專利名稱：采用固相支持物純化dna的制劑和方法
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背景技術(shù)：
在分子生物學(xué)領(lǐng)域，核酸如脫氧核糖核酸DNA)和核糖核酸(RNA)已廣泛用于研究和臨床分析。已有許多核酸純化方法，包括二種通用類型的液相和固相純化方法。液相純化時，DNA留在液相中而雜質(zhì)通過沉淀和/或離心被除去。固相純化時，DNA結(jié)合于固相支持物而雜質(zhì)被選擇性洗脫。常規(guī)的液相和固相純化方法需要采用許多步驟和有害的試劑。
本發(fā)明一些實施方式的概述本文描述一種分離和/或純化核酸的制劑。該制劑含有濃度至少約1M的鋰鹽、至少一種表面活性劑和緩沖液。該制劑還含有螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽。該制劑不含離液劑和/或強離液物質(zhì)。強離液物質(zhì)的例子有胍鹽、尿素、銨鹽、銫鹽、鉫鹽、鉀鹽或碘鹽。該制劑中的鋰鹽可以是氯化鋰。鋰鹽的濃度可以是2M-10M，或2M-6M。在某些實施方式中，鋰鹽的濃度可以是2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M或10M，或上述二種濃度之間的任何范圍(如5.5M)。該制劑的pH約高于7，例如在約7-9之間(如pH8、8.5、9)。在某些實施方式中，所分離和/或純化的核酸是DNA。此制劑中的表面活性劑濃度約占制劑總體積的10-40％(或其間的任何百分比)。此組合物中的表面活性劑可以是去污劑。所述去污劑可以是陰離子、陽離子、兩性離子或非離子去污劑。在一實施方式中，表面活性劑是非離子去污劑。合適的非離子去污劑的例子包括Tween、Triton、Nonidet、Igepal或Tergitol。例如，去污劑可以是Triton-X。表面活性劑還可以是二甘醇單乙醚(DGME，diethyl glycol monoethylether)。DGME的濃度占此制劑總體積的約5-35％(或此二百分比之間的任何百分比)。總之隨著該制劑其它組分濃度的增加DGME的用量也增加，從而可提高其它組分的溶解度。在某些實施方式中，表面活性劑是Triton-X與DGME的混合物。在一實施方式中，表面活性劑是5％v/v Triton與5％v/v DGME的混合物。在一實施方式中，表面活性劑的濃度占此制劑終體積的約10％v/v。
在一實施方式中，表面活性是陰離子去污劑。合適陰離子去污劑的例子包括十二烷基硫酸鈉(SDS)或N-十二烷酰肌氨酸。在一實施方式中，SDS是陰離子去污劑。在一實施方式中，去污劑的濃度在約0.05-0.2％之間(和此間的任何百分比)。在一實施方式中，其濃度約為0.1％。
在某些實施方式中，該制劑含有濃度為0.1％SDS和30％DGME的一種以上表面活性劑的混合物。
該制劑中的緩沖液的pKa至少約為8。螯合劑可以是EDTA或檸檬酸鹽。
在一實施方式中，用于分離和純化核酸的該制劑含有至少約1M濃度的鋰鹽、表面活性劑、緩沖液和任選的螯合劑，其中該溶液的pH約為7。
在另一實施方式中，用于分離和純化核酸的該制劑基本上由至少約1M濃度的鋰鹽、至少一種表面活性劑、緩沖液和任選的螯合劑組成。
在還有一種實施方式中，該制劑基本上由鋰鹽、至少一種表面活性劑、緩沖液和任選的螯合劑組成，該制劑的pH約為7。
另一實施方式該制劑基本上由至少約1M濃度的鋰鹽、表面活性劑、緩沖液和任選的螯合劑組成，pH約為7。
本發(fā)明也提供了從生物學(xué)材料純化基本純和無降解DNA的方法。所用的生物學(xué)材料可以是核酸的初制樣品或部分純化的混合物。生物學(xué)材料的例子包括；真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、微生物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、支原體、原蟲、細(xì)菌、真菌、病毒、酵母菌或立克氏體，或它們的勻漿液。生物學(xué)材料的其它例子包括；全血、骨髓、宮頸拭子、血斑點、血清、血漿、白細(xì)胞層制品、唾液、腦脊液或動物固體組織。生物學(xué)材料的其它例子包括糞便、尿、眼淚或汗液。生物學(xué)材料也可以是取自空氣、水、沉積物或土壤的環(huán)境樣品。生物學(xué)材料的樣品可有各種類型，包括例如培養(yǎng)的細(xì)胞、固定的細(xì)胞和/或組織。在一實施方式中，生物學(xué)樣品是宮頸細(xì)胞樣品。在另一實施方式中，生物學(xué)樣品是全血。
所用的固相支持物包括二氧化硅、纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍、聚酯、聚醚砜、聚烯烴或聚偏1，1-二氟乙烯，或它們的組合?？蓪⒐滔嘀С治锇b在在容器中。所述容器可以是離心管、旋轉(zhuǎn)管、針筒、筒芯、小室、多孔板或試管，或它們的組合。固相支持物可在生物學(xué)材料與其接觸前用RNA酶溶液預(yù)處理。
DNA裂解液中的鋰鹽是一種DNA絡(luò)合鹽(DNA-complexing salt)?？刹捎玫匿圎}的例子有氯化鋰和溴化鋰。DNA裂解溶液中的DNA-絡(luò)合鹽濃度高于約1M。在一實施方式中，DNA絡(luò)合鹽的濃度可以在2M-8M之間。在某些實施方式中，DNA-絡(luò)合鹽的濃度約為2M、3M、4M、5M、6M、7M或8M，或它們之間的任何濃度(例如約5.5M)。
所述裂解液可任選含有螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽。
所提供的方法還涉及以下步驟使生物學(xué)材料接觸DNA裂解液而形成混合液，其中所述DNA裂解液緩沖于pH大于7，且所述DNA裂解液含有鋰鹽和至少一種表面活性劑；使該混合液與DNA結(jié)合液(Spiking Solution)接觸；使該混合液與固相支持物接觸從而生物學(xué)材料中存在的DNA結(jié)合于該固相支持物；用洗滌液洗滌該固相支持物去除結(jié)合的基本上未降解的DNA以外的生物學(xué)物質(zhì)；用DNA洗脫液洗脫DNA獲得基本純的未降解DNA?！盎旧衔唇到獾腄NA結(jié)合于固相支持物”指基本上未降解的DNA結(jié)合于固相支持物而生物學(xué)樣品中的其它細(xì)胞或非細(xì)胞組分(如細(xì)胞膜或蛋白質(zhì))不結(jié)合于該固相支持物。
本發(fā)明提供了從生物學(xué)材料純化基本純和未降解DNA的方法，該方法包括以下步驟使含DNA的生物學(xué)材料與用DNA裂解液預(yù)處理的固相支持物接觸，其中所述DNA裂解液緩沖于pH大于約7，且該DNA裂解液含有表面活性劑和鋰鹽；在生物學(xué)材料中加入DNA結(jié)合液；使生物學(xué)材料與固相支持物接觸以釋放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物質(zhì)，其中所述含基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于該固相支持物；用洗滌液洗滌該固相支持物以去除包含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)；用DNA洗脫液從固相支持物上洗脫結(jié)合的未降解DNA。所述洗滌液可以是pH大于約7的緩沖液。在某些實施方式中，所述洗滌液是pH約7-9之間(如pH約8、約8.5或約9)的緩沖液。此方法和/或制劑中所用的裂解液和/或洗滌液可沒有離液劑和/或強離液物質(zhì)。
所述DNA結(jié)合液可包含醇類。所述醇類可以是異丙醇、乙醇、甲醇等。所述醇類可以是各種醇的混合液。在一實施方式中，所述DNA結(jié)合液是100％異丙醇。
所述表面活性劑可以是去污劑。所述去污劑可以是非離子去污劑，如Tween、Triton、Nonidet、Igepal或Tergitol。所述去污劑可以是陰離子去污劑，如SDS(十二烷基硫酸鈉)或N-十二烷酰肌氨酸，所述表面活性劑可以是去污劑的混合物，或去污劑與增溶表面活性劑(如DGME)的混合物。
所述DNA結(jié)合液可含堿金屬鹽如鋰鹽。DNA結(jié)合液可以是pH大于7的緩沖液。在某些實施方式中，DNA結(jié)合液是pH值在約7-9之間(如pH約8、約8.5或約9)的緩沖液。DNA結(jié)合液可含有表面活性劑。在一實施方式中，所述表面活性劑是DGME。
