專利名稱：突變的葡萄糖脫氫酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及表現(xiàn)出改進的底物特異性的突變的葡萄糖脫氫酶。本發(fā)明的突變的葡萄糖脫氫酶可以合適地用于葡萄糖傳感器、葡萄糖測定試劑盒等，并且在生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中有用。
背景技術(shù)：
近年中，將多種酶用作生物傳感器元件。已經(jīng)將葡萄糖氧化酶(GODs)實際用作測量血糖水平的傳感器元件，用于診斷糖尿病的目的。但是，GODs的問題是它們受到樣品中溶解的氧的影響。因此，不受樣品中溶解的氧影響的葡萄糖脫氫酶(GDHs)引起了注意，作為GODs的替代。
作為GDHs，報道了一種需要NAD(P)+作為輔酶(E.C.1.1.1.47)，一種需要pyroloquinoline quinone(PQQ)作為輔酶(PQQGDH；E.C.1.1.99.17)，等等。需要NAD(P)+作為輔酶的GDH的問題是作為傳感器元件，需要在測定系統(tǒng)中加入NAD(P)+。相反，對于輔酶結(jié)合型GDHs，如PQQGDH，不需要在測定系統(tǒng)中加入輔酶。
此外，傳感器元件需要表現(xiàn)出穩(wěn)定性，當(dāng)它們連續(xù)使用或保持在室溫中時不喪失傳感器的功能。
由于來源于在高溫下生長的嗜熱細菌的酶通常表現(xiàn)出高穩(wěn)定性，并且在長期儲存中甚至也表現(xiàn)出高穩(wěn)定性，預(yù)期可以連續(xù)使用，并且因此可以將它們用作傳感器元件。但是，盡管已經(jīng)報道來源于嗜酸熱原體和硫磺礦硫化葉菌的GDHs是來源于嗜熱細菌的耐熱GDHs，但兩者都需要NAD(P)+作為輔酶。
另一方面，由一種中度嗜熱的細菌，即洋蔥伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的耐熱GDH是FAD結(jié)合型GDH，并且其酶學(xué)特征如最優(yōu)反應(yīng)溫度、熱穩(wěn)定性和底物特異性已經(jīng)得到闡述(專利文件1)。這種GDH通常作為異寡聚物存在，由高度抗熱的催化亞基(α-亞基)和電子轉(zhuǎn)移亞基(β-亞基)，即細胞色素C和功能未知的γ-亞基組成，其最優(yōu)反應(yīng)溫度是45℃。這些亞基被溫度高于50℃的熱處理解離，以釋放最優(yōu)反應(yīng)溫度為75℃的α-亞基單體。α-亞基單體是耐熱的，甚至在60℃熱處理30分鐘后表現(xiàn)出80％或更多的殘留活性。也已經(jīng)分離了編碼這些亞基的基因(專利文件1和2)。
但是，輔酶結(jié)合型GDHs通常表現(xiàn)出廣泛的底物特異性，并且也與麥芽糖、半乳糖等，以及葡萄糖反應(yīng)。當(dāng)它們作為監(jiān)測糖尿病患者的血糖水平的葡萄糖傳感器施用，并且糖尿病患者具有嚴重癥狀以至于必須進行腹膜透析時，存在可能獲得比真實血糖水平更高的值的可能，因為在透析物中含有大量的麥芽糖。來源于洋蔥伯克霍爾德氏菌的GDH也表現(xiàn)出除葡萄糖之外，對麥芽糖和半乳糖的反應(yīng)性。
通過導(dǎo)入氨基酸取代突變而改變GDH的底物特異性的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。例如，作為所述突變的GDHs，存在來源于大腸桿菌(專利文件3和4)、乙酸鈣不動桿菌(乙酸鈣葡糖桿菌)(專利文件5)和鮑氏不動桿菌(專利文件6-8)的公知的PQQGDHs，它們需要pyroloquinoline quinone作為輔酶。
美國專利申請No.2004/0023330[專利文件2]國際專利公開WO03/091430[專利文件3]日本專利公開(Kokai)No.10-243786[專利文件4]日本專利公開No.2001-197888[專利文件5]日本專利公開No.2004-173538[專利文件6]日本專利公開No.2004-313172[專利文件7]日本專利公開No.2004-313180[專利文件8]日本專利公開No.2004-344145發(fā)明公開本發(fā)明的一個目的是提供表現(xiàn)出對葡萄糖的改進的底物特異性的FAD結(jié)合型GDH。
本發(fā)明的發(fā)明人進行了多項研究，以獲得上述目的。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)通過在特定位點修飾來源于洋蔥伯克霍爾德氏菌的FAD結(jié)合型GDH，可以降低其對除葡萄糖之外的糖類的反應(yīng)性，同時保持對葡萄糖的反應(yīng)性，因此完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供了以下內(nèi)容。
(1)表現(xiàn)出對葡萄糖的改進的底物特異性的突變的葡萄糖脫氫酶，其是具有SEQ ID NO13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸殘基的SEQ IDNO13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白，并且其具有以下列出的任意氨基酸取代突變(數(shù)字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸殘基代表在該位置取代后的氨基酸殘基，“+”表示同時包括兩種氨基酸取代)(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472GIy，472His，472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser，472Trp，472Tyr，472Val，(B)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475His，475Met，475Phe，475Ser，475Tyr，475Val，(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Asp+475(His，Phe，Ser，Val)，472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Ser，Tyr)，472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Pro+475His472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，472Trp+475(His，Phe，Ser)，472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
(2)前述突變的葡萄糖脫氫酶，其具有SEQ ID NO13的氨基酸序列，前提是它包括前述(A)-(C)中列出的任意氨基酸取代突變。
(3)前述突變的葡萄糖脫氫酶，其具有選自以下突變的氨基酸取代突變(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，
472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，472Asp+475(His，Ser)，472Cys+475(Gly，His，Phe)，472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，472His+475(His，Ser)，472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，472Trp+475(His，Phe)，472Tyr+475His，472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
(4)葡萄糖脫氫酶，其是具有SEQ ID NO13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸殘基的SEQ ID NO13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白，并且其中(i)SEQ ID NO13的氨基酸序列中至少第472位的精氨酸殘基或第475位的天冬酰胺殘基被另一種氨基酸殘基取代，并且(ii)導(dǎo)入前述突變的葡萄糖脫氫酶對葡萄糖的比活性和對麥芽糖的比活性的比值((對麥芽糖的反應(yīng)性/對葡萄糖的反應(yīng)性)×100)與沒有導(dǎo)入突變的葡萄糖脫氫酶的該比值相比減少了10％或更多。
(5)突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物，至少包含前述突變的葡萄糖脫氫酶和電子轉(zhuǎn)移亞基。
(6)編碼前述突變的葡萄糖脫氫酶的DNA。
(7)具有前述DNA并且產(chǎn)生前述突變的葡萄糖脫氫酶或突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物的微生物。
(8)葡萄糖測定試劑盒，包含前述突變的葡萄糖脫氫酶、突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物或微生物。
(9)葡萄糖傳感器，包含前述突變的葡萄糖脫氫酶、突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物或微生物。
在本說明書中，盡管術(shù)語“突變的GDH”是指與突變的GDH復(fù)合物不同的內(nèi)容中的突變的α-亞基，但突變的α-亞基和突變的GDH復(fù)合物也可以通稱為“突變的GDH”。
附圖簡述

