專利名稱：細(xì)胞剝離劑和細(xì)胞片剝離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞剝離劑和細(xì)胞片的剝離方法。
背景技術(shù)：
在容器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞片附著于容器表面，回收該細(xì)胞片時(shí)使用ディスパ-ゼ(注冊(cè)商標(biāo))等蛋白分解酶，進(jìn)行由容器表面剝離的操作。上述使用蛋白分解酶進(jìn)行的剝離操作中，不僅會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，伴隨著培養(yǎng)而產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)也分解。另外，蛋白分解酶大多來(lái)自動(dòng)物材料，在應(yīng)用于再生醫(yī)療用的細(xì)胞片時(shí)存在著安全性的問(wèn)題。針對(duì)該問(wèn)題，例如在特公平6-104061號(hào)公報(bào)中提出了無(wú)需使用蛋白分解酶即可剝離附著于容器表面的培養(yǎng)細(xì)胞并回收的方法。即，準(zhǔn)備表面用聚-N-異丙基丙烯酰胺覆蓋的培養(yǎng)皿，在該培養(yǎng)皿上、在37℃進(jìn)行牛主動(dòng)脈血管內(nèi)細(xì)胞的培養(yǎng)，然后冷卻至4℃，將培養(yǎng)皿的表面由疏水性轉(zhuǎn)為親水性，使培養(yǎng)細(xì)胞剝離并回收。

發(fā)明內(nèi)容
但是上述公報(bào)中，使培養(yǎng)細(xì)胞剝離時(shí)必須對(duì)溫度進(jìn)行控制，因此很難說(shuō)操作簡(jiǎn)便。
本發(fā)明的目的之一在于提供通過(guò)簡(jiǎn)便的操作可以將附著于容器表面的細(xì)胞剝離的細(xì)胞剝離劑。本發(fā)明的目的之一還在于提供使用該細(xì)胞剝離劑，將附著于容器表面的細(xì)胞片剝離的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的的至少一部分，本發(fā)明采取了以下方法。
本發(fā)明的細(xì)胞片剝離劑含有氨基化聚輪烷。該細(xì)胞片剝離劑不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，還無(wú)需控制溫度即可將附著于容器表面的培養(yǎng)細(xì)胞剝離。
形成本發(fā)明的細(xì)胞剝離劑骨架的聚輪烷具有以下結(jié)構(gòu)在使多個(gè)環(huán)狀分子貫穿線狀分子的狀態(tài)下，在線狀分子的兩端結(jié)合大體積的罩，使環(huán)狀分子不會(huì)脫離。
這里，線狀分子優(yōu)選為選自聚乙二醇、聚丙二醇、星形聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、聚乙烯基醚、高支鏈聚醚、高支鏈低聚乙二醇、高支鏈低聚丙二醇、聚(氧雜環(huán)丁烷)、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚乳酸、聚(ε-己內(nèi)酯)和聚乳酸的共聚物、聚乳酸和聚乙二醇的共聚物、聚(ε-賴氨酸)、聚酰胺、聚(亞氨基低聚亞甲基)、紫羅烯、ポリビニルジェンクロルド、聚丙烯、低聚丙烯、聚乙烯、低聚乙烯、聚(亞烷基苯并咪唑)、聚氨酯、ポリ(ビォロゲン)、聚(N-二甲基十亞甲基銨)、聚(二甲基硅氧烷)、聚苯胺、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-酰基丫丙啶)、聚丫丙啶、聚(4-乙烯基吡碇)-十二烷基苯磺酸復(fù)合物、富勒烯(フラ-レン)-聚乙二醇結(jié)合物、疏水化多糖、聚乙二醇-多糖接枝共聚物、聚丙二醇-多糖接枝共聚物、二苯基己三烯的一種或多種。該線狀分子的平均分子量?jī)?yōu)選200-1000000，更優(yōu)選400-50000，特別優(yōu)選1000-5000。
