析了通過采用直接融合到hGH的酵母a因子前體肽原的分泌控制(圖3B,c136)。采用在兔中產(chǎn)生針對hGH的特異性抗體通過Western印跡分析來自細(xì)胞和培養(yǎng)基的總蛋白。如所預(yù)料的，當(dāng)采用Afprepro肽時，hGH被分泌到培養(yǎng)基中(圖3B,道cl36/m)。與此相反，融合蛋白RX3-hGH積聚在酵母細(xì)胞中，與所采用的信號肽無關(guān)。如圖3B所示，在以下兩種情況下，即當(dāng)釆用酵母Afprepro肽(道cl35/y)時和當(dāng)采用7-玉米蛋白信號肽(道cl21/y)時，融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)，在培養(yǎng)基中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)蛋白(未示出)。因此，7-玉米蛋白的N末端富集脯氨酸的結(jié)構(gòu)域足以介導(dǎo)蛋白保留在酵母細(xì)胞的內(nèi)膜區(qū)室中，更具體地在對應(yīng)于可通過離心分離的PB樣結(jié)構(gòu)的密集部分。在5Vzcc/^ra附y(tǒng)c^scerev/s/ae和尸/cAzVz;^5^on's中獲得的結(jié)果是不同于植物界和動物界的其他真核生物體的實例，其中包含種子貝i藏蛋白的融合蛋白在PB樣結(jié)構(gòu)中有效組裝和積聚。實驗方法用于哺乳動物轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒構(gòu)建體按之前的描述(專利申請WO2004003207)獲得對應(yīng)于成熟降釣素序列(Ct)的合成基因。采用約60個堿基的4個寡核苷酸(20個重疊堿基)通過引物重疊延伸PCR方法獲得編碼活性hEGF的53個氨基酸的合成基因。合成的hEGFcDNA包括對應(yīng)于因子Xa特異性切割位點(diǎn)的5'接頭序列。通過聚丙烯酰胺變性凝膠純化寡核苷酸(EGF1SEQIDNO:25;EGF2SEQIDNO:26;EGF3SEQIDNO:27;EGF4SEQIDNO:28)。采用寡核苦酸GH5(SEQIDNO:29)和GH3(SEQIDNO:30)通過PCR從人垂體腺的cDNA(Clontech,BDBiosciences)獲得編碼人生長激素(hGH)的191個氨基酸的cDNA序列，其包含對應(yīng)于腸激酶切割位點(diǎn)的序列。將對應(yīng)于成熟降釣素(Ct，WO2004003207)和hEGF序列的合成基因以及編碼hGH的cDNA融合到RX3N末端7-玉米蛋白編碼序列(專利WO2004003207),并將其引入到pUC18中。將來自pUC18衍生質(zhì)粒pUC18RX3Ct、pUC18RX3EGF和pUC18RX3gHG(包含對應(yīng)的融合蛋白RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH序歹'J)的SalI-BamHI限制性片#爻引入經(jīng)XhoI-BamHI限制性酶切的載體pcDNA3.1-(Invitrogen)中。在得到的命名為p3.1RX3CT、p3.1RX3EGF和p3.1RX3hGH的構(gòu)建體中，融合蛋白序列置于CMV啟動子和終止子pABGH控制之下。用于酵母轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒構(gòu)建體宿主菌4朱和載體采用載體pYX243(GAL啟動子、丄五t/2、AmpR，來自R&DSystem)書f生的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化Sacc/^ramycescerev/w'ae菌才朱(基因型A&3/ew2t/ra36aW:..f//M3)。/7chV7/a加n.s菌抹GS115(A&力以及載體pPIC9和pPIC3.5K(JOW啟動子，HIS4，AmpR)來自Invitrogenlifetech.。質(zhì)粒構(gòu)建體將來自上述pUC18衍生的質(zhì)粒pUC18RX3EGF和pUC18RX3hGH(包含對應(yīng)的融合蛋白RX3-EGF和RX3-hGH)的SalI(平末端)-BamHI限制性片,史引入經(jīng)EcoRI(平末端)-BamHI限制性切割的載體pYX243(R&DSystem)中。在得到的分別命名為c117和c118的構(gòu)建體中，融合蛋白序列置于可誘導(dǎo)GAL啟動子控制之下。