圖1顯示了DH5α/pTrc99A/γ+α對作為底物的葡萄糖和麥芽糖的脫氫酶活性。菱形代表對葡萄糖的活性，矩形代表對麥芽糖的活性(圖2-5中也是如此)。
圖2顯示了DH5α/pTrcγαAsn475Asp對作為底物的葡萄糖和麥芽糖的脫氫酶活性。
圖3顯示了DH5α/pTrc99Aγαβ對作為底物的葡萄糖和麥芽糖的脫氫酶活性。
圖4顯示了DH5α/pTrcγαβAsn475Asp對作為底物的葡萄糖和麥芽糖的脫氫酶活性。
圖5顯示了DH5α/pTrcγαβAsn475Glu對作為底物的葡萄糖和麥芽糖的脫氫酶活性。
圖6顯示了用于對GDHα-亞基中第472和475位進行密碼子取代的PCR引物的序列。
圖7顯示了突變的GDHs的SV圖。
圖8顯示了突變的GDHs的SV圖。
圖9顯示了葡萄糖傳感器的結(jié)構(gòu)。
圖10顯示了葡萄糖傳感器的試劑部分。
圖11顯示了采用野生型GDH的葡萄糖傳感器的葡萄糖反應(yīng)性。
圖12顯示了采用472Glu475Tyr型GDH的葡萄糖傳感器的葡萄糖反應(yīng)性。
圖13顯示了采用472Asp475His型GDH的葡萄糖傳感器的葡萄糖反應(yīng)性。
圖14顯示了葡萄糖存在下，采用野生型GDH的葡萄糖傳感器的麥芽糖反應(yīng)性。
圖15顯示了葡萄糖存在下，采用472Glu475Tyr型GDH的葡萄糖傳感器的麥芽糖反應(yīng)性。
圖16顯示了葡萄糖存在下，采用472Asp475His型GDH的葡萄糖傳感器的麥芽糖反應(yīng)性。
圖17顯示通過采用野生型GDH和突變的GDH的葡萄糖傳感器測量的表現(xiàn)血糖水平。
實施本發(fā)明的最佳方式下文中將詳細解釋本發(fā)明。
本發(fā)明的突變的GDH是通過將特定突變導(dǎo)入野生型GDH而制備的。野生型GDH的實例包括由洋蔥伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的GDHs。由洋蔥伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的GDHs的實例包括由洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1、JCM2800和JCM2801菌株產(chǎn)生的GDHs。KS1菌株于2000年9月25日保藏于獨立的管理機構(gòu)，即國際專利生物保藏機構(gòu)-通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏號是FERM BP-7306。JCM2800和JCM2801菌株儲存在獨立的管理機構(gòu)，即RIKEN，Bioresource Center，日本微生物保藏中心(JCM)。
含有KS1菌株的GDHα-亞基基因和部分β-亞基基因的染色體DNA片段的核苷酸序列示于SEQ ID NO11(美國專利申請No.2004/0023330)。該核苷酸序列中存在3個可讀框(ORF)，從5’末端側(cè)開始的第二個和第三個ORFs分別編碼α-亞基(SEQ ID NO13)和β-亞基(SEQ ID NO14)。此外，推定第一個ORF編碼γ-亞基(SEQID NO12)。此外，含有全長β-亞基基因的片段的核苷酸序列示于SEQID NO15。此外，β-亞基的氨基酸序列示于SEQ ID NO16。推定SEQ ID NO16中的氨基酸1-22相應(yīng)于信號肽。盡管SEQ ID NOS15和16中的第一個氨基酸殘基是Val，它們很可能是Met，并且可能在翻譯后去除。
本發(fā)明的突變的GDH可以由單獨的α-亞基、包含α-亞基和β-亞基的復(fù)合物，或包含α-亞基、β-亞基和γ-亞基的復(fù)合物組成。通過在任何情況下將特定突變導(dǎo)入α-亞基，并且可能在上述特定突變外具有保守突變，獲得本發(fā)明的突變的GDH。此外，其它的亞基可以是野生型亞基或具有保守突變。術(shù)語“保守突變”表示不顯著影響GDH活性的突變。
本發(fā)明的突變的α-亞基優(yōu)選具有SEQ ID NO13的氨基酸序列，但是其包含下文描述的特定突變。此外，突變的α-亞基可以具有前述保守突變，只要它具有GDH活性。也就是說，它可以是具有除上述特定突變外，包含一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO13的氨基酸序列的蛋白。SEQ ID NO13具有可以由SEQ ID NO11的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。但是，在翻譯后可以去除N-末端的甲硫氨酸殘基。前述“一個或幾個”優(yōu)選表示1-10的數(shù)目，更優(yōu)選1-5，特別優(yōu)選1-3。
此外，β-亞基典型地具有SEQ ID NO16的氨基酸序列。但是，只要它作為GDH的β-亞基起作用，它可能是具有包括一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列的蛋白。前述術(shù)語“一個或幾個”優(yōu)選表示1-20的數(shù)目，更優(yōu)選1-10，特別優(yōu)選1-5。“作為GDH的β-亞基起作用”表示作為細胞色素C，而不降解GDH的酶活性。
野生型α-亞基基因的特定實例包括含有相應(yīng)于SEQ ID NO11的核苷酸764-2380的核苷酸序列的DNA。此外，α-亞基基因可以是具有相應(yīng)于SEQ ID NO11的核苷酸序列中的核苷酸764-2380的核苷酸序列的DNA，或在嚴格條件下可以與從該序列制備的探針雜交，并且編碼具有GDH活性的蛋白的DNA。
此外，β-亞基基因的特定實例包括具有相應(yīng)于SEQ ID NO9的核苷酸187-1398的核苷酸序列的DNA。此外，β-亞基基因可以是具有相應(yīng)于SEQ ID NO9的核苷酸187-1398的核苷酸序列的DNA，或在嚴格條件下可以與從該序列制備的探針雜交，并且編碼可以作為β-亞基起作用的蛋白的DNA。
前述嚴格條件的實例包括，例如，以下條件具有70％或更高，優(yōu)選80％或更高，更優(yōu)選90％或更高，特別優(yōu)選95％或更高同源性的DNAs彼此雜交，并且特定實例是60℃下1×SSC，0.1％SDS的條件。
可以通過例如采用洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體DNA作為模板的PCR獲得α-亞基基因和β-亞基基因?？梢曰谇笆龊塑账嵝蛄?，通過化學(xué)合成制備PCR的引物。此外，也可以采用基于作為探針的前述序列制備的寡核苷酸，通過雜交從洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體DNA獲得引物。此外，也可以相似地從洋蔥伯克霍爾德氏菌的其它菌株獲得其變體。其它菌株的實例包括前述JCM2800和JCM2801菌株。由這些菌株產(chǎn)生的GDHs的α-亞基分別與KS1菌株的α-亞基具有95.4和93.7％的同源性。
此外，甚至可以將其它微生物產(chǎn)生的GDHs用于制備本發(fā)明的突變的GDH，只要它們具有與洋蔥伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的GDH相似的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)特征。
在本發(fā)明的突變的GDH中，通過將特定突變導(dǎo)入前述野生型GDH而改進對葡萄糖的底物特異性?！案倪M對葡萄糖的底物特異性”是指對其它糖類，如單糖、二糖和寡糖，例如麥芽糖、半乳糖、木糖等的反應(yīng)性降低，同時基本維持對葡萄糖的反應(yīng)性，或與對其它糖類的反應(yīng)性相比，對葡萄糖的反應(yīng)性改進。例如，即使對葡萄糖的反應(yīng)性降低，但如果對其它糖類的反應(yīng)性降低更大的程度，則改進了對葡萄糖的底物特異性。此外，即使對其它糖類反應(yīng)性升高，但如果對葡萄糖的底物特異性升高更大的程度，則改進了對葡萄糖的底物特異性。具體地，如果對葡萄糖的比活性與對其它糖類，如麥芽糖的比活性的比值((對另一種糖的反應(yīng)性/對葡萄糖的反應(yīng)性)×100)減少10％或更多，優(yōu)選20％或更多，更優(yōu)選50％或更多，則改進了對葡萄糖的底物特異性。
前述特定突變表示在SEQ ID NO13的氨基酸序列中第472位的氨基酸取代、第475位的氨基酸取代，和第472和475位兩者的氨基酸取代。突變的更特定的實例包括下文所述的氨基酸取代。示出的數(shù)字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸殘基代表對前述位置取代后的氨基酸殘基，“+”表示同時包含了兩個氨基酸取代。在以下氨基酸取代中，第472位的氨基酸取代列于(A)中，第475位的氨基酸取代列于(B)，第472和475位兩者的氨基酸取代列于(C)。例如，“472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)”表示用Asn取代第472位的氨基酸殘基(野生型中的Ala)，并且用Asp、Gly、His、Phe、Ser或Tyr取代第475位的氨基酸殘基(野生型中的Asn)的突變。