本發(fā)明提供了從生物學(xué)材料純化基本純和未降解DNA的方法，該方法包括以下步驟(a)使含DNA的生物學(xué)材料與用緩沖于pH大于約7的DNA裂解液預(yù)處理的固相支持物接觸而使DNA裂解液結(jié)合于固相支持物，其中所述DNA結(jié)合液含有DNA絡(luò)合鹽；(b)在該混合液中加入任選的DNA結(jié)合液；(c)使生物學(xué)材料與固相支持物接觸而使含基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于該固相支持物；(d)用DNA洗滌液洗滌該固相支持物以去除包含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)；(e)用DNA洗脫液從固相支持物上優(yōu)先洗脫結(jié)合的基本上未降解的DNA以獲得基本純和未降解的DNA。
本發(fā)明提供了從生物學(xué)材料純化基本純和未降解DNA的方法，該方法包括以下步驟(a)使含DNA的生物學(xué)材料與緩沖于pH大于約7的DNA裂解液預(yù)處理的固相支持物接觸而使DNA裂解結(jié)合于固相支持物，所述DNA裂解液含有表面活性劑和DNA絡(luò)合鹽；(b)在該生物學(xué)樣品中加入任選的DNA結(jié)合液；(c)使該生物學(xué)材料與固相支持物接觸以釋放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物質(zhì)，導(dǎo)致含基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于該固相支持物；(d)洗滌該固相支持物以去除含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)；(e)用DNA洗脫液從同相支持物上優(yōu)先洗脫結(jié)合的未降解的DNA以獲得基本純和未降解的DNA。
還提供了不使用紅細(xì)胞(RBC)裂解步驟從生物學(xué)材料如全血純化基本純和未降解DNA的直接裂解方法，該方法包括以下步驟使含DNA的生物學(xué)材料與第一DNA裂解液接觸，該第一DNA裂解液緩沖于pH大于約7并含有濃度在約5-15％v/v之間的表面活性劑和濃度大于1M的DNA絡(luò)合鹽；使該生物學(xué)材料與第二DNA裂解液接觸，該第二DNA裂解液含有表面活性劑和1M以上濃度的DNA絡(luò)合鹽；使該混合液與DNA結(jié)合液接觸；使該混合液與固相支持物接觸，其中所述含有來自于該生物學(xué)材料的基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于固相支持物；用DNA洗滌液洗滌該固相支持物以去除含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)，該DNA洗滌液含DNA絡(luò)合鹽和表面活性劑；和用DNA洗脫液從固相支持物上優(yōu)先洗脫結(jié)合的未降解的DNA。在某些實施方式中，第二DNA裂解液中的表面活性劑濃度在約25-35％v/v之間。在某些實施方式中，第二DNA裂解液還含螯合劑。
還提供了從生物學(xué)材料如固定的宮頸細(xì)胞樣品純化基本純和未降解的DNA的方法，該方法包括以下步驟使含DNA的生物學(xué)材料與緩沖于pH大于約7的DNA裂解液接觸，該DNA裂解液含有表面活性劑和濃度大于1M的DNA絡(luò)合鹽；在混合液中加入含醇的任選DNA結(jié)合液；使該生物學(xué)材料與固相支持物接觸以釋放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物質(zhì)，導(dǎo)致含基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于該固相支持物；用DNA洗滌液洗滌該固相支持物以去除含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)；用DNA洗脫液從固相支持物上優(yōu)先洗脫結(jié)合的未降解的DNA以獲得基本純和未降解的DNA。在某些實施方式中，DNA裂解液中的表面活性劑濃度在約25-35％v/v之間。在某些實施方式中，DNA裂解液還含有螯合劑。
如本文所用，“基本純的”指基本上沒有RNA、糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)污染物，因此這種DNA可用于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的后續(xù)分析，例如核酸定量測定、限制性酶消化、DNA測序、雜交技術(shù)如Southern印跡等，和擴增技術(shù)如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、核酸序列為基礎(chǔ)的擴增(NASBA)、自身支持的序列復(fù)制(SSR或3SR)、鏈置換擴增(SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析。
如本文所用，“基本上未降解的”DNA指未被消化的或完整的DNA，對此本領(lǐng)域技術(shù)人員不難用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測定?！盎旧衔唇到獾摹盌NA指在本文所述純化方法中未受到酶、物理或化學(xué)物質(zhì)損害的DNA。
可采用所述的試劑、方法和試劑盒來分離生物學(xué)廣泛來源的和生命形式的基本純和未降解的DNA，可回收的分子量范圍廣泛?？稍u價基本純和未降解的DNA的純度、產(chǎn)量、大小、逆轉(zhuǎn)錄或其它雜交、擴增和雜交的功能等。所述生物學(xué)樣品包括例如細(xì)胞或病毒懸液或其沉淀物、體液、宮頸細(xì)胞拭子和組織勻漿液等。如果生物學(xué)樣品包含細(xì)胞或病毒、可計數(shù)這些細(xì)胞和病毒。所述計數(shù)可采用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞計數(shù)方法，如電子細(xì)胞計數(shù)器(如CBC5 Coulter Couter，Coulter Corp，Hialeah，F(xiàn)L)或可視計數(shù)小室(如血細(xì)胞計數(shù)器，Bright Line，American Optical，Buffalo，NY)進(jìn)行。
應(yīng)注意，除非另有說明，本文所用的不定冠詞“一”和定冠詞“該”的含義與專利文獻(xiàn)中相同，指一個或多個。此外，本文所用術(shù)語“或”的含義與專利文獻(xiàn)中相同，指轉(zhuǎn)折連接詞“或”，或連接詞“和”。
附圖簡述

圖1是說明QIAamp Blood DNA Midi Kit(Qiagen，Inc.，德國)與Versagene BloodDNA Kit(Gentra Systems Inc.，明尼蘇達(dá)州)相比較的DNA產(chǎn)量理論百分比的圖。
圖2是說明鋰鹽和裂解液pH相比較的DNA產(chǎn)量理論百分比的圖。
發(fā)明詳述為結(jié)合和純化核酸而采用離液鹽是該領(lǐng)域從所周知的。例如，Kuroita等(美國專利No.5,990,302)報導(dǎo)可用含鋰鹽和離液劑如異硫氰酸胍(GITC)的酸性溶液裂解生物學(xué)材料，然后使RNA與核酸結(jié)合載體如二氧化硅接觸。然后以低離子強度緩沖液從二氧化硅上洗脫來純化RNA。此法的缺點是采用了有害物質(zhì)如異硫氰酸胍離液鹽。
為純化RNA，該領(lǐng)域報導(dǎo)了聯(lián)用離子強度高于4M的離液物質(zhì)如異硫氰酸胍、鹽酸胍、碘化鈉和尿素的混合物與二氧化硅相結(jié)合。例如，Hillebrand等(WO 95/343569)描述的一步方法包括在二氧化硅珠漿液中加入離液物質(zhì)使其與RNA結(jié)合。
與采用離液劑明顯相反的方法是采用抗離液劑(該領(lǐng)域也稱為“Kosmotropes”來分離RNA。Hillebrand等(US 2001/0041332)描述采用“抗離液劑”如氯化銨(也提及銫鹽、鈉鹽和/或鉀鹽)與PVP(聚乙烯吡咯烷酮)聯(lián)合裂解初始樣品，和用去污劑/醇類混合液使RNA結(jié)合于固相支持物。除通常所知銫和鉀鹽由于其電荷密度低和水合性能弱而清楚地視為離液劑外，而認(rèn)為銨鹽是一種邊緣性離液劑(Collins，K.生物系統(tǒng)中的粘性離子(Sticky Ions in biological systems)，PNAS，92；5553-5557，1995；Wiggins，P，M.細(xì)胞內(nèi)的高和低密度水份(High and Low Density Intracellular Water)，Cellularand Molecular Biology，47(5)，735-744)。Hillebrand的方法存在幾個缺點，第一，其方法采用了據(jù)研究有致瘤原性的PVP。第二，裂解和洗脫需要65-70℃加熱步驟。這種加熱可因非特異性降解或消化而損傷核酸，導(dǎo)致下游應(yīng)用受到限制，如與限制性酶消化或印跡分析不相容。