環(huán)狀分子優(yōu)選為α、β或γ-環(huán)糊精，也可以是具有與其類似的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，上述環(huán)狀結(jié)構(gòu)有環(huán)狀聚醚、環(huán)狀聚酯、環(huán)狀聚醚胺、環(huán)狀多元胺等。線狀分子和環(huán)狀分子的組合優(yōu)選α-環(huán)糊精和聚乙二醇的組合。
大體積的罩只要具有使環(huán)狀分子無(wú)法脫離的結(jié)構(gòu)即可，優(yōu)選為具有大體積取代基的生物體親和性基團(tuán)，優(yōu)選經(jīng)由水解性鍵導(dǎo)入到線狀分子的兩個(gè)末端。這里，生物體親和性基團(tuán)只要是對(duì)生物體的親和性高的基團(tuán)即可(對(duì)生物體安全性高的基團(tuán))，可以是任何基團(tuán)，例如優(yōu)選氨基酸、低聚肽，低聚糖類或糖衍生物。氨基酸例如有丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、組氨酸等。作為低聚肽例如有上述多種氨基酸以肽鍵結(jié)合而形成的肽等。另外，低聚糖類的重復(fù)單元為1-10左右，有由構(gòu)成葡聚糖、透明質(zhì)酸、殼多糖、脫乙酰殼多糖、海藻酸、硫酸軟骨素、淀粉等多糖類的單糖構(gòu)成的低聚糖，或環(huán)狀低聚糖α、β或γ-環(huán)糊精等。作為糖衍生物例如有將低聚糖類、多糖或單糖進(jìn)行乙?；虍惐然瘜W(xué)改性而成的化合物等。其中，優(yōu)選具有苯環(huán)的氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等。另外，大體積的取代基只要是可以防止環(huán)狀分子從線狀分子上脫落即可，可以是任何基團(tuán)，例如優(yōu)選具有一個(gè)或以上苯環(huán)的基團(tuán)、或具有一個(gè)或以上叔丁基的基團(tuán)。具有一個(gè)或以上苯環(huán)的基團(tuán)例如有芐氧基羰基(Z)、9-芴甲基氧基羰基(Fmoc)、芐基酯基(OBz)等；具有一個(gè)或以上叔丁基的基團(tuán)有叔丁基羰基(Boc)、氨基酸叔丁酯(OBu)等，其中優(yōu)選芐氧基羰基。水解性鍵優(yōu)選在生物體內(nèi)水解的鍵，如果考慮在生物體內(nèi)迅速地非酶性水解，則優(yōu)選酯鍵。
本發(fā)明的細(xì)胞剝離劑中含有的氨基化聚輪烷，只要是聚輪烷中含有的環(huán)糊精骨架中的至少一部分羥基被具有氨基的取代基取代的化合物即可。這里，環(huán)糊精骨架中的羥基優(yōu)選為形成環(huán)糊精骨架的葡萄糖的羥基，更優(yōu)選為該葡萄糖的6位羥基。另外，具有氨基的取代基沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為-OOCNH-A-NR1R2(A為可具有支鏈的烴鏈，R1和R2可以相同或不同，為氫或可具有支鏈的烴基)。這里，A優(yōu)選為碳原子數(shù)為2-4的可具有支鏈的烴鏈，例如有-(CH2)2-、-CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)-、-(CH2)3-、-CH(CH2CH3)CH2-、-CH2CH(CH2CH3)-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-、-(CH2)4-等。R1和R2優(yōu)選為氫或碳原子數(shù)1-5的可具有支鏈的烴基，后者烴基例如有甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基等。-OOCNH-的部位可以認(rèn)為是發(fā)揮連接作用的部位，并不限于該結(jié)構(gòu)，例如還可以是-OCOO-、-OOC-、-OCH2-、-OC(OH)CH2-、-OC(＝S)NH-等。
