專利名稱：表達(dá)pdx1的內(nèi)胚層的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是包含哺乳動(dòng)物PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物及其產(chǎn)生、分離和使用此類細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
人多能性干細(xì)胞(pluripotent stem cell)，如胚胎干細(xì)胞(ES)和胚胎生殖細(xì)胞(EG)，于1994年首先從無(wú)成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Bongso et al.，1994)，1997年從含成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物中分離(Hogan，1997)。隨后Thomson、Reubinoff和Shamblott建立了采用有絲分裂失活的小鼠飼養(yǎng)層連續(xù)培養(yǎng)人ES和EG細(xì)胞的方法(Reubinoffet al.，2000；Shamblott et al.，1998；Thomson et al.，1998)。
人ES和EG細(xì)胞(hESC)為研究人類早期發(fā)育和為治療性干預(yù)一些疾病狀態(tài)(如糖尿病和帕金森氏癥)提供了極難得的機(jī)會(huì)。例如，在采用細(xì)胞療法治療糖尿病的過(guò)程中，使用衍生自hSEC的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞會(huì)比目前利用來(lái)自供者胰腺的細(xì)胞治療糖尿病有很大進(jìn)步。但目前還不知道如何從hSEC得到產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。因此，目前利用來(lái)自供者胰腺的胰島細(xì)胞治療糖尿病的細(xì)胞療法受限于缺乏移植所需的高質(zhì)量胰島細(xì)胞。對(duì)單一I型糖尿病人的細(xì)胞治療需要移植大約8×108胰島細(xì)胞(Shapiro et al.，2000；Shapiro et al.，2001a；Shapiro et al.，2001b)。一次成功移植所需的胰島細(xì)胞至少需要兩個(gè)健康供者的器官提供。而人胚胎干細(xì)胞為開發(fā)用于人類細(xì)胞治療的大量的高質(zhì)量分化細(xì)胞提供了起始材料的來(lái)源。
多能性和能夠維持hSEC細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)這兩個(gè)性質(zhì)使其特別適合用于細(xì)胞治療。多能性是指hESC能夠分化為所有3種主要胚層(內(nèi)胚層，中胚層和外胚層)的衍生物，進(jìn)而在除胚胎外組織(如胎盤)和生殖細(xì)胞外還形成成熟器官的所有體細(xì)胞類型的能力。盡管多能性賦予了hSEC特殊的用途，但這個(gè)性質(zhì)也給這些細(xì)胞及其衍生物的研究和控制帶來(lái)挑戰(zhàn)。由于在分化hSEC培養(yǎng)基中會(huì)產(chǎn)生大量細(xì)胞類型，所以大部分細(xì)胞類型產(chǎn)生效率很低。而且，成功評(píng)價(jià)任一指定細(xì)胞類型的產(chǎn)生關(guān)鍵取決于定義合適的標(biāo)志物。高效、定向的分化對(duì)hESCs的治療應(yīng)用非常重要。
解決上述問(wèn)題對(duì)利用hSEC作為起始材料產(chǎn)生用于細(xì)胞治療的細(xì)胞非常有利。例如，為獲得胰島細(xì)胞移植治療所需的細(xì)胞材料的水平，有利的是在分化的最早期高效地使hESC定向?yàn)橐葝u/β細(xì)胞系。
除了分化過(guò)程的高效定向，另外還有利的是在向胰島/β細(xì)胞系分化過(guò)程中分離和鑒定中間細(xì)胞類型，并利用這些細(xì)胞作為進(jìn)一步分化的合適的前體細(xì)胞系。
發(fā)明概要本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包含表達(dá)PDX1(PDX1-陽(yáng)性)的內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物及產(chǎn)生該組合物的方法。其他實(shí)施方案涉及富含PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群以及產(chǎn)生該細(xì)胞群的方法。其它實(shí)施方案涉及增強(qiáng)內(nèi)胚層細(xì)胞PDX1的表達(dá)以及鑒別用于進(jìn)一步分化PDX1陰性和/或PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層的因子的方法。在貫串本申請(qǐng)描述的組合物和方法的一些實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸/中腸內(nèi)胚層細(xì)胞。在貫串本申請(qǐng)描述的組合物和方法的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞是前腸末端的PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞(multipotentcell)，可以分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含人細(xì)胞。在此人細(xì)胞培養(yǎng)物中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞包含占培養(yǎng)物中人細(xì)胞的至少約2％、至少約5％、至少約10％或至少約25％。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算所述至少約2％、至少約5％、至少約10％或至少約25％時(shí)沒有考慮所述培養(yǎng)物中的飼養(yǎng)細(xì)胞。在此處描述的一些細(xì)胞培養(yǎng)物的實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可表達(dá)選自同源框A13(HOXA13)基因、同源框C6(HOXC6)基因和SOX17的標(biāo)志物。在其他實(shí)施方案中，包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞和/或神經(jīng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物還包含以下物質(zhì)的一種或幾種類視黃醇化合物，如視黃酸(RA)，F(xiàn)GF-10或B27。