將來自pUC18衍生的質(zhì)粒pUC18RX3EGF和pUC18RX3hGH的SalI(平末端)-BamHI(平末端)限制性片段引入經(jīng)Notl(平末端)-EcoRI(平末端)限制性切割的載體pPIC3.5K(Invitrogen)中，獲得質(zhì)粒c120和c121以轉(zhuǎn)化尸/c/n'apa他/ls。質(zhì)粒pPIC9(Invitrogen)用于分析采用酵母信號肽Sacc/^ram少ce:的a前體肽原的融合蛋白表達(dá)。采用pUC18RX3hGH作為模板和寡核苦酸af06(SEQIDNO:31)、afRX(SEQIDNO:32)和06Not(SEQIDNO:33)通過PCR獲得編碼RX3-hGH和hGH蛋白的Xhol-Notl之間的序列。這些序列包含編碼有效切割a前體肽原所必需的位點(diǎn)KEX2的序列(Invitrogen,乃'c/n'a表達(dá)試劑盒)。將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆進(jìn)經(jīng)Xhol-Notl限制性切割的pPIC9中，獲得分別包含融合到a因子前體肽原的RX3-hGH和hGH蛋白序列的質(zhì)粒c135和cl36。酵母轉(zhuǎn)化采用質(zhì)粒構(gòu)建體c117和c118通過LiAc方法(Itoetal.1983，丄Sac/m'o/.153:163-168)轉(zhuǎn)化Sacc/mra附y(tǒng)c&scerevz'w'ae菌林(/e"2)，在Leif平4反中選擇轉(zhuǎn)化體。在包含半乳糖的培養(yǎng)基(demanarcomposici6..)中培育轉(zhuǎn)化體進(jìn)行表達(dá)分析。采用線形化的c120和c121質(zhì)粒通過尸Zc/n'aEasyComp試劑盒(Invitrogenlifetech.)轉(zhuǎn)化P/cA/a戸加n^菌抹GS115(&")，并在RDBHis-培養(yǎng)基中平板培養(yǎng)。通過將克隆在MD和MM瓊脂平板上劃線確定Mut表型。通過在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體兩天進(jìn)行表達(dá)試驗。其后，沉淀細(xì)胞，在MM培養(yǎng)基中再懸浮48小時，每24小時加入曱醇至終濃度為0.5%。選擇積聚最高水平重組蛋白的轉(zhuǎn)化體。培養(yǎng)基的制法如Invitrogen(Pichia表達(dá)試劑盒)所描述的。酵母蛋白提取和Western印跡和paWor"表達(dá)的重組融合蛋白。沉淀等份的各個孵育培養(yǎng)基并保存在-20。C用于分析。還將細(xì)胞沉淀冷凍，融化后，采用玻璃珠和培養(yǎng)基H(50mMHCl-TrispH8.0、150mMNaCl、5mMEDTA、200mMDTT和蛋白酶抑制劑)通過標(biāo)準(zhǔn)方法破碎細(xì)胞。采用針對重組表達(dá)蛋白的特異性抗體通過SDS-PAGE和免疫印跡分析等量的細(xì)胞和培養(yǎng)基。通過參考將本文引用的各個專利和文章并入。本文中使用"a"或"an"旨在包括一個或多個。前面的香又述和實施例旨在作為示例性的而不應(yīng)一見為限定性的。在本發(fā)明本質(zhì)和范圍內(nèi)還可做出其他的變化，這些變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員是不言自明的。權(quán)利要求1.在重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)中包含重組融合蛋白的非高等植物真核宿主細(xì)胞，所述融合蛋白包含連接在一起的兩個序列，其中一個序列為異源于所述宿主細(xì)胞的蛋白體誘導(dǎo)序列，另一個序列為感興趣產(chǎn)物的序列。2.如權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其中所述RPBLA的密度為約1.1至1.35g/ml。3.如權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其中所述融合蛋白還包含所述蛋白體誘導(dǎo)序列和所述感興趣產(chǎn)物的序列之間的接頭序列。4.如權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其中所述蛋白體誘導(dǎo)序列包括醇溶谷蛋白或修飾的醇溶谷蛋白。