本發(fā)明的細(xì)胞剝離劑用于剝離附著在容器表面的細(xì)胞(貼壁依賴性細(xì)胞)。這里，貼壁依賴性細(xì)胞例如有軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰細(xì)胞、肌細(xì)胞或它們的前體細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)等。
本發(fā)明的細(xì)胞剝離劑優(yōu)選用于剝離附著于容器表面的細(xì)胞片、特別是表皮細(xì)胞的細(xì)胞片。剝離細(xì)胞片的方法可以包含以下步驟使細(xì)胞貼壁于容器表面進(jìn)行培養(yǎng)，制成細(xì)胞片的培養(yǎng)步驟；在該培養(yǎng)步驟后，更換為添加有本發(fā)明的細(xì)胞片剝離劑的培養(yǎng)基，使細(xì)胞片由容器表面剝離的剝離步驟。這里所述培養(yǎng)基只要是在剝離步驟中不會(huì)使構(gòu)成細(xì)胞片的細(xì)胞死亡的液體即可，不僅可以使用DMEM等基礎(chǔ)培養(yǎng)基、或基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了增殖因子的增殖用培養(yǎng)基，也可以是生理鹽水或磷酸緩沖液等液體。還可以包含在剝離步驟之后將剝離的細(xì)胞片進(jìn)行回收的回收步驟。這里，還可以在剝離步驟中一邊培養(yǎng)細(xì)胞一邊將細(xì)胞片由容器表面緩慢剝離?；厥詹襟E中，可以通過(guò)將剝離的細(xì)胞片附著于懸掛支撐膜上，然后提起回收。這里，懸掛支撐膜指只要是可將達(dá)到規(guī)定狀態(tài)的細(xì)胞原樣地整體懸掛的膜即可，例如有無(wú)菌紗布、無(wú)菌紙、無(wú)菌濾紙、無(wú)菌無(wú)紡布，還可以是PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)或PTFE膜(聚四氟乙烯膜)等親水性膜，硅橡膠等具有柔軟性的高分子材料，或聚二醇酸、聚乳酸等生物降解性聚合物，或瓊脂培養(yǎng)基，或?qū)⒛z原、明膠凝膠等水凝膠等制成片狀所得等。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是表示氨基化聚輪烷的合成順序的說(shuō)明圖。
實(shí)施例[實(shí)施例1]按照以下的順序合成聚輪烷(參照?qǐng)D1)。
經(jīng)由酯鍵合成兩末端具有氨基的PEG將33g(10mmol)分子量為3300的聚乙二醇(PEG)和20g(200mmol)琥珀酸酐溶解于200ml甲苯中，將該溶液在150℃回流5小時(shí)。反應(yīng)終止后，倒入到過(guò)量的二乙醚中，過(guò)濾并減壓干燥，得到粗產(chǎn)物，將其溶解于二氯甲烷中，通過(guò)離心除去不溶物質(zhì)，倒入到過(guò)量的二乙醚中，進(jìn)行過(guò)濾并減壓干燥，得到為白色粉末的、兩個(gè)末端具有羧基的PEG(化合物A)。將20g(5.7mmol)該化合物A和17.1g(148.2mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)溶解于350ml 1，4-二噁烷和二氯甲烷的混合溶液中(體積比1∶1)，冰冷卻后，加入23.5g(114mmol)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)。冰冷卻下攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌過(guò)夜。濾除副產(chǎn)物二環(huán)己脲，濾液經(jīng)濃縮后倒入到過(guò)量的二乙醚中，過(guò)濾并減壓干燥后得到白色粉末的羧基活化的PEG(化合物D)。接著，向75ml溶解有0.4ml(6mmol)乙二胺的二氯甲烷中滴加75ml溶解有10g(2.7mmol)化合物B的二氯甲烷，滴加結(jié)束后在室溫下攪拌1小時(shí)。反應(yīng)終止后，將溶液倒入到過(guò)量的二乙醚中，過(guò)濾并減壓干燥，得到為白色粉末的、兩個(gè)末端具有氨基的PEG(化合物C)。