應(yīng)注意，從含核酸和其它生物學(xué)材料的溶液中選擇性沉淀核酸的方法，在物理上不同于采用固相選擇性結(jié)合溶液中的DNA或RNA分子的方法?！俺恋怼笔恰叭芙狻钡哪娣磻?yīng)。溶解包括溶質(zhì)如DNA的溶解，溶劑圍繞溶質(zhì)使溶策分子分開。沉淀包括去除溶劑和各DNA分子結(jié)合形成固體與溶劑分離。這些沉淀和溶解發(fā)生在溶液環(huán)境中，不依賴于分離成為截然不同的固相，而這是DNA純化和分離所依賴的。
為促進(jìn)DNA樣品制備領(lǐng)域的發(fā)展，需要有DNA固相純化方法。也需要適合于固相純化策略的試劑和方法，這些方法不僅應(yīng)簡便快速而且應(yīng)最大程度通用適合于自動化。通常需要這些試劑是低濃度、室溫(即20-25℃)穩(wěn)定、危害性低(如腐蝕性低、易燃性低和毒性低)、非顆粒性而不需要混合、和能保護DNA質(zhì)量的試劑。也需要操作步驟少、可采用各種生物學(xué)原料(不論是含水或干燥的)實施的、特別是可應(yīng)用于臨床實驗室常規(guī)實驗的方法。所述試劑不應(yīng)因為干擾了PCR緩沖液的緩沖能力，或因引起DNA擴增時所用聚合酶、引物或寡核苷酸的降解而抑制隨后的DNA分析。也需要操作步驟少、可采用各種生物學(xué)原料(不論是含水或干燥的)實施的、特別是可應(yīng)用于臨床實驗室常規(guī)實驗的方法。固相純化策略中所用的試劑和方法也不應(yīng)干擾核酸的標(biāo)準(zhǔn)實驗和/或診斷方法。
此外，分離和純化核酸由于發(fā)現(xiàn)了更多類型的挑戰(zhàn)性樣品而變得更有挑戰(zhàn)性。例如，隨著PHV(人乳頭瘤病毒)感染對宮頸癌的作用得到證明，臨床實驗室已迅速采用了宮頸細(xì)胞的分離和純化的DNA進(jìn)行HPV的分子試驗。分子診斷實驗室現(xiàn)在每年要進(jìn)行6百萬例以上的HPV診斷試驗。然而制備用于分子試驗的宮頸細(xì)胞樣品的DNA跟不上該日益增長的需求。在標(biāo)準(zhǔn)的測試方法中，收集表皮脫落宮頸上皮細(xì)胞的液體介質(zhì)中含有防腐劑，如SurePathTM防腐液(TriPath Imaging，Burlington，NC)或ThinPrepPap TestTM(Cytyc，Boxborough，MA)，這些樣品常嚴(yán)重污染有各種細(xì)胞和非細(xì)胞組分，使分離和純化困難。這些污染物可包括粘液、白細(xì)胞、紅細(xì)胞和蛋白質(zhì)。目前的手工DNA純化方法有幾個明顯缺點阻礙了臨床實驗室進(jìn)一步采用分子HPV診斷。因此目前迫切需要純化含表皮脫落宮頸細(xì)胞DNA的更有效和更高效方法。
在本文提供的試劑、方法和試劑盒中加入了用于從生物學(xué)樣品，如新鮮、凍存和干燥的生物學(xué)樣品中分離基本純和未降解DNA的固相支持物。這種純化DNA的方法廣泛適合用于分析和診斷方法，如核酸定量、限制性酶消化、DNA測序、雜交技術(shù)如Southern印跡等，和擴增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、核酸序列為基礎(chǔ)的擴增(NASBA)、自身支持的序列復(fù)制(SSR或3SR)、鏈置換擴增(SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析生物學(xué)材料和/或樣品本文提供用于純化生物學(xué)樣品DNA的試劑、方法和試劑盒。這類生物學(xué)樣品包括含有DNA的通常為含水混合物或干燥的生物材料，包括原核或真核細(xì)胞的復(fù)雜生物學(xué)混合物。該生物學(xué)材料通常也含有RNA、糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。生物學(xué)材料包括但不限于以下體液如全血、骨髓、血斑點、血清、血漿、白細(xì)胞層制品、唾液、腦脊液、口腔拭子；培養(yǎng)的細(xì)胞、固定的細(xì)胞、宮頸細(xì)胞拭子；細(xì)菌細(xì)胞的懸浮液或組織勻漿液；動物的實體組織如心、肝和腦；身體排泄的廢物如糞便、尿；取自空氣、水、沉積物或土壤的環(huán)境樣品；植物組織、、酵母菌、細(xì)菌、病毒、支原體、原蟲、立克氏體和其它小微生物細(xì)胞。也可采用這些生物學(xué)材料的裂解液、勻漿液、或部分純化的樣品。在一實施方式中，生物學(xué)材料是初步或部分純化的核酸混合物。
試劑本文描述了4類試劑。它們是DNA裂解液、DNA結(jié)合液、DNA洗滌液和DNA洗脫液。與適合的固相支持物聯(lián)用的這些試劑可用于制備基本純和無污染的未降解DNA。這些試劑可用于純化各種生物學(xué)材料中的DNA，而不采用有害物質(zhì)如苯酚、氯仿，或有害的離液劑如胍鹽、尿素等。
(1)DNA裂解液此DNA裂解液能有效裂解生物學(xué)樣品以釋放核酸，和有效抑制DNA酶活性。該DNA裂解液含以下組分鋰鹽、緩沖液、表面活性劑如去污劑或去污劑/表面活性劑混合物、和任選的螯合劑。該DNA裂解液的獨特性在于不需要加入強離液物質(zhì)如胍鹽、尿素等。胍鹽和尿素是強離液鹽，能破壞水結(jié)構(gòu)傾向降低疏水性相互反應(yīng)的強度，導(dǎo)致對其它溶質(zhì)分子的顯著影響。例如當(dāng)尿素溶于水時，能破壞蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)與DNA分離。胍鹽和尿素通過吸熱反應(yīng)溶于水，如Hofmeister系列(一種根據(jù)相對離液強度給陽離子和陰離子分等級的廣泛采用的系統(tǒng))定義的那樣，認(rèn)為胍鹽和尿素二者都是強離液鹽(F.Hofmeister，對鹽作用的了解(On the understanding of the effects of salts)，Arch ExpPathol Pharmakol.(Leipzig)24247-260，1888)。
與強離液鹽不同，鋰鹽(如氯化鋰和溴化鋰)在水中的反應(yīng)是放熱反應(yīng)，顯示強kosmotropic鋰離子的巨大離子偶極相互作用可導(dǎo)致溶解度增加，這些差異表明強離液劑(如胍鹽)與堿金屬鹽(具體是氯化鋰)之間存在差異。
本文描述采用鋰鹽，包括例如氯化鋰和溴化鋰的效果。認(rèn)為鋰離子由于其表面電荷密度高和水合特性強而非常kosmotropic。鋰離子的獨特處在于與也屬于堿金屬組的鈉、鉀、鉫和銫離子相比，它的半徑小。這使得它的表面電荷密度比同組其它離子高。表面電荷密度較高使鋰離子與水分子相互反應(yīng)時作用極強。這導(dǎo)致水分子圍繞鋰離子而維持其結(jié)構(gòu)的作用甚至超過先形成的水殼的保護作用。
適合的DNA絡(luò)合鹽包括含堿金屬離子的鹽，如鈉、鉀、鉫和銫鹽，因為所有這些陽離子均能與DNA分子的磷酸基團特異性絡(luò)合。DNA分子的這種絡(luò)合和隨后的中和使DNA分子在水環(huán)境中不大穩(wěn)定，而促使其與固相結(jié)合。一種實施方式采用鋰鹽。鋰鹽包括但不限于氯化鋰和溴化鋰。但氟化鋰和碘化鋰是不夠理想的堿金屬鹽，因為它們的價格比氯化鋰和溴鹽高5倍。此外，在上述名單中鋰離子是唯一清楚了解的kosmotropic離子，而鉀、鉫和銫離子是離液離子(Collins，K，生物系統(tǒng)中的粘性離子(Sticky Ions in Biological Systems)，Proc Natl Acad Sci.USA，925553-5557，1995)。氯化銫的價格比其它堿金屬鹽酸鹽高5倍(見表1)，溶解度比氯化鋰和溴化鋰差。此外，如鋰鹽溶于水時溶液大量放熱顯示的那樣，氯化鈉、氯化鉀和氯化銨鹽的溶解度比氯化鋰和溴化鋰差很多(《CRC化學(xué)和物理手冊》(CRC Handbood ofChemistry and Physics)，第62版，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)1)。
上述裂解液和結(jié)合液中高濃度的堿金屬鹽可促進(jìn)DNA與固相支持物結(jié)合。堿金屬鹽的濃度可以是2-10M之間。在實施例2中，觀察到氯化銨和氯化鉀鹽在裂解液中的溶解度分別為3M和＜3M，而氯化銫和氯化鈉鹽易溶解至4M。如表2所見，這些鹽的溶解度值大致上與它們在水溶液中的預(yù)期值相匹配，除氯化銨外(《CRC化學(xué)和物理手冊》，第62版，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)1)。
堿土金屬鹽含有kosmotropic鎂和鈣離子，雖然也具有與DNA形成鹽絡(luò)合物的能力，但在DNA與固相支持物結(jié)合所需的高濃度時不可溶。此外，例如堿土金屬鈹鹽比堿金屬鹽氯化鋰或溴化鋰貴約20倍，因此不適合用于實施本發(fā)明。
