專利名稱：裝載熱激黑素瘤細(xì)胞體的樹(shù)突細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)對(duì)癌的免疫性的組合物和方法，且更具體地，涉及制備免疫原性癌特異性抗原的制劑、處理和方法。
背景技術(shù)：
不限制本發(fā)明的范圍，描述了本發(fā)明與接種有關(guān)的背景。
針對(duì)特定靶的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化仍然是免疫學(xué)中最復(fù)雜的和廣受歡迎的目標(biāo)之一。免疫活化過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞，這是因?yàn)樗軌蛴行Ъ庸ず驮谥饕M織相容性復(fù)合體(MHC)I和II類分子上呈遞抗原。許多遺傳和環(huán)境因素影響免疫應(yīng)答識(shí)別和應(yīng)答抗原呈遞細(xì)胞(APC)如樹(shù)突細(xì)胞呈遞的經(jīng)加工的抗原的能力。
對(duì)于細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答，經(jīng)典的I類途徑模型是使用流感病毒誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，其需要將具有正確的抗原表位的肽準(zhǔn)確的加工、轉(zhuǎn)運(yùn)和遞送到細(xì)胞表面。在由足夠的T細(xì)胞受體(TcRs)識(shí)別和正確的共刺激后，抗原特異性免疫應(yīng)答是可能的。盡管樹(shù)突細(xì)胞有效活化I類限制的CLT，但是進(jìn)入MHC I類途徑以誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞通常需要合成抗原。許多模型包括使用抗原和抗原遞送系統(tǒng)，其將抗原有效遞送到MHC I類限制的抗原呈遞途徑以產(chǎn)生抗原特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
抗原呈遞的其他方法包括將外源抗原遞送到樹(shù)突細(xì)胞的MHC I加工途徑，例如，通過(guò)將抗原偶聯(lián)到有效的佐劑、內(nèi)吞抗原的滲透性裂解和在pH敏感的脂質(zhì)體中插入抗原來(lái)實(shí)現(xiàn)。盡管可用于體外分析，但這些方法在治療應(yīng)用中有困難。迄今為止，可以用外源抗原直接脈沖樹(shù)突細(xì)胞，所述抗原可使用活的或者經(jīng)照射形式的完整細(xì)胞、膜制劑、細(xì)胞凋亡細(xì)胞或者細(xì)胞體和從天然來(lái)源純化或者作為重組產(chǎn)物表達(dá)的抗原，見(jiàn)例如，WO 94/02156和美國(guó)專利號(hào)6,602,709。然而，這些現(xiàn)有方法不識(shí)別死亡細(xì)胞形式或者來(lái)自樹(shù)突細(xì)胞系統(tǒng)中死亡的或者垂死的細(xì)胞入口的加工途徑抗原。
樹(shù)突細(xì)胞用途的一個(gè)實(shí)例在授予Robbins等人的美國(guó)專利號(hào)6,936,468中教導(dǎo)，所述專利為致耐受性的樹(shù)突細(xì)胞在增強(qiáng)宿主中的致耐受性中的用途和其制備方法。簡(jiǎn)言之，公開(kāi)了致耐受性哺乳動(dòng)物樹(shù)突細(xì)胞(DC)和制備致耐受性DC的方法。通過(guò)對(duì)宿主施用致耐受性哺乳動(dòng)物DC提供了增強(qiáng)宿主中致耐受性的方法。致耐受性DC包括具有一個(gè)或多個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的寡脫氧核糖核苷酸(ODN)。致耐受性DC可以包括病毒載體，例如，腺病毒載體，其當(dāng)存在于其中時(shí)不影響致耐受性DC的致耐受性。據(jù)說(shuō)宿主中增強(qiáng)的致耐受性可用于延長(zhǎng)外來(lái)移植物存活和治療炎性相關(guān)疾病，如自身免疫病。
樹(shù)突細(xì)胞的另一用途在授予Hwu等人的美國(guó)專利號(hào)6,734,014中教導(dǎo)，所述專利為用于轉(zhuǎn)化樹(shù)突細(xì)胞和活化T細(xì)胞的方法和組合物。簡(jiǎn)言之，通過(guò)轉(zhuǎn)化干細(xì)胞并使干細(xì)胞分化成樹(shù)突細(xì)胞來(lái)制備重組樹(shù)突細(xì)胞。據(jù)說(shuō)所得樹(shù)突細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞，其活化針對(duì)MHC I類抗原靶的T細(xì)胞。該公開(kāi)內(nèi)容還包括基于通過(guò)重組樹(shù)突細(xì)胞活化T細(xì)胞的試劑盒、測(cè)定和治療劑。據(jù)說(shuō)癌癥、病毒感染和寄生物感染可以通過(guò)所述重組樹(shù)突細(xì)胞或者對(duì)應(yīng)的活化的T細(xì)胞改善。
用于樹(shù)突細(xì)胞裝載的抗原在例如授予Albert等人的美國(guó)專利號(hào)6,602,709中教導(dǎo)。該專利教導(dǎo)了使用細(xì)胞凋亡細(xì)胞遞送抗原到樹(shù)突細(xì)胞以用于T細(xì)胞的誘導(dǎo)或者耐受的方法。據(jù)稱所述方法和組合物可用于將抗原遞送到用于誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和T輔助細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞。該公開(kāi)內(nèi)容包括用于評(píng)估細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性的測(cè)定。靶定樹(shù)突細(xì)胞的抗原是細(xì)胞凋亡細(xì)胞，其也可以經(jīng)修飾以表達(dá)非天然抗原以呈遞到樹(shù)突細(xì)胞。據(jù)稱所述樹(shù)突細(xì)胞通過(guò)能夠加工和呈遞所加工的抗原并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性的細(xì)胞凋亡細(xì)胞(及其碎片)致敏(prime)，或者也可以用于疫苗療法中。
最后，授予Steinman等人的美國(guó)專利號(hào)6,455,299教導(dǎo)了使用病毒載體遞送抗原到樹(shù)突細(xì)胞的方法。據(jù)稱方法和組合物可用于將抗原遞送到樹(shù)突細(xì)胞，其然后用于誘導(dǎo)T抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。該公開(kāi)內(nèi)容提供了評(píng)估細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性的測(cè)定。使用病毒載體如流感病毒可以將抗原提供給樹(shù)突細(xì)胞，所述載體可以經(jīng)修飾以表達(dá)用于呈遞到樹(shù)突細(xì)胞的非天然抗原。將樹(shù)突細(xì)胞用載體感染并且據(jù)稱所述樹(shù)突細(xì)胞能夠呈遞該抗原和誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性，或者還可以用作疫苗。
發(fā)明概述現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)裝載超表達(dá)熱激蛋白或者肽的熱激殺死的腫瘤細(xì)胞或者殺死的腫瘤體的單核細(xì)胞衍生的DC可以用于致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞和誘導(dǎo)它們分化成更強(qiáng)大高效的抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)。在本文中公開(kāi)了這些DC的組合物、使用方法和制備方法。
本發(fā)明包括通過(guò)使用通過(guò)暴露于一種或多種熱激且殺死的癌細(xì)胞致敏的經(jīng)分離和純化的抗原呈遞細(xì)胞，用于誘導(dǎo)對(duì)患者中癌的免疫性的組合物和方法?？乖蔬f細(xì)胞可以是專職抗原呈遞細(xì)胞，例如，樹(shù)突細(xì)胞。通常，抗原呈遞細(xì)胞裝載熱激、熱殺死的癌細(xì)胞，例如，從患者分離的癌細(xì)胞和/或同種異體癌細(xì)胞或者細(xì)胞系。熱激且殺死的癌細(xì)胞被抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)化和加工至少2小時(shí)。
本發(fā)明還包括誘導(dǎo)對(duì)患者中癌癥的免疫性的方法，其通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)，在至少約42℃的溫度下熱激一種或多種癌細(xì)胞至少2小時(shí)以形成熱激的癌細(xì)胞；殺死熱激的癌細(xì)胞以形成熱激的被殺死的癌細(xì)胞；將從患者分離的一種或多種抗原呈遞細(xì)胞與熱激的被殺死的癌細(xì)胞溫育至少3小時(shí)；并對(duì)患者施用一種或多種分離的裝載的抗原呈遞細(xì)胞。抗原呈遞細(xì)胞可以在施用于患者前用一種或多種細(xì)胞因子成熟。
本發(fā)明的另一方法包括誘導(dǎo)對(duì)患者中癌的免疫性，其通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)，從患者得到抗原呈遞細(xì)胞；在至少約42℃的溫度下溫育同種異體癌細(xì)胞至少2小時(shí)以形成熱激的同種異體癌細(xì)胞；殺死熱激的同種異體癌細(xì)胞以形成熱激的被殺死的同種異體癌細(xì)胞；將抗原呈遞細(xì)胞暴露于熱激的被殺死的同種異體癌細(xì)胞至少3小時(shí)以形成裝載的抗原呈遞細(xì)胞；使所分離的裝載的抗原呈遞細(xì)胞成熟；并對(duì)患者施用所述分離的裝載的抗原呈遞細(xì)胞。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到抗原呈遞細(xì)胞可以是各種成熟階段的樹(shù)突細(xì)胞，并且當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞用一種或多種細(xì)胞因子成熟時(shí)，熱激的被殺死的癌細(xì)胞可以被抗原呈遞細(xì)胞(例如，樹(shù)突細(xì)胞)內(nèi)化。同種異體癌細(xì)胞的實(shí)例選自表II。
制備免疫原性分離的抗原呈遞細(xì)胞的另一種方法可以包括步驟從受試者分離抗原呈遞細(xì)胞；通過(guò)應(yīng)激一種或多種癌細(xì)胞并殺死癌細(xì)胞制備抗原；向抗原呈遞細(xì)胞裝載所述抗原至少3小時(shí)；并分離和純化經(jīng)裝載的抗原呈遞細(xì)胞。在殺死癌細(xì)胞前可以通過(guò)一種方法應(yīng)激癌細(xì)胞，所述方法選自熱激、冷激、葡萄糖剝奪、不供氧、暴露于至少一種改變細(xì)胞代謝的藥物和暴露于至少一種細(xì)胞毒性藥物。癌細(xì)胞可以是自體或者同種異體癌細(xì)胞。實(shí)際上，可以在熱激條件下進(jìn)行用抗原裝載抗原呈遞細(xì)胞的步驟。在一個(gè)簡(jiǎn)單步驟中，本發(fā)明包括在殺死癌細(xì)胞前通過(guò)應(yīng)激癌細(xì)胞增加受應(yīng)激的和被殺死的癌細(xì)胞中腫瘤抗原表達(dá)的方法。在殺死細(xì)胞前可通過(guò)熱激、冷激、葡萄糖剝奪、不供氧、暴露于至少一種改變細(xì)胞代謝的藥物和/或暴露于至少一種細(xì)胞毒性藥物應(yīng)激癌細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案包括在將抗原呈遞細(xì)胞暴露于經(jīng)應(yīng)激和殺死的癌細(xì)胞前，通過(guò)應(yīng)激癌細(xì)胞并殺死癌細(xì)胞來(lái)增加裝載被應(yīng)激和殺死的癌細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞中腫瘤抗原的抗原性的方法。在殺死癌細(xì)胞前，通過(guò)熱激、冷激、葡萄糖剝奪、不供氧、暴露于至少一種改變細(xì)胞代謝的藥物和暴露于至少一種細(xì)胞毒性藥物，通過(guò)應(yīng)激癌細(xì)胞來(lái)增加癌細(xì)胞的抗原性。同樣，本發(fā)明包括抗原，該抗原包括熱激的癌細(xì)胞和其部分。
通過(guò)包括熱處理一種或多種癌細(xì)胞系并用細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑殺死細(xì)胞的方法可以制備本發(fā)明的抗原。通過(guò)殺死試劑可以完成細(xì)胞死亡，所述殺死試劑包括白樺脂酸、紫杉醇、喜樹(shù)堿、橢圓玫瑰樹(shù)堿、光神霉素A、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、離子霉素和其組合。備選地或者組合地，通過(guò)將癌細(xì)胞暴露于輻射、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、超聲、干燥、冷凍噴霧、穿刺、饑餓和其組合可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞死亡?？梢詫┘?xì)胞熱處理2、4、6或者8小時(shí)并且殺死后在使用前可以以凍干的、熱干燥的、真空干燥的、熱真空干燥的、通過(guò)蒸發(fā)沉淀到水溶液(EPAS)冷凍的、噴霧冷凍到液體(SFL)中的、反溶劑(antisolvent)沉淀或者冷凍噴霧形式保存。當(dāng)用作試劑盒的部分時(shí)，抗原還可以包括用于重懸浮抗原的稀釋劑，例如，鹽水、pH緩沖鹽水、具有一種或多種細(xì)胞因子的鹽水、佐劑或者抗原和/或任何其他用于重懸浮的溶液。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將癌細(xì)胞進(jìn)一步定義為熱黑素瘤和其部分?？乖梢园峒さ那覛⑺赖陌┘?xì)胞和其部分，例如，具有一種或多種抗原呈遞細(xì)胞和/或佐劑。癌細(xì)胞還可以是熱殺死的或者通過(guò)多種已知方法的任一種殺死的。一種方法是通過(guò)化學(xué)、機(jī)械和照射方法直接殺死。再一個(gè)實(shí)施方案包括使用程序性細(xì)胞死亡或者細(xì)胞凋亡，其也可以在細(xì)胞的熱激后用于本發(fā)明以增加癌細(xì)胞的抗原性。可以通過(guò)白樺脂酸、紫杉醇、喜樹(shù)堿、橢圓玫瑰樹(shù)堿、光神霉素A、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、離子霉素和其組合殺死熱激的癌細(xì)胞和其部分。通過(guò)輻射、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、超聲、干燥、冷凍噴霧、穿刺、饑餓和其組合或者通過(guò)化學(xué)和非化學(xué)步驟兩者也可殺死熱激的癌細(xì)胞和其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用天然殺傷細(xì)胞殺死細(xì)胞。
本發(fā)明還包括具有被殺死的同種異體癌細(xì)胞的疫苗，所述癌細(xì)胞在至少42℃的溫度下熱激至少2小時(shí)以形成熱激的同種異體癌細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)包括下面步驟的方法制備癌癥疫苗在至少42℃的溫度下溫育癌細(xì)胞至少兩小時(shí)；殺死熱激的癌細(xì)胞；并用癌細(xì)胞裝載抗原呈遞細(xì)胞。通常，該方法和疫苗將適于對(duì)患者施用分離的、裝載的抗原呈遞細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于患者的癌癥疫苗還可以包括一種或多種至少部分成熟的抗原呈遞細(xì)胞，其裝載被熱激的且殺死的非細(xì)胞凋亡癌細(xì)胞。
本文教導(dǎo)的疫苗和抗原可以用于通過(guò)用癌癥疫苗免疫患者治療癌癥患者的方法中，所述疫苗和抗原包括裝載熱激和被殺死的癌細(xì)胞的一種或多種至少部分成熟的抗原呈遞細(xì)胞。至少部分成熟的抗原呈遞細(xì)胞可以是自體的并且被熱激且殺死的癌細(xì)胞可以是自體或同種異體的。例如，本發(fā)明將具體用于選自下面所列的細(xì)胞的熱激且殺死的癌細(xì)胞，并且它可以用于確定和檢測(cè)殺死前癌細(xì)胞的熱激蛋白(例如，HSP60、HSP90和gp96)的表達(dá)的調(diào)節(jié)(例如，上調(diào))。在一些情況中，可以將癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染以超表達(dá)HSP60、HSP90和gp96，從而減小或者消除對(duì)實(shí)際的熱激的需要，然而，那些細(xì)胞將落入本發(fā)明的范圍，因?yàn)檫@些細(xì)胞將表達(dá)一種或多種熱激蛋白和/或陪伴分子，其幫助增加本發(fā)明的癌細(xì)胞的抗原性。
另一實(shí)施方案還包括在體外將抗原遞送到樹(shù)突細(xì)胞的方法，其通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)，與能夠內(nèi)化用于抗原呈遞的一種或多種抗原的樹(shù)突細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間，所述時(shí)間允許所述一種或多種抗原內(nèi)化以呈遞到免疫細(xì)胞，其中所述抗原包含熱激的且殺死的癌細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞可以是人的，并且熱激細(xì)胞可以是例如，細(xì)胞系、經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)外來(lái)抗原的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系、異種細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞。熱激的細(xì)胞選自表II中所列的細(xì)胞系和其組合，并且可以通過(guò)化學(xué)處理、輻射、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、超聲、干燥、冷凍噴霧、穿刺、饑餓和其組合來(lái)殺死。任一種細(xì)胞或者細(xì)胞碎片都可以接觸樹(shù)突細(xì)胞，例如，經(jīng)熱激的、殺死的和/或細(xì)胞凋亡的細(xì)胞碎片、泡或者體。通常，樹(shù)突細(xì)胞是不成熟的和吞噬的。盡管技術(shù)人員可能必須調(diào)節(jié)精確的比率，但是熱激細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞的常見(jiàn)比率的一個(gè)實(shí)例為約1-10個(gè)熱激細(xì)胞比約100個(gè)樹(shù)突細(xì)胞。