本發(fā)明其他實(shí)施方案涉及富集的、分離的或基本上純的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞群，其中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，可以分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官。在一些實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞衍生自多能性細(xì)胞，如人胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及包含細(xì)胞的細(xì)胞群，其中至少約90％的細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，其中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，可以分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞群中至少約95％的細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞在細(xì)胞群中的比例為至少約98％。
本發(fā)明其它的實(shí)施方案涉及產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，此方法通過(guò)為包含基本上不表達(dá)PDX1的定形內(nèi)胚層細(xì)胞(PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞)的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群提供前腸分化因子(例如類視黃醇)來(lái)進(jìn)行。類視黃醇(例如視黃酸)可以約0.01至50μM的濃度添加。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)為細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群提供FGF-10和/或B27增加PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性細(xì)胞的分化。FGF-10可以約5ng/ml至約1000ng/ml的濃度添加。在一些實(shí)施方案中，B27以約0.1％至約20％的濃度添加到細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中。FGF-10和/或B27可以與類視黃醇大致同時(shí)加到細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中，或者每種因子也可以間隔幾小時(shí)分別添加。在一些實(shí)施方案中，類視黃醇添加至大約培養(yǎng)4天的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物中。在一些實(shí)施方案中，類視黃醇添加至大約培養(yǎng)5天的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物中。
其它實(shí)施方案還涉及利用前腸分化因子進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群已經(jīng)與類視黃醇(如視黃酸)接觸。在這些實(shí)施方案中，為所述細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群提供活化素A和/或活化素B可促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層的分化?；罨谹和/或活化素B可以5ng/ml至1000ng/ml的濃度提供。其他實(shí)施方案涉及增加細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)生的方法，其通過(guò)在含有類視黃醇的培養(yǎng)基中分化PDX1陰性細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，其中所述培養(yǎng)基之前被某些細(xì)胞類型的維持或生長(zhǎng)條件化。這些細(xì)胞類型包括但不限于胚胎干細(xì)胞或其他多能性細(xì)胞，這些細(xì)胞已在含血清或生長(zhǎng)因子TGFβ超家族成員(如活化素A、活化素B、Nodal和/或骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP)的培養(yǎng)基中分化。在一些實(shí)施方案中，條件培養(yǎng)基以全部培養(yǎng)基的約1％至約100％添加到細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中。TGFβ超家族生長(zhǎng)因子和/或條件培養(yǎng)基可以和類視黃醇大致同時(shí)添加到細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中，或者每種因子也可以幾小時(shí)的間隔分別添加。
本發(fā)明的實(shí)施方案涉及產(chǎn)生富含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群的方法。在一些實(shí)施方案中，這些方法包括獲得多能性細(xì)胞群的步驟，其中多能性細(xì)胞群中至少一個(gè)細(xì)胞包含至少一個(gè)受PDX1啟動(dòng)子控制的核酸拷貝。在一些實(shí)施方案中，所述核酸包含編碼綠色熒光蛋白或其生物學(xué)活性片段的序列。在其它實(shí)施方案中，該方法另外的步驟包括使所述多能性細(xì)胞分化以便產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，以及使PDX1-陽(yáng)性細(xì)胞與PDX1陰性細(xì)胞分離，其中該P(yáng)DX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，可以分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官。