準(zhǔn)聚輪烷的制備在室溫下，向48g(49.2mmol)α-環(huán)糊精(α-CD)的311ml飽和水溶液中滴加4g(1.12mmol)化合物C的20ml水溶液。用超聲波處理1小時(shí)，同時(shí)攪拌，然后在室溫下攪拌24小時(shí)。通過(guò)離心回收白色沉淀物，在50℃減壓干燥，得到白色粉末的準(zhǔn)聚輪烷。聚輪烷是指線狀分子(例如PEG)貫穿多個(gè)環(huán)狀分子(例如環(huán)糊精)，并將該線狀分子的兩個(gè)末端用大體積取代基封住，準(zhǔn)聚輪烷是指尚未用大體積取代基封住聚輪烷的兩個(gè)末端的化合物。
末端封端劑的制備為了導(dǎo)入作為防止α-CD離去的大體積取代基的芐氧基羰基-L-苯丙氨酸(Z-L-Phe，Z表示芐氧基羰基)，進(jìn)行Z-L-Phe的羧基的活化。即，將100g(334mmol)Z-L-Phe溶解于800ml 1，4-二噁烷中，一邊冰冷卻一邊加入38.42g(334mmol)HOSu。1小時(shí)后緩慢加入溶解有75.7g(367mmol)DCC的200ml 1，4-二噁烷溶液，冰冷卻下攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌過(guò)夜。濾除副產(chǎn)物二環(huán)己脲，濾液在濃縮后倒入到過(guò)量的二乙醚中，過(guò)濾并減壓干燥后得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶解于二氯甲烷中，使其在室溫下盡量達(dá)到飽和濃度，然后適量加入石油醚并冷藏，進(jìn)行重結(jié)晶。濾取晶體，減壓干燥，得到白色針狀晶體的Z-L-Phe琥珀酰亞氨酯(Z-L-Phe-OSu)。
聚輪烷的制備將80g(200mmol)Z-L-Phe-OSu溶解于60ml二甲基亞砜(DMSO)，加入45g(2mmol)準(zhǔn)聚輪烷。將該不均勻溶液在室溫下攪拌，同時(shí)少量多次加入DMSO，攪拌96小時(shí)，使其均勻。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)溶液倒入到過(guò)量的二乙醚中，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物依次用丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)洗滌，除去雜質(zhì)(未反應(yīng)的Z-L-Phe-OSu、α-CD、化合物C等)，過(guò)濾并減壓干燥，得到為白色粉末的生物降解性聚輪烷。合成的確認(rèn)通過(guò)1H-NMR進(jìn)行。另外，由1H-NMR中的PEG的質(zhì)子和α-CD的C(碳)的1位質(zhì)子的積分比求出該聚輪烷中α-CD的貫穿數(shù)，為17。

按照以下的順序制備CDI活化聚輪烷。即，在氮?dú)夥障?，?g(0.0369mol，CD＝0.871mmol，OH＝15.6mmol)實(shí)施例1所得的聚輪烷溶解于10ml DMSO中。加入2.54g(15.6mmol；與聚輪烷中的羥基等量)N，N-羰基二咪唑(CDI)，在氮?dú)夥障隆⑹覝叵逻M(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)過(guò)3小時(shí)后滴加乙醚，生成白色沉淀物，將其過(guò)濾，在室溫下減壓干燥，得到為白色粉末的CDI活化聚輪烷(CDI-PR)。使用紫外吸收分光光度計(jì)，由207nm吸光度計(jì)算該CDI-PR的活化率，為91.37％。
如下制備氨基化聚輪烷或磺化聚輪烷、羧基化聚輪烷。
按照以下順序制備氨基化聚輪烷。即，將1g(0.029mmol)實(shí)施例2所得的CDI-PR溶解于20ml二甲基亞砜(DMSO)中，向其中加入過(guò)量的氨基化試劑，在室溫下攪拌3小時(shí)。然后將反應(yīng)溶液倒入到過(guò)量的二乙醚中，將所得沉淀物用同樣的溶劑洗滌，得到目標(biāo)氨基化聚輪烷。其中，將使用氨基化試劑1，2-二氨基丙烷的作為樣品No.1(導(dǎo)入的胺數(shù)為16，α-CD貫穿數(shù)為17)，將使用1，3-二氨基丙烷的作為樣品No.2(導(dǎo)入的胺數(shù)為38，α-CD貫穿數(shù)為17)，將使用N，N-二甲基-1，2-二氨基乙烷的作為樣品No.3(導(dǎo)入胺數(shù)為158，α-貫穿數(shù)為17)，將使用N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷的作為樣品No.4(導(dǎo)入的胺數(shù)為128，α-CD貫穿數(shù)為17)。