DNA裂解液含鋰鹽可使DNA通過吸附機制與特定的固相結(jié)合。采用鋰鹽導(dǎo)致DNA吸附于固相(的機理)不同于用鋰鹽沉淀DNA。在吸附過程中，溶劑分子與DNA分子相分離。DNA與固相之間的相互作用耗能優(yōu)于DNA分子之間的作用，因而吸附于固相而不發(fā)生沉淀。合適的固相材料的例子是硼硅酸鹽。
與生物學(xué)材料中的其它物質(zhì)相比，所述DNA裂解液通過緩沖液中存在的DNA-絡(luò)合鋰鹽(如氯化鋰或溴化鋰)和表面活性劑而實現(xiàn)DNA(與固相)結(jié)合，而不必采用有害的離液劑如胍鹽、尿素等。鋰離子結(jié)合于核酸(如DNA)的帶電荷磷酸骨架，在存在高濃度鋰離子時導(dǎo)致DNA溶解度降低(Kazakov，S.A.，金屬離子導(dǎo)致核酸結(jié)合和促進(jìn)(Nucleic Acid Binding and Catalysis by Metal Ions)，選自Hecht，S.M.編的《Bioorganic ChemistryNucleic Acid》(Bioorganic ChemistryNucleid Acids)，牛津大學(xué)出版社，NY & Oxford，1996)。這樣，DNA-絡(luò)合鹽賦予了核酸(如DNA)獨特的結(jié)合性能，使核酸與固相支持物的結(jié)合超過其它污染物如蛋白質(zhì)、磷脂等。
DNA裂解液中的第二種組分是維持溶液pH的緩沖劑。本文描述采用獨特的中性至高pH的DNA裂解液可使各種不同類型樣品的DNA產(chǎn)量最高。例如，所述DNA裂解液中的緩沖劑可保持此液的pH至少約為7，至少約為8，至少約為8.5或甚至至少約為9。該緩沖液的pKa至少約為8，可采用10-100mM濃度。合適緩沖劑的一個例子是tris(羥甲基)氨基乙烷(Tris)。所用的堿可以是能提高該溶液pH不低于7的堿。所述堿可以是堿金屬氫氧化物。這類堿金屬氫氧化物包括氫氧化鈉、氫氧化鉀和氫氧化鋰。
所述DNA裂解液還含一種或多種表面活性劑。表面活性劑包括能降低液體表面張力和降低不同極性和結(jié)構(gòu)分子之間吸引力的分子，從而使不同極性和結(jié)構(gòu)的分子之間易溶。在一實施方式中，表面活性劑是去污劑，或去污劑/表面活性劑的混合物，以幫助裂解生物學(xué)材料。采用去污劑是為了溶解膜組分如脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，以促進(jìn)細(xì)胞膜裂解和勻漿過程。采用表面活性劑是為了幫助該溶液中(溶質(zhì))的溶解度以及提高該溶液的貯存期。陰離子、陽離子、非離子和兩性離子去污劑均可采用。在某些例子中，DNA的分離優(yōu)選采用非離子去污劑，而在其它例子中，DNA的分離優(yōu)選采用陰離子去污劑?？刹捎梅请x子或陰離子去污劑，非離子去污劑的例子有Tween類(Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80等)、Triton類(X-100、X-114、XL-80N等)、Tergitol(XD、TMN-6等)和Nonidets或Igepal(NP-40等)；陰離子去污劑的例子有SDS(十二烷基硫酸鈉)或N-十二烷酰肌氨酸。陰離子洗滌所用的濃度為5-15％，如約10％。在另一實施方式中，聯(lián)用去污劑和表面活性劑。在一實施方式中，表面活性劑是DGME(二甘醇單乙醚)。在一實施方式中，聯(lián)用去污劑Triton-X和表面活性劑DGME。聯(lián)用的濃度可以是5-15％，如5-10％。在一實施例中，聯(lián)用5％Triton-X和5％DGME。在另一實施方式中，聯(lián)用的濃度可以是25-35％，如約30％。在一實施例中，聯(lián)用0.1％SDS和30％DGME。
在中性和高pH緩沖條件下鋰鹽與去污劑或表面活性劑聯(lián)合也起著使通常與生物學(xué)材料相關(guān)的酶(如DNA酶)變性的作用。所述DNA裂解液也任選含有能與外來金屬離子絡(luò)合的螯合劑。螯合劑的濃度可以是1-100mM，或1-10mM濃度。螯合劑的例子有EDTA或檸檬酸鹽。所述DNA裂解液的優(yōu)點明顯優(yōu)于其它同類試劑。在中性和高pH緩沖條件下DNA絡(luò)合鋰鹽與去污劑的獨特組合可滅活對DNA有害的酶(如DNA酶)而且不必采用苯酚、氯仿和胍鹽等試劑，當(dāng)與DNA結(jié)合液聯(lián)用時可完全裂解生物學(xué)材料并促進(jìn)結(jié)合過程。
(2)DNA結(jié)合液本文描述了DNA結(jié)合液的的用途，可用其使DNA分子脫水導(dǎo)致DNA與固相有效結(jié)合。所述DNA結(jié)合液可以是醇類。醇類的例子有異丙醇、乙醇或甲醇。在一實施方式中，DNA結(jié)合液是100％醇，如100％異丙醇?；蛘逥NA結(jié)合液可包含堿金屬鹽。堿金屬鹽DNA結(jié)合液可以是pH大于7的緩沖液或不是。堿金屬鹽DNA結(jié)合液也可含任選的去污劑或表面活性劑。在一實施方式中，所述表面活性劑是DGME。
所述DNA結(jié)合液可使DNA分子脫水導(dǎo)致DNA與固相有效結(jié)合。已發(fā)現(xiàn)LiCl能在其它鹽不能充分溶解的極高濃度(13摩爾)時將DNA從溶液中沉淀出來(Emanuel，C.F.，溶于高鹽介質(zhì)的脫氧核糖核酸的某些物理性能鹽的超化學(xué)性能(Some Physical Properties of Deoxyribonucleic Acids Dissolved in a High-Salt MediumSalt Hyperchromicity)，Biochim Biophys Acta，4291-98，1960)。高濃度鹽或醇可導(dǎo)致DNA與玻璃纖維結(jié)合而獲得較高產(chǎn)量。隨著LiCl濃度的增加，核酸水合殼中的水被排出，而使核酸優(yōu)先與溶液中的Li結(jié)合。一項研究表明，當(dāng)LiCl濃度足夠高時，最終與DNA結(jié)構(gòu)結(jié)合的殘留水分子消失了(Chattoraj，D.K.和Birdi，K.S.，生物聚合物對水蒸氣的吸附(Adsorption of Water Vapor by Biopolymers)，選自《吸附和吉布斯表面超額》(Adsorption and the Gibbs Surface Excess)，Plenum Press，NY & London，1984)。表面的脫水和隨后的中和迫使DNA分子因疏水性提高而從高序水溶液中逸出與固相結(jié)合。DNA分子吸附于二氧化硅固相表面也部分受到能熵提高的驅(qū)動。、能熵提高發(fā)生在脫水過程中當(dāng)水分子從DNA分子和二氧化硅固相表面釋放時(Melzak，K.A等，在高氯酸鹽溶液中趨使DNA吸附于二氧化硅的力(Driving Forces forDNA Adsorption to Silica in Perchlorate Solutions)，J Colloid interface Science，181635-644，1996)。采用含高濃度鹽或高醇組分的DNA結(jié)合液使脫水或脫鹽更完全，使DNA分子離開溶液而吸附于固相。
在一實施方式中，DNA結(jié)合液含有高濃度的堿金屬鹽，如鋰鹽。在一實施方式中，所述堿金屬鹽的濃度為10-15M。DNA結(jié)合液可以是pH至少7的緩沖液。DNA結(jié)合液可含表面活性劑以幫助鹽和緩沖劑的溶解。所述表面活性劑是DGME。
(3)DNA洗滌液本文也描述用于洗滌核酸所結(jié)合的固相支持物，以洗去非核酸污染物或雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)和磷脂)，同時保持核酸與固相支持物結(jié)合的DNA洗滌液。該洗滌液含有醇和緩沖鹽或螯合劑(如EDTA)。所述緩沖組分可以是例如pH6-8的Tris-HCl。緩沖劑的濃度為50-150mM(例如100mM)。所述醇是乙醇。醇的濃度為25-100％。EDTA的濃度為1-20mM(例如5-10mM)。
(4)DNA洗脫液結(jié)合于固相支持物的DNA可用DNA洗脫液洗脫。裂解生物學(xué)材料和使DNA結(jié)合于固相支持物及洗滌固相支持物所用的試劑很簡單，本身就使DNA洗脫液簡單化。也可采用該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它DNA洗脫液。例如，可用的DNA洗脫液是VersageneTMDNA洗脫液(Gentra Systems Inc，Minneapolis，MN)或者可采用Tris-EDTA(TE)。
