專利名稱：通過提高的分泌來生產(chǎn)多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)。具體地，本發(fā)明涉及SEC61多肽，其具 有針對(duì)酵母SEC61所描述的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性(&zcc/wram少ces基因組數(shù)據(jù)庫-SGD: http://www.yeastgenome.org/),涉及編碼這些多肽的核酸序列，以 及其在制備適合用于生產(chǎn)目標(biāo)多肽的宿主細(xì)胞中的用途。發(fā)明背景蛋白向培養(yǎng)基的分泌涉及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)過多個(gè)膜閉合的區(qū)室，這構(gòu)成了 分泌途徑。首先，蛋白被轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER內(nèi)腔。蛋白質(zhì)在膜囊中從那兒 轉(zhuǎn)運(yùn)到Golgi復(fù)合體，并從Golgi復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜。分泌過程涉及多個(gè) 步驟，其中，含有被分泌蛋白的囊從供體膜上被剪下來，定位到受體膜并 與之融合。在這些步驟中的每一個(gè)，需要若干種不同蛋白的功能。已經(jīng)進(jìn)行了若干嘗試，企圖提高有絲真菌中蛋白的分泌。用于提高異 源蛋白分泌的常用手段是使用信號(hào)序列(見，例如，EP 0215 594)。針對(duì) 被分泌蛋白的隨機(jī)誘變和篩選(Smith et al., 1985; Sakai et al.， 1988; Shuster et al.， 1989; Suzuki et al.， 1989; Sleep et al.， 1991 ; Lamsa and Bloebaum, 1990; Dunn-Coleman et al.， 1991和US 2002/0068325 Al)或外源蛋白與高效分泌 的內(nèi)源蛋白的融合(Ward et al.， 19卯；Harkki et al., 1989; Nyyssonen et al 1993; Nyyssonen et al.， 1992)己被廣泛用于酵母和有絲真菌，以使異源蛋 白的分泌更為高效。這兩種方法都有使用局限。通過隨機(jī)誘變和篩選分離 出的突變體基本都是排他性地隱性的(exclusively recessive)，因此不能 被轉(zhuǎn)入是多倍體的工業(yè)菌株。通常，獲得的突變體僅具有針對(duì)用于篩選的 蛋白的提高的分泌能力。融合蛋白手段需要在對(duì)每種異源或外源蛋白的融 合分別進(jìn)行融合構(gòu)建的設(shè)計(jì)。融合蛋白通常沒有功能，因此，需要通過蛋 白水解來釋放終產(chǎn)物，這使得生產(chǎn)過程復(fù)雜化。
由于它們作為蛋白生產(chǎn)者的工業(yè)重要性，人們?nèi)孕枰@得具有提高的 分泌能力的有絲真菌。


圖1:脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶表達(dá)載體pGBTOPEPO-l的質(zhì)粒圖 譜。標(biāo)注的是相對(duì)于gtoA啟動(dòng)子和脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶印o基因的 glaA側(cè)翼區(qū)域。可通過在轉(zhuǎn)入A 菌株之前用限制性酶///"Dili進(jìn)行 消化來去除五.co/z'DNA。圖2: PLA2表達(dá)載體pGBTOPPLA-2的質(zhì)粒圖譜。標(biāo)注的是相對(duì) g/aA啟動(dòng)子、截短的g/flA基因和pro少/fl2編碼序列的gfeA側(cè)翼區(qū)域?？?通過在轉(zhuǎn)入A Wger菌株之前用限制性酶M^I進(jìn)行消化來去除& co// DNA。圖3:表達(dá)載體pGBFIN-18的質(zhì)粒圖譜。標(biāo)注的是相對(duì)g/flA啟動(dòng)子 的g/flA側(cè)翼區(qū)域，所述啟動(dòng)子在葡糖淀粉酶啟動(dòng)子中具有獨(dú)特的S力I和 五coRI克隆位點(diǎn)，接著是尸flcl和Jscl克隆位點(diǎn)?？赏ㄟ^在轉(zhuǎn)入A Wgw菌 株之前用限制性酶MWI進(jìn)行消化來去除五.co// DNA。圖4:表達(dá)載體pGBFINSEC-l的質(zhì)粒圖譜。標(biāo)注的是相對(duì)g/aA啟動(dòng) 子、截短的g/flA基因和A w/ger基因組sec61基因的g/aA側(cè)翼區(qū)域。可通 過在轉(zhuǎn)入A菌株之前用限制性酶MWI進(jìn)行消化來去除co// DNA。圖5:表達(dá)載體pGBDEL-Sec6"的質(zhì)粒圖譜。標(biāo)注的是相對(duì)于函rfS 標(biāo)記的Sec6"突變體基因和3' Sec6F突變體基因片段?？赏ㄟ^在轉(zhuǎn)入A菌株之前用限制性酶Jscl和Wort進(jìn)行消化來去除五.co/Z DNA。圖6:表達(dá)載體pGBFINSEC-3的質(zhì)粒圖譜。標(biāo)注的是相對(duì)于 g/o^/7epC啟動(dòng)子和經(jīng)修飾的sec6"基因的g/aA側(cè)翼區(qū)域?？赏ㄟ^在轉(zhuǎn)入 A w/gw菌株之前用限制性酶iVofl進(jìn)行消化來去除co/i' DNA。圖7: sec61基因置換的圖示。包含有側(cè)翼于sec61基因同源區(qū)域的 flm必選擇標(biāo)記的pGBDEL-Sec6"線性DNA構(gòu)建體(1)通過在基因組 wc61基因座進(jìn)行雙同源重組(X)來進(jìn)行整合(2)，并由經(jīng)修飾的 wc6"基因置換基因組wc61基因拷貝(3)。隨后，在(經(jīng)修飾的)mc6"序列(U)的正向重復(fù)上發(fā)生的重組除去fl/m/S標(biāo)記，導(dǎo)致了經(jīng)修飾 的jec6P基因?qū)ec61基因的基因置換事件(4)。具有(3)和沒有(4) amdS標(biāo)記的兩種菌株都有功能性的經(jīng)修飾的wc6"基因。圖8:用多種sec61構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的EPO 1菌株的相對(duì)細(xì)胞外脯氨酸特 異性內(nèi)切蛋白酶活性。在發(fā)酵的數(shù)天過程中取樣。EPO 1在第3天的表達(dá) 被設(shè)為100%。圖9:用多種sec61構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的PLA 1菌株的細(xì)胞外PLA2活性。 在發(fā)酵的數(shù)天過程中取樣。圖10:用多種sec61構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的PLA 1菌株的細(xì)胞外葡糖淀粉酶活 性。菌株和樣品與圖ll中的相同。在發(fā)酵的數(shù)天過程中取樣。發(fā)明詳述本文中引用的所有專利和公開文本，包括此類專利和公開文本中公開 的所有序列和方法，都明確通過引用并入本文。這些專利和公開文本包 括EP 357 127、 EP 635 574、 WO 97/06261、 WO 98/46772。顯示SEC61活性的多肽本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及新穎的SEC61多肽。SEC61多肽是通常己知 用于調(diào)控多肽經(jīng)過ER膜的轉(zhuǎn)運(yùn)的。根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽被定義為 顯示已知與SEC61多肽相關(guān)的至少一種活性的多肽。根據(jù)本發(fā)明的SEC61 多肽還可顯示已知與SEC61多肽相關(guān)的全部活性。特別地，本發(fā)明公開了選自由下述多肽構(gòu)成的組的SEC61多肽(a) 具有根據(jù)SEQIDNO: 3的氨基酸序列的多肽，和(b) 具有與根據(jù)SEQIDNO: 3的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序 列的多肽。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"實(shí)質(zhì)上同源"用于包括顯示出SEC61 多肽的至少一種活性，且與SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列具有至少 89%，優(yōu)選至少90%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少92%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少93%， 進(jìn)一步更優(yōu)選至少94%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少95%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少96%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少97%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%以及最優(yōu)選至少 99%的相同程度的多肽。優(yōu)選地，該相同程度在SEQ ID NO: 3的全長(zhǎng)上° 就本發(fā)明的目的而言，兩條氨基酸序列之間的相同程度指兩條序列間 相同氨基酸的百分比。相同程度是用BLAST算法測(cè)定的，其被描述于 Altschul， et al.， J. Mol. Biol. 215: 403-410 (19卯)中。用于進(jìn)行BLAST分析 的軟件是公眾可通過the National Center for Biotechnology Information (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得的。BLAST算法參數(shù)W、 T和X確定了 比對(duì)的靈敏度和速度。BLAST程序的缺省設(shè)置是字長(zhǎng)(W)為11，使 用BLOSUM62計(jì)分矩陣(見Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)),對(duì)齊(B)為50，期望(E)為10， M=5， N=-4 以及對(duì)兩條鏈進(jìn)行比較。