接觸抗原后，可以進(jìn)一步成熟抗原呈遞細(xì)胞，例如，通過(guò)暴露于一種或多種成熟因子足夠的時(shí)間以誘導(dǎo)例如樹(shù)突細(xì)胞的成熟。使用樹(shù)突細(xì)胞作為實(shí)例，成熟步驟可以包括將CD83陰性樹(shù)突細(xì)胞與至少一種成熟因子接觸，所述成熟因子選自導(dǎo)致CD83陰性樹(shù)突細(xì)胞成熟從而表達(dá)CD83、TNFα、IL-1β、IL-6、PGE2、IFNα、CD40配體的單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基，和熱激且殺死的細(xì)胞。通過(guò)使用單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基；IFNα和選自IL-1β、IL-6和TNFα的至少一種其他因子；和熱激細(xì)胞可以成熟其他抗原呈遞細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述為了更完整理解本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在參考本發(fā)明的詳細(xì)描述以及附圖，并且附圖中

圖1A和1B描繪了黑素瘤細(xì)胞系中熱激后HSP的表達(dá)模式。如從左到右描繪的，將黑素瘤細(xì)胞系SKMel28、SKMel24、Me275、Me290和Colo829在37℃溫育，在42℃熱激2小時(shí)、4小時(shí)或8小時(shí)(這里未顯示)；或者加熱后用10μg/ml白樺脂酸(BA)處理24小時(shí)，或者僅用10μg/ml BA處理24小時(shí)和48小時(shí)。在不同的時(shí)間點(diǎn)，收獲細(xì)胞并用冷PBS洗滌兩次。用提取試劑裂解細(xì)胞沉淀。從左到右，圖1A和1B描繪了結(jié)果，其中圖1A描繪了熱激或者BA處理后的HSP70表達(dá)。用ELISA試劑盒測(cè)量HSP70表達(dá)。圖1B描繪了熱激或者BA處理后的HSP60表達(dá)。用ELISA試劑盒測(cè)量HSP60表達(dá)。結(jié)果代表兩次獨(dú)立研究的平均值。
圖2描繪了在實(shí)施例6和7中給出的研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。將HLA-A*0201+單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞用未加熱的(冷)或者熱處理的(熱)黑素瘤體以1∶1的比率裝載3小時(shí)，基于CD11c表達(dá)分選，用sCD40L成熟并用于在兩周培養(yǎng)物中以10∶1的比率致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的自體CD8+T細(xì)胞。
圖3A到3C描繪了能夠殺死黑素瘤細(xì)胞系的CTL的致敏。將代表性細(xì)胞系用BA處理48小時(shí)(以“冷”示出)或者在42℃熱激4小時(shí)且然后用BA處理24小時(shí)(以“熱”示出)。這些黑素瘤體與未成熟MDDC以1∶1的比率共培養(yǎng)3小時(shí)，然后分選CD11c+MDDCs并用sCD40L(每毫升200納克)成熟24小時(shí)。對(duì)于第一周刺激，將自體首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8 T細(xì)胞與10IU/ml IL-7以10∶1的比率加入，且在第7天，如第一周所述重復(fù)刺激，只是用IL-2替換IL-7。在第7天進(jìn)行第二輪刺激后，收集T細(xì)胞，并用標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞毒性殺傷活性。圖3A描繪了與致敏的HLA-A*0201+CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)后，從HLA-A*0201+Me275黑素瘤細(xì)胞和對(duì)照K562細(xì)胞的51Cr釋放。CTLun＝用未裝載的DC培養(yǎng)2周的T細(xì)胞，CTL冷＝用裝載冷Me275體的DC培養(yǎng)兩周的T細(xì)胞，且CTL熱＝用裝載熱Me275體的DC培養(yǎng)的T細(xì)胞。結(jié)果代表三個(gè)研究的平均值和SD。圖3B描繪了從HLA-A*0201+Me290黑素瘤細(xì)胞的51Cr釋放，從而證明通過(guò)熱Me275體DCs致敏的T細(xì)胞可以交叉殺死(crosskill)Me290細(xì)胞系。T細(xì)胞與對(duì)圖3A描述的相同。結(jié)果代表三個(gè)研究的平均值和SD。圖3C描繪了通過(guò)用所指出的mAb致敏靶細(xì)胞對(duì)特定裂解的抑制，從而表明熱Me275體致敏的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性主要由MHC I類途徑介導(dǎo)。結(jié)果代表兩個(gè)獨(dú)立研究的平均值。
圖4描繪了能夠殺死黑素瘤細(xì)胞系的CTL的交叉致敏。如對(duì)圖3A-3C所述致敏T細(xì)胞，只是DC裝載了HLA-A*0201neg SKMel28黑素瘤細(xì)胞，并且結(jié)果顯示了從HLA-A*0201+SKMel24黑素瘤細(xì)胞的51Cr釋放(兩次研究的代表)，從而證明通過(guò)熱SKMel28體致敏的T細(xì)胞可以交叉殺死SKMel24細(xì)胞。
圖5A到5D描繪了能夠控制黑素瘤細(xì)胞系的存活/生長(zhǎng)的CTL的致敏。如圖3A-3C所述致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞。EGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染的黑素瘤和K562細(xì)胞系用作腫瘤退化測(cè)定中的靶。如圖5A-5C所示，兩輪刺激后，用未裝載的DC(CTLun)(這里未顯示)、裝載冷Me290體的DC(CTL冷)或者裝載熱Me290體的DC(CTL熱)培養(yǎng)的T細(xì)胞與Me290-EGFP靶細(xì)胞以20∶1的比率共培養(yǎng)。在所指出的時(shí)間點(diǎn)收獲共培養(yǎng)物，用PE綴合的抗-CD8 mAb染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。右上方的值指出存活的EGFP+腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果代表三次研究。圖5D描繪了通過(guò)裝載冷Me275細(xì)胞(CTL冷)或熱Me275細(xì)胞(CTL熱)的DC致敏并與Me290-EGFP靶細(xì)胞以20∶1的比率共培養(yǎng)4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)或者72小時(shí)的T細(xì)胞。使用光學(xué)顯微鏡術(shù)通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)活的腫瘤細(xì)胞。結(jié)果代表三次研究的平均值和SD。
圖6A到6F描繪了黑素瘤特異性CTLs的致敏T2殺傷測(cè)定。在4小時(shí)的51Cr釋放測(cè)定中，圖6A描繪了如圖3A-3C中描述的針對(duì)HLA-A*0201+Me290細(xì)胞的致敏，從而提供從T2細(xì)胞的51Cr釋放，所述T2細(xì)胞已經(jīng)用四種黑素瘤肽MART-1/Melan A、gp100、酪氨酸酶和MAGE-3(T2+4P)的混合物或者用對(duì)照PSA肽(T2+PSA)脈沖或者不脈沖而使用(T2)。結(jié)果代表三次研究的平均值和SD。圖6B描繪了如圖4中針對(duì)HLA-A*0201neg Sk-Mel28細(xì)胞的致敏，讀出數(shù)據(jù)如圖6A中給出的。結(jié)果代表三次研究的平均值和SD。圖6C-6E描繪了通過(guò)分別與T2-EGFP細(xì)胞(效應(yīng)物/靶比為30∶1)、用PSA肽脈沖的T2-EGFP細(xì)胞(效應(yīng)物/靶比為30∶1)、或者用四種黑素瘤肽(gp100、Tyr、MART1和MAGE3)脈沖的T2-EGFP細(xì)胞(效應(yīng)物/靶比為20∶1)作為靶共培養(yǎng)0小時(shí)、4小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)的用熱細(xì)胞凋亡的Me290體裝載的MDDCs致敏的T細(xì)胞的腫瘤退化測(cè)定的流式細(xì)胞儀結(jié)果。結(jié)果代表兩次研究。根據(jù)來(lái)自圖6C-6E的FACS數(shù)據(jù)，圖6F描繪了肽脈沖的T2-EGFP細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，其通過(guò)用下式計(jì)算％生長(zhǎng)速率＝(時(shí)間點(diǎn)時(shí)的％EGFP+群體/0小時(shí)時(shí)的％EGFP+群體)×100％。0小時(shí)時(shí)的腫瘤生長(zhǎng)速率定義為100％。結(jié)果代表兩次研究的平均值。
圖7A到7C描繪了黑素瘤特異性CTL的致敏四聚體結(jié)合測(cè)定，致敏如圖3A-3C描述的對(duì)HLA-A*0201+Me290細(xì)胞所述。如圖7A所示，在第二次刺激后第7天進(jìn)行四聚體染色，且對(duì)每個(gè)樣品獲得50,000個(gè)細(xì)胞。結(jié)果指出了總的CD8群體中雙陽(yáng)性群體(CD8+四聚體+)的百分?jǐn)?shù)。如圖7B中所示，通過(guò)用PSA1脈沖的DC(CTL熱-2R/PSA+DCs)再刺激致敏的T細(xì)胞一次并在再刺激后7天進(jìn)行分析。如圖7C中所示，通過(guò)四種黑素瘤肽的每一種脈沖的DC(CTL熱-2R/Mel+DCs)再刺激致敏的T細(xì)胞一次并在再刺激后7天進(jìn)行分析。結(jié)果代表兩次研究。
圖8A和8B描繪了SKMel28黑素瘤細(xì)胞系中HSP70超表達(dá)的構(gòu)建。圖8A描繪了慢病毒載體RRL-pgk-hsp70-EGFP(用于腫瘤退化測(cè)定)的概圖。圖8B描繪了轉(zhuǎn)染的和假轉(zhuǎn)染的SKMel28黑素瘤細(xì)胞系中的HSP70表達(dá)水平。通過(guò)ELISA和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)SKMel28、SKMel28/RRL-pkg-EGFP(縮寫(xiě)為“SKMel28-EGFP”)和SKMel28/RRL-pkg-HSP70-EGFP(縮寫(xiě)為“SKMel28-HSP70-EGFP”)。結(jié)果代表三次獨(dú)立研究的平均值。觀察到顯著HSP70超表達(dá)(當(dāng)SKMel28/RRL-pgk-hsp70-EGFP細(xì)胞系中HSP70水平與SKMel28/RRL-pgk-EGFP或SKMel28細(xì)胞系比較時(shí)P＜0.001)。
圖9A到9F描繪了來(lái)自黑素瘤細(xì)胞系SkMel28和Me290在如實(shí)施例17中描述的三種黑素瘤抗原MAGE-B3、MAGE-B4和MAGE-A8的mRNA表達(dá)方面的實(shí)時(shí)RT-PCR分析的相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)。如圖9A-9F中描繪的，黑素瘤細(xì)胞在黑素瘤抗原的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析前為未處理的(“non”)；在42℃熱處理4小時(shí)的(“加熱4小時(shí)”)；在42℃4小時(shí)的熱處理期間暴露于已知的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(“熱加AD”)；用對(duì)照載體EGFP轉(zhuǎn)染的(“EGFP”)；或者用表達(dá)載體HSP70轉(zhuǎn)染的(“HSP70”)。圖9A描繪了在MAGE-B3的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析前如上所述未處理的、熱處理的或者轉(zhuǎn)染的SkMel28細(xì)胞。圖9B描繪了在MAGE-B3的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析前如上所述未處理或熱處理的Me290細(xì)胞。圖9C描繪了在MAGE-B4的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析前如上所述未處理的、熱處理的或者轉(zhuǎn)染的SkMel28細(xì)胞。圖9D描繪了在MAGE-B4的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析前如上所述未處理或熱處理的Me290細(xì)胞。圖9E描繪了在MAGE-A8的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析前如上所述未處理的、熱處理的或者轉(zhuǎn)染的SkMel28細(xì)胞。圖9F描繪了在MAGE-A8的mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)RT-PCR分析前如上所述未處理或熱處理的Me290細(xì)胞。
發(fā)明詳述盡管在下文詳細(xì)討論了做出和使用本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但是應(yīng)該明白本發(fā)明提供了許多可應(yīng)用的發(fā)明概念，其可以在多種特定背景中體現(xiàn)。本文討論的特定實(shí)施方案僅僅闡明做出和使用本發(fā)明的特定方法并且不限制本發(fā)明的范圍。
為了促進(jìn)理解本發(fā)明，下面定義了許多術(shù)語(yǔ)。本文定義的術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中技術(shù)人員通常理解的含義。術(shù)語(yǔ)如“一個(gè)(a)”、“一種(an)”及“該(the)”不意在指僅僅單數(shù)實(shí)體，而是包括其特定實(shí)例可以用于闡明的一般類別。本文的術(shù)語(yǔ)用于描述本發(fā)明的特定實(shí)施方案，但是它們的用法不限制本發(fā)明，本發(fā)明僅僅受到權(quán)利要求書(shū)的限定。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原呈遞細(xì)胞”或者“APC”用于指表達(dá)向T細(xì)胞呈遞抗原的MHC I類和/或II類分子的自體細(xì)胞?？乖蔬f細(xì)胞的實(shí)例包括，例如，專職或者非專職抗原加工和呈遞細(xì)胞。專職APC的實(shí)例包括例如，B細(xì)胞、完整脾細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或者非分級(jí)分離的外周血單核細(xì)胞(PMBC)。造血APC的實(shí)例包括樹(shù)突細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。當(dāng)然，可以理解本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到其他抗原呈遞細(xì)胞可以用于本發(fā)明并且本發(fā)明不限于本文描述的示例性細(xì)胞類型。
APC可以“裝載了”經(jīng)脈沖的抗原，或者裝載了抗原性肽或來(lái)自一種或多種抗原的重組肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽是抗原并且通常是能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原片段，所述免疫應(yīng)答的特征是激活針對(duì)哺乳動(dòng)物的惡性腫瘤或者感染的輔助T細(xì)胞、細(xì)胞溶解性T淋巴細(xì)胞(細(xì)胞溶解性T細(xì)胞或者CTL)。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽包括由I類MHC或者II類MHC分子呈遞的抗原的一種或多種肽片段。肽片段可以是由肉瘤、淋巴瘤、黑素瘤或者其他自體或者異種腫瘤或者癌表達(dá)的抗原。當(dāng)然，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明可以使用作為其他抗原的一種或多種片段的肽或者蛋白質(zhì)片段并且本發(fā)明不限于本文描述的示例性肽、腫瘤細(xì)胞、細(xì)胞克隆、細(xì)胞系、細(xì)胞上清液、細(xì)胞膜和/或抗原。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“樹(shù)突細(xì)胞”或者“DC”指用于本發(fā)明的所有DC，即，DC處于分化、成熟和/或活化的各種階段。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，樹(shù)突細(xì)胞和應(yīng)答T細(xì)胞來(lái)自健康志愿者。在另一實(shí)施方案中，樹(shù)突細(xì)胞和T細(xì)胞來(lái)自患有癌癥或者其他形式的腫瘤疾病的患者。在再一個(gè)實(shí)施方案中，樹(shù)突細(xì)胞用于自體或者同種異體應(yīng)用。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”指足夠誘導(dǎo)或者擴(kuò)增針對(duì)腫瘤抗原，例如腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答的抗原或者表位的量。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“疫苗”指通過(guò)對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的細(xì)胞，即B細(xì)胞和/或T細(xì)胞產(chǎn)生作用來(lái)影響病程的組合物。疫苗的作用可以包括例如，誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性或者改變T細(xì)胞對(duì)其抗原的應(yīng)答。