(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472Gly，472His，472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser， 472Trp，472Tyr，472Val，(B)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475His，475Met，475Phe，475Ser，475Tyr，475Val，(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，
472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Asp+475(His，Phe，Ser，Val)，472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Ser，Tyr)，472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Pro+475His472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，472Trp+475(His，Phe，Ser)，472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
在前述的氨基酸取代中，優(yōu)選取代如下(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，472Asp+475(His，Ser)，472Cys+475(Gly，His，Phe)，472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，472His+475(His，Ser)，472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，472Trp+475(His，Phe)，472Tyr+475His，
472Vai+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
前述氨基酸取代突變的位置是SEQ ID NO13，即洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的野生型GDHα-亞基的氨基酸序列中的位置，以及GDHα-亞基同源物或變體中的位置，所述同源物或變體具有除前述特定突變外取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸殘基的SEQ IDNO13的氨基酸序列，所述位置相應(yīng)于通過于SEQ ID NO13的氨基酸序列進行比對而確定的前述氨基酸取代的位置。例如，在1-471位的區(qū)域中缺失一個氨基酸殘基的保守GDH α-亞基變體中，第472和475位代表變體中的第471和第474位。
本發(fā)明的發(fā)明人研究了葡萄糖脫氫酶中參與結(jié)合FAD的區(qū)域和附近區(qū)域作為導(dǎo)入改進底物特異性的突變的位置。作為參與結(jié)合FAD的區(qū)域，考慮了FAD附近的區(qū)(覆蓋FAD的蓋)或FAD結(jié)合域，具體是相應(yīng)于SEQ ID NOS1-4的氨基酸序列的區(qū)域。
術(shù)語“相應(yīng)于氨基酸序列的區(qū)域”表示在具有SEQ ID NO13的氨基酸序列的洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的GDHα-亞基中，具有SEQ ID NO1、2或4的氨基酸序列的區(qū)域，即，SEQ ID NO13的氨基酸88-92、57-61和470-504的區(qū)域。此外，在具有與SEQID NO13的氨基酸序列同源的氨基酸序列的GDH α亞基中，這些區(qū)域是相應(yīng)于通過與SEQ ID NO13的氨基酸序列比對確定的前述洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的GDHα-亞基中的氨基酸88-92、57-61或470-504的區(qū)域。
本發(fā)明的發(fā)明人比較了用FAD作為輔酶的GMC氧化還原酶家族酶、氧化葡糖桿菌的山梨糖醇脫氫酶(GenBank編碼AB039821)、草生歐文氏菌的2-酮戊二酸脫氫酶(GenBank編號AF068066)、Phanerochaete chrysosporium的纖維二糖脫氫酶(CDH)(J.Mol.Biol.，315(3)，421-34(2002))、鏈霉菌種的膽固醇氧化酶(COD)(J.Struct.Biol.116(2)，317-9(1996))和尼崎青霉的葡萄糖氧化酶(Eur.J.Biochem.252，90-99(1998))的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了FAD結(jié)合域和覆蓋FAD的蓋保守的區(qū)域，和脯氨酸保守的區(qū)域，脯氨酸是參與蛋白折疊的氨基酸殘基。然后，他們檢驗了通過修飾這些區(qū)域和其它區(qū)域之間的邊界附近的序列而改進底物特異性的可能性。結(jié)果，他們證實了可以通過前述氨基酸殘基的突變改進底物特異性。
可以通過定點誘變將相應(yīng)于需要的氨基酸突變的核苷酸突變導(dǎo)入編碼GDHα-亞基的DNA(α-亞基基因)，并且使用合適的表達系統(tǒng)表達獲得的突變DNA，從而獲得具有需要的突變的GDHα-亞基。此外，可以通過表達編碼突變的GDHα-亞基的DNA以及編碼β-亞基的DNA(β-亞基基因)或β-亞基基因和編碼γ-亞基的DNA(γ-亞基基因)，獲得突變的GDH復(fù)合物。為了將突變導(dǎo)入編碼GDHα-亞基的DNA，也可以使用編碼GDHα-亞基、γ-亞基和β-亞基(以此順序)的多順反子DNA片段。
可以通過以下方法確定導(dǎo)入突變的GDHα-亞基或GDH復(fù)合物對糖類的底物特異性通過實施例中描述的方法檢驗對各種糖類的反應(yīng)性，并且將其與野生型α-亞基或野生型GDH復(fù)合物的反應(yīng)性進行比較。
可以通過例如采用洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體DNA作為模板和具有SEQ ID NOS12和13的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物的PCR獲得編碼α-亞基、γ-亞基和β-亞基(以此順序)的多順反子DNA片段(參見下文描述的實施例)。
用于獲得GDH亞基的基因、導(dǎo)入突變、表達基因等的載體的實例包括在埃希氏菌屬細菌中起作用的載體，其特定實例包括pTrc99A，pBR322，pUC18，pUC118，pUC19，pUC119，pACYC184，pBBR122等。用于表達基因的啟動子的實例包括lac，trp，tac，trc，PL，tet，PhoA等。此外，可以通過在含有啟動子的表達載體中的合適位點插入α-亞基基因或其它亞基基因，以一個步驟進行這些基因在載體中的插入和啟動子的連接。所述表達載體的實例包括pTrc99A，pBluescript，pKK223-3等。
此外，可以將α-亞基基因或其它亞基基因以可表達的形式摻入宿主微生物的染色體DNA。
用重組載體轉(zhuǎn)化微生物的方法的實例包括，例如，采用鈣處理的感受態(tài)細胞法、原生質(zhì)體法、電穿孔等。
宿主微生物的實例包括芽孢桿菌屬細菌，如枯草芽孢桿菌、酵母，如啤酒糖酵母，和絲狀真菌，如黑曲霉。但是，宿主微生物不限于這些實例，并且可以使用適于產(chǎn)生外來蛋白的宿主微生物。
可以將本發(fā)明的突變的α-亞基、突變的GDH復(fù)合物和表達它們的微生物用作葡萄糖傳感器的酶電極或葡萄糖測定試劑盒的成分。采用洋蔥伯克霍爾德氏菌的野生型GDH的葡萄糖傳感器和葡萄糖測定試劑盒描述于美國專利No.2004/0023330A1。本發(fā)明的突變的GDH也可以以相似的方式使用。
實施例將參照以下實施例更具體解釋本發(fā)明。但是，本發(fā)明的范圍不限于這些實施例。
實施例1表達洋蔥伯克霍爾德氏菌的GDH的質(zhì)粒作為表達洋蔥伯克霍爾德氏菌的GDH的質(zhì)粒，制備了表達GDHα-亞基和γ-亞基的質(zhì)粒和表達α-亞基、β-亞基和γ-亞基的質(zhì)粒。