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽具有根據(jù)SEQ ID NO: 3的 氨基酸序列。在另一種實(shí)施方式中，與根據(jù)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列實(shí)質(zhì)上同 源的多肽的氨基酸序列，可由于天然或人工變異(誘變)從而與SEQ ID NO: 3的氨基酸序列有所不同。具有與根據(jù)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列 實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列的多肽較之SEQ ID NO: 3的序列可以含有至少 一處修飾。所述修飾可以是氨基酸取代、添加或缺失。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽具有與SEQ ID NO: 3所示 的氨基酸序列有五個(gè)氨基酸不同，優(yōu)選四個(gè)氨基酸不同，更優(yōu)選三個(gè)氨基 酸不同，進(jìn)一步更優(yōu)選兩個(gè)氨基酸不同，最優(yōu)選一個(gè)氨基酸不同的氨基酸 序列，但仍具有與具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的多肽相同的 SEC61活性。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有與根據(jù)SEQ ID NO: 3的氨基酸序 列實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列的多肽具有根據(jù)SEQ ID NO: 9的氨基酸序 列。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了一種SEC61多肽，其具 有與根據(jù)SEQIDNO: 3的氨基酸序列至少85°/。，優(yōu)選至少87%,更優(yōu)選
至少89%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少卯％,進(jìn)一步更優(yōu)選至少92%，進(jìn)一步更優(yōu) 選至少93%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少94%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少95%,進(jìn)一步更 優(yōu)選至少96%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少97%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%以及最優(yōu) 選至少99%的相同程度，其中，在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 3第373至379位 的保守基元(motif)中至少一個(gè)氨基酸被修飾，所述保守基元即對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO: 3第373至379位存在的氨基酸序列ALFSKTW。優(yōu)選地， 在保守基元中被修飾的至少一個(gè)氨基酸在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的第376 位的位置。更優(yōu)選地，在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 3的第376位的位置上的氨 基酸被色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或組氨酸所取代。最優(yōu)選地，在對(duì)應(yīng)于 SEQ ID NO: 3的第376位的位置上的絲氨酸被色氨酸所取代。此類經(jīng)修 飾的SEC61多肽的一個(gè)例子是具有根據(jù)SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的多 肽。保守基元中的其它變異可以是在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的第374位的 位置上存在亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸，和/或在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的第377位的位置上存在賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸或精氨酸， 和/或在對(duì)應(yīng)于犯Q ID NO: 3的第378位的位置上存在蘇氨酸或亮氨酸。經(jīng)過分離的、編碼SEC61多肽的有絲真菌核酸序列 本發(fā)明的第二方面涉及一種經(jīng)過分離的多核苷酸，其包含編碼第一個(gè) 方面的SEC61多肽的核酸序列。特別地，編碼SEC61多肽的多核苷酸或核酸序列選自下述物質(zhì)構(gòu)成的組(a) 根據(jù)SEQ ID NO: 1的多核苷酸，(b) 根據(jù)SEQ ID NO: 2的核酸序列，(c) 與SEQ ID NO: 2的核酸序列具有至少90%相同程度的核酸序 列，以及(d) 編碼下述多肽的核酸，所述多肽具有與SEQIDNO: 3的氨基酸 序列實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，特征(c)的核酸序列具有與SEQ ID
NO: 2所示的核酸序列至少91%,更優(yōu)選至少92%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少 93%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少94%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少95%，進(jìn)一步更優(yōu)選至 少96%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少97%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%，最優(yōu)選至少 99%的相同程度。就本發(fā)明的目的而言，兩條核酸序列間的相同程度是通過Clustal方法 (Higgins， 1989， CABIOS 5: 151- 153)，采用相同性表，缺口懲罰為10， 以及缺口長(zhǎng)度懲罰為io來測(cè)定的。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，經(jīng)過分離的核酸序列編碼下述多肽，所 述多肽具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列或其具有SEC61活性的片段。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，經(jīng)過分離的核酸序列編碼下述多肽，所 述多肽具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列或其具有SEC61活性的片段。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼SEC61多肽的核酸序列具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8所示的核酸序列。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，經(jīng)過分離的核酸序列編碼具有下述氨基 酸序列的SEC61多肽，所述氨基酸序列具有與根據(jù)SEQ ID NO: 3的氨基 酸序列至少85%的相同程度，其中，在對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 3的第373至 379位的保守基元中至少一個(gè)氨基酸被修飾，所述保守基元即對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3第373至379位存在的氨基酸序列ALFSKTW。例如，經(jīng)過分離 的核酸序列編碼具有根據(jù)SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的多肽，優(yōu)選是 SEQ ID NO: 5的核酸序列。本文中使用的術(shù)語"經(jīng)過分離的多核苷酸或核酸序列"指，基本上沒 有其它核酸序列的多核苷酸或核酸序列，例如，通過瓊脂糖電泳測(cè)定為至 少大約20%純，優(yōu)選至少大約40%純，更優(yōu)選至少大約60%純，進(jìn)一步更 優(yōu)選至少大約80%，最優(yōu)選至少大約90%純。例如，可以通過在遺傳工程 中用于將核酸序列從其天然位置易位到其將被復(fù)制的不同位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)克隆 方案，來獲得經(jīng)過分離的核酸序列。多核苷酸或核酸序列可以是基因組的、cDNA、 RNA、半合成、合成 來源的或它們的任意組合。編碼SEC61多肽并具有與根據(jù)SEQ ID NO: 3的蛋白實(shí)質(zhì)上同源的氨 基酸序列的經(jīng)過分離的核酸分子，較之根據(jù)SEQ ID NO: 2的編碼核苷酸 序列，可以含有一處或多處核苷酸修飾，B卩，取代，添加或缺失，使得在 編碼的蛋白中存在一處或多處氨基酸修飾，即，取代，添加或缺失。此類 修飾可以是由于天然變異導(dǎo)致的，或者可由標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變 或PCR介導(dǎo)的誘變引入。還可能向sec61編碼序列引入下述核苷酸取代，所述取代在該核酸序 列編碼的多肽中不會(huì)產(chǎn)生不同的氨基酸殘基。這可例如有利于產(chǎn)生下述核 酸序列，其中，密碼子使用對(duì)應(yīng)于想要用來表達(dá)SEC61蛋白的宿主生物的 密碼子使用。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見地，可能導(dǎo)致編碼蛋白氨基酸序列中 的變化的DNA序列多態(tài)性在給定種群中可能天然存在。