5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中所述蛋白體誘導(dǎo)序列為醇-溶谷蛋白序列。6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其中所述醇溶谷蛋白序列為t玉米蛋白、a-玉米蛋白或稻米醇溶谷蛋白。7.生產(chǎn)融合蛋白的方法，包括如下步驟(a)用包含可操作地同框連接到(ii)第二核酸序列的(i)第一核酸序列的核酸序列轉(zhuǎn)化非高等植物真核宿主細(xì)胞，其中所述第一核酸序列編碼蛋白體誘導(dǎo)序列(PBIS),所述第二核酸序列包含編碼感興趣多肽產(chǎn)物的核酸序列；以及(b)在適合所述融合蛋白表達(dá)和所述表達(dá)的融合蛋白組裝進(jìn)重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)的培養(yǎng)條件下維持轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞一,殳時間。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一核酸序列(i)的3'端連接到所述第二核酸序列(ii)的5，端。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述核酸編碼所述PBIS和感興趣多肽產(chǎn)物之間的接頭序列。10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為真菌細(xì)月包，尤其是酵母細(xì)胞。11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞為藻類細(xì)胞。12.如;K利要求7所述的方法,尤其是哺乳動物細(xì)胞。13.如權(quán)利要求7所述的方法，的步驟。14.如沖又利要求7所述的方法,溶谷蛋白或修飾的醇溶谷蛋白。其中所述宿主細(xì)胞為動物細(xì)胞,還包括回收所述表達(dá)的融合蛋白其中所述蛋白體誘導(dǎo)序列包括醇15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述醇溶谷蛋白序列為i^飾的醇溶谷蛋白，其包含(a)信號肽序列，(b)7-玉米蛋白的重復(fù)結(jié)構(gòu)域六肽PPPVHL(SEQIDNO:l)的一個或多個拷貝的序列，以及(c)7-玉米蛋白ProX結(jié)構(gòu)域的全部或部分序列。16.如;K利要求14所述的方法，其中所述醇溶谷蛋白序列為7-玉米蛋白、a-玉米蛋白或稻米醇溶谷蛋白。17.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的核酸序列存在于包含一個或多個調(diào)控序列的表達(dá)載體中。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述一個或多個調(diào)控序列包含啟動子。19.包含含有可操作地連接到外源核酸片段的一個或多個調(diào)控序列的載體的重組核酸分子，所述外源核酸片段限定了編碼融合蛋白的基因，所述融合蛋白包含連接到(ii)感興趣多肽產(chǎn)物的(i)蛋白體誘導(dǎo)序列。20.如權(quán)利要求19所述的核酸，其中所述載體的所述一個或多個調(diào)控序列包含適于在適合的真核宿主細(xì)胞中啟動所述基因的表達(dá)的啟動子。全文摘要本發(fā)明公開了形成融合蛋白的方法，所述融合蛋白在作為宿主體系的不同于高等植物的宿主真核細(xì)胞和生物體中以重組蛋白體樣組裝體表達(dá)。更具體地，將肽和蛋白融合到介導(dǎo)誘導(dǎo)重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)形成的蛋白序列，通過適合的載體轉(zhuǎn)化后在這些宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)和積聚。本發(fā)明也公開了制備融合蛋白的方法。文檔編號C12N15/62GK101098886SQ200580046111公開日2008年1月2日申請日期2005年11月29日優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日發(fā)明者巴勃羅·馬薩阿瓦爾魯納,布蘭卡·洛姆帕特羅約,瑪加麗塔·托倫特克格拉斯,米利亞姆·巴斯蒂達(dá)維爾基里,馬里亞·多洛雷斯·路德維德穆西卡申請人:Era生物技術(shù)有限公司