此處所述方法的一些實(shí)施方案中，分化步驟還包括為所述多能性細(xì)胞群提供至少一種TGFβ超家族的生長(zhǎng)因子，其量足以促進(jìn)所述多能性細(xì)胞向PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化，以及為該P(yáng)DX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞提供前腸分化因子，其量足以促進(jìn)該P(yáng)DX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向前腸的PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞分化。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及促進(jìn)表達(dá)SOX-17(SOX-17陽(yáng)性)的定形內(nèi)胚層細(xì)胞中PDX1基因產(chǎn)物表達(dá)的方法，其通過(guò)使這些細(xì)胞與足以促進(jìn)PDX1基因產(chǎn)物表達(dá)的量的分化因子接觸。在一些實(shí)施方案中，所述分化因子選自RA、FGF-10和B27。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及鑒定能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子的方法。在這些方法中，使PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞與候選分化因子接觸，并確定與在與候選分化因子接觸前細(xì)胞群中PDX1的表達(dá)相比，在與候選分化因子接觸后細(xì)胞群中PDX1的表達(dá)是否增加。細(xì)胞群中PDX1表達(dá)的增加表明候選分化因子能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。在一些實(shí)施方案中，PDX1的表達(dá)由定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)確定。上述方法的一些實(shí)施方案還包括確定在與候選分化因子接觸前后細(xì)胞群中HOXA13和/或HOXC6基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，候選分化因子是小分子，例如類視黃醇，如視黃酸。其它實(shí)施方案中，候選分化因子是多肽，例如生長(zhǎng)因子，如FGF-10。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及鑒定能夠促進(jìn)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子。在這些方法中，在使PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞與候選分化因子接觸，并確定與在與候選分化因子接觸前細(xì)胞群中標(biāo)志物的表達(dá)相比，在與候選分化因子接觸后細(xì)胞群中標(biāo)志物的表達(dá)是增加還是降低。標(biāo)志物表達(dá)的增加或降低表明候選分化因子能夠促進(jìn)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)志物表達(dá)通過(guò)Q-PCR檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中，候選分化因子是小分子，例如類視黃醇，如視黃酸。其它實(shí)施方案中，候選分化因子是多肽，例如生長(zhǎng)因子，如FGF-10。
一些權(quán)限中，術(shù)語(yǔ)“包含”可能不具有任何通常所接受的定義。此處使用的術(shù)語(yǔ)“包含”是開放式的，可以包括任何其他元素?？紤]到這一點(diǎn)，本發(fā)明的其他實(shí)施方案參考以下編號(hào)的段落進(jìn)行描述1.包含人細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約2％的所述人細(xì)胞是胰-十二指腸同源框因子-1(PDX1)陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官的多潛能細(xì)胞。
2.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約5％的所述人細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
3.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約10％的所述人細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
4.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中至少約25％的所述人細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
5.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在所述培養(yǎng)物中存在人飼養(yǎng)細(xì)胞，其中除了所述人飼養(yǎng)細(xì)胞以外，至少約2％的人細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
6.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)同源框A13(HOXA13)基因。
7.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)同源框C6(HOXC6)基因。
8.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)SOX17。
9.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中在所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞中PDX1的表達(dá)高于選自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的標(biāo)志物的表達(dá)。
10.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含選自內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞、體壁內(nèi)胚層細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞。