此類遺傳多態(tài)性 可存在于來自不同種群的細(xì)胞中，或由于天然等位基因變異存在于同--種 群中。根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽和編碼核酸序列可從任何真核細(xì)胞獲得，優(yōu) 選從真菌，更優(yōu)選從有絲真菌獲得。"有絲真菌"包括亞門Eumycota和Oomycota的所有有絲形式(如前 述Hawksworth etal.， 1995所定義的)。有絲真菌菌株包括但不限于 y4cre加o/H'M祝、Jj/^z-gH/iAS 、 JMreo6awVftt/;n 、 Oy/^ococo/s 、 i^/沾ajzY/z'w附、 Fwjan'M/w 、 //i//m'co/a 、 Afagwa/ oWAe 、 Afwco;- 、 Afyce/io/ A^o/-a 、5^&&0/ 6>7/" 1 、 ra/aramyces 、 7Tiey7WoascMJ 、 7%/e/av/a、 7b(ypoc/arfz'"附禾卩 7Wc/iorfermfl的菌株o在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的具有SEC61活性的多肽的 核酸序列是從^spergz7/M的菌株獲得的，例如，A awa/non'或A mV/"/a朋。優(yōu)選地，核酸序列從A "&w或A 0^加e的菌株獲得。進(jìn)一歩更 優(yōu)選地，核酸序列從A Wger的菌株的分離系(isolate)獲得，例如，SEQ ID NO: l或SEQ ID NO: 2所示的核酸序列。在另一種實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的具有SEC61活性的多肽的核酸序 列是從Fiaww7'w附的菌株，例如F. 0jg;s/70rM附或F vewe"fl似m，或從
尸e/M'cz7/zi/m的菌株，例如尸.cA^ ogem w獲得的，例如，SEQIDNO: 7或 SEQBDNO: 8所示的核酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)上述物種而言，本發(fā)明包括完美的和不完美的狀態(tài)，以 及其它分類學(xué)等同物，例如，無性型，而不管它們是作為什么名字被知道 的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易地識(shí)別合適的等同物的身分。例如，多肽可 從Raper， K. D. and Fennel, D. 1.(1965. The Genus Aspergillus, The Wilkins Company, Baltimore MD)所定義的^spe^7/^的分類學(xué)等同微生物獲得， 而不管它們是作為什么名字被知道的。此外，可例如使用基于根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的探針，從并非有絲真 菌的其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物 來鑒定和獲得具有SEC61活性的多肽。用于從天然棲息地分離微生物的技 術(shù)是本領(lǐng)域公知的。編碼本發(fā)明SEC61多肽的DNA序列可由雜交獲得。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明 sec61 DNA的變體(例如，天然等位基因變體)和同源物的核酸分子可基 于它們與本文公開的核酸的同源性，使用這些核酸或其合適的片段作為雜 交探針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下被分離出來。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)謹(jǐn)度"可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定。關(guān)于雜 交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)度的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley lnterscience Publishers, (1995)。核酸序列可通過，例如，對(duì)目標(biāo)微生物的基因組或cDNA文庫進(jìn)行篩 選來分離。 一旦用，例如，從SEQIDNO: 2獲得的探針探測(cè)到了編碼具 有SEC61活性的多肽的核酸序列，即可利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技 術(shù)對(duì)該序列進(jìn)行分離和克隆(見，例如，J. Sambrook， E. F. Fritsch， and T. Maniatis, 1989， Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York)。從此類基因組DNA對(duì)本發(fā)明的核酸序列的克隆還可通過，例如，使 用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或?qū)Ρ磉_(dá)文庫進(jìn)行抗體篩選以探測(cè)具有共 有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段的方法來進(jìn)行(見，例如，Innis etal.， 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York.)。本文提供的序列信息不應(yīng)被狹義理解為需要包括進(jìn)錯(cuò)誤鑒定的堿基。本文公開的特定序列可容易地用于從有絲真菌，特別是A /i/gw分離出完 整基因，進(jìn)而可容易地對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步序列分析，由此鑒定出測(cè)序錯(cuò)誤。除非另有指明，本文中所有通過對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序測(cè)定出的核苷 酸序列都是用自動(dòng)DNA測(cè)序儀來測(cè)定的，由本文所測(cè)定的DNA分子編碼 的多肽的所有氨基酸序列都是通過對(duì)按照上文所述測(cè)定的DNA序列進(jìn)行 翻譯來預(yù)測(cè)的。因此，如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的那樣，對(duì)通過該自動(dòng)手段測(cè)定 的任何DNA序列而言，本文中測(cè)定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò) 誤。典型地，通過自動(dòng)操作測(cè)定的核苷酸序列與被用來測(cè)序的DNA分子 的實(shí)際核苷酸序列至少約卯％相同，更典型地，至少約95%到至少約 99.9%相同?？赏ㄟ^其它手段更精確地測(cè)定所述的實(shí)際序列，所述手段包 括本領(lǐng)域中公知的手工DNA測(cè)序方法。如本領(lǐng)域中還已知的那樣，測(cè)定 出的核苷酸序列較之實(shí)際序列的一個(gè)插入或缺失，會(huì)導(dǎo)致由測(cè)定出的核苷 酸序列編碼的預(yù)測(cè)氨基酸序列從此類插入或缺失點(diǎn)開始，就將完全不同于 被用于測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠鑒別出此類被錯(cuò)誤鑒別的堿基，而且知道如 何改正此類錯(cuò)誤。核酸構(gòu)建體本發(fā)明的另一方面涉及核酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼根據(jù)本發(fā)明 的SEC61多肽的核酸序列，所述核酸序列與一種或多種控制序列可操作地 相連，所述控制序列指導(dǎo)具有SEC61活性的多肽在合適的表達(dá)宿主中的表 達(dá)。表達(dá)將被理解為包括在多肽生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，其可以包括轉(zhuǎn) 錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、分泌。"核酸構(gòu)建體"在本文中被定義為一種核酸分子，其是單鏈或雙鏈 的，其是從天然存在的基因分離出的，或者已被修飾為含有下述核酸片 斷，所述片斷以自然界不存在的手段的組合及并置(juxtapose)的。當(dāng)核 酸構(gòu)建體含有在特定宿主生物中表達(dá)編碼序列所需的所有控制序列時(shí)，術(shù)語"核酸構(gòu)建體"與術(shù)語表達(dá)載體或表達(dá)盒同義。術(shù)語"控制序列"在本文中被定義為包括多肽表達(dá)所需或?qū)ζ溆欣?所有組分。每種控制序列對(duì)于編碼多肽的核酸序列來說可以是天然的或外 源的。此類控制序列可以包括但不限于，啟動(dòng)子、引導(dǎo)序列、優(yōu)化翻譯起始序列(如Kozak， 1991, J.Biol.Chem. 266:19867-19870所述的)、分泌信 號(hào)序列、前肽序列、聚腺苷化序列、轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟 動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。術(shù)語"可操作地相連"在本文中被定義為下述構(gòu)造，其中，控制序列 被合適地放置于相對(duì)DNA序列的編碼序列的位置，使得該控制序列能指 導(dǎo)多肽的生產(chǎn)。控制序列可以是含有轉(zhuǎn)錄控制序列的合適的啟動(dòng)子序列。啟動(dòng)子可以是在細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的任何核酸序列，包括，突變體、截短的和雜交體啟動(dòng)子，其可從編碼細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。啟動(dòng)子可以是與所述細(xì)胞或多肽同源或異源的。