固相支持物可采用各種固相支持物。合適的固相支持物包括二氧化硅支持物如玻璃纖維，或其它材料如纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍、聚酯、聚醚砜、聚烯烴、聚偏1，1-二氟乙烯和它們的組合?？蓪⒐滔嘀С治锇饣蚬潭ㄔ谌萜髦袕亩刹捎妹}沖流動或持續(xù)流動的DNA分離方法?；蛘呖蓪⒃摴滔嘀С治锊牧现瞥蔁o(流動死角)的固體支持物如膜、園盤或園筒，再將它們固定或包封在合適的容器如管子或平板中。在一實施方式中，該固相支持物是適合接觸所述生物學(xué)材料的纖維或顆粒。適合與所述試劑一起使用的固相支持物的尺寸視生物學(xué)材料的體積而不同。例如，可將玻璃纖維膜切成不同大小用以結(jié)合、純化和洗脫不同量的DNA。
在一實施方式中，所述固相支持物是充許本文所述DNA裂解液中的核酸結(jié)合于該固相支持物而其它生物學(xué)污染物不結(jié)合的材料。這類固相支持物是二氧化硅或硼硅酸鹽玻璃纖維材料。玻璃纖維材料因為DNA具有能特異性結(jié)合于帶陽電的硅和硼原子的性質(zhì)，及氫原子具有結(jié)合硅酸表面的性質(zhì)而能提供更高產(chǎn)量。因為二氧化硅對核酸具有(結(jié)合)特異性，與其它污染物相比，DNA結(jié)合更多，制備的洗脫產(chǎn)物基本純度更高。
適合與所述試劑聯(lián)用的固相支持物形狀可以是，例如片層、預(yù)先切成的園盤、園筒、一層纖維或由顆粒組成的固相支持物?？蓪⒃摴滔嘀С治锊牧现瞥蔁o(流動死角)的固體支持物如膜、園盤或園筒，再將它們固定或包封在合適的容器中。如果需要，可將該固相支持物，以紙張形式(如紙板)、微離心管、旋轉(zhuǎn)管、96孔板、小室或厚紙形式裝在合適的容器中。如果固相支持物含有纖維，可將其包封在合適的容器中，適當(dāng)壓緊纖維以使核酸能最佳結(jié)合而洗去污染物如蛋白質(zhì)、磷脂等。
可用RNA酶預(yù)處理該固相支持物以降解生物學(xué)樣品中的RNA。此外，采用經(jīng)預(yù)處理的柱可取消分離RNA消化產(chǎn)物的步驟，而這是常規(guī)方法通常需要的。
任選采用經(jīng)RNA酶處理的柱(Gentra Systems Inc)來改進(jìn)純化。RNA酶處理的柱能降解生物學(xué)樣品中的RNA。此外，采用經(jīng)預(yù)處理的柱可取消分離RNA消化產(chǎn)物的步驟，而這是常規(guī)方法通常需要的。
在另一實施方式中，可將DNA裂解液直接加入到制備該固相支持物的原料(如纖維)中，等其干燥后將其制成用戶易使用形式(如紙張、拭子、園盤、柱塞、柱子等)。采用RNA酶處理的柱(Gentra Systems Inc)減少了純化過程的步驟和加工DNA樣品的時間。
為更好地理解本發(fā)明，現(xiàn)詳細(xì)描述裝有該固相支持物的容器的具體實施方式
。在一實施方式中，此容器是頂部配有一個或多個入口或可刺穿的隔膜的筒芯。該入口可通過一連接管，如凹形Luer鎖緊接口(Luer-Lock)與裝有樣品或試劑的上游容器相連。可利用一個入口(加樣孔)將生物學(xué)樣品加入到固相支持物。該加樣孔的一種任選特征是具有自身可密封機制，當(dāng)樣品液通過此入口后可密封加樣孔。第二個入口是試劑入口。這二入口的一種特征是能保護性打開密封。因此，通過此二入口打開密封后可用任選的螺旋蓋防止液體擴散。
DNA裂解液的通用性和效果使其能用于DNA分離的二種切實可行的方法。第一種方法，使生物學(xué)材料與DNA裂解液接觸，然后與固相支持物接觸。在一實施方式中，當(dāng)生物學(xué)材料含細(xì)胞或病毒物質(zhì)時，用該DNA裂解液裂解細(xì)胞釋放核酸(包括DNA)。第二種方法，將DNA裂解液直接加入固相支持物使其結(jié)合于固相支持物。從而減少了一步，還簡化了此方法。在后一方法中，將DNA裂解液直接加入固相支持物使生物學(xué)材料與經(jīng)(RNA酶)處理的固相支持物接觸，然后抽干固相支持物。
在該固相支持物的底部是含有孔徑適合細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)和脂分子通過而分離的任選擴散層。該擴散層能使生物學(xué)材料均勻通過此筒芯的橫截面和防止生物學(xué)材料(無論在固相支持物之上或之下)不均勻凝聚。筒芯的出口配有與其錐形管幾乎匹配的保護蓋。將純化的DNA收集到收集管(包括有緊閉蓋子的錐形管)中，以方便和無污染保存。所有容器的大小取決于要加工樣品體積的大小和后續(xù)分析所需的用量。
在另一實施方式中，所述容器是離心管，設(shè)計在其中可安置壓緊的固相支持物。該固相支持物可以是二氧化硅纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍、聚酯、聚醚砜、聚烯烴、聚偏1，1-二氟乙烯和它們的組合。在一實施方式中，該支持物是二氧化硅為基礎(chǔ)的硼硅酸鹽玻璃纖維膜。此膜具有使其能保持在離心管中的凸形頂部和讓液體流穿同時支撐該固相支持物的有孔底部?？衫迷撾x心管的蓋子封住此膜。通過離心力使溶液，如含有非核酸污染物的DNA裂解液、DNA洗滌液或DNA洗脫液通過該有孔底部，收集到離心管底部而抽吸除去這些溶液。
在另一實施方式中，所述容器是多孔板，例如6、12、24、48、96或384孔板，其中各孔中有壓緊的固相支持膜。各孔底有一出口，含污染物的溶液或純化的DNA可通過此出口。
所選固相支持物與專用試劑(DNA裂解液、DNA結(jié)合液、DNA洗滌液和DNA洗脫液)的獨特組合可用于分離得到基本純的未降解DNA。所述DNA裂解和結(jié)合液的性能有利于裂解和使核酸結(jié)合于固相支持物，而用DNA洗脫液和任選的RNA酶處理此柱有利于從固相支持物上洗脫DNA。
試劑盒本發(fā)明提供的純化DNA試劑盒也裝有制備生物學(xué)樣品的基本純和未降解DNA的說明書，和一種或多種(如全部)以下物質(zhì)DNA裂解液，分裝的溶液或裝在固相支持物上的預(yù)處理溶液；未經(jīng)DNA裂解液處理的固相支持物；DNA結(jié)合液；DNA洗滌液；DNA洗脫液或它們的任何組合。此外，該試劑盒可裝有輔助組分，如蛋白酶K溶液、裝有固相支持物的容器、裝基本純和未降解DNA的容器，和它們的組合?；炯兒臀唇到獾腄NA適合用于該領(lǐng)域技術(shù)人員所知的后續(xù)分析，如核酸定量、限制酶消化、DNA測序、雜交技術(shù)如Southern印跡等，和擴增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、核酸序列為基礎(chǔ)的擴增(NASBA)、自身支持的序列復(fù)制(SSR或3SR)、鏈置換擴增(SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析。
本發(fā)明的試劑、方法和試劑盒提供的基本純和未降解的DNA所含RNA污染或其它雜質(zhì)少，因而該DNA可用于下游研究，如核酸定量、限制酶消化、DNA測序、雜交技術(shù)如Southern印跡等，和擴增方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、核酸序列為基礎(chǔ)的擴增(NASBA)、自身支持的序列復(fù)制(SSR或3SR)、鏈置換擴增(SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)、定量PCR(qPCR)或其它DNA分析。
方法本文提供從生物學(xué)材料純化DNA的方法。所述試劑和固相支持物本身構(gòu)成了所選的分離方法。
在方法的一實施方法中，使生物學(xué)材料與DNA裂解液接觸，再與固相支持物接觸。用DNA裂解液裂解生物學(xué)材料以釋放DNA，再將其加入固相支持物。此外，該DNA裂解液可防止有害酶(如DNA酶)的不良作用?？沙晒Φ赜迷揇NA裂解液來裂解培養(yǎng)的細(xì)胞或沉淀的白細(xì)胞，或裂解粘附在或收集在培養(yǎng)板(如標(biāo)準(zhǔn)的96孔板)中的細(xì)胞。如果生物學(xué)材料含有組織塊或小顆粒，該DNA裂解液的有效裂解能力能有效地粉碎這種組織塊成為漿液。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量或組織大小，可增加或減少DNA裂解液的體積。一旦生物學(xué)材料裂解，可在裂解液中加入DNA結(jié)合液，然后將它們加到固相支持物上。
在另一實施方式中，將DNA裂解液直接加到固相支持物上，從而減少了一步，還簡化了此方法。在后一方法中，將DNA裂解液加到固相支持物上使生物學(xué)材料與經(jīng)處理的固相支持物接觸，然后抽干固相支持物。
可將RNA酶直接加到固相支持物上來預(yù)處理該柱，或加到裂解液中來降解生物學(xué)樣品中的RNA。采用預(yù)處理柱和/或?qū)NA酶加入裂解液中，不需要分別進(jìn)行裂解和/或RNA酶消化步驟，而這是常規(guī)方法通常需要的。
當(dāng)生物學(xué)材料含有細(xì)胞或病毒物質(zhì)時，使之直接與DNA裂解液接觸，或與用DNA裂解液和/或RNA酶溶液預(yù)處理的固相支持物接觸，可導(dǎo)致細(xì)胞膜和核膜或病毒包膜溶解和/或破裂，而釋放核酸及其它污染物質(zhì)如蛋白質(zhì)、磷脂等。