11.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中約每10個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約一個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
12.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中約每5個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約一個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
13.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物中約每4個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約一個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
14.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含胚胎干細(xì)胞。
15.段落14的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述胚胎干細(xì)胞衍生自選自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和胚胎生殖嵴的組織。
16.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含類視黃醇。
17.段落16的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述類視黃醇是視黃酸(RA)。
18.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含F(xiàn)GF-10。
19.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含B27。
20.段落1的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含RA和FGF-10。
21.段落20的細(xì)胞培養(yǎng)物，還包含B27。
22.包含細(xì)胞的細(xì)胞群，其中至少約90％的所述細(xì)胞是人PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官的多潛能細(xì)胞。
23.段落22的細(xì)胞群，其中至少約95％的所述細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
24.段落22的細(xì)胞群，其中至少約98％的所述細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
25.段落22的細(xì)胞群，其中所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)HOXA13基因。
26.段落22的細(xì)胞群，其中所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)HOXC6基因。
27.段落22的細(xì)胞群，其中所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)SOX17。
28.段落22的細(xì)胞群，其中在所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞中PDX1的表達(dá)高于選自AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的標(biāo)志物的表達(dá)。
29.產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包含以下步驟獲得包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群；為所述細(xì)胞群提供足以促進(jìn)至少部分所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的量的類視黃醇，其中所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官的多潛能細(xì)胞。
30.段落29的方法，還包括給予足夠時(shí)間供PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞形成的步驟，其中所述供PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞形成的足夠時(shí)間通過(guò)檢測(cè)所述細(xì)胞群中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的存在來(lái)確定。
31.段落29的方法，其中至少約2％的所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化為PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
32.段落29的方法，其中至少約5％的所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化為PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
33.段落29的方法，其中至少約10％的所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化為PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
34.段落29的方法，其中至少約25％的所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化為PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
35.段落29的方法，其中在所述細(xì)胞群中檢測(cè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的存在包括檢測(cè)PDX1的表達(dá)。
36.段落35的方法，其中在所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞中PDX1的表達(dá)高于選自α-胎蛋白(AFP)、SOX7、SOX1、ZIC1和NFM的標(biāo)志物的表達(dá)。