用于有絲真菌細(xì)胞的優(yōu)選啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，其可以是，例如，6-磷酸葡糖脫氫酶s^/A啟動(dòng)子，蛋白酶啟動(dòng)子例如，/7印A、 / 印B、 p印C，葡糖淀粉酶g/flA啟動(dòng)子，淀粉酶flmyA、 a/nyB啟動(dòng)子，過氧化氫 酶cWR或cWA啟動(dòng)子，葡糖氧化酶gOJtC啟動(dòng)子，beta-半乳糖苷酶/acA 啟動(dòng)子，alpha-葡糖苷酶flg/A啟動(dòng)子，翻譯延伸因子te/A啟動(dòng)子，木聚糖 酶啟動(dòng)子，例如，x/"A、 jc/wB、 jc/"C、 jc/"D，纖維素酶啟動(dòng)子，例如， eg/A、 eg氾、cMA，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的啟動(dòng)子，例如weA、 c"A、 jc/wR、 p"cC、 pWT等，或可從NCBI網(wǎng)站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/) 等找到的任何其它啟動(dòng)子。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可從高度表達(dá)的基因(本文中定義 為mRNA濃度占到總細(xì)胞mRNA的至少0.5% (w/w))獲得。在另一種 優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可從中度表達(dá)的基因(本文中定義為mRNA濃 度占到總細(xì)胞mRNA的至少0.01Q/n至0.5n/n (w/w))獲得。在另一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可從低度表達(dá)的基因(本文中定義為mRNA濃度低 于總細(xì)胞mRNA的0.01% (w/w))獲得。 控制序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，這是被有絲真菌細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列3'末端可操作地相 連。在細(xì)胞中起作用的任何終止子都可用于本發(fā)明。用于有絲真菌細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從編碼A ow加eTAKA淀粉酶、A n&e/"葡糖淀粉酶、A "z'血/fl朋氨基苯甲酸鹽/酯合酶、A "Zger alpha葡糖苷 酶、trpC基因和FM5a"'wm ojo^pomm類胰蛋白酶(trypsin)的蛋白酶的基 因獲得的?？刂菩蛄羞€可以是合適的引導(dǎo)序列，這是對(duì)有絲真菌細(xì)胞的翻譯來說 重要的mRNA非翻譯區(qū)域。引導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列5'末端可操 作地相連。在細(xì)胞中起作用的任何引導(dǎo)序列都可用于本發(fā)明。用于有絲真菌細(xì)胞的優(yōu)選引導(dǎo)序列是從編碼A 0/7zae TAKA淀粉酶、A wzW"/a朋磷酸丙糖異構(gòu)酶和A w&er glaA的基因獲得的?？刂菩蛄羞€可以是聚腺苷化序列，這是與核酸序列3'末端可操作地相 連的，被有絲真菌細(xì)胞識(shí)別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA加上聚腺苷殘基的信號(hào)的序 列。在細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷化序列都可用于本發(fā)明。用于有絲真菌細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷化序列是從編碼A o^yzae TAKA淀粉 酶、A w&er葡糖淀粉酶、A /w'甴/fl/w氨基苯甲酸鹽/酯合酶、 ojo^orum類胰蛋白酶的蛋白酶和A w扭r alpha葡糖苷酶的基因獲得的。對(duì)于待分泌的多肽而言，控制序列還可以是信號(hào)肽編碼區(qū)域，其編碼 與多肽氨基末端相連的氨基酸序列，可指導(dǎo)被編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途 徑。核酸序列的編碼序列的5'末端可天然地(inherently)含有在翻譯讀碼 框中與編碼區(qū)域中編碼分泌多肽的片斷天然相連的信號(hào)肽編碼區(qū)域?；?者，編碼序列的的5'末端可以含有對(duì)編碼序列來說外源的信號(hào)肽編碼序 列。當(dāng)編碼序列正常情況下不含信號(hào)肽編碼區(qū)域時(shí)，外源信號(hào)肽編碼序列 可能是必需的?；蛘?，外源信號(hào)肽編碼區(qū)域可以簡(jiǎn)單置換天然信號(hào)肽編碼 區(qū)域，以獲得增強(qiáng)的多肽分泌。核酸構(gòu)建體可以是表達(dá)載體。表達(dá)載體可以是可方便地用于重組 DNA過程，并可導(dǎo)致編碼多肽的核酸序列表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；?病毒)。典型地，對(duì)載體的選擇取決于載體與載體將被引入的細(xì)胞的相容
性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外的個(gè)體(entity)存在、 其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如，質(zhì)粒，染色體外元件、微型染 色體或人工染色體。用于有絲真菌的自主保持克隆載體可包含AMA1序列 (見，例如，Aleksenko and Clutterbuck (1997), Fungal Genet. Biol. 21: 373-397)?；蛘?，載體可以是下述這樣的當(dāng)引入細(xì)胞時(shí)，其整合進(jìn)基因組，與 其被整合進(jìn)去的染色體一起復(fù)制。整合型克隆載體可以在宿主細(xì)胞的染色 體中隨機(jī)整合或在預(yù)定的目標(biāo)基因座整合。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方 式中，整合型克隆載體包含與宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定目標(biāo)基因座中的 DNA序列同源的DNA片段，用于將克隆載體的整合靶向到該預(yù)定的基因 座。為促進(jìn)靶向整合，克隆載體優(yōu)選在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞前被線性化。線性化 優(yōu)選被進(jìn)行為使得克隆載體的至少一端但優(yōu)選任意一端側(cè)翼有與目標(biāo)基 因座同源的序列。目標(biāo)基因座側(cè)翼的同源序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少0.1 kb， 進(jìn)一步優(yōu)選為至少0.2 kb，更優(yōu)選為至少0.5 kb,進(jìn)一步更優(yōu)選為至少1 kb，最優(yōu)選為至少2kb。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，包含編碼根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽的基因 的表達(dá)載體整合的目標(biāo)基因座是sec61基因座。載體系統(tǒng)可以是單種載體或質(zhì)粒，或兩種載體或質(zhì)粒，它們一起含有 將被引入到宿主細(xì)胞基因組中的全部DNA，或轉(zhuǎn)座子。載體優(yōu)選含有一種或多種選擇標(biāo)記，其允許對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞容易地加以 選擇。選擇標(biāo)記是下述基因，其產(chǎn)物提供對(duì)生物殺滅劑或病毒的抗性、重 金屬抗性、針對(duì)營養(yǎng)缺陷型的原營養(yǎng)型等。用于有絲真菌細(xì)胞的選擇標(biāo)記 可以選自下述組，所述組包括但不限于，amdS (乙酰胺酶)、argB (鳥氨 酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar (草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB (潮霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶)、niaD (硝酸還原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)、sC (硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶)和trpC (氨基苯甲酸合酶)，以及來自其它物種的等 同物。優(yōu)選用于^s/ ergz7/M5細(xì)胞中的是A m'c w/a朋或A 0/7加e的pyrG和 amdS ( EP 635574B1 、 WO 97/06261 )基因，以及5^e/ to附;/ces/iiygrasco/w'cttf的bar基因。更優(yōu)選地，使用amdS基因，進(jìn)一步更優(yōu)選 地，使用來自A mV/"/aw或A 的amdS基因。最優(yōu)選的選擇標(biāo)記基 因是與j. m'血/fl/w g w/A啟動(dòng)子融合的A w'血/朋j o; k/S編碼序列(見ep 635 574)。來自其它有絲真菌的amdS基因也可使用(WO97/06261)。宿主細(xì)胞在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了適合用于生產(chǎn)目標(biāo)多肽的宿主細(xì)胞，所 述宿主細(xì)胞過量表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的具有SEC61活性的多肽。所述宿主細(xì)胞 包含編碼根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體。令人驚奇地，我們發(fā)現(xiàn)，其中，根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽(特別是按 上文所述在保守基元中有修飾的突變體SEC61多肽)過量表達(dá)的真菌細(xì) 胞，特別是有絲真菌細(xì)胞，較之不過量表達(dá)此類SEC61多肽的真菌細(xì)胞， 具有提高的蛋白分泌能力。尤其地，異源蛋白的分泌被提高?？蛇x地，在 過量表達(dá)較之內(nèi)源SEC61多肽有修飾的SEC61多肽的細(xì)胞中，內(nèi)源sec61 基因可被失活。