在第三種實施方式中，例如所述試劑可用于全血直接裂解方法。此法不需要進(jìn)行其它大多數(shù)全血純化方法中共同采用的紅細(xì)胞裂解步驟。此法中，先將DNA裂解液加入到生物學(xué)材料中。第一DNA裂解液含堿金屬鹽和非離子去污劑。將含堿金屬鹽和陰離子去污劑的第二DNA裂解液加入到生物學(xué)材料中。采用二種裂解液有助于在直接裂解大量血液時成功裂解和溶解所有血細(xì)胞。
在第四種實施方法中，例如能有效地純化固定的細(xì)胞、或?qū)m頸拭子上的細(xì)胞、或固定的宮頸細(xì)胞的DNA。簡單地將含陰離子去污劑的裂解液加入到生物學(xué)材料中，用吸管上下吹打裂解細(xì)胞和使蛋白質(zhì)變性。裂解步驟后，對某些類型的樣品，如宮頸拭子，可能需要采用蛋白酶K溶液。在這些樣品中加入蛋白酶K，振蕩混合樣品。65℃培育樣品2-3小時。
在上述方法之一的裂解步驟后，可用DNA結(jié)合液脫水DNA分子使其有效結(jié)合于固相。然后任選采用適當(dāng)方法，如離心、移液管上下吸取、加壓、抽真空，或這些方法與DNA洗滌液聯(lián)用，除去生物學(xué)材料而DNA仍維持與固相結(jié)合?？上韧ㄟ^離心除去殘留的非核酸生物材料(包括蛋白質(zhì)、磷脂等)。這樣做可使裂解液中未結(jié)合的污染物從固相支持物上分離下來。
然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的足量DNA洗脫液洗脫結(jié)合的DNA，將固相支持物離心、加壓或抽真空使DNA釋放，收集在適當(dāng)?shù)娜萜髦小?br> 另一方面，本發(fā)明提供的試劑盒裝有具體使用方案，說明可按照本文所述方法，用本文所述的試劑和任選的固相支持物來從生物學(xué)材料純化DNA。
本發(fā)明現(xiàn)將參考以下詳述的實施例來進(jìn)一步說明。這些實施例進(jìn)一步闡述了各種具體和說明性的實施方式及技術(shù)。然而，應(yīng)理解可對其作出許多變化和修改，但仍屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
以下提及的所有原料不難獲自商業(yè)來源，如Sigma化學(xué)公司，St，Louis，MO。除非另有說明，文中所有的百分?jǐn)?shù)是根據(jù)試劑總體積的體積百分比。
實施例1價格分析為了生產(chǎn)出質(zhì)量最好的用于固相DNA純化的產(chǎn)品，該產(chǎn)品應(yīng)在幾個方面都具有極其良好的性能。用于固相純化DNA的產(chǎn)品應(yīng)能有效分離純化各種類型樣品中的DNA，和盡可能高的DNA產(chǎn)量。應(yīng)是用戶喜歡的，即其步驟不麻煩，其組分無害、易使用后丟棄。此外，該產(chǎn)品對用戶應(yīng)經(jīng)濟實惠。因此必須尋找成本效益好的溶液組分。表1顯示本文評估的各種鹽的價格。
雖然鋰鹽在這些方法中工作良好，但鋰鹽LiF和LiI較貴，此外LiF有相當(dāng)毒性。這些方法中LiCl和LiBr工作良好，ADW價格大約相同為60-65美元/500克。KCl、NaCl和NH4Cl雖然都很經(jīng)濟但不能產(chǎn)生所需量的DNA。
實施例2固相DNA純化過程中鹽酸鹽的溶解度和溶解熱數(shù)據(jù)，及其與LiCI和LiBr鹽的比較檢測了幾種鹽酸鹽的溶解度和性能，并與兩種鋰鹽氯化鋰和溴化鋰作比較。用其它鹽酸鹽制備DNA裂解液以檢測基于DNA裂解液的緩沖劑和去污劑所獲得的最大溶解度。表2顯示此研究所測定的幾乎是最大的溶解度，是將其與獲自《化學(xué)和物理手冊》(第62版，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L)的外推至20℃的表內(nèi)溶解度數(shù)據(jù)以及表內(nèi)溶解熱數(shù)據(jù)作比較。
所研究的用于裂解液的大多數(shù)鹽酸鹽的溶解度與4M濃度的氯化鋰和溴化鋰鹽相當(dāng)，除氯化鉀和氯化銨外。與其它鹽的相比，氯化鉀在水溶液中溶解度只是大約3M，比預(yù)期的溶解度低。預(yù)計其它鹽在水溶液中更易達(dá)到4M以上，然而觀察到氯化銨鹽只能溶解至大約3M，而其預(yù)期溶解度約為7M。這可能是由于溶液中存在表面活性劑，如Triton X-100(5％)和DGME(5％)，因為溶液中此二種組分聯(lián)合的濃度為10％。除鹽外，DNA裂解液中的其余組分保持恒定，含有5％Triton X-100、5％DGME(二甘醇單乙醚)、10mM EDTA、10mM TCEP、1％鎢酸鈉、10mM TRIZMA，pH8.8。
氯化鋰和溴化鋰溶于水時溶液放出大量熱證明了鋰鹽通常顯示的高溶解度。此實施例中的其它鹽酸鹽顯示溶解時吸熱，表明這些鹽溶于水溶液中時，溶解度不如鋰鹽。
表2
*注數(shù)據(jù)從化學(xué)和物理手冊表中列出數(shù)據(jù)外推至20℃。
實施例3DNA純化用去污劑的比較鑒定了能充分裂解細(xì)胞也能在DNA裂解液中保持可溶的去污劑。檢測了去污劑Tween、Triton、Nonidet和Igepal家族與一些表面活性劑化合物。
發(fā)現(xiàn)這些去污劑中的許多去污劑當(dāng)與DNA裂解液其它成分混合時隨時間變化而皂化或降解從溶液中沉淀出來。例如這發(fā)生在用10％Tween-20(聚氧乙烯山梨醇單月桂酯)時。類似現(xiàn)象見于采用等量Triton X-100(叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)和Tween-20的混合物時，雖然這種混合物在長時間內(nèi)穩(wěn)定。選擇DGME(二甘醇單乙醚)測試其作為表面活性劑促進(jìn)鹽和去污劑組合物溶解的性能。發(fā)現(xiàn)5％Triton-X和5％DGME特別好地維持了第一DNA裂解液的溶解度。
抽提宮頸細(xì)胞的DNA證明是一種特別的挑戰(zhàn)，因需要用蛋白酶K來消化此類樣品中堅硬的DNA收集物。裂解液中存在十二烷基硫酸鈉(SDS)時工作良好可獲得最高的蛋白酶K活性。通過系統(tǒng)測試用蛋白酶K處理的不同裂解液確定了SDS的最佳濃度。在高于或低于室溫時較高濃度的SDS(SDS最終濃度大于0.1％)可使裂解液產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致蛋白酶K活性低于所需活性。較低濃度的SDS(SDS最終濃度低于0.1％)可使蛋白酶K活性完全消失，從而有助于完全裂解固定的細(xì)胞制品如宮頸細(xì)胞。第二DNA裂解液中也含DGME時可使SDS和LiCl在裂解、摻加和結(jié)合過程中保持可溶。
開發(fā)直接裂解全血技術(shù)的主要障礙是去污劑對全血的裂解效率。初步試驗致力于采用非離子去污劑Triton X-100來裂解細(xì)胞。采用此去污劑導(dǎo)致該直接裂解方法的DNA回收低，可能是由于溶液中的紅細(xì)胞和紅細(xì)胞裂解物的干擾所致。Triton X-100不是蛋白變性劑，由于細(xì)胞污染物水平高，決定嘗試采用含蛋白變性劑的去污劑。為了提高裂解效率，測試了去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)代替非離子去污劑。這提高了DNA回收率但引起純化時膜堵塞。采用沉淀細(xì)胞時顯示二種去污劑聯(lián)用提高了DNA回收率。在直接裂解法中用這二種去污劑提高了DNA回收率和消除了膜堵塞。測試了加入去污劑的順序(陰離子/非離子對比非離子/陰離子)表明非離子去污劑必須在陰離子去污劑之前加入才能最優(yōu)回收DNA。
實施例4用直接裂解法分離血的DNA在全血樣品中加入等到體積的第一DNA裂解液(6M LiCl、5％Triton X-100、5％DGME(二甘醇單乙醚)、10mM EDTA、100mM Tris，pH8.8)。用移液管上下吸取所得溶液5次，高速振蕩5次，用移液管上下吸取20次，再振蕩5次，獲得完全的勻漿液。勻漿后，在樣品中加入二倍血體積的第二DNA裂解液(25mM檸檬酸鹽、2M LiCl，0.1％SDS、30％DGME、25mM Tris pH9.1)。按上述第一DNA裂解液同樣方法混合樣品。勻漿和用二種裂解液裂解后，各樣品中加入4倍血體積的DNA結(jié)合液(10MLiCl、10％DGME、100mM Tris pH7.9)。用移液管上下吸取所得溶液5次混合。
勻漿后將各600微升的裂解勻漿液移入各純化柱中。該純化柱的籃子中裝有硼硅酸玻璃纖維膜(Whatman D玻璃纖維膜)，放在抽真空洗脫平臺內(nèi)側(cè)。抽真空過濾將裂解液抽濾通過此膜。在柱中加入其余的裂解液，每次600微升，真空過濾抽除。