<1>表達GDH α-亞基和γ-亞基的質(zhì)粒作為表達α-亞基和γ-亞基的質(zhì)粒，使用了描述于WO02/036779中的質(zhì)粒pTrc99A/γ+α。該質(zhì)粒是通過將按順序含有分離自洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株(FERM BP-7306)的染色體DNA的GDHγ-亞基結(jié)構(gòu)基因和α-亞基結(jié)構(gòu)基因插入載體pTrc99A(Pharmacia)中作為克隆位點的NcoI/HindIII位點而獲得的質(zhì)粒。該質(zhì)粒中的GDHγα基因受trc啟動子的調(diào)節(jié)。pTrc99A/γ+α具有氨芐青霉素抗性基因。
<2>表達GDH α-亞基、β-亞基和γ-亞基的質(zhì)粒按照以下方法制備表達GDH α-亞基、β-亞基和γ-亞基的質(zhì)粒。
(1)制備洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株的染色體DNA。
以常規(guī)方法從洋蔥伯克霍爾德氏菌KS1菌株制備染色體基因。也就是說，采用TL液體培養(yǎng)基(1L中含有10g聚蛋白胨，1g酵母提取物，5g NaCl，2g KH2PO4，5g葡萄糖，pH7.2)，34℃下在培養(yǎng)基中振蕩菌株細胞過夜。通過離心收集生長的細胞。將細胞懸浮在含有10mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中，50℃下處理6小時。在混合物中加入等體積的苯酚-氯仿，在室溫下將混合物攪拌10分鐘。然后，通過離心收集上清液。在上清液中加入終濃度為0.3M的乙酸鈉，覆蓋2倍體積的乙醇，以便在中間層中沉淀染色體DNA。用玻璃棒收集DNA，用70％的乙醇洗滌，然后溶解于合適體積的TE緩沖液中，獲得染色體DNA溶液。
(2)制備編碼GDHγ-亞基、α-亞基和β-亞基的DNA片段。
采用前述染色體DNA作為模板，具有以下序列的寡核苷酸作為引物，通過PCR擴增編碼GDH γ-亞基、α-亞基和β-亞基的DNA片段。
5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACAC-3’(SEQ ID NO5)[反向引物]5’-GTCGACGATCTTCTTCCAGCCGAACATCAC-3’(SEQ ID NO6)對擴增的片段的C-末端側(cè)進行平端化，用Ncol消化N-末端側(cè)，將片段連接到相似處理的pTrc99A(Pharmacia)中。用獲得的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，收集在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落。在液體LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)化體，提取質(zhì)粒，分析插入質(zhì)粒中的DNA片段。結(jié)果，證實了大約3.8kb的插入的片段。將該質(zhì)粒命名為pTrc99Aγαβ。該質(zhì)粒中GDH的結(jié)構(gòu)基因受到trc啟動子的調(diào)節(jié)。pTrc99Aγαβ具有氨芐青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。
實施例2將突變導(dǎo)入GDHα-亞基基因通過采用商購的定點誘變試劑盒(QuikChangeII Site-DirectedMutagenesis Kit，Stratagene)，用天冬氨酸的密碼子(GAT)或谷氨酸的密碼子(GAA)取代實施例1中描述的質(zhì)粒pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ中含有的GDHα-亞基基因中第475位的天冬酰胺的密碼子(AAT)。作為引物，使用了以下寡核苷酸。下文中，將用天冬氨酸殘基取代第475位的天冬酰胺稱作“Asn475Asp”，用谷氨酸殘基取代第475位的天冬酰胺稱作“Asn475Glu”。
Asn475Asp取代的引物[正向引物]5’-CGCGCCGAACGATCACATCACGGGC-3’(SEQ ID NO7)[反向引物]5’-GCCCGTGATGTGATCGTTCGGCGCG-3’(SEQ ID NO8)
Asn475Glu取代的引物[正向引物]5’-GAATTCGCGCCGAACGAACACATCACGGGCTCG-3’(SEQ IDNO9)[反向引物]5’-CGAGCCCGTGATGTGTTCGTTCGGCGCGAATTC-3’(SEQ IDNO10)采用以下反應(yīng)組成進行PCR。在95℃下反應(yīng)30秒后，重復(fù)95℃下30秒，55℃下1分鐘和68℃下8分鐘的一輪反應(yīng)15次。然后，在68℃下反應(yīng)30分鐘后，將反應(yīng)混合物在4℃下維持。
模板DNA(5ng/μl) 2μl(pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ)10x反應(yīng)緩沖液 5μl正向引物(100ng/μl)1.25μl反向引物(100ng/μl)1.25μldNTP 1μl蒸餾水 38.5μlDNA聚合酶 1μl總量 50μlPCR后，在反應(yīng)混合物中加入0.5μl DNA聚合酶I，將混合物在37℃溫育1小時，以分解模板質(zhì)粒。
用獲得的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細胞(supE44，ΔlacU169(φ80lacZΔM15)，hsdR17，recAi，endA1，gyrA96，thi-1，relA1)。從在含有氨芐青霉素(50μl/ml)和卡那霉素(30μl/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基(1％細菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化鈉，1.5％瓊脂)上生長的一些菌落制備質(zhì)粒DNA，進行序列分析，證實目標突變已經(jīng)被導(dǎo)入GDHα-亞基基因。將導(dǎo)入Asn475Asp突變的pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ分別稱作pTrcγαAsn475Asp和pTrcγαβAsn475Asp。此外，將導(dǎo)入Asn475Glu突變的pTrc99A/γ+α和pTrc99Aγαβ分別稱作pTrcγαAsn475Glu和pTrcγαβAsn475Glu。
實施例3突變的GDHs的底物特異性分析采用實施例2中獲得的表達突變的GDH的質(zhì)粒制備突變的GDH，檢驗其底物特異性。
(1)培養(yǎng)振蕩下在L形試管中在37℃下在2ml LB培養(yǎng)基(含有50μg/ml氨芐青霉素和30μg/ml卡那霉素)中培養(yǎng)導(dǎo)入了pTrcγαAsn475Glu和pTrcγαβAsn475Glu的大腸桿菌DH5α菌株。將這些培養(yǎng)液接種在裝在500-ml Sakaguchi燒瓶中的150ml LB培養(yǎng)基(含有50μg/ml氨芐青霉素和30μg/ml卡那霉素)中，在振蕩下在37℃培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)開始后3小時，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，將細胞進一步培養(yǎng)2小時。
(2)制備酶樣品從按照上文的描述獲得的每個培養(yǎng)液收集細胞，洗滌，然后懸浮于含有每0.3mg濕細胞1ml 0.2％Triton X-100的10mM磷酸鉀緩沖液(PPB，pH 7.0)中，通過超聲處理破碎。離心(10000rpm，10分鐘，4℃)該懸浮液以除去殘留物，然后超速離心(50,000 r.p.m.，60分鐘，4℃)上清液，將獲得的上清液(水溶性級分)用作粗酶樣品。進一步，通過常規(guī)的疏水層析(柱子Octyl Sepharose，AmershamBiosciences)和離子交換層析(Q-Sepharose，Amersham Biosciences)純化該樣品，獲得純化的酶樣品。通過采用GDH活性作為指標，確定目標酶級分。
(3)GDH活性的測量在8μl前述純化的酶樣品中加入8μl用于測量活性的試劑(在12μl600mM甲基吩嗪硫酸二甲酯(PMS)和120μl 6mM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)中加入含有0.2％(w/v)Triton X-100的10mM PPB，達到480μl的總體積而獲得的溶液)。采用鋁塊溫度調(diào)節(jié)室，使該混合物在每個反應(yīng)溫度預(yù)溫育1分鐘，然后在混合物中迅速加入每個濃度的8μl底物(葡萄糖或麥芽糖)或蒸餾水，攪拌混合物。采用分光光度計測量作為DCIP-引起的吸收波長的600nm處的吸光度。試劑DCIP和PMS的終濃度分別是0.06和0.6mM。底物的終濃度是40，20，10和5mM。
結(jié)果示于表1和圖1-5。
表1