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，過量表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽的宿主 細(xì)胞表達(dá)的根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽的量比內(nèi)源表達(dá)的SEC61多肽的量 高至少50%，優(yōu)選高至少100%，更優(yōu)選高至少200%，最優(yōu)選高至少 400%。內(nèi)源表達(dá)的SEC61多肽的量是親本宿主細(xì)胞所表達(dá)的SEC61多肽 的量，過量表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽的宿主細(xì)胞是從所述親本宿主細(xì) 胞獲得的?？赏ㄟ^技術(shù)人員已知的任何方法來測(cè)量表達(dá)的SEC61多肽的 量，例如，通過定量SDS-PAGE， 二維蛋白電泳或Western雜交印跡來測(cè)本發(fā)明包括關(guān)于能過量表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的SEC61多肽的宿主細(xì)胞的多 種實(shí)施方式。在一種實(shí)施方式中，提供了過量表達(dá)天然SEC61多肽的宿主細(xì)胞，其 中，天然SEc61多肽是與所述宿主天然產(chǎn)生的SEC61多肽相同的多肽。在另一種實(shí)施方式中，提供了一種宿主細(xì)胞，其表達(dá)所述宿主天然不 產(chǎn)生的SEC61多肽?？蛇x地，此類宿主細(xì)胞不表達(dá)天然SEC61多肽。不 表達(dá)天然SEC61多肽可通過，例如，失活內(nèi)源sec61基因來完成。優(yōu)選 地，對(duì)內(nèi)源sec61基因的失活可通過基因置換來完成，例如，EP 0 357 127 中所述的。更優(yōu)選地，所述基因置換包含由下述核酸構(gòu)建體(表達(dá)載 體)來置換內(nèi)源sec61基因，所述構(gòu)建體包含編碼根據(jù)本發(fā)明的SEC61多 肽的核酸序列。在本發(fā)明的方法中，對(duì)宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上將取決于編碼目 標(biāo)多肽的核酸序列的來源。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更優(yōu)選地，是 真菌，最優(yōu)選地，是有絲真菌。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，有絲真菌宿主 細(xì)胞是下述物種的細(xì)胞，所述物種是提到的從中可獲得根據(jù)本發(fā)明的 SEC61多肽的物種。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，有絲真菌宿主細(xì)胞過量表達(dá)具有編碼具有 下述氨基酸序列的多肽的核酸序列的基因，所述氨基酸序列與SEQID NO: 3的氨基酸序列有至少89%的相同性，優(yōu)選地，具有SEQIDNO: 3 或SEQIDNO: 6或SEQIDNO: 9的氨基酸序列的多肽。獲得的宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)目標(biāo)多肽。因此，在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞額外含有下述多核苷酸 的至少一個(gè)拷貝，所述多核苷酸包含編碼目標(biāo)多肽的核酸序列。所述核酸 序列可被克隆進(jìn)前文所述的用于表達(dá)sec61基因的表達(dá)載體。應(yīng)當(dāng)理解， 本發(fā)明的方法不被限制為用于獲得生產(chǎn)目標(biāo)多肽的有絲真菌細(xì)胞的特定 順序。sec61基因的引入，可選地，與對(duì)內(nèi)源sec61基因的修飾組合，可在 構(gòu)建用于生產(chǎn)目標(biāo)多肽的細(xì)胞的過程中的任何步驟進(jìn)行。^她本發(fā)明的另一方面涉及一種方法，用于在前述方面的宿主細(xì)胞中(優(yōu)選地，有絲真菌宿主細(xì)胞中)生產(chǎn)目標(biāo)多肽，所述方法包括(a) 在適合用于生產(chǎn)目標(biāo)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)前述方面的宿主細(xì)胞，(b) 從營養(yǎng)培養(yǎng)物中回收目標(biāo)多肽。 本發(fā)明的宿主細(xì)胞被培養(yǎng)于適合用于用本領(lǐng)域已知的方法來生產(chǎn)B1
標(biāo)多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。例如，可通過在允許目標(biāo)多肽表達(dá)和/或分離的條 件下，在合適的培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī) ?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。 培養(yǎng)發(fā)生于至少包含碳和氮源以及無機(jī)鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng) 域已知的方案來進(jìn)行培養(yǎng)。可通過本領(lǐng)域已知的方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收 目標(biāo)多肽。如果多肽被分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以直接從培養(yǎng)基中回收多 肽。如果多肽不分泌，可以從細(xì)胞裂解物中對(duì)其進(jìn)行回收。如果需要的 話，回收可以包含通過傳統(tǒng)手段進(jìn)行的進(jìn)一步的分離和純化。例如，可以通過傳統(tǒng)方案來分離多肽，其包括但不限于，離心、過 濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可用本領(lǐng)域巳知的多種方案對(duì)經(jīng) 過分離的多肽加以進(jìn)一步純化，其包括但不限于，色譜(例如，離子交 換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排阻)、電泳過程(例如，制備性等電聚焦)、差異溶解(例如，硫酸銨沉淀)、或萃取(見，例如Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)。方便地，目標(biāo)多肽可與合適的(固體或液體)載體或稀釋劑(包括緩 沖液)組合，以產(chǎn)生多肽組合物。多肽可附著到載體上或與其混合，例 如，固定到固體載體上?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知特定用于多肽的方法來探測(cè)目標(biāo)多肽。這些探測(cè)方 法包括使用特異性抗體、酶產(chǎn)物的形成、酶底物的消失或SDS PAGE。 例如，酶試驗(yàn)可被用于測(cè)定多肽活性。對(duì)很多酶而言，用于測(cè)定酶活性的 方案是本領(lǐng)域已知的。在本發(fā)明的方法中，在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，宿主細(xì)胞(優(yōu)選地，有絲 真菌宿主細(xì)胞)較之未按照本發(fā)明針對(duì)SEC61的表達(dá)加以修飾的其相應(yīng)副 本(counterpart)細(xì)胞，產(chǎn)生高至少大約20%,優(yōu)選高至少大約50%，更 優(yōu)選高至少大約100%,進(jìn)一步更優(yōu)選高至少大約200%，以及最優(yōu)選高至 少大約300%的目標(biāo)多肽。目標(biāo)多肽可以是對(duì)宿主細(xì)胞來說同源(天然)或異源的多肽。術(shù)語 "多肽"在本文中并不表示特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因此其包括肽、寡肽和異源多肽可以包含宿主細(xì)胞天然不產(chǎn)生的多肽。目標(biāo)多肽還可以包含 下述多肽，其對(duì)宿主細(xì)胞來說是天然的且其被下述核酸序列所編碼，所述 核酸序列的表達(dá)受對(duì)于編碼所述多肽的核酸序列來說是外源的一種或多種 控制序列所控制。還可能在下述菌株中獲得本發(fā)明SEC61多肽的過量表達(dá)，所述菌株未 被遺傳修飾為能產(chǎn)生目標(biāo)多肽，但是天然能產(chǎn)生此類多肽。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是抗體或其一部分、抗原、凝血 因子、酶、激素或激素變體、受體或其一部分、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào) 道蛋白(reporter)或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是酶，最優(yōu)選地，酶是氧化還 原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。在一種進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧 肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、葡 聚糖酶、酯酶、alpha-半乳糖苷酶、beta-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、淀粉 酶、alpha-葡糖苷酶、beta-葡糖苷酶、卣代過氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、 脂肪酶、磷脂酶、甘露糖苷酶、突變酶(mutanase)、氧化酶、果膠酶、 過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、肽酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨 酰胺酶或木聚糖酶。在另一種進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方式中，多肽是人胰島素或其類似物、 人生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素或促胰島素生成素(insulinotropin)。編碼目標(biāo)多肽的核酸序列可從任何原核、真核或其它來源獲得。