真空過濾各裂解液使DNA結(jié)合于硼硅酸膜表面后，在柱填料中加入400微升DNA洗滌液(5mM EDTA、70％乙醇、100mM Tris HCl pH7.6)，抽真空30秒去除洗滌液。重復(fù)加入DNA洗滌液和真空過濾步驟一次，收集洗滌液到同一管中。
為洗脫固相支持物上的DNA，將裝有膜的籃子轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在柱填料中加入50微升DNA洗脫液(1mM EDTA、10mM Tris pH7.5)，培育5分鐘，以最高速度離心一分鐘。重復(fù)加入DNA洗脫液、培育5分鐘和離心步驟一次。進(jìn)行了5種血體積(300ml、500ml、1ml、1.5ml和3ml)的純化，跑電泳與200納克Lambda HindIII梯級(標(biāo)準(zhǔn)品)比較。結(jié)果表明，采用大量輸入體積的全血直接裂解法，可純化全血獲得完整的高分子量DNA。
實施例5用RBC裂解法分離血的DNA一種用于分離全血樣品DNA的實施方式是先裂解血樣品中的紅細(xì)胞，然后離心沉降紅細(xì)胞裂解液中的白細(xì)胞。倒去紅細(xì)胞裂解上清液后，洗滌和反復(fù)沉降白細(xì)胞沉淀，在該沉淀中加入200微升DNA裂解液(6M LiCl、5％Triton X-100、5％DGME(二甘醇單乙醚)、10mM EDTA、100mMTris，pH8.8)振蕩裂解白細(xì)胞，用移液管吸取DNA裂解液徹底勻漿樣品。勻漿后，在白細(xì)胞裂解液中加入400微升DNA結(jié)合液(10MLiCl、10％DGME、100mM Tris，pH7.90，將混合液加到裝有硼硅酸玻璃纖維膜(Whatman D玻璃纖維膜)籃子的純化柱中，放在2ml微離心管內(nèi)。然后7000xg離心該微離心管一分鐘。離心裂解液后，在柱填料中加入400微升DNA洗滌液(5mMEDTA、70％乙醇、100mM Tris HCl pH7.6)，以最高速度離心微離心管一分鐘。重復(fù)加入DNA洗脫液、培育5分鐘和離心步驟一次。為洗脫柱上的DNA，將裝有膜的籃子轉(zhuǎn)移到一新的微離心管中，在柱中加入50微升DNA洗脫液(1mM EDTA、10mMTris pH7.5)，以最高速度離心微離心管一分鐘。重復(fù)加入DNA洗脫液、培育5分鐘和離心步驟一次，收集洗脫液到同一洗脫管中。
直接與QIAamp血DNA Midi試劑盒(Qiagen Inc，德國)比較，2ml血樣品Versagene血DNA(試劑盒)的平均產(chǎn)量大約是QIAamp平均產(chǎn)量的二倍，見圖1(也見表3的相關(guān)統(tǒng)計)。
表3
根據(jù)每個白細(xì)胞含有6pg基因組DNA的假設(shè)，計算理論上的產(chǎn)量百分比。在采用圖2所示的RBC裂解法和2ml血樣品的某些例子中獲得了高達(dá)預(yù)期理論產(chǎn)量約70-80％的產(chǎn)率，其中DNA裂解液組合物的pH和LiCl濃度不同(見表4相關(guān)統(tǒng)計)。
表4
實施例6分離宮頸細(xì)胞的DNA由于提取宮頸拭子上的細(xì)胞或固定的頸細(xì)胞的核酸特別困難，故可用其闡明本文所述組合物和方法的效果。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道本文所述的組合物和方法也可有效地用于其它廣泛的生物學(xué)樣品，本發(fā)明可采用的樣品類型不受限制。
將宮頸細(xì)胞樣品收集在ThinPrepPap TestTM(Cytyc，Boxborough，MA)中，2200xg離心5分鐘，然后重懸于PBS以洗滌細(xì)胞。將重懸細(xì)胞置于微離心管中14000xg離心15秒沉降。除去宮頸細(xì)胞沉淀上方的PBS上清液。強力振蕩各管重懸細(xì)胞；這大大有利于細(xì)胞裂解。在樣品中加入200微升裂解液(25mM檸檬酸鹽、2M LiCl，0.1％SDS、30％DGME、25mM Tris pH9.1)重懸細(xì)胞，用移液管上下吸取裂解細(xì)胞和使蛋白質(zhì)變性。在細(xì)胞裂解液中加入1微升蛋白酶K溶液(20mg/ml)，簡單振蕩混合；然后65℃培育樣品2-3分鐘。在樣品中加入400微升100％異丙醇DNA結(jié)合液。間歇振蕩樣品30秒，讓其靜置2分鐘然后加入柱中。將樣品加到用RNA酶預(yù)處理的純化柱(Gentra Systems，Inc.)上。以7000xg離心樣品一分鐘。將裝有純化柱的籃子轉(zhuǎn)移到新的清潔管子中。每個純化柱加入200微升DNA洗滌液(5mM EDTA、70％乙醇、100mM Tris HCl pH7.6)。然后7000xg離心純化柱一分鐘。每個純化柱再加入200微升DNA洗滌液。7000xg離心純化柱二分鐘。將裝有純化柱的籃子小心轉(zhuǎn)移到新的清潔管子中。每個純化柱加入50微升DNA洗脫液(1mM EDTA、10mM Tris pH7.5)室溫培育5分鐘。然后14000xg離心純化柱一分鐘。
直接比較Puregene Liquid Chemistry(Gentra Systems Inc)、Versagene Solid PhaseDNA Chemistry(Gentra Systems Inc)，就初始宮頸樣品類型而言，平均產(chǎn)量相似，見下表所示。
表5
表6
表7
本文革所引用的所有出版物、專利、專利申請均納入本文參考文獻(xiàn)。雖然在上述說明書中，已用某些優(yōu)選實施方式描述了本發(fā)明，提供了許多細(xì)節(jié)目的是說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可對本發(fā)明的附加實施方式和詳細(xì)內(nèi)容作相當(dāng)改變而不脫離本發(fā)明的基本原理。
權(quán)利要求
1.一種用于分離和純化DNA的制劑，其特征在于，該制劑包含濃度至少約1M的鋰鹽；至少一種表面活性劑；和緩沖劑。
2.如權(quán)利要求1所述的制劑，其特征在于，該制劑還包含螯合劑。
3.如權(quán)利要求2所述的制劑，其特征在于，所述螯合劑是EDTA或檸檬酸鹽。
4.如權(quán)利要求1-3任何一項所述的制劑，其特征在于，所述制劑不含離液劑和/或強離液物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1-4任何一項所述的制劑，其特征在于，所述鋰鹽是氯化鋰。
6.如權(quán)利要求1-5任何一項所述的制劑，其特征在于，所述鋰鹽的濃度為約2-10M。
7.如權(quán)利要求1-6任何一項所述的制劑，其特征在于，所述制劑的pH為約7以上。
8.如權(quán)利要求1-6任何一項所述的制劑，其特征在于，所述制劑的pH在約7-9之間。
9.如權(quán)利要求1-8任何一項所述的制劑，其特征在于，所述表面活性劑的濃度約為10-40％v/v。
10.如權(quán)利要求1-9任何一項所述的制劑，其特征在于，所述至少一種表面活性劑是二甘醇單乙醚(DGME)。
11.如權(quán)利要求10所述的制劑，其特征在于，所述制劑中DGME的濃度約為5-35％v/v。
12.如權(quán)利要求1-11所述的制劑，其特征在于，所述至少一種表面活性劑是去污劑。
13.如權(quán)利要求12所述的制劑，其特征在于，所述去污劑是陰離子、陽離子、兩性離子或非離子去污劑，或它們的混合物。
14.如權(quán)利要求12或13所述的制劑，其特征在于，所述去污劑是陰離子和非離子去污劑的混合物。
15.如權(quán)利要求13或14所述的制劑，其特征在于，所述陰離子去污劑是SDS。
16.如權(quán)利要求15所述的制劑，其特征在于，所述SDS的濃度在0.05-0.2％v/v之間。
17.如權(quán)利要求12或13所述的制劑，其特征在于，所述去污劑是Triton-X。
18.如權(quán)利要求17所述的制劑，其特征在于，所述去污劑的濃度在0.05-5.0％v/v之間。
19.一種從生物學(xué)材料分離基本純和未降解的DNA的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)使含DNA的生物學(xué)材料與DNA裂解液接觸形成混合液，其中所述DNA裂解液緩沖于pH大于7，且所述DNA裂解液含有鋰鹽和至少一種表面活性劑；(b)使所述混合液與DNA結(jié)合液接觸；(c)使所述混合液與固相支持物接觸以致使該生物學(xué)材料中存在的DNA結(jié)合于該固相支持物；(d)用洗滌液洗滌該固相支持物；和(e)用DNA洗脫液洗脫DNA。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述DNA結(jié)合液含有異丙醇、乙醇和/或甲醇。
21.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述DNA結(jié)合液含混合醇。