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫有效的”指抗原和裝載一種或多種熱激和/或被殺死的腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞引起免疫應(yīng)答的改變以防止或者治療癌癥的量。插入或者再插入患者的抗原裝載的和/或抗原裝載的APC的量將在個(gè)體之間不同，這取決于許多因素。例如，在具有實(shí)體瘤或者轉(zhuǎn)移性腫瘤的人中有效的免疫應(yīng)答可能需要不同的劑量。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”指顯示出異常形態(tài)或者增殖表型的細(xì)胞。癌細(xì)胞可以形成部分腫瘤，在該情況中其可以定義為腫瘤細(xì)胞。在體外，癌細(xì)胞的特征是如技術(shù)人員已知的無(wú)貼壁依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)、失去接觸抑制等等。與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞可以展示出組織的異常的新生長(zhǎng)，例如，實(shí)體瘤或者細(xì)胞，其侵入周圍組織并且轉(zhuǎn)移到其他身體部位。腫瘤或者癌“細(xì)胞系”通常用于描述無(wú)限增殖的和可以在體外生長(zhǎng)的那些細(xì)胞。原代細(xì)胞通常用于描述原代培養(yǎng)中的細(xì)胞，即它從患者、組織或者腫瘤新鮮分離。細(xì)胞克隆將通常用于描述已經(jīng)從單個(gè)細(xì)胞分離或者克隆的細(xì)胞并且可以在體外培養(yǎng)中傳代或未傳代。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞抗原”指已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明應(yīng)激和殺死的細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，可以處理或者應(yīng)激癌細(xì)胞從而使得癌細(xì)胞增加熱激蛋白如HSP70、HSP60和GP96的表達(dá)，所述蛋白是已知作為被降解或者可以被降解的蛋白質(zhì)的分子陪伴起作用的一類蛋白質(zhì)。通常，這些熱激蛋白將穩(wěn)定內(nèi)部癌細(xì)胞抗原，從而使得癌細(xì)胞可以包括更高度免疫原性的癌細(xì)胞特異性抗原。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“接觸的”和“暴露的”當(dāng)應(yīng)用于抗原和APC時(shí)，在本文中用于描述將抗原與APC直接并列放置的過(guò)程。為了通過(guò)APC實(shí)現(xiàn)抗原呈遞，以有效“致敏”APC在細(xì)胞表面表達(dá)抗原裝載的MHC I類和/或II類抗原的量提供抗原。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“殺死”描述了通過(guò)多種因素導(dǎo)致細(xì)胞死亡，所述因素為諸如化學(xué)殺死，其中使用例如，白樺脂酸、紫杉醇、喜樹(shù)堿、橢圓玫瑰樹(shù)堿、光神霉素A、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、離子霉素和其組合。許多方法或試劑的任一種都可以用于殺死作為本發(fā)明抗原的熱激癌細(xì)胞，例如，任一種或多種輻射(γ、紫外線、微波、超聲等等)、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、干燥、冷凍噴霧、冷凍干燥、真空干燥、穿刺、饑餓和其組合。另一類型的細(xì)胞殺死或者死亡通常稱作“細(xì)胞凋亡”，其包括激活細(xì)胞內(nèi)蛋白酶和核酸酶，其導(dǎo)致例如，細(xì)胞核退化和核DNA斷裂。各種細(xì)胞內(nèi)分子相互作用以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞死亡的精確機(jī)制的理解對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐不是必需的。
本文使用的短語(yǔ)“治療有效量”指裝載了抗原的APC的量，其當(dāng)組合施用于動(dòng)物時(shí)有效殺死動(dòng)物內(nèi)的癌細(xì)胞。本發(fā)明的方法和組合物同樣適于在體外和體內(nèi)殺死一種或多種癌細(xì)胞。當(dāng)待殺死的細(xì)胞位于動(dòng)物中時(shí)，本發(fā)明可以結(jié)合療程使用或者作為療程的部分使用，所述療程也可以包括一種或多種抗腫瘤劑，例如，化學(xué)藥品、輻射、X射線、紫外光照射、微波、電子發(fā)射等等。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明可以結(jié)合治療有效量的藥物組合物使用，如DNA損傷化合物，如阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、喜樹(shù)堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉑等等。然而，本發(fā)明包括將激活可以受到DNA損傷劑影響的其他免疫細(xì)胞的活細(xì)胞。同樣，任何化學(xué)藥品和/或其他療程將一般被定時(shí)以使適應(yīng)性免疫應(yīng)答最大化而同時(shí)幫助殺死盡可能多的癌細(xì)胞。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“裝載了抗原的樹(shù)突細(xì)胞”、“抗原脈沖的樹(shù)突細(xì)胞”等等指已經(jīng)接觸抗原的DC，在該情況中，所述抗原為已經(jīng)被熱激的癌細(xì)胞。通常，樹(shù)突細(xì)胞需要幾小時(shí)，或者最長(zhǎng)達(dá)一天來(lái)加工用于呈遞到首次用于實(shí)驗(yàn)的和記憶T細(xì)胞的抗原?？赡苄枰谝惶旎騼商旌笥每乖俅蚊}沖DC以增強(qiáng)抗原的攝入和加工和/或提供將改變DC的成熟水平的一種或多種細(xì)胞因子。一旦DC已經(jīng)吞食了抗原(例如，預(yù)加工的熱激和/或殺死的癌細(xì)胞)，就將它稱作“抗原致敏的DC”。通過(guò)用例如針對(duì)用于脈沖的特定癌細(xì)胞的抗體進(jìn)行免疫染色可以在DC中看到抗原致敏。
可以將抗原裝載或脈沖的DC群體洗滌、濃縮或直接輸注入患者中作為針對(duì)該抗原所來(lái)源的病原體或腫瘤細(xì)胞的一類疫苗或者治療。通常，預(yù)期裝載了抗原的DC在體內(nèi)接觸首次用于實(shí)驗(yàn)的和/或記憶T淋巴細(xì)胞，從而導(dǎo)致它們識(shí)別并破壞在它們的表面上展示所述抗原的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，裝載了抗原的DC可以甚至在體外與T細(xì)胞相互作用，之后重新導(dǎo)入患者中。技術(shù)人員將知道怎樣最優(yōu)化每次輸注的裝載了抗原的DC的數(shù)目、輸注數(shù)目和時(shí)間選擇。例如，將通常每次輸注用1-2百萬(wàn)個(gè)抗原脈沖的細(xì)胞輸注患者，但是更少的細(xì)胞也可以誘導(dǎo)所需的免疫應(yīng)答。
可以將裝載了抗原的DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)以產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗原特異性T細(xì)胞”指在暴露于本發(fā)明的裝載了抗原的APC后增殖以及發(fā)展攻擊在它們的表面上具有特定抗原的細(xì)胞的能力的T細(xì)胞。此類T細(xì)胞，例如，細(xì)胞毒性T細(xì)胞通過(guò)多種方法來(lái)裂解靶細(xì)胞，例如，向靶細(xì)胞的表面上釋放毒性酶，如粒酶和穿孔素，或者通過(guò)實(shí)現(xiàn)這些裂解酶進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)部。通常，細(xì)胞毒性T細(xì)胞在它們的細(xì)胞表面上表達(dá)CD8。表達(dá)CD4抗原CD4的T細(xì)胞通常稱作“輔助”T細(xì)胞，還可以幫助促進(jìn)特定細(xì)胞毒性活性并且還可以被本發(fā)明的裝載了抗原的APC活化。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞、APC和甚至T細(xì)胞可以來(lái)自相同的供體，其MNC產(chǎn)生DC，所述供體可以是該患者或者HLA或者從將被治療的個(gè)體患者得到。備選地，癌細(xì)胞、APC和/或T細(xì)胞可以是同種異體的。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用腫瘤細(xì)胞抗原裝載的抗原呈遞細(xì)胞，例如樹(shù)突細(xì)胞(DC)接種癌癥患者可以誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答。然而，已經(jīng)證明難以將免疫應(yīng)答與臨床結(jié)果關(guān)聯(lián)起來(lái)。Banchereau等人，(2001)；和Palucka等人，(2003)報(bào)導(dǎo)用裝載了肽的CD34-DC接種具有IV期黑素瘤的18名HLA-A*0201患者，并且在體外暴露于黑素瘤抗原衍生的肽后如通過(guò)IFN-γ產(chǎn)生(ELISPOT)測(cè)量到的增強(qiáng)黑素瘤特異性CD8+T細(xì)胞免疫性。這些研究證明免疫應(yīng)答與早期臨床應(yīng)答相關(guān)。此外，用CD34-DC接種可以引發(fā)黑素瘤特異性CD8+記憶T細(xì)胞，其可以在回憶測(cè)定中，即在體外用肽脈沖的DC單次再刺激后擴(kuò)張，其中它們成熟為特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。表明疾病進(jìn)展與缺少黑素瘤特異性CD8+記憶T細(xì)胞的誘導(dǎo)有關(guān)。盡管做出了這些努力，但是需要改進(jìn)的接種策略來(lái)克服臨床中黑素瘤特異性免疫的這種選擇性缺乏。
例如，已經(jīng)表明DC在健康志愿者和IV期黑素瘤患者中作為免疫貯庫(kù)(reservoir)或者佐劑起作用(Nestle等人，1998；Dhodapkar等人，1999；Thurner等人，1999；和Dhodapkar等人，2000)。迄今為止，僅僅已報(bào)導(dǎo)了有限的臨床應(yīng)答，其可以是由于免疫表位的選擇或者單個(gè)表位的靶定。實(shí)際上，使用多種腫瘤抗原促進(jìn)具有多種特異性的T細(xì)胞的活化/誘導(dǎo)，這可能更好地控制疾病和防止腫瘤逃逸。在這方面，已經(jīng)使用了幾個(gè)系統(tǒng)來(lái)用腫瘤相關(guān)抗原(TAA)裝載DC(Gilboa，E.1999)。用來(lái)自確定的抗原的肽裝載MHC I類分子是最常用的，并且也應(yīng)用于最近鑒定的MHC II類輔助表位(Wang等人，1999；和Kierstead，等人，2001)。
盡管對(duì)于“概念證明(proof of concept)”研究是重要的，但是肽的使用具有來(lái)自如下的限制(i)它們局限于給定的HLA型；(ii)有限數(shù)目的確定的TAA；和(iii)誘導(dǎo)T細(xì)胞克隆的有限的所有組成成分，從而限制免疫系統(tǒng)控制腫瘤抗原變異的能力。需要備選的策略，其提供MHC I類和II類表位并且導(dǎo)致涉及CD4+T細(xì)胞和CTL的許多克隆的不同免疫應(yīng)答。已報(bào)導(dǎo)的策略涉及使用重組蛋白質(zhì)、外來(lái)體(Zitvogel，等人，1998)、病毒載體(Ribas，等人，2002)、質(zhì)粒DNA或者RNA轉(zhuǎn)染(Boczkowski，等人，1996；Ashley等人，1997；和Heiser，等人，2002)、免疫復(fù)合體(Regnault，1999)和更近地，針對(duì)DC表面分子的抗體(Gilboa，E.1999；和Fong，等人，2000)。
使免疫應(yīng)答多樣化的再一種方法是利用DC呈遞來(lái)自被吞噬的細(xì)胞凋亡腫瘤細(xì)胞的肽的能力，或所謂的交叉致敏(Albert等人，1998a；Albert等人，1998b；Nouri-Shirazi等人，2000；Berard等人，2000；和Labarriere等人，2002)。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)向DC導(dǎo)入完整抗原允許DC選擇和剪裁用于呈遞給T細(xì)胞的肽，并從而不需要鑒定具有已知的MHC限制的腫瘤特異性肽。已經(jīng)表明裝載了被殺死的同種異體黑素瘤細(xì)胞的DC可以交叉致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞以分化成黑素瘤特異的CTL(Berard，等人，2000)。裝載了被殺死的同種異體黑素瘤或者前列腺癌細(xì)胞系的DC致敏針對(duì)共有的腫瘤抗原的首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8 T細(xì)胞(Nouri-Shirazi，等人，2000；和Berard，等人，2000)。然而，T細(xì)胞需要幾輪刺激以確立腫瘤特異性應(yīng)答。因此，重要的是鑒定和開(kāi)發(fā)用于增加腫瘤或者癌細(xì)胞免疫原性的組合物和方法。
本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到熱激蛋白(HSP)組成了分子陪伴，其用于將多肽從它們的產(chǎn)生轉(zhuǎn)運(yùn)到例如，它們結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的MHC I類(Basu，等人，2000；和Frydman，J.2001)。最近已經(jīng)確立HSP70、HSP60和GP96為用于與抗原性蛋白質(zhì)或者肽交叉致敏的免疫佐劑(Srivastava，等人，1994；和Srivastava，P.，2002)。在該過(guò)程中，重構(gòu)的hsp-70肽復(fù)合體或者gp96-肽復(fù)合體被抗原呈遞細(xì)胞(APC)通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用經(jīng)由CD91(Basu，等人，2001)、CD40(Becker，等人，2002)、LOX-1(Delneste，等人，2002)或TLR2/4(Asea，等人，2002)內(nèi)化。已經(jīng)將HSP肽復(fù)合體用作疫苗(美國(guó)專利號(hào)6,468,540；和Noessner，等人2002.“Tumor-derived heat shock protein 70 peptidecomplexes are cross-presented by human dendritic cells，”J Immunol1695424-5432)?？梢詮幕颊叩哪[瘤細(xì)胞純化HSP70肽復(fù)合體并且將其施用于患者(美國(guó)專利號(hào)6,468,540)。已經(jīng)確定HSP70肽復(fù)合體能夠結(jié)合到抗原呈遞細(xì)胞并且活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Castelli，等人2001.“Human heat shock protein 70 peptide complexes specifically activateantimelanoma T cells，”Can Res 61222-227；和Noessner，等人2002.J Immunol 1695424-5432)。HSP70已經(jīng)用于刺激樹(shù)突細(xì)胞成熟(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0020127718)。
更具體地，本發(fā)明包括抗原呈遞細(xì)胞，例如，樹(shù)突細(xì)胞(DC)，其裝載了應(yīng)激和/或熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞，或者表達(dá)熱激蛋白的被殺死的腫瘤細(xì)胞，并且在本文中描述了制備此類抗原呈遞細(xì)胞的方法。這些經(jīng)裝載的DC可以用于在人和動(dòng)物中誘導(dǎo)預(yù)防性免疫應(yīng)答和治療性免疫應(yīng)答兩者。具體地，此類經(jīng)裝載的DC可以用于管理癌癥和感染性疾病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括用于治療黑素瘤的樹(shù)突細(xì)胞(DC)疫苗，其整合了下面的免疫原性現(xiàn)象(i)DC交叉致敏黑素瘤特異性CTL的能力，(ii)使用被殺死的腫瘤細(xì)胞作為抗原來(lái)源的優(yōu)點(diǎn)，(iii)HSP在肽保護(hù)和運(yùn)輸中的有利的作用，和(iv)如本文中證明的，通過(guò)熱激上調(diào)腫瘤抗原表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的DC疫苗包括裝載了熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC，其中DC能夠交叉致敏抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的DC疫苗包括裝載了被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC，所述腫瘤細(xì)胞已經(jīng)被誘導(dǎo)以超表達(dá)HSP，其中DC能夠交叉致敏抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。除非另外指出，將理解當(dāng)在本文中引用包含裝載了熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC的DC疫苗時(shí)，也可以使用包含裝載了經(jīng)轉(zhuǎn)染或者誘導(dǎo)以超表達(dá)HSP的被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC的DC疫苗。
用于本發(fā)明的DC包括各種分化階段的樹(shù)突細(xì)胞(前體、不成熟樹(shù)突細(xì)胞和成熟樹(shù)突細(xì)胞)，來(lái)自血液前體的樹(shù)突細(xì)胞(包括但不限于單核細(xì)胞)，來(lái)自CD34-造血祖細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞的亞群，如朗格漢斯細(xì)胞、間質(zhì)DC和淋巴樣DC。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹(shù)突細(xì)胞是單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(MDDC)，例如，DC為人來(lái)源的。