就本 發(fā)明的目的而言，本文中與給定來源聯(lián)系使用的"從……獲得"將表示， 多肽是由該來源產(chǎn)生的，或由其中插入了來自該來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生 的。下述實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但它們不應(yīng)被理解為限制 本發(fā)明的范圍。實(shí)施例 實(shí)驗(yàn)信息菌株WT1:該A 菌株被用作為野生型菌株。該菌株被保藏于CBSInstitute,保藏號(hào)為CBS 513.88。WT2:該A 菌株是包含編碼葡糖淀粉酶的基因(g/flA)缺失的 WT1菌株。WT2是通過使用EP 0 635 574所述的"MARKER-GENE FREE"方法構(gòu)建的，在該專利中描述了如何在CBS 513.88基因組中缺失 g/aA特定DNA序列的方法。該方法產(chǎn)生了不含標(biāo)記基因的Ag/aA重組A w/gwCBS513.88菌株，該菌株不具有任何外源DNA序列。WT3:該A wfger菌株是包含編碼主要(major)細(xì)胞外天冬氨酸蛋白 酶PepA的基因的缺失的WT2菌株。WT3是通過使用EP 0 635 574所述的 "MARKER-GENE FREE"方法構(gòu)建的。該專利中所述的方法被用于缺失 CBS 513.88基因組中的/ 印A特定DNA序列，這是按照van den Hombergh et al. (van den Hombergh JP， Sollewijn Gelpke MD， van de Vondervoort PJ, Buxton FP, Visser J. (1997) - Disruption of three acid proteases in Aspergillus niger — effects on protease spectrum, intracellular proteolysis, and degradation of target proteins - Eur J Biochem. 247(2): 605-13)所述來進(jìn)行的。該方法產(chǎn) 生了不含標(biāo)記基因的Ap印A、 Ag/flA重組A CBS513.88菌株，該菌株不具有任何外源DNA序列。WT4:該P(yáng)ewfd戰(zhàn)wm c/^，sogem/m菌株被用作為野生型菌株。該茼株 被保藏于CBS Institute,保藏號(hào)為CBS 455.95。EPO 1:該A wfger菌株是包含A Wgw印o基因(編碼脯氨酸特異性 內(nèi)切蛋白酶)的多個(gè)拷貝的WT2菌株，其已被公開于別處(WO 02/45524) 。 EPO 1是通過下述方法構(gòu)建的按照W098/46772和 W099/32617所述，用被命名為pGBAAS-1的、含有amdS選擇標(biāo)記基因 的載體(按照EP 635 574構(gòu)建的)和包含編碼脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶的 基因的pGBTOPEPO-1載體(圖 PLA 1:該異源豬磷脂酶A2 (PLA2)蛋白被選用為模式蛋白。以前 已顯示出該蛋白難于在A 中以高產(chǎn)量生產(chǎn)(Roberts I. N., JeenesDJ. ， MacKenzie D.A., Wilkinson A.P.， Sumner I. G. and Archer D.B. (1992)-Heterologous gene expression in Js/ ergz7/us w/ger: a glucoamylase國porcine pancreatic phospholipase A2 fUsion protein is secreted and processed to yield mature enzyme. Gene 122: 155-161)。用于過量表達(dá)PLA2的片段是作為 proPLA2與A 的天然葡糖淀粉酶A基因的融合體來制造的，其是按 照Roberts et al. (1992)所述來制備的。融合蛋白含有kexl剪切位點(diǎn)，以在 Golgi體中被加工。使用與W098/46772和W099/32617所述相同的技術(shù)， 將該g/flA少/a2融合基因克隆進(jìn)A wfger pGBTOP表達(dá)載體，得到 pGBTOPPLA-1 (圖2)。PLA 1 A /^gw菌株是包含葡糖淀粉酶-豬胰磷脂酶A2融合蛋白編碼基 因多個(gè)拷貝的WT3菌株。PLA 1是通過含有a/w/S選擇標(biāo)記基因的載體 pGBAAS-1和pGBTOPPLA-1載體(圖2)進(jìn)行共轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的。轉(zhuǎn)化和 反向選擇方案產(chǎn)生了不含標(biāo)記基因的PLA 1菌株，其含有處于葡糖淀粉酶 啟動(dòng)子控制下的、葡糖淀粉酶-豬胰磷脂酶A2融合蛋白編碼基因的多個(gè)拷 貝。A wfger搖瓶發(fā)酵按照WO 99/32617中實(shí)施例"Aspergillus niger搖瓶發(fā)酵"小節(jié)所述， 在20 ml預(yù)培養(yǎng)基中對(duì)A w&er菌株進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)后，將10 ml該 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到發(fā)酵培養(yǎng)基(FM)。發(fā)酵培養(yǎng)基(FM)每升含有82.5 g 葡萄糖 1H20、 25 g Maldex 15 (Boom Meppel， Netherlands) 、 2 g檸檬 酸、4.5 g NaH2P04 1H20、 9 g KH2P04、 15 g (NH4)2S04、 0.02 g ZnCl2、 0.1 g MnS04 1H20、 0.015 g CuS04 5H20、 0.015 g CoCl2 6H20、 1 g MgS04 7H20、 0.1 g CaCl2 2H20、 0.3 g FeS04 7H20、 30 g MES (2-[N-嗎啉]乙磺酸)，pH=6。在FM中的發(fā)酵在500 ml帶擋板燒瓶中，用100 ml發(fā)酵培養(yǎng)液，于 34。C和170ipm，進(jìn)行指定的天數(shù)。酶試驗(yàn)PLA2磷脂酶活性為通過分光光度方法測(cè)定A/^gz7/w Wger培養(yǎng)物中的磷脂酶PLA2活 性(PLA2)，使用人工底物1，2-二硫代二辛酰磷脂酰膽堿(diC8，底 物)。PLA2水解A2位置的硫鍵，分離出硫代辛酸。硫代辛酸與4，4-二硫 代吡啶(著色劑，4-DTDP)發(fā)生反應(yīng)，形成4-硫代吡啶酮。4-硫代吡啶酮 與4-巰基吡啶處于互變異構(gòu)平衡，后者吸收具有334 nm波長(zhǎng)的輻射。測(cè) 量該波長(zhǎng)處的消光變化。 一個(gè)單位是于37。C， pH4.0時(shí)，每分鐘從1，2-二硫代二辛酰磷脂酰膽堿釋放出lnmol硫代辛酸的酶的量。通過將1 g diC8晶體溶解于每66 ml乙醇加164 ml乙酸鹽緩沖液來制 備底物溶液。乙酸鹽緩沖液包含pH 3.85的、含有0.2% Triton-XlOO的 0.1 M乙酸鹽緩沖液。著色劑是11 mM的4,4-二硫代吡啶溶液。其是通過 下述方法制備的在2 ml eppendorf樣品杯中稱量出5.0 mg 4,4-二硫代吡 啶，將其溶于1.00 ml乙醇。加入1.00 ml milli-Q水。脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶活性在pH 5的檸檬酸鹽/磷酸二鈉緩沖液中，于37°C，使用CBZ-Gly(cine)-Pro(line)-pNA于410 nm處，以分光光度法對(duì)脯氨酸特異性內(nèi)切 蛋白酶的蛋白水解活性進(jìn)行及時(shí)測(cè)量。1 U脯氨酸特異性內(nèi)切蛋白酶被定 義為在上述條件下，于pH 5和37°C下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 Mmol (微摩) CBZ-Gly(cine)-Pro(line)-pNA的酶的量。葡糖淀粉酶活性試驗(yàn)按照WO 98/46772所述，使用對(duì)硝基苯o^D-吡喃葡糖苷(Sigma)來 測(cè)定葡糖淀粉酶活性。實(shí)施例l在表達(dá)載體中克隆Mc61基因，其編碼Sec61轉(zhuǎn)位通道 對(duì)y4印ergz7/ws wfge/"菌株WT1和尸em'cz7/z'i/m cAo^ogew鵬WT4的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序和分析。鑒定出了一個(gè)基因，其具有被注釋為Sec61同 源物的翻譯蛋白，其被命名為sec61。 A w&ef mc61基因座的基因組序列 被展示于SEQIDNO: 1中，其包含開放讀碼框(ORF)(具有內(nèi)含子) 和大約180 bp的5'非翻譯區(qū)域(UTR)和327 bp的3'UTR。 Pem'"7/z'wm c/^sogem/w sec61的基因座的基因組序列被展示于SEQ ID NO: 7中，其 包含開放讀碼框(ORF)(具有內(nèi)含子)和大約12 bp的5'非翻譯區(qū)域 (UTR)和66bp的3，UTR。來自WT1的基因組DNA被用作為PCR反應(yīng)的模板，其中使用具有 SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14的引物去擴(kuò)增野生型jec61基因并加上 合適的限制性位點(diǎn)。平行地，使用cDNA作為模板進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)用具 有SEQ ID NO: 14和15的引物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，以擴(kuò)增野生型wc61 cDNA。所有PCR反應(yīng)、cDNA合成、連接和轉(zhuǎn)化都按照Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al， New York: Cold Spring Harbour Press, 1989所述來進(jìn)行。通過序列分析來確定多種獨(dú)立擴(kuò)增的 PCR片段的序列。SEQ ID NO: 1包含A a^wsec61基因組序列。編碼A Wger的Sec61蛋白的cDNA序列的ORF被提供為SEQ ID NO: 2。 SEQ ID NO: 2翻譯的氨基酸序列被定為SEQIDNO: 3，其代表A WT1 的Sec61蛋白。