22.如權(quán)利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述DNA結(jié)合液含有100％的異丙醇。
23.如權(quán)利要求19-22任何一項所述的方法，其特征在于，所述DNA結(jié)合液含有1M以上濃度的堿金屬鹽。
24.如權(quán)利要求19-23任何一項所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)材料是宮頸細(xì)胞樣品。
25.如權(quán)利要求19-23任何一項所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)材料是全血。
26.如權(quán)利要求19-23任何一項所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)材料是培養(yǎng)的細(xì)胞、固定的細(xì)胞和/或組織樣品。
27.如權(quán)利要求19-26任何一項所述的方法，其特征在于，所述洗滌液緩沖于pH大于約7。
28.如權(quán)利要求19-27任何一項所述的方法，其特征在于，所述裂解和/或洗滌液不含離液劑和/或強離液物質(zhì)。
29.如權(quán)利要求19-28任何一項所述的方法，其特征在于，所述DNA裂解液還含有螯合劑。
30.如權(quán)利要求19-29任何一項所述的方法，其特征在于，所述固相支持物包括二氧化硅、纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維素、尼龍、聚酯、聚醚砜、聚烯烴、聚偏1，1-二氟乙烯或它們的組合。
31.如權(quán)利要求19-30任何一項所述的方法，其特征在于，所述固相支持物在與生物學(xué)材料接觸前先用RNA酶溶液預(yù)處理。
32.如權(quán)利要求19-31任何一項所述的方法，其特征在于，所述裂解液中的鋰鹽是氯化鋰或溴化鋰。
33.如權(quán)利要求19-32任何一項所述的方法，其特征在于，所述裂解液中的鋰鹽濃度大于約1M。
34.如權(quán)利要求19-33任何一項所述的方法，其特征在于，所述裂解液中的鋰鹽濃度在2M-8M之間。
35.如權(quán)利要求19-34任何一項所述的方法，其特征在于，所述裂解液還含有螯合劑。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述螯合劑是EDTA或檸檬酸鹽。
37.如權(quán)利要求19-36任何一項所述的方法，其特征在于，所述DNA裂解液含有約25-35％v/v的表面活性劑。
38.如權(quán)利要求19-37任何一項所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑是去污劑。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述去污劑是非離子去污劑。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述非離子去污劑是Tween、Triton、Nonidet、Igepal或Tergitol。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述去污劑是陰離子去污劑。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述陰離子去污劑是SDS(十二烷基硫酸鈉)或N-十二烷酰肌氨酸。
43.如權(quán)利要求19-37任何一項所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑是去污劑混合物，或去污劑與增溶表面活性劑的混合物。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述增溶表面活性劑是DGME。
45.一種從生物學(xué)材料純化基本純和未降解的DNA的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)使含DNA的生物學(xué)材料與用DNA裂解液預(yù)處理過的固相支持物接觸，其中所述DNA裂解液緩沖于pH大于約7，且其中所述DNA裂解液含有表面活性劑和鋰鹽；(b)在該生物學(xué)材料中加入DNA結(jié)合液；(c)使該生物學(xué)材料與固相支持物接觸以釋放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物質(zhì)，其中所述含基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于該固相支持物；(d)用洗滌液洗滌該固相支持物以去除含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)；和(e)用DNA洗脫液從固相支持物上洗脫結(jié)合的未降解的DNA。
46.一種不用紅細(xì)胞裂解步驟從生物學(xué)材料純化基本純和未降解的DNA的直接裂解方法，其特征在于，該方法包括(a)使含DNA的生物學(xué)材料與第一DNA裂解液接觸，該第一DNA裂解液緩沖于pH大于約7并含有約5-15％v/v的表面活性劑和濃度大于1M的DNA絡(luò)合鹽；(b)使該生物學(xué)材料與第二DNA裂解液接觸，該第二DNA裂解液含有表面活性劑和濃度高于1M的DNA絡(luò)合鹽；(c)使該混合液與DNA結(jié)合液接觸；(d)使該混合液與固相支持物接觸，其中所述含有來自于該生物學(xué)材料的基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于該固相支持物；(e)用DNA洗滌液洗滌該固相支持物以去除含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)，所述DNA洗滌液含DNA絡(luò)合鹽和醇；和(f)用DNA洗脫液從固相支持物上優(yōu)先洗脫結(jié)合的基本上未降解的DNA。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述第二DNA裂解液還含有螯合劑。
48.一種從生物學(xué)材料純化基本純和未降解DNA的方法，其特征在于，該方法包括(a)使含DNA的生物學(xué)材料與緩沖于pH大于約7的DNA裂解液接觸，該DNA裂解液含有表面活性劑和濃度大于1M的DNA絡(luò)合鹽；(b)使該生物學(xué)材料與固相支持物接觸，其中所述含基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于該固相支持物；(c)使該固相支持物與DNA結(jié)合液接觸；(d)用DNA洗滌液洗滌固相支持物以去除含未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)，所述DNA洗滌液含DNA絡(luò)合鹽和醇；和(e)用DNA洗脫液從固相支持物上優(yōu)先洗脫結(jié)合的基本上未降解的DNA。
49.一種從固定的宮頸細(xì)胞樣品純化基本純和未降解DNA的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(a)使包含DNA所在固定宮頸細(xì)胞的生物學(xué)材料與緩沖于pH大于約7的DNA裂解液接觸，該DNA裂解液含有約25-35％v/v的表面活性劑、螯合劑和濃度大于1M的DNA-絡(luò)合鹽；(b)在該混合液中加入任選的含醇DNA結(jié)合液；(c)使該生物學(xué)材料與固相支持物接觸以釋放含基本上未降解DNA的核酸和非核酸生物物質(zhì)，導(dǎo)致含基本上未降解DNA的核酸結(jié)合于固相支持物；(d)用DNA洗滌液洗滌該固相支持物以去除含基本上未降解DNA的結(jié)合核酸以外的生物學(xué)物質(zhì)；和(e)用DNA洗脫液從固相支持物上優(yōu)先洗脫結(jié)合的未降解DNA而獲得基本純和未降解的DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供用于從生物材料純化DNA的試劑、方法和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101023171SQ200580025930
公開日2007年8月22日 申請日期2005年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月2日
發(fā)明者R·J·貝爾, K·C·本尼迪克特, W·J·基維斯, R·W·小奎亞蒂科夫斯基, K·保爾森, D·A·斯特姆, J·M·韋杰斯 申請人:根特拉體系股份有限公司