疫苗方案和劑量。本發(fā)明可以使用任一接種方案，然而，下面的示例性方案已經(jīng)用于產(chǎn)生效果，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道的。一次或多次接種可以在施用額外的肽脈沖的APC之前或之后，時(shí)間間隔為數(shù)秒到數(shù)小時(shí)到數(shù)天到甚至數(shù)周。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)患者分開(kāi)施用細(xì)胞碎片脈沖的APC和一種或多種淋巴因子和/或細(xì)胞因子。通常，在每次免疫的時(shí)間之間選擇相當(dāng)大的時(shí)間段(1、2、3或者4周)，從而兩次抗原脈沖的APC的組合和/或重疊對(duì)受體發(fā)揮有益作用。
例如，將在一些情況中需要組合施用肽脈沖的APC與一種或多種淋巴因子，其驅(qū)動(dòng)例如來(lái)自Th1的T細(xì)胞免疫應(yīng)答到Th2型應(yīng)答，或者反之亦然?？梢允褂酶鞣N組合，例如，其中肽脈沖的APC為“A”并且淋巴因子為“B”A/B/B B/A/A A/A/BA/B/A B/A/B B/B/AB/B/B/AB/B/A/BB/A/B/AB/A/A/BA/A/B/BA/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AB/A/B/BA/A/B/AA/B/B/B可以在開(kāi)始接種方案之前、期間和/或之后測(cè)量有效腫瘤殺死。為了實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞殺死，將裝載了抗原的APC以有效殺死腫瘤細(xì)胞的組合量遞送給患者。這些治療循環(huán)可以重復(fù)多次，或者僅遞送一次。技術(shù)人員已知各種因素影響患者對(duì)接種的反應(yīng)，所述因素包括例如，物種、年齡、重量、性別、健康、妊娠、上癮、變態(tài)反應(yīng)、種族起源、以前的醫(yī)學(xué)狀況、當(dāng)前的醫(yī)學(xué)狀況、用消炎藥治療、化學(xué)療法和治療的時(shí)間長(zhǎng)度。從而，技術(shù)人員理解需要對(duì)每名患者個(gè)體化劑量并且可以容易地改變各種參數(shù)以實(shí)現(xiàn)最佳免疫應(yīng)答，無(wú)論其是細(xì)胞殺死(例如，針對(duì)癌)還是減小不想要的免疫應(yīng)答(例如，惡病質(zhì))。技術(shù)人員還可以考慮在選擇合適的劑量前將被治療的狀況。例如，適于治療癌癥的接種劑量可能不是隨后設(shè)計(jì)用來(lái)防止癌癥復(fù)發(fā)的監(jiān)視療法所需要的劑量。
可以靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、瘤內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、腎被膜下、眼內(nèi)、骨內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸、硬膜外、硬膜內(nèi)等等進(jìn)行接種。通常，最常用的接種途徑是皮下(SC)、靜脈內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)和腹膜內(nèi)(IP)。就疫苗與緩沖液和/或藥理學(xué)上可接受的鹽相容方面來(lái)說(shuō)，這些可以在適于與一種或多種添加劑混合的水溶液中制備。在普通保存和使用條件下，這些制劑可以包括有限量的防腐劑和/或抗生素以防止微生物的生長(zhǎng)。
適于注射使用的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或者分散體。在所有情況中，所述形式必須是無(wú)菌的并且必須是容易注射的流體。保存條件(如果存在)必須與在生產(chǎn)和保存條件下遞送穩(wěn)定的DC相容并且必須在防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用下保存。在大多數(shù)情況中，它通常包括一種或多種等滲劑，如糖或者氯化鈉。用APC對(duì)抗原的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在抗原中使用延遲的吸收，如單硬脂酸鋁、磷酸鈣和明膠來(lái)引起。
通過(guò)將所需量的活性化合物與上面列舉的已經(jīng)例如過(guò)濾滅菌的各種其他成分摻入合適的溶劑中來(lái)制備無(wú)菌可注射溶液。通常，通過(guò)將各種滅菌的活性成分摻入無(wú)菌載體中來(lái)制備分散體，所述無(wú)菌載體包括基本的分散介質(zhì)和來(lái)自上面列舉的所需的其他成分。在用于制備抗原的無(wú)菌粉末的情況中，抗原可以是預(yù)先制備的和真空干燥的、冷凍干燥的和/或冷凍噴霧的以產(chǎn)生活性成分加上其來(lái)自前面無(wú)菌過(guò)濾的溶液的任何額外所需成分的粉末。
本文使用的“可藥用載體”包括任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。此類介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域公知的。除了在任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與癌癥抗原不相容的范圍內(nèi)，所述試劑可以用作疫苗生產(chǎn)方法的部分。
本文使用的短語(yǔ)“在有效允許蛋白質(zhì)復(fù)合體形成的條件下”指需要“裝載”APC，例如，樹(shù)突細(xì)胞的MHC的被熱殺死的、殺死的或者以其他方式加工的腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞碎片、加工的腫瘤抗原、加工的腫瘤細(xì)胞、熱殺死的腫瘤細(xì)胞和/或抗原的那些條件和量。本文使用的術(shù)語(yǔ)“適于”抗原裝載為允許DC接觸、加工和在MHC上呈遞一種或多種腫瘤抗原(無(wú)論是在細(xì)胞內(nèi)還是在細(xì)胞表面上)的那些條件?；诒竟_(kāi)內(nèi)容和本文的實(shí)施例，技術(shù)人員將知道足夠允許有效結(jié)合、加工和裝載的溫育、溫度和時(shí)間段。溫育步驟通常為約1到2到4小時(shí)，在約25℃到37℃(或更高)的溫度下，和/或可以在約4℃下過(guò)夜等等。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，APC是裝載了死亡或者垂死的腫瘤細(xì)胞(在本文中稱作“殺死的腫瘤細(xì)胞”)的DC，所述腫瘤細(xì)胞包括但不限于腫瘤細(xì)胞系和分離的自體或者同種異體腫瘤細(xì)胞?？梢灶A(yù)知從患者分離或者可以從其他來(lái)源得到的任何腫瘤或者癌細(xì)胞都可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。盡管實(shí)例公開(kāi)了使用黑素瘤細(xì)胞系，但是預(yù)期本發(fā)明的實(shí)施方案可以用于治療其他癌癥，并且本發(fā)明的實(shí)施方案可以治療的癌癥類型取決于用于裝載樹(shù)突細(xì)胞的癌細(xì)胞類型。
在本文給出的實(shí)施例中，通過(guò)用白樺脂酸(BA)處理實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的死亡。BA是針對(duì)黑素瘤的特定活性劑，其通過(guò)活化胱天蛋白酶-8和胱天蛋白酶-3誘導(dǎo)依賴于線粒體的死亡。盡管白樺脂酸(BA)用于誘導(dǎo)用于本文給出的實(shí)施例中黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡，但是在本文的實(shí)施方案中可以用其他細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑代替BA。其他細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑包括但不限于白樺脂酸、紫杉醇、喜樹(shù)堿、橢圓玫瑰樹(shù)堿、光神霉素A、依托泊苷、長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿。
本發(fā)明的DC疫苗包含裝載了被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC，所述腫瘤細(xì)胞已經(jīng)被處理以誘導(dǎo)熱激蛋白(HSP)的表達(dá)或者已經(jīng)被轉(zhuǎn)染以超表達(dá)HSP。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DC疫苗包含單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(MDDCs)，該樹(shù)突細(xì)胞裝載了以前在至少42℃(在本文中稱作“熱激”)溫育至少4小時(shí)以誘導(dǎo)HSP表達(dá)的被殺死的腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，DC疫苗包含裝載了腫瘤體的MDDC，所述腫瘤體已經(jīng)用包含HSP超表達(dá)基因的載體，例如，本文描述的RRL-pgk-HSP70-EGFP慢病毒載體轉(zhuǎn)染。可以用于本發(fā)明的其他HSP包括但不限于HSP60、HSP90和gp96。盡管42℃用于熱激腫瘤體或者細(xì)胞的實(shí)施例中，但是足夠增加HSP表達(dá)而保留HSP功能的任何溫度都可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中(例如，約39-55℃)。增加細(xì)胞中HSP表達(dá)的其他方法包括但不限于冷溫度、葡萄糖剝奪或者不供氧、暴露于改變細(xì)胞代謝的藥物、暴露于細(xì)胞毒性藥物和其他應(yīng)激信號(hào)。此外，盡管實(shí)施例顯示了熱激2、4或者8小時(shí)，但是足夠增加HSP70或者其他HSP表達(dá)的任何時(shí)間段都可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。
根據(jù)本發(fā)明，裝載了被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC能夠引起細(xì)胞毒性細(xì)胞(CTL)，其能夠殺死裝載了腫瘤相關(guān)抗原來(lái)源的肽的腫瘤細(xì)胞以及靶細(xì)胞。細(xì)胞毒性細(xì)胞包括但不限于CD8 T細(xì)胞、CD4 T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、和天然殺傷T細(xì)胞。在下文中將理解，除非另外說(shuō)明，對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的引用指一種或多種細(xì)胞毒性細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)將細(xì)胞毒性細(xì)胞如CD8+T細(xì)胞與裝載了熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC共培養(yǎng)來(lái)制備CTL。在一種方法中，將熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞與MDDC以1∶1的比率在37℃下共培養(yǎng)；3小時(shí)共培養(yǎng)后，將細(xì)胞懸浮在0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA PBS溶液中5分鐘以破壞細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合；分選CD11c+DCs，用sCD40L(200納克/毫升)成熟24小時(shí)，然后用于致敏細(xì)胞毒性細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，如免疫學(xué)家將知的，可以使用允許DC攝入HSP腫瘤抗原復(fù)合體的經(jīng)裝載的樹(shù)突細(xì)胞共培養(yǎng)的任何溫育溫度和任何量的時(shí)間。
裝載了熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC還可以致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞分化成效應(yīng)細(xì)胞，所述效應(yīng)細(xì)胞能夠識(shí)別在用于裝載樹(shù)突細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞和/或其他腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的特異抗原或多種和/或共有的腫瘤抗原。在不同細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞之間共有的該針對(duì)多種抗原的交叉致敏對(duì)于引起寬免疫應(yīng)答是重要的。在本發(fā)明中，裝載了來(lái)自一種特定同種異體腫瘤來(lái)源的細(xì)胞體的DC引起的CTL可以用于提供對(duì)其他腫瘤的殺死效應(yīng)。例如，裝載了來(lái)自特定同種異體黑素瘤癌細(xì)胞系如Me275的被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC引起的CTL可以殺死其他腫瘤細(xì)胞系，如Me290。
本發(fā)明的方法也包括使用用于接種的合適的載體，例如，裝載了被熱激的、殺死的腫瘤細(xì)胞的自體樹(shù)突細(xì)胞中的本發(fā)明的抗原處理患者來(lái)治療患者的腫瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，用裝載來(lái)自相同患者的熱激的、殺死的腫瘤細(xì)胞的DC治療患者。在另一實(shí)施方案中，用裝載以前被誘導(dǎo)以超表達(dá)HSP的被殺死的腫瘤細(xì)胞的DC治療患者。在另一實(shí)施方案中，用通過(guò)裝載了自體或者同種異體的熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞的自體或同種異體樹(shù)突細(xì)胞致敏的自體T細(xì)胞治療患者。在再一個(gè)實(shí)施方案中，用裝載了以前經(jīng)熱激和/或被轉(zhuǎn)染以超表達(dá)HSP的被殺死的腫瘤細(xì)胞的自體或同種異體樹(shù)突細(xì)胞致敏的自體T細(xì)胞治療患者。將遵照類似的方案進(jìn)行預(yù)防性治療。本發(fā)明中疫苗施用途徑包括但不限于皮下、皮內(nèi)、腎被膜內(nèi)、眼內(nèi)或者皮內(nèi)注射。
可以基于第一次接種后評(píng)估血液免疫應(yīng)答來(lái)個(gè)體化疫苗施用頻率。在這種早期階段存在免疫應(yīng)答鑒定了需要較低頻率接種(例如，基于每月)的患者。在該階段不存在免疫應(yīng)答鑒定了需要更頻繁的接種(例如，每隔一周)的患者。在本發(fā)明中，患者將被終身接種或者直到惡性腫瘤發(fā)展。將遵照類似的方案進(jìn)行預(yù)防性治療。
在本發(fā)明中，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任一方法確定針對(duì)腫瘤抗原引起的免疫性的全面評(píng)價(jià)。例如，通過(guò)CD8+T細(xì)胞交叉致敏的幾種參數(shù)可以測(cè)量本發(fā)明的DC的免疫原性，包括下面的方法(i)首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞分化所需的用經(jīng)裝載的DC刺激的數(shù)目，(ii)在標(biāo)準(zhǔn)的4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定中HLA-A*0201黑素瘤細(xì)胞的殺死，(iii)在腫瘤退化測(cè)定中在體外防止腫瘤生長(zhǎng)的能力，(iv)黑素瘤肽脈沖的T2細(xì)胞的殺死，和(v)黑素瘤四聚體的結(jié)合。
在下面提供的實(shí)施例中進(jìn)一步詳細(xì)闡明本發(fā)明使用的組合物和方法，但是不將這些實(shí)施例認(rèn)為是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。盡管這些實(shí)施例描述了本發(fā)明，但是將理解對(duì)所述組合物和方法的修改在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，并且認(rèn)為此類修改在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1.細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)。人黑素瘤細(xì)胞系HLA-A*0201+Me275和HLA-A*0201+Me290系在Lausanne的Ludwig CancerInstitute中確立，并且由J-C.Cerottini和D.Rimoldi博士友情贈(zèng)送。乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(HLA-A2+)(ATCC No.HTB-22)和T2(HLA-A2+)(ATCC No.CRL-1922)來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)。K562(ATCC No.CCL-243)是多潛能造血惡性細(xì)胞系。Colo829(ATCC No.CRL-1974)是惡性黑素瘤細(xì)胞系。HLA-A*0201neg SKMel28和HLA-A*0201+SKMel24是從ATCC得到的惡性黑素瘤細(xì)胞系。所有這些細(xì)胞系都保持在由RPMI 1640(GIBCOBRL)、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素和10％熱滅活的胎牛血清(FCS)組成的完全培養(yǎng)基(CM)中。對(duì)于T細(xì)胞培養(yǎng)物，將FCS替換為10％熱滅活的人AB血清。