來自WT4的基因組DNA被用作為PCR反應(yīng)的模板，其中使用具有 SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的引物去擴(kuò)增野生型wc61基因并加上 合適的限制性位點(diǎn)。平行地，使用cDNA作為模板進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)用具 有SEQ ID NO: 11和12的引物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，以擴(kuò)增野生型sec61 cDNA。通過序列分析來確定多種獨(dú)立擴(kuò)增的PCR片段的序列。SEQ ID NO : 7包含尸e"icz7/zM/w cAA7加ge/w加sec61基因組序列。編碼尸. c/^sog幼M/w的Sec61蛋白的cDNA序列的ORF被提供為SEQ ID NO: 8。 SEQ ID NO: 8翻譯的氨基酸序列被定為SEQ ID NO: 9，其代表尸. cAo^og幼"m WT4的Sec61蛋白。按照廠商說明書，用尸acl和Jscl去切得到的PCR片段(其中包含A wfgw jec61基因組DNA和cDNA序列)，將其連接進(jìn)用尸acl、 Acl線性 化過的pGBFIN-18 A /i&er表達(dá)載體(圖3) 。 WO 99/32617描述了 pGBFIN-18載體的質(zhì)粒和構(gòu)建。這產(chǎn)生了構(gòu)建體pGBFINSEC-1和 pGBFINSEC-2，其中，Sec61被放置于g/aA啟動(dòng)子的控制之下(關(guān)于 pGBFINSEC-1的圖譜，見圖4)。處于^s/7^^7/m5 wW"/a朋的組成型sw/A啟動(dòng)子控制下，并且也存在于 基于pGBFIN-18游A Wger表達(dá)載體中的a/m/S基因可被用作為選擇標(biāo) 記，其誘導(dǎo)在作為唯一N源的乙酰胺上的生長(zhǎng)(如Kelly, J.M.， and Hynes, M丄 (1985). Transformation of J5pergz7/iw wfger by the a/w<iS gene of ^s/7erg"/i/j EMBO J. 4， 475-479所述)。實(shí)施例2在基因置換和過量表達(dá)載體中構(gòu)建wc6"，其編碼經(jīng)修飾的Sec61轉(zhuǎn)位通道按照Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, Sambrook " "/.， New York: Cold Spring Harbour Press, 1989所述使用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)。對(duì)A w/gw 缺失載體的通常設(shè)計(jì)在EP635 574和WO 98/46772中有所描述。經(jīng)修飾的sec61基因，被稱為wc6"，其編碼其中絲氨酸376被蘇氨 酸置換的Sec6"蛋白，其是通過序列重疊延伸PCR (SOE-PCR，如Gene. 1989 Apr 15;77(l):51-9. Ho SN, Hunt HD， Horton RM, Pullen JK， Pease LR "Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction"所述)來構(gòu)建的。使用被稱為SEQ ID NO: 18和SEQIDNO: 17 的寡核苷酸，用A "扭rWTl的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增出 mc61的1.4 kb的5'區(qū)域，其被稱為片段A。此外，將Acl限制性位點(diǎn)加 到片段A的5'末端。使用被稱為SEQ ID NO: 16和SEQIDNO: 19的寡 核苷酸，用A WT1的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增出 wc61的0.6 kb的3'區(qū)域，其包括3'-UTR，被稱為片段B。此外，將iVort 和五coRI限制性位點(diǎn)加到片段B的3'末端。通過SOE-PCR，被稱為SEQ ID NO: 18和SEQIDNO: 19的寡核苷酸和片段A和B，將得到的兩條片 段A和B融合起來；產(chǎn)生2 kb的片段C。將該片段C克隆進(jìn)pCR2.1-TOPO (Invitrogen)，產(chǎn)生pCR_Sec61*。驗(yàn)證pCI^Sec6P的PCR產(chǎn)生的 片段的序列，其被提供為SEQ ID NO: 4。經(jīng)修飾的Sec6"蛋白的編碼序 列被提供為SEQIDNO: 5。 SEQ ID NO: 5的翻譯氨基酸序列被定為SEQ ID NO: 6，其代表經(jīng)修飾的Sec6"蛋白。用Acl和￡coRI去消化載體pCR_Sec61*，將wc6"片段引入Acl和 ￡coRI消化過的載體pGBDEL，產(chǎn)生pGBDEL-1 (數(shù)據(jù)未示出)。隨后， 用五coRV和去消化載體pCR_Sec61*，將3， wc6"片段引入S附al和 A^I消化過的載體pGBDEL-l，產(chǎn)生pGBDEL-SEC6P (圖5)。載體pCR—Sec6"被用作為PCR反應(yīng)的模板，其中使用具有SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14的引物去擴(kuò)增經(jīng)修飾的wc6P基因并加上合適 的限制性位點(diǎn)。按照廠商說明書，用尸acl和去切得到的PCR片段(其中包含經(jīng)修飾的化c6"序列)，將其連接進(jìn)用尸flcl和線性化過 的pGBFINA WgeA"表達(dá)載體，其中，PglaA啟動(dòng)子已被/ 印C啟動(dòng)子置換(Frederick GD, Rombouts P， Buxton FP (1993)國Cloning and characterisation of pepC, a gene encoding a serine protease from Aspergillus niger.- Gene 125(1): 57-64)。這產(chǎn)生了 pGBFINSEC-3構(gòu)建體，其中，經(jīng)修飾的Sec6"基因被 放置于/7卬C啟動(dòng)子的控制之下(圖6)。實(shí)施例3過量表達(dá)野生型wc61和經(jīng)修飾的wc61 *基因以及表達(dá)經(jīng)修飾的^c6"轉(zhuǎn)位通道的真菌宿主細(xì)胞按EP635 574所述，被組成型g w/A啟動(dòng)子控制的J印ergz7/w5 m'^/a"s am必基因被用作為選擇標(biāo)記。原則上，在用指定的限制性酶消化之后， 分離pGBFINSEC-l、 pGBFINSEC國2、 pGBFINSEC畫3和pGBDEL-SEC61* 的線性DNA。轉(zhuǎn)化^印e^7/M5 PLA1和EPO 1菌株，隨后按照 W098/46772、 EP635 574和WO 99/32617所述來進(jìn)行在乙酰胺上的轉(zhuǎn)化體 選擇。隨后，按照標(biāo)準(zhǔn)方案純化菌落。針對(duì)轉(zhuǎn)化SEC質(zhì)粒的拷貝數(shù)，以及p/fl2和印o基因拷貝的沒有丟 失，對(duì)PLA1和EPO 1菌株的生長(zhǎng)菌落加以分析判斷。選出具有近似估計(jì) 的拷貝數(shù)并且/ /a2和印o基因拷貝沒有丟失的pGBFINSEC-l、 pGBFINSEC-2和pGBFINSEC-3轉(zhuǎn)化子。選出一些具有單拷貝的轉(zhuǎn)化子(—A、 _B、 —C、……)。這產(chǎn)生了過量表達(dá)野生型基因組"c61 (pGBFINSEC-l) 、 cDNAwc61 (pGBFINSEC-2)和經(jīng)修飾的wc6"基 因(pGBFINSEC-3)的大量轉(zhuǎn)化子。PLA1和EPO 1菌株的轉(zhuǎn)化子分別被 稱為PLA_SEC1、 PLA_SEC2、 PLA—SEC3和EPO—SEC1、 EPO—SEC2、 EPO_SEC3。如圖7所示，具有在sec61基因座上的基因組整合的pGBDEL-SEC6"片段的轉(zhuǎn)化子已用jec6"基因和a/m/S基因取代了野生型"c61基 因。由于所用的片段和用于靶向的策略，同源重組取代并非100%。因 此，通過兩次PCR反應(yīng)，針對(duì)在sec61基因座上的同源整合、和5"61*基 因序列對(duì)wc61基因的取代，對(duì)純化的pGBDEL-SEC6"轉(zhuǎn)化子加以分析 判斷。wc6"基因?qū)c61的這種取代可被第一次PCR擴(kuò)增的條帶探測(cè) 到，其中使用pGBDEL-SEC6"轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，用具有 SEQIDNO: 20和SEQIDNO: 22的引物去擴(kuò)增犯c61基因座上的經(jīng)修飾 wc6"基因。wc6"基因?qū)ec61的這種置換通過第二次PCR被證實(shí)，其 中使用pGBDEL-SEC6P轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，用具有SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21的引物，去檢驗(yàn)擴(kuò)增野生型wc61基因的失 敗。此外，針對(duì);7/a2和卬o基因拷貝沒有丟失，分別進(jìn)行檢驗(yàn)。隨后，將 孢子涂布到氟乙酰胺培養(yǎng)基上，以選出丟失了 a/m/S標(biāo)記的菌株。再按照 上文所述，針對(duì)sec6P基因?qū)c61的取代以及p/a2和卬o基因拷貝的沒 有丟失，通過PCR對(duì)生長(zhǎng)菌落加以分析判斷，通過對(duì)含amrfS的轉(zhuǎn)化子以 及獲得的丟失了 a/m/S標(biāo)記的菌株進(jìn)行Southern分析，對(duì)候選菌株加以檢 驗(yàn)。wc6"基因?qū)c61的取代可通過下述兩條鏈與sec61探針的雜交來探 測(cè)，所述兩條鏈?zhǔn)呛琭l附必的轉(zhuǎn)化子中覆蓋了整個(gè)基因座的、大小增加 了~2.2 kb的DNA片段，以及獲得的丟失了 fl/w必標(biāo)記的菌株中的野生型 片段。菌株中的大約40%顯示出了 pGBDEL-SEC6"的同源重組，其中大 約70%能探測(cè)到sec6P基因?qū)ec61的取代。菌株P(guān)LA—SEC6"和 EPO一SEC6"被選用為具有經(jīng)修飾wc6"基因?qū)ec61基因的置換的代 表性菌株。