從這些結(jié)果可以明確看出，所有突變的GDHs對麥芽糖的反應(yīng)性都明顯降低，而保持了對葡萄糖的反應(yīng)性，即，改進了它們對葡萄糖的特異性。
實施例4將突變導(dǎo)入GDH α-亞基基因在實施例1中獲得的pTrc99Aγαβ中所包含的GDHα-亞基基因中的第475位和鄰近位置導(dǎo)入突變，并且評估突變的酶的底物特異性。按照與實施例2相同的方式導(dǎo)入突變。用于導(dǎo)入突變的引物按照如下方法制備。在圖6中示出的基本引物(野生型)(正向引物SEQ IDNO17，反向引物SEQ ID NO18)中，在圖6中提到的密碼子改變表中所示的預(yù)定位置(第472位和第475位)改變密碼子，以制備用于導(dǎo)入多種突變的引物。
實施例5突變的GDHs的底物特異性分析采用實施例4中獲得的表達突變的GDH的質(zhì)粒，通過與實施例3相同的方式制備突變的GDHs，并且檢驗其底物特異性。通過采用粗酶樣品檢驗酶活性。每種突變的GDH對葡萄糖的比活性、對麥芽糖的比活性和反應(yīng)比值(對麥芽糖的比活性/對葡萄糖的比活性，單位是U/ml)示于表2-7。當(dāng)對葡萄糖的比活性是0.5U/ml或更低時，判斷無活性，這種結(jié)果在表中以“-”表示。
結(jié)果，對于第475位，證實了除實施例2中進行的用天冬氨酸(GAT)或谷氨酸(GAA)取代天冬酰胺外的取代也具有改進底物特征的作用。此外，發(fā)現(xiàn)用另一種氨基酸取代第475位附近第472位的天冬酰胺(AAC)也改進了底物特性。此外，也發(fā)現(xiàn)第472位和第475位的氨基酸取代的組合可以協(xié)同改進底物特征。
表2底物濃度10mM對葡萄糖的比活性(U/ml培養(yǎng)液)