實(shí)施例2.產(chǎn)生EGFP+細(xì)胞系。將HLA-A201+同種異體細(xì)胞系T2、K562、Me275、Me290和MCF7用慢病毒載體pHREF1α-EGFP(由Patrice Mannoni博士友情提供)轉(zhuǎn)染，該載體編碼置于延伸因子1α啟動(dòng)子控制下的EGFP。在15的感染復(fù)數(shù)(MOI)下在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中以8微克/毫升聚凝胺(polybrene)(Sigma-Aldrich，St.Louis MO)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系6小時(shí)。然后加入新鮮培養(yǎng)基，并恢復(fù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第二天，通過(guò)流式細(xì)胞儀監(jiān)控EGFP表達(dá)。擴(kuò)張細(xì)胞并分選到＞95％EGFP+細(xì)胞的純度。將它們計(jì)數(shù)并以5.104/ml重懸浮在cRPMI+10％AB中。
實(shí)施例3.試劑和肽。使用的重組人細(xì)胞因子是GM-CSF(Immunex)、可溶性CD40配體(sCD40L)、IL-2、IL-7和IL-4(R&DSystems，Minneapolis，MN)。白樺脂酸(BA)和DNA染料7-氨基放線菌素D(7-AAD)購(gòu)買自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。肽gp100209-217(IMDQVPFSV；SEQ ID NO1)、酪氨酸酶368-376(YMDGTMSQV；SEQ ID NO2)、MART127-35(AAGIGILTV；SEQ IDNO3)、MAGE3271-279(FLWGPRALV；SEQ ID NO4)和PSA1141-150(FLTPKKLQCV；SEQ ID NO5)由Bio-Synthesis(Lewisville，TX)合成。將凍干的肽溶解在DMSO中，用無(wú)熱原水稀釋到1mg/ml，并在-80℃下保存。
實(shí)施例4.制備熱激的被殺死的黑素瘤細(xì)胞。將黑素瘤細(xì)胞系以CM中3×105個(gè)細(xì)胞/ml濃度鋪平板在250ml燒瓶中。如下所述制備熱激并殺死的黑素瘤細(xì)胞。在37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，將細(xì)胞移動(dòng)到42℃培養(yǎng)箱中2小時(shí)或4小時(shí)。然后在加入10微克/毫升的BA(經(jīng)報(bào)導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡的一種化合物)時(shí)將細(xì)胞在37℃溫育，并溫育額外的24小時(shí)。下文中將這些細(xì)胞稱作“熱黑素瘤體”。用裝載熱黑素瘤體的DC致敏的CD8+T細(xì)胞在下文中稱作“CTL熱”。
對(duì)于被殺死但是沒(méi)有熱激的黑素瘤細(xì)胞，將細(xì)胞用10微克/毫升BA在37℃下處理24或者48小時(shí)。下文中將這些細(xì)胞稱作“冷黑素瘤體”。用裝載了冷黑素瘤體的DC致敏的CD8+T細(xì)胞在下文中稱作“CTL冷”。對(duì)于熱激但是沒(méi)有用BA處理的黑素瘤細(xì)胞，將細(xì)胞移動(dòng)到42℃培養(yǎng)箱中2小時(shí)或者4小時(shí)，然后不加入BA，在37℃溫育額外的24小時(shí)。下文中將這些細(xì)胞稱作“熱激的黑素瘤細(xì)胞”。
在本文中給出的許多實(shí)驗(yàn)中，用未裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞用作對(duì)照。這些對(duì)照稱作“CTLun”。用APC-綴合的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠(PI)染色檢測(cè)在不同條件下腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡百分比。
實(shí)施例5.HSP表達(dá)的確定。將黑素瘤細(xì)胞系SKMel28、SKMel24、Me275、Me290和Colo829熱激、熱激加BA處理或者BA處理。收集代表性細(xì)胞并用冷磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次。用補(bǔ)加蛋白酶抑制劑混合物(0.1mM PMSF、1微克/毫升亮抑酶肽、1微克/毫升抑酶肽和1微克/毫升胃酶抑制劑)的合適體積的裂解緩沖液重懸浮細(xì)胞沉淀并在冰上溫育30分鐘，同時(shí)偶爾混合，直到細(xì)胞懸浮液是均勻的并且見(jiàn)不到團(tuán)塊。在4℃下將細(xì)胞裂解物于12,000rpm離心20分鐘。通過(guò)ELISA試劑盒(Stressgene，加拿大)檢測(cè)上清液中的HSP60和HSP70水平(圖1A和1B)。用Micro BSATMproteinAssay reagent Kit(Pierce Biotechnology，Inc.Rockford，IL)檢查細(xì)胞上清液中的總蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解物中HSP60或HSP70濃度定義為上清液中每毫克蛋白質(zhì)的納克HSP(ng/mg Pr)。如圖1A中所示，在4小時(shí)熱激的黑素瘤細(xì)胞和熱激加BA處理的細(xì)胞(熱黑素瘤體)中，每種黑素瘤細(xì)胞系中的HSP70表達(dá)都極大地增加。在圖1B中，2小時(shí)和4小時(shí)熱激黑素瘤細(xì)胞和熱激加BA處理的細(xì)胞(熱黑素瘤體)顯示出HSP60表達(dá)增加。
用蛋白質(zhì)印跡測(cè)量熱激細(xì)胞(2小時(shí)或4小時(shí))、熱激加BA處理的細(xì)胞(熱黑素瘤體)和BA處理的細(xì)胞(冷黑素瘤體)(24小時(shí))的SKMel28細(xì)胞系中HSP70、HSP60和GP96的表達(dá)模式。裝載含有30微克總蛋白質(zhì)的每種細(xì)胞裂解物并在8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Novex，San Diego)上。通過(guò)使用SuperBlocking緩沖液(Pierce Biotechnology，Inc.)在4℃下過(guò)夜封閉膜并與1微克/毫升小鼠抗人HSP60(SPA806)、HSP70(SPA810)或gp96(SPA851)單克隆抗體(Stressgene)在室溫下溫育2小時(shí)。用PBS-T緩沖液洗滌膜后，加入HRP-綴合的山羊抗小鼠IgG溫育1小時(shí)，并用Fluoro BlotTM過(guò)氧化物酶底物(Pierce Biotechnology，Inc.)揭示蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果表明對(duì)于4小時(shí)熱激的黑素瘤細(xì)胞和熱激加BA處理的細(xì)胞(熱黑素瘤體)，HSP60、HSP70和GP96表達(dá)增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例6.單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞產(chǎn)生和抗原裝載。將來(lái)自HLA-A*0201+健康供體或者G-CSF固定化的HLA-A*0201+健康供體的PBMC鋪平板到6孔板并允許在37℃貼壁2小時(shí)。除去未貼壁的細(xì)胞，并在補(bǔ)加GM-CSF(100納克/毫升)和IL-4(25納克/毫升)的CM中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。通過(guò)每隔一天加入新鮮GM-CSF和IL-4培養(yǎng)基來(lái)喂飼DC。在第5天，收獲未成熟單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(MDDCs)并用PBS洗滌，然后在4℃用CD11c-APC標(biāo)記30分鐘。
將殺死的腫瘤細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的MDDC以1∶1的比率在37℃共溫育。3小時(shí)的共溫育后，用0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA PBS溶液懸浮細(xì)胞5分鐘以破壞細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合。分選CD11c+DCs，用sCD40L(200納克/毫升)成熟24小時(shí)并用于致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞。
通過(guò)樹(shù)突細(xì)胞證實(shí)腫瘤體的吞噬作用。為了證實(shí)被殺死的腫瘤細(xì)胞被未成熟MDDC捕獲，將殺死的腫瘤細(xì)胞用DNA特異染料7AAD在4℃染色30分鐘，且然后與CD11c-APC標(biāo)記的未成熟MDDC以不同比率(3∶1、1∶1或1∶3)在4℃或者37℃下共溫育。2小時(shí)的培養(yǎng)后，通過(guò)FACS展示DC對(duì)被殺死的腫瘤體的吞噬作用，其表示為總的CD11c+DC群體中雙陽(yáng)性DC(即，CD11c+7AAD+)的百分比(數(shù)據(jù)未顯示)。還用共焦顯微鏡術(shù)證實(shí)DC對(duì)被殺死的腫瘤體的內(nèi)化。簡(jiǎn)言之，將DC和腫瘤體的共培養(yǎng)混合物封固到聚賴氨酸包被的載玻片(Baxter Diagnostics，Deerfield，IL)，用4％多聚甲醛固定，并用0.5％皂苷/0.2％BSA/0.2％明膠溶液透化。分別用gp100單克隆抗體(NKI/beteb，Biodesign International，Saco，ME)和CD1a-FITC-綴合的mAb鑒定腫瘤體和DC。在CD1a+標(biāo)記的MDDCs的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生gp100染色指示被殺死的腫瘤體被MDDC捕獲(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例7.首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞純化和致敏。檢查了裝載熱激的被殺死的腫瘤細(xì)胞的單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞(MDDC)致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T淋巴細(xì)胞的能力。
通過(guò)用小鼠抗人CD4、CD14、CD16、CD56、CD19和血型糖蛋白A微珠(Miltenyi Biotec，Inc.，Auburn，CA)損耗其他細(xì)胞從HLA-A*0201+健康供體的PBMC富集CD8+T細(xì)胞。通過(guò)AutoMACS系統(tǒng)(Miltenyi Biotec，Inc.)進(jìn)行損耗。將富集的CD8+T細(xì)胞用抗-CD27-FITC、CD45RA-PE、CD8-QR和CD45RO-APC染色并分選為CD8+CD45RA+CD27+CD45RO-首次用于實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞(＞95％純度)。將首次用于實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞與成熟的未裝載的DC或者裝載的DC以10∶1的比率共培養(yǎng)，在第一周補(bǔ)加10IU/ml IL-7，而在第二周補(bǔ)加IL-2。在第7天再刺激T細(xì)胞。
實(shí)施例8.51Cr釋放測(cè)定。將靶細(xì)胞用Na51CrO4在37℃標(biāo)記1小時(shí)。用4種黑素瘤肽(gp100、Tyr、MART1和MAGE3)脈沖T2細(xì)胞3小時(shí)后標(biāo)記。如前面描述的(Paczesny等人，2004)進(jìn)行4小時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)殺傷測(cè)定。簡(jiǎn)言之，將效應(yīng)細(xì)胞(30×103/孔)與51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞一起鋪平板在96孔圓底板中。4小時(shí)后，用收獲框架收獲上清液并用γ-計(jì)數(shù)器(Packard Instruments Co，Meriden，CT，US)測(cè)量釋放的鉻標(biāo)記的蛋白質(zhì)。然后確定抗原特異性裂解的百分?jǐn)?shù)。
對(duì)于封閉，將51Cr-標(biāo)記的靶與10微克/毫升的純化的小鼠抗人HLA-ABC mAb(克隆W6/32，DAKO，Carpinteria，CA)或HLA-DRmAb(克隆G46-6，BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)或匹配的小鼠IgG同種型(克隆G155-178或G46-6，BD BiosciencesPbarmingen)在96孔板中共溫育30分鐘，然后加入T細(xì)胞用于4小時(shí)標(biāo)準(zhǔn)殺傷測(cè)定。計(jì)算每個(gè)樣品的一式三份孔的平均值，并根據(jù)下式確定特定51Cr釋放的百分比
實(shí)施例9.腫瘤退化測(cè)定。如以前描述(Paczesny等人，2004)和實(shí)施例2中簡(jiǎn)述的用編碼EGFP的慢病毒載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞系。將細(xì)胞系以5×104個(gè)細(xì)胞/ml的濃度用含有10％AB血清的RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮。致敏的T細(xì)胞系以106個(gè)細(xì)胞/ml懸浮。在96孔U形底平板中在200微升的總體積中共溫育靶和T細(xì)胞0小時(shí)、4小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收獲細(xì)胞混合物并用0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA PBS溶液處理5分鐘。用PE-綴合的CD8 mAb將細(xì)胞沉淀染色并通過(guò)使用FACS CaliburTM(Becton Dickinson，SanJose，CA)進(jìn)行分析。對(duì)于每種樣品，獲得50,000個(gè)細(xì)胞。通過(guò)CELLQuestTM軟件(Becton-Dickinson)定量總?cè)后w(無(wú)閘門)中EGFP+群體(閘門R1)的百分?jǐn)?shù)。通過(guò)使用下式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)速率 0小時(shí)時(shí)的腫瘤生長(zhǎng)速率定義為100％。為了使用光學(xué)顯微鏡術(shù)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，使用錐蟲(chóng)藍(lán)排除。
實(shí)施例10.四聚體染色。iTAgTMMHC四聚體HLA-A0201/gp100(IMDQVPFSV)、HLA-A0201/MAGE3(FLWGPRALV)、HLA-A0201/酪氨酸酶(YMDGTMSQV)和HLA-A0201/MART1(ELAGIGILTV)肽四聚體購(gòu)自Beckman-Coulter。在室溫下將致敏的T細(xì)胞系用PE-綴合的四聚體染色30分鐘并用PerCP-或FITC-綴合的抗-CD8 mAb染色額外的30分鐘。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。
實(shí)施例11.回憶測(cè)定。用黑素瘤體裝載的DC進(jìn)行兩次刺激后的CD8 T細(xì)胞與肽脈沖的自體DC以10∶1的比率鋪平板。培養(yǎng)7天后對(duì)T細(xì)胞分析黑素瘤特異性CD8+T細(xì)胞的頻率。
實(shí)施例12黑素瘤特異性CTL的交叉致敏。如圖2中圖解的，通過(guò)與GM-CSF和IL-4培養(yǎng)從HLA-A*0201+健康志愿者的單核細(xì)胞產(chǎn)生未成熟DC。在殺死前將黑素瘤細(xì)胞系在42℃(熱激)溫育4小時(shí)。如實(shí)施例4中給出或者以前描述的(Berard等人，2000)，通過(guò)用白樺脂酸(BA)處理24小時(shí)，從未加熱(冷黑素瘤體)或者加熱(熱黑素瘤體)的黑素瘤細(xì)胞產(chǎn)生黑素瘤體。將這些被殺死的腫瘤細(xì)胞與未成熟MDDC以1∶1的比率共培養(yǎng)3小時(shí)以產(chǎn)生裝載了冷黑素瘤體的DC和裝載了熱黑素瘤體的DC，如實(shí)施例6中所述。分選未裝載的DC、裝載了冷黑素瘤體的DC和裝載了熱黑素瘤體的DC并與純化的CD8+CD45RA+CD27+CD45RO-首次用于實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞培養(yǎng)。向DC/T細(xì)胞(1∶10比率)共培養(yǎng)物補(bǔ)加可溶性CD40配體(200納克/毫升)、IL-7(10U/ml，整個(gè)培養(yǎng)物中)和IL-2(在第二周中)(10U/ml)。除非另外指出，用裝載了抗原的DC再刺激T細(xì)胞。在第二輪刺激后第7天，收獲細(xì)胞以如用4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定檢測(cè)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒性殺死活性以及黑素瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞的頻率。如實(shí)施例7中給出的該方法導(dǎo)致用未裝載的DC(CTLun)、裝載了冷黑素瘤體的DC(CTL冷)和裝載了熱黑素瘤體的DC(CTL熱)致敏的T細(xì)胞。