按照以下順序制備羧基化聚輪烷。即，按照實(shí)施例1制備將貫通了很多α-CD空洞部的PEG(分子量4000)的兩末端用Z-酪氨酸封端，制備聚輪烷。該聚輪烷通過(guò)琥珀酸酐進(jìn)行酯化，合成在α-CD羥基上導(dǎo)入了羧基乙基酯(CEE)基團(tuán)的水溶性羧基化聚輪烷(導(dǎo)入的CEE數(shù)為188，α-CD貫穿數(shù)為15)。將該羧基化聚輪烷作為樣品No.5。
按照以下順序制備磺化聚輪烷。即，使用水溶性碳二酰亞胺作為縮合劑，向上述合成的羧基化聚輪烷中導(dǎo)入?；撬?、得到磺化聚輪烷(導(dǎo)入的?；撬釘?shù)為117，α-CD貫穿數(shù)為9)。以該磺化聚輪烷為樣品No.6。以實(shí)施例1的聚輪烷作為樣品No.7。下表1給出了各樣品的結(jié)構(gòu)性特征。

對(duì)于各聚輪烷樣品，按照以下順序進(jìn)行細(xì)胞剝離試驗(yàn)。即，正確地稱量各聚輪烷樣品，然后加入70％乙醇，制備200m/ml的溶液或懸浮液。然后用70％乙醇制備0.02-20mg/ml的稀釋系列，將各100μL添加到96孔板中，在超凈工作臺(tái)內(nèi)以排風(fēng)的狀態(tài)干燥過(guò)夜。添加100μL細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基，攪拌1小時(shí)。再溶解聚輪烷，然后分別添加100μLNIH3T3細(xì)胞懸浮液(高密度條件3×105細(xì)胞/ml、中密度條件9×104細(xì)胞/ml、低密度條件3×104細(xì)胞/ml)。聚輪烷的終濃度為0.01、0.1、1、10mg/ml，NIH3T3細(xì)胞密度為1、3、10×104細(xì)胞/cm2。然后，在5％CO2、37℃的條件下培養(yǎng)8天，用顯微鏡進(jìn)行觀察。
結(jié)果，在含有羧基化聚輪烷(樣品No.5)、磺化聚輪烷(樣品No.6)和α-CD羥基無(wú)取代的聚輪烷(樣品No.7)的培養(yǎng)基中，與接種密度無(wú)關(guān)，在濃度為1mg/ml或以下時(shí)，只見(jiàn)與板面附著并增殖，未見(jiàn)到剝離，在濃度10mg/ml時(shí)，細(xì)胞不貼壁、不增殖。
與此相對(duì)，在導(dǎo)入了伯胺的氨基化聚輪烷(樣品No.1、2)中，在濃度為0.1-1mg/ml、接種密度為中、高密度條件時(shí)，至培養(yǎng)的第三天，細(xì)胞增殖為片狀并剝離，并且收縮，形成一個(gè)球狀體。由此可推測(cè)，氨基化聚輪烷與細(xì)胞弱結(jié)合，部分抑制細(xì)胞與板面的附著，在形成片后，細(xì)胞的片的收縮力高于板面與細(xì)胞的附著力，剝離成片狀。因此，在形成球狀體之前的片狀階段，可以使用細(xì)胞片支撐體回收細(xì)胞片。另外，在該氨基化聚輪烷中，在濃度為10mg/ml、接種密度為中、高密度的條件下，培養(yǎng)的第一天，細(xì)胞集落凝聚，形成很多小球狀體。由此可以推測(cè)，與呈片狀剝離、形成一個(gè)球狀體的情況相比，氨基化聚輪烷與細(xì)胞的結(jié)合量多，在形成小的集落的階段，細(xì)胞集落的片收縮力高于板面與細(xì)胞的附著力。
另一方面，在導(dǎo)入了叔胺的氨基化聚輪烷(樣品No.3、4)中，在濃度為10mg/ml的高密度條件下，培養(yǎng)至第二、三天，細(xì)胞集落凝聚，形成很多小球狀體，而在同樣濃度的中、低密度條件下，細(xì)胞只是與板附著并增殖。由此可以推測(cè)，導(dǎo)入了叔胺的氨基化聚輪烷與導(dǎo)入了伯胺的氨基化聚輪烷相比，與細(xì)胞的附著性弱。