表3底物濃度10mM對麥芽糖的比活性(U/ml培養(yǎng)液)

表4底物濃度10mM麥芽糖/葡萄糖(反應(yīng)比值)

總共60表5底物濃度10mM對葡萄糖的比活性(U/ml培養(yǎng)液)

表6底物濃度10mM對麥芽糖的比活性(U/ml培養(yǎng)液)

表7底物濃度10mM麥芽糖/葡萄糖(反應(yīng)比值)

總共60
實施例6基于SV曲線評估純化的酶獲得表現(xiàn)出實施例5中的改進的底物特異性的一些突變的GDHs的SV曲線。以與實施例3中相同的方式純化每種突變的GDH。結(jié)果示于圖7和8以及表8。
結(jié)果，證實純化的酶的反應(yīng)比值(對麥芽糖的比活性/對葡萄糖的比活性)也得到改進，并且低于所有檢驗的底物濃度下野生型的該比值。此外，由于結(jié)果基本與采用實施例5中的粗酶溶液獲得的測量結(jié)果基本一致，可以證實采用粗酶進行的修飾的酶的篩選的足夠可行性。此外，從這些候選物選擇用于葡萄糖傳感器的修飾的酶。為此目的，由于血麥芽糖水平最多升高到200mg/dl，特別注意了底物濃度180和90mg/dl時的反應(yīng)比值。結(jié)果，選擇472Asp475His作為候選物，其對葡萄糖的反應(yīng)性沒有像野生型那樣降低，并且選擇72Glu475Tyr作為候選物，其對葡萄糖的反應(yīng)性降低，但幾乎不與麥芽糖反應(yīng)。
表8酶特征的評估



實施例7制備用于采用突變的GDHs測量血糖水平的比色傳感器采用472Asp+475His型突變GDH和472Glu+475Tyr型突變GDH制備用于測量血糖水平的比色傳感器。
制備具有圖9所示基本結(jié)構(gòu)的葡萄糖傳感器(1)。也就是說，前述葡萄糖傳感器具有如下構(gòu)造通明蓋(4)(材料PET)通過間隔區(qū)(3)層壓在透明的底板(2)上，通過元件(2)-(4)限定毛細管(5)。毛細管(5)的尺寸是1.3mm×9mm×50μm(圖9)。透明的底板(2)和透明蓋(4)是用厚度為250μm的PET制成，間隔區(qū)(3)是用黑色的雙面膠帶制成。
葡萄糖傳感器具有圖10所示的第一試劑部分(1)、第二試劑部分(2)和第三試劑部分(3)，每個部分的成分和涂布量示于表9。該表中，“Ru”代表六氨合釕復(fù)合物(Ru(NH3)6Cl3)，CHAPS代表3-[(3-膽胺基丙基)二甲基氨]丙磺酸，ACES代表N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸，MTT代表3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑。
表9第一試劑部分含有電子轉(zhuǎn)移物質(zhì)的試劑部分的材料溶液(溶劑是水)

第二試劑部分含有酶的試劑部分的材料溶液(溶劑是水)

第三試劑部分含有顯色劑的試劑部分的材料溶液(溶劑是水)

將測定樣品加入前述葡萄糖傳感器的毛細管，然后每0.1秒重復(fù)測量吸光度，以制備吸光度的時程。對于每次吸光度測量，沿著毛細管高度的方向用光照射第三試劑部分(3)，在照射后立即接收穿透葡萄糖傳感器的光。通過用發(fā)光二極管以630nm的光照射，獲得光照射。穿透的光用光電二極管接收。
用加入葡萄糖的血液作為測定樣品。將加入濃度為0，100，200和400mg/dl葡萄糖的血細胞比容調(diào)節(jié)為42％的血樣用于評估葡萄糖傳感器的線性。結(jié)果示于圖11(野生型)、12(472Glu475Tyr)和13(472Asp475His)。
此外，在血細胞比容調(diào)節(jié)為42％并且葡萄糖濃度調(diào)節(jié)為45mg/dl的血樣中進一步加入濃度為0，100，200和300mg/dl的麥芽糖，并且用于評估麥芽糖的影響。結(jié)果示于圖14(野生型)、15(472Glu475Tyr)和16(472Asp475His)。
當(dāng)在45mg/dl的葡萄糖樣品中加入麥芽糖時，對于野生型，吸光度以麥芽糖濃度依賴性方式增加，這表明與麥芽糖的強反應(yīng)。另一方面，對于采用突變的酶的傳感器，抑制了吸光度的麥芽糖濃度依賴性增加，表明麥芽糖的影響較小。通過將這些數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為表觀血糖升高值而獲得的結(jié)果示于圖17。在采用野生型酶的傳感器中，由于麥芽糖的污染，低血糖水平(45mg/dl葡萄糖)表面上顯示為正常值(122mg/dl葡萄糖)。另一方面，當(dāng)使用采用了修飾的GDHs的傳感器時，甚至當(dāng)樣品被最多達300mg/dl麥芽糖污染時，表觀血糖水平?jīng)]有升高到正常范圍。
從上述結(jié)果可以明確看出，在采用突變的GDHs的葡萄糖傳感器中，即使線性保持到與野生型相似的程度，對麥芽糖的反應(yīng)性仍然顯著降低。如果采用這些使用突變的GDHs的葡萄糖傳感器，對于在醫(yī)院等施用時上限(200mg/dl)的麥芽糖血液濃度或更高濃度時，不會將低血糖值(50mg/dl或更低)判斷為正常值或高血糖水平，因此可以進行安全的治療性處理。此外，由于上文所述，GDHs不與溶解氧反應(yīng)，通過提供采用這些突變的GDHs的傳感器，可以進行糖尿病患者的準確診斷和治療。
實施例8證實第472位的氨基酸取代和除475位外的位置的氨基酸取代的組合的作用在具有472Phe型取代的突變的GDH中，在鄰近第475位的位置(第477-第479位)和從遠離第475位的位置中隨機選擇的位置(第53-73位)中進一步導(dǎo)入苯丙氨酸的取代。
采用表達在第472位含有苯丙氨酸的取代的突變的GDH的pTrc99Aγαβ，按照與實施例2相同的方式導(dǎo)入突變。用于導(dǎo)入該突變的正向引物的序列示于表10和11。反向引物的序列與正向引物鏈完全互補。
表10