37.段落35的方法，其中所述PDX1的表達(dá)通過(guò)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)來(lái)測(cè)定。
38.段落35的方法，其中所述PDX1的表達(dá)通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)來(lái)測(cè)定。
39.段落29的方法，其中所述類視黃醇是RA。
40.段落39的方法，其中RA以約0.01μM至約50μM的濃度范圍提供。
41.段落39的方法，其中RA以約0.04μM至約20μM的濃度范圍提供。
42.段落39的方法，其中RA以約0.1μM至約10μM的濃度范圍提供。
43.段落39的方法，其中RA以約0.2μM至約2.5μM的濃度范圍提供。
44.段落39的方法，其中RA以是約0.5μM至約1.5μM的濃度范圍提供。
45.段落39的方法，其中RA以約1μM的濃度提供。
46.段落39的方法，其中RA在所述培養(yǎng)進(jìn)行約4天時(shí)提供。
47.段落29的方法，還包括向所述培養(yǎng)物中提供足以增強(qiáng)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的產(chǎn)生的量的因子，所述因子選自FGF-10、FGF-4、活化素A、活化素B、B27、條件培養(yǎng)基和所述因子的組合。
48.段落47的方法，其中所述因子選自FGF-10、FGF-4、活化素A和活化素B。
49.段落48的方法，其中所述因子以約10ng/ml至約500ng/ml的濃度范圍提供。
50.段落48的方法，其中所述因子以約20ng/ml至約200ng/ml的濃度范圍提供。
51.段落48的方法，其中所述因子以約25ng/ml至約75ng/ml的濃度范圍提供。
52.段落48的方法，其中所述因子約50ng/ml的濃度提供。
53.段落48的方法，其中所述因子與所述類視黃醇大致同時(shí)提供。
54.段落47的方法，其中所述因子是B27。
55.段落54的方法，其中B27以全部培養(yǎng)基的約0.1％至約20％的濃度范圍提供。
56.段落54的方法，其中B27以全部培養(yǎng)基的約0.2％至約5％的濃度范圍提供。
57.段落54的方法，其中B27以全部培養(yǎng)基的約0.5％至約2％的濃度范圍提供。
58.段落54的方法，其中B27以全部培養(yǎng)基的約1％的濃度提供。
59.段落54的方法，其中B27與所述類視黃醇大致同時(shí)提供。
60.段落47的方法，其中所述因子是條件培養(yǎng)基。
61.段落60的方法，其中條件培養(yǎng)基以全部培養(yǎng)基的約10％至約100％的濃度范圍提供。
62.段落60的方法，其中條件培養(yǎng)基以全部培養(yǎng)基的約20％至約80％的濃度范圍提供。
63.段落60的方法，其中條件培養(yǎng)基以全部培養(yǎng)基的約40％至約60％的濃度范圍提供。
64.段落60的方法，其中條件培養(yǎng)基以全部培養(yǎng)基的約50％的濃度提供。
65.段落60的方法，其中條件培養(yǎng)基與所述類視黃醇大致同時(shí)提供。
66.段落60的方法，其中條件培養(yǎng)基通過(guò)使分化的人胚胎干細(xì)胞(hESC)與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸約24小時(shí)來(lái)制備。
67.段落66的方法，其中所述hESC在選自補(bǔ)加3％血清的RPMI、補(bǔ)加活化素A的低血清RPMI和補(bǔ)加BMP4的低血清RPMI的培養(yǎng)基中分化約5天。
68.段落29的方法產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
69.產(chǎn)生富集PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述方法包括以下步驟獲得多能性細(xì)胞群，其中所述多能性細(xì)胞群中至少一個(gè)細(xì)胞包含至少一個(gè)拷貝的受PDX1啟動(dòng)子控制的核酸，所述核酸包含編碼綠色熒光蛋白(GFP)或其生物學(xué)活性片段的序列；分化所述多能性細(xì)胞以便產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官的多潛能細(xì)胞；以及使所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞與PDX1-陰性細(xì)胞分離。
70.段落69的方法，其中所述富集的細(xì)胞群包含至少約95％的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
71.段落69的方法，其中所述富集的細(xì)胞群包含至少約98％的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
72.段落69的方法，其中所述分化步驟還包括為所述多能性細(xì)胞群中提供足以促進(jìn)所述多能性細(xì)胞向PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化的量的至少一種TGFβ超家族的生長(zhǎng)因子，以及為所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞提供足以促進(jìn)所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的量的類視黃醇。
73.段落72的方法，其中所述類視黃醇是RA。
74.段落69的方法產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集群。
75.在表達(dá)SOX17的定形內(nèi)胚層細(xì)胞中增加PDX1基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法，所述方法包括使所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞與足以增加所述PDX1基因產(chǎn)物表達(dá)的量的分化因子接觸。
76.段落75的方法，其中所述分化因子是類視黃醇。
77.段落76的方法，其中所述分化因子是RA。
78.段落75的方法，其中所述分化因子選自FGF-10、FGF-4、活化素A、活化素B、B27、條件培養(yǎng)基和所述因子的組合。