實(shí)施例13裝載了熱黑素瘤體的DC快速產(chǎn)生能夠在4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定中殺死黑素瘤細(xì)胞的CTL。以前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞需要用冷黑素瘤體裝載的DC三次刺激以分化成黑素瘤特異性CTL(Berard等人，2000)。因此，為了評(píng)估用熱黑素瘤體裝載是否增強(qiáng)所裝載的DC的免疫原性，測(cè)量?jī)奢喆碳ず蟮腃TL分化。如圖3A-3C中所示，用熱黑素瘤體裝載的DC刺激兩次的HLA-A*0201+CD8+T細(xì)胞能夠殺死用作黑素瘤體來(lái)源的HLA-A*0201+Me275黑素瘤細(xì)胞，在E∶T比率30∶1時(shí)具有33％±3特異性裂解(n＝3，圖3A)。殺死是特異的，因?yàn)闆](méi)有發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞的裂解。如所預(yù)期的，用冷黑素瘤體裝載的DC刺激兩次的CD8+T細(xì)胞不能殺死黑素瘤細(xì)胞(圖3A)。此外，兩次刺激后，用熱Me275黑素瘤體裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞能夠殺死HLA-A*0201+Me290黑素瘤細(xì)胞(n＝3，圖3B)，從而提示針對(duì)這兩種黑素瘤細(xì)胞系之間共有的抗原的致敏。黑素瘤細(xì)胞的殺死受到它們的I類MHC的表達(dá)的限制，因?yàn)橛米钄郔類MHC的mAb W6/32致敏靶細(xì)胞導(dǎo)致在不同的E∶T比率下Me275和Me290殺死的＞60％抑制(沒(méi)有W6/32mAb下E∶T比率15∶1時(shí)15％裂解，有W6/32mAb時(shí)4％裂解，圖3C，數(shù)據(jù)未顯示)。
此外，裝載來(lái)了自HLA-A*0201negSk-Mel28黑素瘤細(xì)胞的熱黑素瘤體的HLA-A*0201+DCs引起CD8+T細(xì)胞，其能夠殺死(盡管效率較低)HLA-A*0201+Sk-Mel24黑素瘤細(xì)胞(在30∶1的E∶T比率下16％的特異性裂解)。這些結(jié)果表明針對(duì)共有的黑素瘤抗原的交叉致敏。從而，用熱黑素瘤體裝載DC增強(qiáng)了它們的免疫原性，因?yàn)閮纱未碳ぷ銐蛘T導(dǎo)首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞分化成能夠殺死黑素瘤細(xì)胞系的CTL。
實(shí)施例14.裝載了熱黑素瘤體的DC快速產(chǎn)生能夠控制黑素瘤細(xì)胞的存活/生長(zhǎng)的CTL。本發(fā)明人已經(jīng)表明腫瘤退化測(cè)定(TRA)允許檢測(cè)腫瘤存活/生長(zhǎng)的T細(xì)胞依賴性抑制，其可以作為T細(xì)胞防止復(fù)發(fā)的能力的度量(Paczesny等人，2004)。因此，TRA被用作熱黑素瘤體裝載的DC的增強(qiáng)的免疫原性的另一種測(cè)量。為此，將來(lái)自具有冷或者熱黑素瘤體裝載的DC的培養(yǎng)物的CD8+T細(xì)胞與EGFP-標(biāo)記的黑素瘤細(xì)胞(以20∶1的E∶T比率)共培養(yǎng)；并在不同時(shí)間點(diǎn)收獲培養(yǎng)物，用抗CD8-PE標(biāo)記并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。
圖5A-5D顯示了代表性研究，其中在兩周培養(yǎng)中，對(duì)針對(duì)HLA-A*0201+Me290黑素瘤細(xì)胞致敏的HLA-A*0201+T細(xì)胞測(cè)試它們抑制Me290黑素瘤和對(duì)照K562細(xì)胞的存活/生長(zhǎng)的能力。如所預(yù)期的，用冷Me290體致敏的CD8+T細(xì)胞在控制Me290生長(zhǎng)方面不是非常有效。實(shí)際上，4小時(shí)共培養(yǎng)后，EGFP+(活的)黑素瘤細(xì)胞的級(jí)分與共培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的相比幾乎相同(圖5A)。24小時(shí)后，觀察到在活黑素瘤細(xì)胞的級(jí)分中約20％的降低(圖5A)。相反，用熱黑素瘤體裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞在控制Me290細(xì)胞存活/生長(zhǎng)中非常有效(圖5B)；培養(yǎng)4小時(shí)后，EGFP+黑素瘤細(xì)胞的級(jí)分降低＞80％并且在48小時(shí)的共培養(yǎng)中保持低水平。在活的腫瘤細(xì)胞的級(jí)分中觀察到的降低是黑素瘤特異的，因?yàn)镹K敏感性K562細(xì)胞的存活/生長(zhǎng)沒(méi)有改變(圖5C)。
通過(guò)針對(duì)HLA-A*0201+Me275黑素瘤細(xì)胞致敏的HLA-A*0201+CD8+T細(xì)胞抑制HLA-A*0201+Me290黑素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力進(jìn)一步證實(shí)特異針對(duì)黑素瘤細(xì)胞系的CD8+T細(xì)胞的致敏(圖5D)。這里，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)排除和使用光學(xué)顯微鏡術(shù)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)量黑素瘤細(xì)胞的存活/生長(zhǎng)。在三種研究中，用熱Me275黑素瘤體裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞比用冷Me275體裝載的DC致敏的那些細(xì)胞在控制Me290黑素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)/存活中明顯更有效(圖5D)。從而，用熱黑素瘤體裝載DC增強(qiáng)它們的免疫原性，因?yàn)閮H僅需要兩次刺激來(lái)誘導(dǎo)首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞分化成能夠控制黑素瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)/存活的CTL。
實(shí)施例15.裝載了熱黑素瘤體的DC快速產(chǎn)生能夠識(shí)別黑素瘤分化抗原衍生的肽的CTL。進(jìn)一步確定用熱體裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞對(duì)于黑素瘤分化抗原MART-1/Melan A、gp100、酪氨酸酶和MAGE-3是否特異。通過(guò)T細(xì)胞在如下兩種測(cè)定中識(shí)別T2細(xì)胞上呈遞的黑素瘤肽的能力來(lái)評(píng)估T細(xì)胞特異性1)與用來(lái)自分化抗原的四種黑素瘤肽的混合物脈沖的51Cr標(biāo)記的T2細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)后的51Cr釋放，和2)在TRA中黑素瘤肽脈沖的表達(dá)EGFP的T2細(xì)胞的存活。發(fā)現(xiàn)用熱HLA-A*0201+Me290黑素瘤體致敏的CD8+T細(xì)胞可以殺死黑素瘤肽脈沖的T2細(xì)胞，在51Cr釋放測(cè)定中40∶1的E∶T比率下具有40％的特異性裂解(圖6A)。所述殺死是特異的，因?yàn)橛脤?duì)照PSA肽脈沖的T2細(xì)胞沒(méi)有被殺死。如所預(yù)期的，用冷Me290黑素瘤體裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞不能殺死肽脈沖的T2細(xì)胞(圖6A)，這與我們以前觀察到必需三次刺激相一致(Berard等人，2000)。在交叉致敏研究中進(jìn)一步證實(shí)了黑素瘤分化抗原特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。將HLA-A*0201+CD8+T細(xì)胞用裝載了來(lái)自HLA-A*0201negSk-Mel28細(xì)胞的熱黑素瘤體的DC刺激兩次。如圖6B中所示，被致敏的CD8+T細(xì)胞以48％±8特異性裂解(E∶T比率為40∶1，n＝3)殺死黑素瘤肽脈沖的T2細(xì)胞，但是不殺死PSA肽脈沖的T2細(xì)胞，從而表明交叉致敏。
在腫瘤退化測(cè)定中也證實(shí)了致敏的CD8+T細(xì)胞識(shí)別黑素瘤抗原的能力。將來(lái)自與裝載的DC培養(yǎng)兩周的CD8+T細(xì)胞與表達(dá)EGFP的T2細(xì)胞共培養(yǎng)，所述T2細(xì)胞為未脈沖的、用對(duì)照PSA肽脈沖的或者用四種黑素瘤肽的混合物脈沖的。用流式細(xì)胞儀在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量T2細(xì)胞的存活作為EGFP+細(xì)胞的級(jí)分。如圖6E中所示，所致敏的CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)4小時(shí)共培養(yǎng)后EGFP+黑素瘤肽-脈沖的T2細(xì)胞級(jí)分的顯著減小(約70％)，并且在48小時(shí)的共培養(yǎng)中EGFP+T2細(xì)胞的級(jí)分保持低水平。該作用是特異的，因?yàn)閷?duì)照T2細(xì)胞(未脈沖的或者PSA脈沖的)的存活沒(méi)有改變(分別為圖6C和6D)。根據(jù)FACS數(shù)據(jù)，通過(guò)使用下式計(jì)算肽脈沖的T2-EGFP細(xì)胞的生長(zhǎng)速率
其中0小時(shí)時(shí)的腫瘤生長(zhǎng)速率定義為100％。如圖6F中所示，用熱黑素瘤體裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞比用冷黑素瘤體裝載的DC致敏的那些CD8+T細(xì)胞更有效，而用冷黑素瘤體裝載的DC致敏的CD8+T細(xì)胞在三次獨(dú)立研究中不能控制黑素瘤-肽脈沖的T2細(xì)胞的存活/生長(zhǎng)。從而，用熱黑素瘤體裝載DC增強(qiáng)了它們的免疫原性并且兩次刺激足夠誘導(dǎo)首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞分化成黑素瘤特異性CTL。
實(shí)施例16裝載了熱黑素瘤體的DC快速產(chǎn)生結(jié)合黑素瘤四聚體的CD8+T細(xì)胞。用裝載了四種黑素瘤肽，即gp100、MART-1/MelanA、酪氨酸酶和MAGE-3的四聚體測(cè)量黑素瘤特異性CD8+T細(xì)胞的頻率。圖7A-7C顯示了四聚體染色的代表性模式。用熱HLA-A*0201+Me290黑素瘤體裝載的DC兩次刺激后，0.4％的CD8+T細(xì)胞對(duì)于MART-1/Melan A是特異的(圖7A)。然而，在獲得5×104個(gè)T細(xì)胞用于分析后，幾乎檢測(cè)不到其他特異性，從而表明T細(xì)胞僅針對(duì)MART-1被致敏或者所引發(fā)的所有組成成分寬但是給定肽的頻率低，因此使得難以以特定特異性檢測(cè)到T細(xì)胞。
為了解決該問(wèn)題，分析回憶記憶CD8+T細(xì)胞的存在，即需要用確定的肽脈沖的DC進(jìn)行單次再刺激用于擴(kuò)張的T細(xì)胞。如上所述用裝載了熱Me290黑素瘤體的DC在兩周培養(yǎng)中致敏首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞。第二次刺激后第7天，洗滌T細(xì)胞，使用用四種黑素瘤肽的每一種或者用對(duì)照PSA肽脈沖的自體DC再刺激，并在培養(yǎng)額外的7天后進(jìn)行分析。如圖7B中所示，在用PSA肽脈沖的DC再刺激后，結(jié)合黑素瘤四聚體的CD8+T細(xì)胞的頻率保持穩(wěn)定。然而，用黑素瘤肽脈沖的DC的加強(qiáng)導(dǎo)致黑素瘤特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)張(圖7C)。從而，結(jié)合MART-1/Melan A四聚體的CD8+T細(xì)胞的頻率增加到1.49％，且具有其他特異性的T細(xì)胞明顯可檢測(cè)到0.35％MAGE-3特異性CD8+T細(xì)胞、0.25％gp100特異性CD8+T細(xì)胞和0.16％酪氨酸激酶特異性CD8+T細(xì)胞。
在用針對(duì)熱HLA-A*0201+Me290黑素瘤細(xì)胞致敏的CD8+T細(xì)胞的兩種研究中以及在交叉致敏情況下得到相似的結(jié)果，在交叉致敏情況中，針對(duì)HLA-A*0201negSk-Mel28黑素瘤細(xì)胞致敏HLA-A*0201+T細(xì)胞(表I)。在后一情況中，通過(guò)黑素瘤體裝載的DC致敏并且通過(guò)用黑素瘤肽脈沖的DC加強(qiáng)擴(kuò)張的回憶記憶T細(xì)胞明顯可檢測(cè)到，其對(duì)MART-1/Melan A、酪氨酸酶和MAGE-3具有優(yōu)勢(shì)特異性(表I)。最后，在兩種情況中，即T細(xì)胞用HLA-A*0201+Me290黑素瘤體或者HLA-A*0201negSk-Mel28黑素瘤體致敏的情況中，裝載熱體的DC在致敏黑素瘤特異性CD8+T細(xì)胞中比裝載冷體的DC有效得多(表I)。
表I結(jié)合黑素瘤四聚體的T細(xì)胞的頻率

實(shí)施例17熱處理通過(guò)編碼腫瘤抗原的基因的轉(zhuǎn)錄的上調(diào)增加交叉致敏。使用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析研究熱處理對(duì)編碼腫瘤抗原的基因的轉(zhuǎn)錄的作用。
對(duì)于給定目的細(xì)胞系，使用RNeasy試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明提取總RNA，并使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Palo Alto，CA)進(jìn)行評(píng)估。將RNA進(jìn)行使用TURBO DNA-free試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，Texas)的第二次DNA酶處理。使用Two-Cycle cDNA Synthesis試劑盒(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，California)從100納克RNA合成cDNA，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(MEGAscript T7 kit，Ambion，Inc.)。使用AppliedBiosystems TaqMan Assays on Demand探針和引物組根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明(Applied Biosystems，Inc.Foster City，California)進(jìn)行兩步RT-PCR。使用High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在ABI Prism 7700 Sequence Detection System上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。使用如Affymetrix User Bulletin#2(2001年10月更新)中描述的比較Ct方法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)。結(jié)果計(jì)算為熱處理的黑素瘤細(xì)胞相對(duì)于未處理的黑素瘤細(xì)胞的Ct中的標(biāo)準(zhǔn)化差異(ΔΔCt，q)。
研究結(jié)果在圖9A-9F中給出。SkMel28細(xì)胞不被加熱(“non”)；在42℃加熱4小時(shí)(“加熱4小時(shí)”)；在42℃熱處理4小時(shí)期間暴露于一種已知的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(“熱加AD”)；用對(duì)照載體EGFP轉(zhuǎn)染(“EGFP”)；或者用表達(dá)載體HSP70轉(zhuǎn)染(“HSP70”)，然后實(shí)時(shí)RT-PCR分析MAGE-B3(圖9A)、MAGE-B4(圖9C)或MAGE-A8(圖9E)的mRNA表達(dá)。將未加熱的細(xì)胞與熱處理的細(xì)胞比較，在熱處理后觀察到腫瘤抗原MAGE-B3、MAGE-B4和MAGE-A8的轉(zhuǎn)錄的確定的上調(diào)。放線菌素D的加入抑制上調(diào)，從而證實(shí)了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。HSP70的超表達(dá)不導(dǎo)致增加的黑素瘤抗原的轉(zhuǎn)錄。在Me290細(xì)胞系中獲得了相似的結(jié)果。細(xì)胞不被加熱(“non”)；在42℃加熱4小時(shí)(“加熱4小時(shí)”)；在42℃熱處理4小時(shí)期間暴露于一種已知的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(“熱加AD”)，然后實(shí)時(shí)RT-PCR分析MAGE-B3(圖9A)、MAGE-B4(圖9C)或MAGE-A8(圖9E)的mRNA表達(dá)。將未加熱的細(xì)胞與熱處理的細(xì)胞比較，在熱處理后觀察到腫瘤抗原MAGE-B3、MAGE-B4和MAGE-A8的轉(zhuǎn)錄的確定的上調(diào)。放線菌素D的加入抑制上調(diào)，從而證實(shí)了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。從而，熱處理或者體溫過(guò)高通過(guò)上調(diào)編碼黑素瘤抗原的基因的轉(zhuǎn)錄而增加了交叉致敏。
總之，誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞死亡和產(chǎn)生將裝載到根據(jù)本發(fā)明方法的DC疫苗上的黑素瘤體前熱處理黑素瘤細(xì)胞導(dǎo)致這種DC疫苗的免疫原性的顯著增強(qiáng)。增強(qiáng)的免疫原性以及從而患者對(duì)這類療法的應(yīng)答可以在測(cè)量首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞的幾種測(cè)定中容易地檢測(cè)i)首次用于實(shí)驗(yàn)的CD8+T細(xì)胞分化所需的用裝載的DC刺激的數(shù)目，ii)在標(biāo)準(zhǔn)4小時(shí)51Cr釋放測(cè)定中HLA-A*0201黑素瘤細(xì)胞的殺死，iii)在腫瘤退化測(cè)定中防止體外腫瘤生長(zhǎng)的能力，iv)黑素瘤肽脈沖的T2細(xì)胞的殺死，和v)黑素瘤四聚體的結(jié)合。在所有測(cè)定中，用加熱的黑素瘤體裝載的DC優(yōu)于用未加熱的或者冷黑素瘤體裝載的DC。這些結(jié)果提示當(dāng)加熱的黑素瘤細(xì)胞用作將裝載到DC疫苗上的黑素瘤抗原的來(lái)源時(shí)，不僅被致敏的T細(xì)胞的量而且質(zhì)量都是優(yōu)良的。對(duì)基于DC或者基于T細(xì)胞的腫瘤免疫療法臨床應(yīng)用本發(fā)明的方法包括使用本發(fā)明的DC疫苗的增加的免疫原性來(lái)1)縮短過(guò)繼T細(xì)胞療法方案的T細(xì)胞引發(fā)/擴(kuò)張所需的時(shí)間和2)限制在基于DC的免疫療法方案中每次注射的DC數(shù)目和/或DC注射的次數(shù)。