此外，用pGBFINSEC-3的線性DNA去轉(zhuǎn)化^pergz7/"s w/gw PLA一SEC6"和EPO_SEC61*，隨后按照上文所述在乙酰胺上進(jìn)行轉(zhuǎn)化子 選擇和菌落分離。菌株P(guān)LA一SEC6"一2和EPO_SEC61*_2被選作為下述菌 株的代表，所述菌株過量表達(dá)經(jīng)修飾的Sec61*，具有經(jīng)修飾的wc6"基因 對(duì)內(nèi)源wc61基因的置換，具有處于強(qiáng)g/aA啟動(dòng)子控制下的經(jīng)修飾Sec61* 基因的額外拷貝，并且沒有丟失p/fl2和印o基因拷貝。實(shí)施例4獲得的^pg朋7/w AH'ger菌株對(duì)蛋白分泌的提高 選出若干A w/ger WT 2以及具有相同拷貝數(shù)的pGBTOPEPO-l構(gòu)建體 的 EPO_SECl 、 EPO—SEC2 以及 EPO—SEC3 、 EPO—SEC61*和 EPO—SEC61*—2，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。此外，選出若干A WgwWT3以及具有 相同拷貝數(shù)的pGBTOPPPLA-l構(gòu)建體的PLA_SEC1、 PLA_SEC2以及 PLA_SEC3、 PLA—SEC6"和PLA_SEC61*—2，進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。搖瓶實(shí)驗(yàn) 在100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基(FM)中，按照實(shí)驗(yàn)方案——M "/gw搖瓶發(fā)酵" 所述來進(jìn)行。7天培養(yǎng)期間，收集培養(yǎng)液，按照上文所述對(duì)內(nèi)切蛋白酶和 PLA2活性加以測(cè)量。圖8顯示了具有相同拷貝數(shù)的A z^gw EPO菌株轉(zhuǎn)化子中脯氨酸特異 性內(nèi)切蛋白酶的相對(duì)活性。我們得出結(jié)論Sec61和經(jīng)修飾的Sec6"蛋A 的過量表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)切蛋白酶的產(chǎn)量增加。已使用葡糖淀粉酶gfeA和蛋l(fā)ll 酶p印C啟動(dòng)子進(jìn)行了過量表達(dá)。此外，基因組或cDNA構(gòu)建體對(duì)Sec61 的過量表達(dá)或仍存在于基因組中的內(nèi)源sec61基因與經(jīng)修飾的Sec6"的過 量表達(dá)導(dǎo)致了內(nèi)切蛋白酶的產(chǎn)量增加。這些結(jié)果顯示，sec6P和sec61是在真菌宿主細(xì)胞中獲得提高的多肽 產(chǎn)量的優(yōu)秀手段。圖9和圖10分別顯示了在A WT2、 SEC1、SEC2、 SEC3、 SEC6"和SEC61*_2的轉(zhuǎn)化子以及A w/ger WT2 pGBFIN-PLA2轉(zhuǎn)化子中測(cè)量到的PLA2和葡糖淀粉酶的活性。明顯地，在具有缺 失的野生型mc61基因的菌株中觀察到PLA2活性較之具有相同拷貝數(shù) 的、具有完整A PLA 1和PLA_SEC1、 PLA—SEC3和PLA—SEC61*的菌株明顯增加。我們得出結(jié)論經(jīng)修飾的Sec6P蛋白導(dǎo)致異源磷脂酶 A2以及同源葡糖淀粉酶的產(chǎn)量增加。己使用葡糖淀粉酶g/aA和蛋白酶 /;印C啟動(dòng)子進(jìn)行了過量表達(dá)。具有未增加的PLA2和/或葡糖淀粉酶活性 的菌株顯示出在發(fā)酵期間丟失了拷貝。因此，伴隨Sec61的過量表達(dá)，每 拷貝表達(dá)仍提高了。上述結(jié)果表明，對(duì)sec6"和sec61的表達(dá)加以操縱， 導(dǎo)致真菌宿主細(xì)胞中多肽的產(chǎn)量提高。
權(quán)利要求
1. —種SEC61多肽，其選自下述多肽構(gòu)成的組(a) 具有根據(jù)SEQIDNO: 3的氨基酸序列的多肽，和(b) 具有與根據(jù)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列至少89%，優(yōu)選至少 90%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少92%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少93%，進(jìn)一步更優(yōu)選至 少94%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少95%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少96%，進(jìn)一步更優(yōu)選 至少97%，進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%以及最優(yōu)選至少99%的相同程度的氨基 酸序列的多肽。
2. 如權(quán)利要求1所述的多肽，其具有根據(jù)SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。
3. 與根據(jù)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少85%相同程度的多 肽，其中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3第373至379位的保守基元中的至少一 個(gè)氨基酸被修飾。
4. 如權(quán)利要求2所述的多肽，其中，被修飾的至少一個(gè)氨基酸處于對(duì) 應(yīng)于SEQ ID NO: 3第376位的位置上。
5. 如權(quán)利要求3所述的多肽，其中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3第376位 的位置上的氨基酸被色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或組氨酸置換，優(yōu)選被色 氨酸置換。
6. 如權(quán)利要求2-4所述的多肽，其中，被修飾的至少一個(gè)氨基酸是絲 氨酸。
7. 如權(quán)利要求1或3-6中任意一項(xiàng)所述的多肽，其具有根據(jù)SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。
8. 經(jīng)過分離的多核苷酸，其包含下述核酸序列，所述核酸序列編碼根 據(jù)前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述的多肽。
9. 如權(quán)利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸或核酸序列選 自由下述物質(zhì)構(gòu)成的組(a) 根據(jù)SEQ ID NO: 1的多核苷酸，(b) 根據(jù)SEQ ID NO: 2的核酸序列， (c) 與SEQIDNO: 2的核酸序列具有至少90%相同程度的核酸序 列，以及(d) 編碼下述多肽的核酸，所述多肽具有與SEQ ID NO: 3的氨基酸 序列實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列。
10. 核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求8或9的編碼SEC61多 肽的核酸序列，所述核酸序列與一種或多種控制序列可操作地相連，所述 控制序列指導(dǎo)所述多肽在合適的宿主中的表達(dá)。
11. 如權(quán)利要求10所述的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其中所述控制序列 包含啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。
12. 用權(quán)利要求8-11所述的多核苷酸、核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞。
13. 如權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其中內(nèi)源sec61基因被失活。
14. 如權(quán)利要求12或13所述的宿主細(xì)胞，其是有絲真菌細(xì)胞。
15. 如權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞，其中，所述有絲真菌細(xì)胞屬于選 自由^sperg/Z/w^尸幼fcz'戰(zhàn)M附或7Wc/iocter/na的種構(gòu)成的組的種。
16. 如權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其中，所述有絲真菌細(xì)胞屬于 爿5perg"/w5 w扭jr或Js/7erg"Zw5 oo^ae的種。
17. 如權(quán)利要求12至16中任意一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，其中，所述宿主 細(xì)胞額外包含編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸，或包含編碼目標(biāo)多肽的核酸序列 的表達(dá)載體。
18. —種方法，用于生產(chǎn)目標(biāo)多肽，所述方法包括在有益所述目標(biāo)多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，以及可選地，從培養(yǎng)液中回收所述目標(biāo)多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有與SEC61多肽的至少一種活性相應(yīng)的活性的多肽，涉及編碼這些多肽的多核苷酸，以及其在制備適合用于生產(chǎn)目標(biāo)多肽的宿主細(xì)胞中的用途。此類宿主細(xì)胞可以具有增加的分泌目標(biāo)多肽的能力。
文檔編號(hào)C12N15/80GK101146820SQ200580019938
公開日2008年3月19日 申請(qǐng)日期2005年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月16日
發(fā)明者琳達(dá)·蘭格·德, 瑟戈·彼得呂斯·當(dāng)克斯, 科尼利斯·瑪麗亞·雅各布斯·沙吉, 諾林·尼古拉斯·瑪麗亞·艾里薩伯斯·佩伊·范, 馬帝那·貝舒森 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司