以上的細(xì)胞剝離試驗(yàn)是將培養(yǎng)步驟和剝離步驟同時(shí)進(jìn)行，如果在培養(yǎng)步驟中在匯合之前添加氨基化聚輪烷，則細(xì)胞增殖成片狀，并且通過(guò)片收縮力由容器表面剝離，例如由上方落在親水處理的PVDF膜(聚偏氟乙烯膜)上，使細(xì)胞片與該P(yáng)VDF膜上接觸，然后分別提起每張膜，可以剝離并回收細(xì)胞片。
本發(fā)明以2004年9月30日提出的日本國(guó)特許出愿2004-286163號(hào)作為優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)，其內(nèi)容全部引入本發(fā)明中。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明可用于再生醫(yī)療領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞剝離劑，該細(xì)胞剝離劑含有氨基化聚輪烷。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞剝離劑，其中，所述氨基化聚輪烷是聚輪烷中所含的環(huán)糊精骨架中的至少一部分羥基被具有氨基的取代基取代的化合物。
3.權(quán)利要求2的細(xì)胞剝離劑，其中，上述聚輪烷是在使多個(gè)環(huán)狀分子貫穿線狀分子的狀態(tài)下，經(jīng)由水解性鍵向線狀分子的兩端導(dǎo)入具有大體積取代基的生物體親和性基團(tuán)的化合物。
4.權(quán)利要求2或3的細(xì)胞剝離劑，其中，上述具有氨基的取代基為-OOCNH-A-NR1R2，其中A為可具有支鏈的烴鏈，R1和R2可以相同或不同，為氫或可具有支鏈的烴基。
5.權(quán)利要求4的細(xì)胞剝離劑，其中，A為碳原子數(shù)為2-4的、可具有支鏈的烴鏈。
6.權(quán)利要求4或5的細(xì)胞剝離劑，其中，R1和R2可以相同或不同，為氫或碳原子數(shù)為1-5的、可具有支鏈的烴基。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的細(xì)胞剝離劑，該細(xì)胞剝離劑用于剝離附著在容器表面的細(xì)胞片。
8.細(xì)胞片的剝離方法，該方法包含以下步驟使細(xì)胞附著于容器表面進(jìn)行培養(yǎng)、制成細(xì)胞片的培養(yǎng)步驟；在上述培養(yǎng)步驟之后，更換為添加有權(quán)利要求7的細(xì)胞片剝離劑的培養(yǎng)基，使上述細(xì)胞片從上述容器表面剝離的剝離步驟。
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞片剝離方法，該方法還包含在上述剝離步驟后，將上述剝離的細(xì)胞片回收的回收步驟。
全文摘要
本發(fā)明的細(xì)胞片剝離劑含有氨基化聚輪烷，這里，形成本發(fā)明的細(xì)胞剝離劑骨架的聚輪烷具有以下結(jié)構(gòu)在使多個(gè)環(huán)狀分子貫穿線狀分子的狀態(tài)下，在線狀分子的兩端結(jié)合大體積的罩，使環(huán)狀分子不會(huì)脫離。本發(fā)明的細(xì)胞剝離劑中所含的氨基化聚輪烷是聚輪烷中含有的環(huán)糊精骨架上至少一部分羥基被具有氨基的取代基取代的化合物。根據(jù)該細(xì)胞片剝離劑，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，無(wú)需進(jìn)行溫度控制，可以將附著于容器表面的培養(yǎng)細(xì)胞剝離。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101031636SQ20058003319
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月30日
發(fā)明者W·塔查布恩阿基艾, 加藤雅一, 大谷亨, 由井伸彥 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu), 株式會(huì)社日本組織工程, 國(guó)立大學(xué)法人北陸先端科學(xué)技術(shù)大學(xué)院大學(xué)