本發(fā)明可以使用的額外的人腫瘤細(xì)胞系的實(shí)例包括，例如表II.癌細(xì)胞細(xì)胞系 腫瘤類型J82 移行細(xì)胞癌，膀胱R(shí)T4 移行細(xì)胞乳頭狀瘤，膀胱ScaBER 鱗癌，膀胱T24 移行細(xì)胞癌，膀胱TCCSUP 移行細(xì)胞癌，膀胱，原發(fā)級(jí)別IV5637癌，膀胱，原發(fā)SK-N-MC 成神經(jīng)細(xì)胞瘤，轉(zhuǎn)移到眶上區(qū)SK-N-SH 成神經(jīng)細(xì)胞瘤，轉(zhuǎn)移到骨髓SW 1088 星形細(xì)胞瘤SW 1783 星形細(xì)胞瘤U-87 MG 成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，級(jí)別IIIU-118 MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤U-138 MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤U-373 MG成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，星形細(xì)胞瘤，級(jí)別IIIY79 成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤BT-20 癌，乳BT-474 導(dǎo)管癌，乳MCF7乳腺癌，胸膜滲漏MDA-MB-134-V乳，導(dǎo)管癌，胸膜I滲漏MDA-MD-157 乳髓質(zhì)，癌，胸膜滲漏MDA-MB-175-V乳，導(dǎo)管癌，胸膜II滲漏
MDA-MB-361 腺癌，乳，轉(zhuǎn)移到腦SK-BR-3 腺癌，乳，惡性胸膜滲漏C-33 A 癌，子宮頸HT-3癌，子宮頸，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)ME-180 表皮樣癌，子宮頸，轉(zhuǎn)移到網(wǎng)膜MEL-175 黑素瘤MEL-290 黑素瘤HLA-A*0201 黑素瘤細(xì)胞MS751 表皮樣癌，子宮頸，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)SiHa鱗癌，子宮頸JEG-3 絨毛膜癌Caco-2 腺癌，結(jié)腸HT-29 腺癌，結(jié)腸，適度良好分化的級(jí)別IISK-CO-1 腺癌，結(jié)腸，腹水HuTu 80 腺癌，十二指腸A-253 表皮樣癌，下頜腺FaDu鱗狀細(xì)胞癌，咽A-498 癌，腎A-704 腺癌，腎Caki-1 透明細(xì)胞癌，與腎原發(fā)的一致，轉(zhuǎn)移到皮膚Caki-2 透明細(xì)胞癌，與腎原發(fā)的一致SK-NEP-1Wilms氏瘤，胸膜滲漏SW 839 腺癌，腎SK-HEP-1腺癌，肝，腹水A-427 癌，肺Calu-1 表皮樣癌級(jí)別III，肺，轉(zhuǎn)移到胸膜Calu-3 腺癌，肺，胸膜滲漏Calu-6 未分化癌，可能為肺SK-LU-1 腺癌，肺，與差分化的一致，級(jí)別IIISK-MES-1鱗癌，肺，胸膜滲漏SW 900 鱗狀細(xì)胞癌，肺EB1 Burkitt淋巴瘤，upper maxilia
EB2Burkitt淋巴瘤，卵巢P3HR-1 Burkitt淋巴瘤，腹水HT-144 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到皮下組織Malme-3M 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到肺RPMI-7951 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)SK-MEL-1 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到淋巴系統(tǒng)SK-MEL-2 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到股皮膚SK-MEL-3 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)SK-MEL-5 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到輔助結(jié)(auxillary node)SK-MEL-24 惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到結(jié)SK-MEL-28 惡性黑素瘤SK-MEL-31 惡性黑素瘤Caov-3 腺癌，卵巢，與原發(fā)的一致Caov-4 腺癌，卵巢，轉(zhuǎn)移到輸卵管的漿膜下層SK-OV-3腺癌，卵巢，惡性腹水SW 626 腺癌，卵巢Capan-1腺癌，胰，轉(zhuǎn)移到肝Capan-2腺癌，胰DU 145 癌，前列腺，轉(zhuǎn)移到腦A-204 橫紋肌肉瘤Saos-2 骨肉瘤，原發(fā)的SK-ES-1退行發(fā)育的骨肉瘤對(duì)Swing肉瘤，骨SK-LNS-1 平滑肌肉瘤，女陰，原發(fā)的SW 684 纖維肉瘤SW 872 脂肉瘤SW 982 腋窩滑膜肉瘤SW 1353軟骨肉瘤，肱骨U-2 OS 骨肉瘤，骨原發(fā)的Malme-3皮膚成纖維細(xì)胞KATO III 胃癌Cate-1B胚胎性癌，睪丸，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)Tera-1 胚胎性癌，與轉(zhuǎn)移到肺一致的惡性
Tera-2 胚胎性癌，與轉(zhuǎn)移到肺一致的惡性SW579 甲狀腺癌AN3 CA 子宮內(nèi)膜腺癌，轉(zhuǎn)移的HEC-1-A子宮內(nèi)膜腺癌HEC-1-B子宮內(nèi)膜腺癌SK-UT-1子宮的，混合性中胚層瘤，與III級(jí)平滑肌肉瘤一致SK-UT-1B 子宮的，混合性中胚層瘤，與III級(jí)平滑肌肉瘤一致Sk-Mel28 黑素瘤SW 954 鱗狀細(xì)胞癌，女陰SW 962 癌，女陰，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NCI-H69小細(xì)胞癌，肺NCI-H128 小細(xì)胞癌，肺BT-483 導(dǎo)管癌，乳BT-549 導(dǎo)管癌，乳DU4475 轉(zhuǎn)移性皮膚結(jié)節(jié)，乳腺癌HBL-100乳Hs 578Bst 乳，正常的Hs 578T導(dǎo)管癌，乳MDA-MB-330 癌，乳MDA-MB-415 腺癌，乳MDA-MB-435S導(dǎo)管癌，乳MDA-MB-436 腺癌，乳MDA-MB-453 癌，乳MDA-MB-468 腺癌，乳T-47D 導(dǎo)管癌，乳，胸膜滲漏Hs 766T癌，胰，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)Hs 746T癌，胃，轉(zhuǎn)移到左腿Hs 695T無(wú)黑色素性惡性黑素瘤，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)Hs 683 神經(jīng)膠質(zhì)瘤Hs 294T黑素瘤，轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)
Hs 602 淋巴瘤，頸JAR絨毛膜癌，胎盤Hs 445 淋巴樣的，何杰金氏病Hs 700T腺癌，轉(zhuǎn)移到骨盆H4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤，腦Hs 696 原發(fā)性腺癌，未知的，轉(zhuǎn)移到骨-骶骨Hs 913T纖維肉瘤，轉(zhuǎn)移到肺Hs 729 橫紋肌肉瘤，左腿FHs 738Lu 肺，正常胎兒FHs 173We 完整胚胎，正常FHs 738B1 膀胱，正常胎兒NIHOVCAR-3 卵巢，腺癌Hs 67 胸腺，正常的RD-ES Ewing氏肉瘤ChaGo K-1 支氣管癌，皮下轉(zhuǎn)移，人WERI-Rb-1 成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤NCI-H446 小細(xì)胞癌，肺NCI-H209 小細(xì)胞癌，肺NCI-H146 小細(xì)胞癌，肺NCI-H441 乳頭腺癌，肺NCI-H82小細(xì)胞癌，肺H9 T細(xì)胞淋巴瘤NCI-H460 大細(xì)胞癌，肺NCI-H596 腺鱗癌，肺NCI-H676B 腺癌，肺NCI-H345 小細(xì)胞癌，肺NCI-H820 乳頭腺癌，肺NCI-H520 鱗狀細(xì)胞癌，肺NCI-H661 大細(xì)胞癌，肺NCI-H510A 小細(xì)胞癌，肺外來(lái)源的，轉(zhuǎn)移的D283 Med 成神經(jīng)管細(xì)胞瘤Daoy 成神經(jīng)管細(xì)胞瘤
D341 Med 成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(medulloblastouia)AML-193 急性單核細(xì)胞性白血病MV4-11雙表型白血病將理解本文描述的具體實(shí)施方案通過(guò)闡明示出并且不作為本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，本發(fā)明的主要特征可以用于各種實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或者能夠使用僅僅常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定本文描述的特定步驟的許多等同方案。認(rèn)為此類等同方案在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且被權(quán)利要求涵蓋。
說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。將所有出版物和專利申請(qǐng)都引入本文作為參考，就好像每個(gè)單獨(dú)的出版物或者專利申請(qǐng)都特別并且單獨(dú)地指出作為參考文獻(xiàn)并入一樣。
在權(quán)利要求中，將理解所有過(guò)渡型短語(yǔ)如“包含”、“包括”、“攜帶”、“具有”、“含有”、“涉及”等等都是開(kāi)放的，即表示包括但不限于。僅僅過(guò)渡型短語(yǔ)“由...組成”和“基本由...組成”分別將是封閉的或者半封閉的過(guò)渡型短語(yǔ)。
按照本公開(kāi)內(nèi)容，可以不用過(guò)多實(shí)驗(yàn)即可做出和執(zhí)行本文中公開(kāi)和要求保護(hù)的所有組合物和/或方法。盡管已經(jīng)按照優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明的組合物和方法，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的是可以在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的情況下，將變形應(yīng)用于本文所述的所述組合物和/或方法和方法的步驟或步驟的順序中。更具體地，將顯而易見(jiàn)的是化學(xué)和生理學(xué)上相關(guān)的某些試劑可以代替本文描述的試劑同時(shí)實(shí)現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。認(rèn)為對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所有此類相似的替代和修飾都在所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。
參考文獻(xiàn)Albert，M.L.，B.Sauter，and N.Bhardwaj.1998a.Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells andinduce class I-restricted CTLs.Nature 39286.
Albert，M.L.，J.C.Darnell，A.Bender，L.M.Francisco，N.Bhardwaj，and R.B.Darnell.1998b.Tumor-specific killer cells in paraneoplastic cerebellar degeneration.Nat Med 41321.
Asea，A.，M.Rehli，E.Kabingu，J.A.Boch，O.Bare，P.E.Auron，M.A.Stevenson，and S.K.Calderwood.2002.Novel signal transduction pathway used by extracellular HSP70role of toll-like receptor(TLR)2 andTLR4.J Biol Chem 27715028.
Ashley，D.M.，B.Faiola，S.Nair，L.P.Hale，D.D.Bigner，and E.Gilboa.1997.Bone marrow-generateddendritic cells pulsed with tumor extracts or tumor RNA induce antitumor immunity against central nervoussystem tumors.J Exp Med 1861177.
Banchereau，J.，A.K.Palucka，M.Dhodapkar，S.Burkeholder，N.Taquet，A.Rolland，S.Taquet，S.Coquery，K.M.Wittkowski，N.Bhardwaj，L.Pineiro，R.Steinman，and J.Fay.2001.Immune and clinicalresponses in patients with metastatic melanoma to CD34(+)progenitor-derived dendritic cell vaccine.Cancer Res 616451.
Basu，S.，and P.K.Srivastava.2000.Heat shock proteinsthe fountainhead of innate and adaptive immuneresponses.Cell Stress Chaperones 5443.
Basu，S.，R.J.Binder，T.Ramalingam，and P.K.Srivastava.2001.CD91 is a common receptor for heatshock proteins gp96，hsp90，hsp70，and calreticulin.Immunity 14303.
Becker，T.，F(xiàn).U.Hartl，and F.Wieland.2002.CD40，an extracellular receptor for binding and uptake ofHsp70-peptide complexes.J Cell Biol 1581277.
Berard，F(xiàn).，P.Blanco，J.Davoust，E.M.Neidhart-Berard，M.Nouri-Shirazi，N.Taquet，D.Rimoldi，J.C.Cerottini，J.Banchereau，and A.K.Palucka.2000.Cross-priming of naive CD8 T cells against melanomaantigens using dendritic cells loaded with killed allogeneic melanoma cells.J Exp Med 1921535.
Boczkowski，D.，S.K.Nair，D.Snyder，and E.Gilboa.1996.Dendritic cells pulsed with.RNA are potentantigen-presenting cells in vitro and in vivo.J Exp Med 184465.
Castelli，C.，A.M.Ciupitu，F(xiàn).Rini，L.Rivoltini，A.Mazzocchi，R.Kiessling，and G.Parmiani.2001.Humanheat shock protein 70 peptide complexes specifically activate antimelanoma T cells.Can Res 61222-227.
Delneste，Y.，G.Magistrelli，J.Gauchat，J.Haeuw，J.Aubry，K.Nakamura，N.Kawakami-Honda，L.Goetsch，T.Sawamura，J.Bonnefoy，and P.Jeannin.2002.Involvement of LOX-1 in dendritic cell-mediatedantigen cross-presentation.Immunity 17353.
Dhodapkar，M.V.，R.M.Steinman，M.Sapp，H.Desai，C.Fossella，J.Krasovsky，S.M.Donahoe，P.R.Dunbar，V.Cerundolo，D.F.Nixon，and N.Bhardwaj.1999.Rapid generation of broad T-cell immunity inhumans after a single injection of mature dendritic cells.J Clin Invest 104173.
Dhodapkar，M.V.，J.Krasovsky，R.M.Steinman，and N.Bhardwaj.2000.Mature dendritic cells boostfunctionally superior CD8(+)T-cell in humans without foreign helper epitopes[see comments].J Clin Invest105R9.
Fong，L.，and E.G.Engleman.2000.Dendritic cells in cancer immunotherapy.Annu Rev Immunol 18245.
Frydman，J.2001.Folding of newly translated proteins in vivothe role of molecular chaperones.Annu RevBiochem 70603.