表11

結(jié)果示于表12和13。從這些結(jié)果可以明確看出，采用472Phe的氨基酸取代和除475位之外的其它位置的取代的組合，觀察到了活性喪失、沒有發(fā)生改變，或僅僅增加對麥芽糖的反應(yīng)性的作用，因此，證實在任意位置導(dǎo)入突變并不必然獲得改進作用。
表12 10mM10mM突變的位點 用于取代 葡萄糖 麥芽糖 麥芽糖/葡萄糖的氨基酸 U/mlU/ml反應(yīng)比值

表13 10mM10mM突變的位點 用于取代 葡萄糖 麥芽糖 麥芽糖/葡萄糖的氨基酸 U/mlU/ml反應(yīng)比值

工業(yè)實用性本發(fā)明的突變的GDH對葡萄糖具有改進的底物特異性，并且可以合適地用于采用葡萄糖傳感器等測量葡萄糖。
<110>Arkray，Inc.
<120>突變的葡萄糖脫氫酶<130>OPC5040<150>JP2004-128165<151>2004-04-23<160>59<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>5<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>1Glu His Lys Phe Asn<210>2<211>5<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>2Asp Lys Met Asp Phe1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>3Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu1 5<210>4<211>35<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌
<400>4Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile Met Gly Ala1 5 10 15Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr Phe Asp His20 25 30Pro Asn Leu35<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>5catgccatgg cacacaacga caacac26<210> 6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>6gtcgacgatc ttcttccagc cgaacatcac30<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>7cgcgccgaac gatcacatca cgggc 25<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物
<400>8gcccgtgatg tgatcgttcg gcgcg 25<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>9gaattcgcgc cgaacgaaca catcacgggctcg 33<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>10cgagcccgtg atgtgttcgttcggcgcgaa ttc 33<210>11<211>2467<212>DNA<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<220>
<221>CDS<222>(258)..(761)<220>
<221>CDS<222>(764)..(2380)<220>
<221>CDS<222>(2386)..(2466)<400>11aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240
gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc 290Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg1 5 10cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa338His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln15 20 25ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg385Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu30 35 40cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg434Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met45 50 55acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc482Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile60 65 70 75ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc530Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala80 85 90gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg578Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr95 100 105cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc626Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu110 115 120ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc674Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe125 130 135ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa722Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys140 145 150 155ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc 769Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln AlaMet Ala160 165170gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc817Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val175 180 185gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg865Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val190 195 200atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag913Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu205 210 215cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg961Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro220 225 230tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac 1009Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr235 240 245 250
ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg1057Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala255 260 265gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att1105Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile270 275 280ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg1153Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp285 290 295ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa1201Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu300 305 310gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg1249Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro315 320 325 330cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag1297Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu335 340 345cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc1345Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val350 355 360gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg393Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro365 370 375act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg1441Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala380 385 390atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg1489Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala395 400 405 410aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac1537Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp415 420 425aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat1585Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His430 435 440cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg1633Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr445 450 455ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc1681Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val460 465 470gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc1729Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly475 480 485 490acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc1777Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly495 500 505
ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc 1825Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg510 515 520gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc 1873Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile525 530 535gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc 1921Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro540 545 550gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag 1969Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Glu555 560 565 570ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg 2017Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val575 580 585ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag ate 2065Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile590 595 600acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc 2113Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg605 610 615gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg 2161Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val620 625 630ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc 2209Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile635 640 645 650atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg 2257Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr655 660 665ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc 2305Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr670 675 680gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg 2353Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg685 690 695atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Val Arg Lys Ser Thr Leu700 705 710act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg 2451Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala715 720 725gcc gat gcg gcc gat c 2467Ala Asp Ala Ala Asp730<210>12<211>168
<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>12Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala1 5 10 15Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu20 25 30Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp35 40 45Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser50 55 60Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu65 70 75 80Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Glu85 90 95Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser100 105 110Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn115 120 125Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp130 135 140Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Ash Lys Pro Gly Phe Trp Ala145 150 155 160Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala165<210>13<211>539<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>13Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser1 5 10 15Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys20 25 30Ala Va1 Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile35 40 45Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro50 55 60Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn65 70 75 80Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile85 90 95Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg100 105 110Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg
115 120 125Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala130 135 140Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr145 150 155 160Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe165 170 175Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe180 185 190His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly195 200 205Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile210 215 220Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala225 230 235 240Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly245 250 255Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala260 265 270Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ila275 280 285Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn290 295 300Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Mer Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His305 310 315 320Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly325 330 335Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro340 345 350Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser355 360 365Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met370 375 380Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr385 390 395 400Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg405 410 415Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro420 425 430Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His435 440 445Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp450 455 460Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser465 470 475 480Thr Ile Mer Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys485 490 495Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met
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<221>CDS<222>(121)..(1398)<400>15tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg 168Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag 216Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag 264Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg 312Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc 360Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac 408Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg 456
Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac 504Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag 552Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg 600Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc 648Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc 696Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac 744Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac 792Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp210 215 220ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg 840Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr225 230 235 240cag cag cag crc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc 888Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val245 250 255gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg 936Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser260 265 270aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg 984Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr275 280 285gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg 1032Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp290 295 300ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg 1080Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg 1128Set Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr325 330 335tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg 1176Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser340 345 350ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg 1224
Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val355 360 365cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc 1272Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile370 375 380ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg 1320Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg 1368Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca 1418Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425cggcgcaacc gataggacag gag 1441<210>16<211>425<212>PRT<213>洋蔥伯克霍爾德氏菌<400>16Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205
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<223>人工序列說明引物<400>35cgcgactccg tcgtctttaa ggactgccgc acg 33<210>36<211>35
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>36cgactccgtc gtcgactttg actgccgcac gttcg35<210>37<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>37ctccgtcgtc gacaagtttt gccgcacgtt cgacc35<210>38<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>38cgtcgtcgac aaggactttc gcacgttcga ccatc35<210>39<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>39gtcgtcgaca aggactgctt tacgttcgac catccgaac39<210>40<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>40ggaaatcgtc gagcgcttct ttaatcagcc cgacaagatg g41<210>41<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>41cgagcgcttccgctttcagc ccgacaagat g 31<210>42<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>42gtcgagcgct tccgcaattt tcccgacaag atggacttc 39<210>43<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>43gagcgcttcc gcaatcagtt tgacaagatg gacttcatgg c 41<210>44<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>44gcttccgcaa tcagccctt t aagatggact tcatggcgc 39
<210>45<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>45ccgcaatcag cccgacttta tggacttcat ggcgccg37<210>46<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>46gcaatcagcc cgacaagttt gacttcatgg cgccg 35<210>47<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>47caatcagccc gacaagatgt ttttcatggc gccgtaccc 39<210>48<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>48cgacaagatg gacttctttg cgccgtaccc gtc33<210>49<211>39<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>49cgacaagatg gacttcatgt ttccgtaccc gtcgagccc39<210>50<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>50caagatggac ttcatggcgt tttacccgtc gagcccctg39<210>51<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>51acttcatggc gccgtttccg tcgagcccc 29<210>52<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>52cttcatggcg ccgtactttt cgagcccctg ggc 33<210>53<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物
<400>53gcgccgtacccgtttagccc ctgggcg 27<210>54<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>54cgccgtaccc gtcgtttccc tgggcgccg 29<210>55<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>55ccgtacccgtcgagcttttg ggcgccgcat ccc 33<210>56<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>56ccgtcgagcc cctttgcgcc gcatccc27<210>57<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>57cgtcgagccc ctggtttccg catcccgagt acg 33
<210>58<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>58cgagcccctg ggcgtttcat cccgagtacg gcc33<210>59<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物<400>59ccctgggcgc cgtttcccga gtacggc 2權(quán)利要求
1.表現(xiàn)出對葡萄糖的改進的底物特異性的突變的葡萄糖脫氫酶，其是具有SEQ ID NO13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸殘基的SEQID NO13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白，并且其具有以下列出的任意氨基酸取代突變(數(shù)字代表氨基酸序列中的位置，氨基酸殘基代表在該位置取代后的氨基酸殘基，“+”表示同時包括兩種氨基酸取代)(A)472Arg，472Asn，472Asp，472Cys，472Glu，472Gly，472His，472Ile，472Leu，472Met，472Phe，472Pro，472Ser，472Trp，472Tyr，472Val，(B)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475His，475Met，475Phe，475Ser，475Tyr，475Val，(C)472Arg+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Asn+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Asp+475(His，Phe，Ser，Val)，472Cys+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，472Glu+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Gly+475(Asp，Cys，Gly，Met，Phe，Ser，Tyr)，472His+475(Cys，Glu，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Ile+475(Asp，Cys，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Leu+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Met+475(Asp，Gly，His，Phe，Ser)，472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Met，Phe，Ser，Tyr)，472Pro+475His472Ser+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)，472Trp+475(His，Phe，Ser)，472Tyr+475(Asp，His，Phe，Ser)，472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser)。
2.權(quán)利要求1的突變的葡萄糖脫氫酶，其具有SEQ ID NO13的氨基酸序列，前提是它包括前述(A)-(C)中列出的任意氨基酸取代突變。
3.權(quán)利要求1的突變的葡萄糖脫氫酶，其具有選自以下突變的氨基酸取代突變(D)472Arg，472Asn，472Asp，472Glu，472Gly，472Phe，472Pro，(E)475Asp，475Cys，475Glu，475Gly，475Met，475Phe(F)472Arg+475(Asp，Gly，His，Phe)，472Asn+475(Gly，His，Phe，Tyr)，472Asp+475(His，Ser)，472Cys+475(Gly，His，Phe)，472Glu+475(Glu，His，Phe，Tyr)，472Gly+475(Asp，Phe，Tyr)，472His+475(His，Ser)，472Ile+475(Asp，Glu，Gly，His，Ser)，472Leu+475(Gly，His，Phe，Tyr)，472Met+475(Asp，Gly，His，Phe)，472Phe+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe，Ser，Tyr)，472Ser+475(Glu，Gly，His，Phe)，472Trp+475(His，Phe)，472Tyr+475His，472Val+475(Asp，Glu，Gly，His，Phe)。
4.葡萄糖脫氫酶，其是具有SEQ ID NO13的氨基酸序列或包括在除以下列出的位置外的位置取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸殘基的SEQ ID NO13的氨基酸序列，并且具有葡萄糖脫氫酶活性的蛋白，并且其中(i)SEQ ID NO13的氨基酸序列中至少第472位的精氨酸殘基或第475位的天冬酰胺殘基被另一種氨基酸殘基取代，并且(ii)導(dǎo)入突變的葡萄糖脫氫酶對葡萄糖的比活性和對麥芽糖的比活性的比值((對麥芽糖的反應(yīng)性/對葡萄糖的反應(yīng)性)×100)與沒有導(dǎo)入突變的葡萄糖脫氫酶的該比值相比減少了10％或更多。
5.突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物，至少包含權(quán)利要求1-4的任一項的突變的葡萄糖脫氫酶和電子轉(zhuǎn)移亞基。
6.編碼權(quán)利要求1-4的任一項的突變的葡萄糖脫氫酶的DNA。
7.具有權(quán)利要求6的DNA并且產(chǎn)生權(quán)利要求1-4的任一項的突變的葡萄糖脫氫酶或權(quán)利要求5的突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物的微生物。
8.葡萄糖測定試劑盒，包含權(quán)利要求1-4的任一項的突變的葡萄糖脫氫酶、權(quán)利要求5的突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物或權(quán)利要求7的微生物。
9.葡萄糖傳感器，包含權(quán)利要求1-4的任一項的突變的葡萄糖脫氫酶、權(quán)利要求5的突變的葡萄糖脫氫酶復(fù)合物或權(quán)利要求7的微生物。
全文摘要
通過用其它氨基酸殘基取代具有SEQ ID NO13所示氨基酸序列的葡萄糖脫氫酶的第472位和第475位的氨基酸殘基，改進了該酶對葡萄糖的底物特異性。
文檔編號C12N1/21GK1973036SQ20058002053
公開日2007年5月30日 申請日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者山岡秀亮 申請人:愛科來株式會社