Gilboa，E.1999.The makings of a tumor rejection antigen.Immunity 11263.Heiser，A.，D.Coleman，J.Dannull，D.Yancey， M.A.Maurice，C.D.Lallas，P.Dahm，D.Niedzwiecki，E.Gilboa，and J.Vieweg.2002.Autologous dendritic cells transfected with prostate-specific antigen RNAstimulate CTL responses against metastatic prostate tumors.J Clin Invest 109409.
Kierstead，L.S.，E.Ranieri，W.Olson，V.Brusic，J.Sidney，A.Sette，Y.L.Kasamon，C.L.Slingluff，Jr.，J.M.Kirkwood，and W.J.Storkus.2001.gp100/pmel17 and tyrosinase encode multiple epitopes recognizedby Th1-type CD4+T cells.Br J Cancer 851738.
Labarriere，N.，L.Bretaudeau，N.Gervois，M.Bodinier，G.Bougras，E.Diez，F(xiàn).Lang，M.Gregoire，and F.Jotereau.2002.Apoptotic body-loaded dendritic cells efficiently cross-prime cytotoxic T lymphocytesspecific for NA17-A antigen but not for Melan-A/MART-1 antigen.Int J Cancer 101280.
Nestle，F(xiàn).O.，S.Alijagic，M.Gilliet，Y.Sun，S.Grabbe，R.Dummer，G.Burg，and D.Schadendorf.1998.Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendritic cells.Nat Med 4328.
Noessner，E，R.Gastpar，V.Milani，A.Brandl，P.J.Hutzler，M.C.Kuppner，M.Roos，E.Kremmer，A.Asea，S.K.Calderwood，and R.D.Issels.2002.Tumor-derived heat shock protein 70 peptide complexes arecross-presented by human dendritic cells.J Immunol 1695424-5432.
Nouri-Shirazi，M.，J.Banchereau，D.Bell，S.Burkeholder，E.T.Kraus，J.Davoust，and K.A.Palucka.2000.Dendritic cells capture killed tumor cells and present their antigens to elicit tumcr-specific immuneresponses.J Immunol 1653797.
Paczesny， S.，J.Banchereau，K.M.Wittkowski，G.Saracino，J.Fay，and A.K.Palucka.2004.Expansion ofMelanoma-specific Cytolytic CD8+ T Cell Precursors in Patients with Metastatic Melanoma Vaccinatedwith CD34+ Progenitor-derived Dendritic Cells.J Exp Med 1991503.
Palucka，A.K.，M.V.Dhodapkar，S.Paczesny，S.Burkeholder，K.M.Wittkowski， R.M.Steinman，J.Fay，and J.Banchereau.2003.Single injection of CD34+ progenitor-derived dendritic cell vaccine can lead toinduction of T-cell immunity in patients with stage IV melanoma.J Immunother 26432.
Regnault，A.，D.Lankar，V.Lacabanne，A.Rodriguez，C.Thery，M.Rescigno，T.Saito，S.Verbeek，C.Bonnerot，P.Ricciardi-Castagnoli，and S.Amigorena.1999.Fcgamma receptor-mediated induction ofdendritic cell maturation and major histocompatibility complex class I-restricted antigen presentation afterimmune complex internalization.J Exp Med 189371.
Ribas，A.，L.H.Butterfield，J.A.Glaspy，and J.S.Economou.2002.Cancer immunotherapy using gene-modified dendritic cells.Curr Gene Ther 257.
Srivastava，P.K.，H.Udono，N.E.Blachere，and Z.Li.1994.Heat shock proteins transfer peptides duringantigen processing and CTL priming.Immunogenetics 3993.
Srivastava，P.2002.Interaction Of Heat Shock Proteins With Peptides And Antigen Presenting Cells.Chaperoning of the Innate and Adaptive Immune Responses.Annu Rev Immunol 20395.
Thurner，B.，I.Haendle，C.Roder，D.Dieckmann，P.Keikavoussi，H.Jonuleit，A.Bender，C.Maczek，D.Schreiner，P.von den Driesch，E.B.Brocker，R.M.Steinman，A.Enk，E.Kampgen，and G.Schuler.1999.Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature，monocyte-derived dendritic cells expands specificcytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma.J Exp Med1901669.
Wang，R.F.，X.Wang，A.C.Atwood，S.L.Topalian，and S.A.Rosenberg.1999.Cloning genes encodingMHC class II-restricted antigensmutated CDC27 as a tumor antigen.Science 2841351.
Zitvogel，L.，A.Regnault，A.Lozier，J.Wolfers，C.Flament，D.Tenza，P.Ricciardi-Castagnoli，G.Raposo，and S.Amigorena.1998.Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccinedendriticcell-derived exosomes.Nat Med 4594.
權(quán)利要求
1.誘導(dǎo)對(duì)患者中癌的免疫性的組合物，其包含通過(guò)暴露于一種或多種熱激且被殺死的癌細(xì)胞致敏的分離的和純化的抗原呈遞細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包含樹(shù)突細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原呈遞細(xì)胞裝載了熱激的、被熱殺死的癌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述癌細(xì)胞從患者分離。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述癌細(xì)胞包含同種異體癌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述被熱激且殺死的癌細(xì)胞被抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)化和加工至少2小時(shí)。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中所述癌細(xì)胞包含一種或多種腫瘤細(xì)胞系。
8.誘導(dǎo)對(duì)患者中癌的免疫性的方法，其包括步驟在至少約42℃的溫度下熱激一種或多種癌細(xì)胞至少2小時(shí)以形成熱激的癌細(xì)胞；殺死熱激的癌細(xì)胞以形成熱激的被殺死的癌細(xì)胞；將從患者分離的一種或多種抗原呈遞細(xì)胞與熱激的被殺死的癌細(xì)胞溫育至少3小時(shí)；并且對(duì)患者施用一種或多種分離的經(jīng)裝載的抗原呈遞細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞在施用于患者前用一種或多種細(xì)胞因子成熟。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞是樹(shù)突細(xì)胞。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述癌細(xì)胞包含一種或多種腫瘤細(xì)胞系。
12.誘導(dǎo)對(duì)患者中癌的免疫性的方法，其包括步驟從患者得到抗原呈遞細(xì)胞；在至少42℃的溫度下溫育同種異體癌細(xì)胞至少2小時(shí)以形成熱激的同種異體癌細(xì)胞；殺死熱激的同種異體癌細(xì)胞以形成熱激的被殺死的同種異體癌細(xì)胞；將抗原呈遞細(xì)胞暴露于熱激的被殺死的同種異體癌細(xì)胞至少3小時(shí)以形成裝載的抗原呈遞細(xì)胞；使所分離的裝載的抗原呈遞細(xì)胞成熟；并且對(duì)患者施用所述分離的裝載的抗原呈遞細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗原呈遞細(xì)胞包含樹(shù)突細(xì)胞。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述熱激的被殺死的癌細(xì)胞被抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)化，并且所述抗原呈遞細(xì)胞用一種或多種細(xì)胞因子成熟。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述癌細(xì)胞選自表II。
16.制備免疫原性分離的抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括步驟從受試者分離抗原呈遞細(xì)胞；通過(guò)應(yīng)激一種或多種癌細(xì)胞并殺死癌細(xì)胞制備抗原；向抗原呈遞細(xì)胞裝載所述抗原至少3小時(shí)；并且分離和純化經(jīng)裝載的抗原呈遞細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的方法，其中在殺死癌細(xì)胞前，通過(guò)選自熱激、冷激、葡萄糖剝奪、不供氧、暴露于至少一種改變細(xì)胞代謝的藥物和暴露于至少一種細(xì)胞毒性藥物的方法應(yīng)激癌細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述癌細(xì)胞是同種異體癌細(xì)胞。
19.權(quán)利要求16的方法，其中在熱激下進(jìn)行用抗原裝載抗原呈遞細(xì)胞的步驟。
19.增加受應(yīng)激的且被殺死的癌細(xì)胞中腫瘤抗原的表達(dá)的方法，其包括在殺死癌細(xì)胞前應(yīng)激癌細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中在殺死癌細(xì)胞前，通過(guò)選自熱激、冷激、葡萄糖剝奪、不供氧、暴露于至少一種改變細(xì)胞代謝的藥物和暴露于至少一種細(xì)胞毒性藥物的方法應(yīng)激癌細(xì)胞。
21.增加裝載了被應(yīng)激和殺死的癌細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞中腫瘤抗原的抗原性的方法，其包括應(yīng)激癌細(xì)胞并殺死癌細(xì)胞，并將抗原呈遞細(xì)胞暴露于經(jīng)應(yīng)激和殺死的癌細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中在殺死癌細(xì)胞前，通過(guò)選自熱激、冷溫度、葡萄糖剝奪、不供氧、暴露于至少一種改變細(xì)胞代謝的藥物和暴露于至少一種細(xì)胞毒性藥物的方法應(yīng)激癌細(xì)胞。
23.包含熱激的癌細(xì)胞和其部分的抗原。
24.制備抗原的方法，其包括熱處理一種或多種癌細(xì)胞系并用一種或多種細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑殺死細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞死亡誘導(dǎo)試劑包含白樺脂酸、紫杉醇、喜樹(shù)堿、橢圓玫瑰樹(shù)堿、光神霉素A、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、離子霉素和其組合。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述細(xì)胞死亡誘導(dǎo)劑包含輻射、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、超聲、干燥、冷凍噴霧、穿刺、饑餓和其組合。
27.權(quán)利要求24的方法，其中所述癌細(xì)胞選自表II。
28.權(quán)利要求24的方法，其中將所述癌細(xì)胞熱處理2、4、6或者8小時(shí)。
29.權(quán)利要求24的方法，其中將所述癌細(xì)胞進(jìn)一步定義為包含熱黑素瘤和其部分。
30.包含熱激且被殺死的癌細(xì)胞和其部分的抗原。
31.權(quán)利要求30的抗原，其中所述抗原是凍干的、熱干燥的、真空干燥的、熱真空干燥的、通過(guò)蒸發(fā)沉淀到水溶液(EPAS)冷凍的、噴霧冷凍到液體(SFL)中的、反溶劑沉淀或者冷凍噴霧的。
32.權(quán)利要求30的抗原，其還包含佐劑。
33.權(quán)利要求30的抗原，其中通過(guò)白樺脂酸、紫杉醇、喜樹(shù)堿、橢圓玫瑰樹(shù)堿、光神霉素A、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、離子霉素和其組合殺死所述熱激的癌細(xì)胞和其部分。
34.權(quán)利要求30的抗原，其中通過(guò)輻射、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、超聲、干燥、冷凍噴霧、穿刺、饑餓和其組合殺死所述熱激的癌細(xì)胞和其部分。
35.包含被殺死的同種異體癌細(xì)胞的疫苗，所述細(xì)胞在至少42℃的溫度下熱激至少2小時(shí)以形成熱激的被殺死的同種異體癌細(xì)胞。
36.通過(guò)包括以下步驟的方法制備的癌癥疫苗在至少42℃的溫度下溫育癌細(xì)胞至少兩小時(shí)；殺死熱激的癌細(xì)胞；并且用被熱激的且殺死的癌細(xì)胞裝載抗原呈遞細(xì)胞。
37.權(quán)利要求36的疫苗，其適于對(duì)患者施用分離的、裝載的抗原呈遞細(xì)胞。
38.用于患者的癌癥疫苗，其包含一種或多種至少部分成熟的抗原呈遞細(xì)胞，所述抗原呈遞細(xì)胞裝載被熱激且殺死的非細(xì)胞凋亡癌細(xì)胞。
39.治療癌癥患者的方法，其包括用癌癥疫苗免疫患者，所述癌癥疫苗包含裝載了熱激且殺死的非細(xì)胞凋亡癌細(xì)胞的一種或多種至少部分成熟的抗原呈遞細(xì)胞。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述一種或多種至少部分成熟的抗原呈遞細(xì)胞是自體的。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述熱激且殺死的癌細(xì)胞是自體的。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述熱激且殺死的癌細(xì)胞選自表II中的細(xì)胞。
43.權(quán)利要求39的方法，其中在殺死前，所述癌細(xì)胞中的HSP60、HSP90和gp96被上調(diào)。
44.權(quán)利要求39的方法，其中將所述癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染以超表達(dá)HSP60、HSP90和gp96。
45.權(quán)利要求39的方法，其中通過(guò)白樺脂酸、紫杉醇、喜樹(shù)堿、橢圓玫瑰樹(shù)堿、光神霉素A、依托泊苷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、離子霉素和其組合殺死所述癌細(xì)胞。
46.權(quán)利要求39的方法，其中通過(guò)輻射、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、超聲、干燥、冷凍噴霧、穿刺、饑餓和其組合殺死所述癌細(xì)胞。
47.在體外將抗原遞送到樹(shù)突細(xì)胞的方法，其包括與能夠內(nèi)化用于抗原呈遞的一種或多種抗原的樹(shù)突細(xì)胞接觸足夠的時(shí)間，所述時(shí)間允許所述一種或多種抗原內(nèi)化以呈遞到免疫細(xì)胞，其中所述抗原包含被熱激且殺死的癌細(xì)胞。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述樹(shù)突細(xì)胞是人的。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述被熱激的細(xì)胞選自細(xì)胞系、經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達(dá)外來(lái)抗原的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系、異種細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞。
50.權(quán)利要求47的方法，其中所述被熱激的細(xì)胞選自表II中所列的細(xì)胞系和其組合。
51.權(quán)利要求47的方法，其中通過(guò)化學(xué)處理、輻射、熱、冷、滲透壓休克、壓力、碾磨、剪切、超聲、干燥、冷凍噴霧、穿刺、饑餓和其組合殺死所述細(xì)胞。
52.權(quán)利要求47的方法，其中將所述樹(shù)突細(xì)胞暴露于包含抗原的熱激的、細(xì)胞凋亡的細(xì)胞碎片、泡或者體的制劑。
53.權(quán)利要求47的方法，其中所述樹(shù)突細(xì)胞是不成熟的和吞噬的。
54.權(quán)利要求47的方法，其中通過(guò)細(xì)胞凋亡殺死所述癌細(xì)胞。
55.權(quán)利要求47的方法，其中熱激細(xì)胞與樹(shù)突細(xì)胞的比率為約1-10個(gè)熱激的細(xì)胞比約100個(gè)樹(shù)突細(xì)胞。
56.權(quán)利要求47的方法，其還包括成熟步驟，其中將樹(shù)突細(xì)胞暴露于成熟因子足夠的時(shí)間以誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞的成熟。
57.權(quán)利要求47的方法，其中所述成熟步驟包括將CD83陰性樹(shù)突細(xì)胞與至少一種成熟因子接觸，所述成熟因子選自導(dǎo)致CD83陰性樹(shù)突細(xì)胞成熟從而表達(dá)CD83、TNFα、IL-1β、IL-6、PGE2、IFNα、CD40配體的單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基，和熱激且殺死的細(xì)胞。
58.權(quán)利要求47的方法，其中所述成熟因子選自單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基；IFNα和選自IL-1β、IL-6和TNFα的至少一種其他因子；和熱激的細(xì)胞。
59.權(quán)利要求47的方法，其中所述抗原是還包含病毒的腫瘤細(xì)胞。
60.權(quán)利要求47的方法，其中所述樹(shù)突細(xì)胞在接觸抗原時(shí)是CD83陰性樹(shù)突細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明包括用于分離、純化和制備用于產(chǎn)生定制的癌癥疫苗的免疫原性抗原的組合物和方法，所述疫苗包括與包括熱激癌細(xì)胞的抗原接觸的樹(shù)突細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/16GK101052709SQ200580036477
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2005年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月25日
發(fā)明者A·K·帕盧卡, J·邦舍羅 申請(qǐng)人:貝勒研究院