79.鑒定能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步驟獲得包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的群；使所述包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的群與候選分化因子接觸；以及與在與所述候選分化因子接觸之前所述細(xì)胞群中PDX1的表達(dá)比較，確定在與所述候選分化因子接觸之后所述細(xì)胞群中PDX1的表達(dá)是否增加，其中在所述細(xì)胞群中所述PDX1表達(dá)的增加表明所述候選分化因子能夠促進(jìn)所述PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化，所述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是能夠分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官的多潛能細(xì)胞。
80.段落79的方法，其中所述PDX1表達(dá)通過(guò)Q-PCR檢測(cè)。
81.段落79的方法，還包括在與所述候選分化因子接觸前后測(cè)定所述細(xì)胞群中HOXA13基因的表達(dá)的步驟。
82.段落79的方法還包含在添加所述候選分化因子前后檢測(cè)所述細(xì)胞群中HOXC6基因的表達(dá)的方法。
83.段落79的方法，其中所述候選分化因子是小分子。
84.段落83的方法，其中所述小分子是類視黃醇。
85.段落84的方法，其中所述類視黃醇是RA。
86.段落79的方法，其中所述候選分化因子是多肽。
87.段落79的方法，其中所述候選分化因子是生長(zhǎng)因子。
88.段落79的方法，其中所述候選分化因子是FGF-10。
89.鑒定能夠促進(jìn)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子的方法，所述方法包括以下步驟獲得包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的群；使所述包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的群與候選分化因子接觸；以及與在與所述候選分化因子接觸之前所述細(xì)胞群中標(biāo)志物的表達(dá)比較，確定在于所述候選分化因子接觸之后所述細(xì)胞群中相同標(biāo)志物的表達(dá)是增加還是降低，其中在所述細(xì)胞群中所述標(biāo)志物表達(dá)的增加或降低表明所述候選分化因子能夠促進(jìn)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。
90.段落81的方法，其中所述標(biāo)志物表達(dá)通過(guò)Q-PCR測(cè)定。
91.段落81的方法，其中所述候選分化因子是小分子。
92.段落81的方法，其中所述候選分化因子是多肽。
93.段落81的方法，其中所述候選分化因子是生長(zhǎng)因子。
94.包含可操作地連接到PDX1控制區(qū)的報(bào)告基因的載體。
95.段落94的載體，其中所述報(bào)告基因是EGFP。
96.段落94的載體的細(xì)胞。
97.包含可操作地連接到PDX1控制區(qū)的報(bào)告基因的細(xì)胞。
98.段落97的細(xì)胞，其中所述可操作地連接到所述PDX1控制區(qū)的報(bào)告基因整合入染色體。
99.段落97的細(xì)胞，其中所述報(bào)告基因是EGFP。
100.段落97的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是多能的。
101.段落100的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是hESC。
102.段落97的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
103.段落97的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
104.通過(guò)以下步驟制備的條件培養(yǎng)基使新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基與分化的hESC群接觸約24小時(shí)，其中所述hESC已經(jīng)在選自補(bǔ)加3％血清的RPMI、補(bǔ)加活化素A的低血清RPMI和補(bǔ)加BMP4的低血清RPMI的細(xì)胞培養(yǎng)基中分化約5天；以及從所述培養(yǎng)基中去除所述分化的hESC群。
105.段落104的條件培養(yǎng)基，其中所述新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基是RPMI。
106.段落105的條件培養(yǎng)基，其中所述RPMI是低血清RPMI。
107.條件化培養(yǎng)基的方法，所述方法包括以下步驟使新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基與分化的hESC群接觸約24小時(shí)，其中所述hESC已經(jīng)在選自補(bǔ)加3％血清的RPMI、補(bǔ)加活化素A的低血清RPMI和補(bǔ)加BMP4的低血清RPMI的細(xì)胞培養(yǎng)基中分化約5天；以及從所述培養(yǎng)基中去除所述分化的hESC群。
108.段落107的方法，其中所述新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基是RPMI。
109.段落108的條件培養(yǎng)基，其中所述RPMI是低血清RPMI。
應(yīng)了解上述的方法和組合物與體外培養(yǎng)的細(xì)胞有關(guān)。但是，上述體外分化的細(xì)胞組合物可用于體內(nèi)用途。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案可參見以下專利申請(qǐng)2003年12月23日提交的第60/532,004號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“定形內(nèi)胚層”；2004年4月27日提交的第60/566,293號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“表達(dá)PDX1的內(nèi)胚層”；2004年7月9日提交的第60/586,566號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“用于分離定形內(nèi)胚層的趨化因子細(xì)胞表面受體”；2004年12月23日提交的第11/021,618號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)，標(biāo)題為“定形內(nèi)胚層”。


圖1是從hESC產(chǎn)生β-細(xì)胞的假想的分化途徑示意圖。途徑的第一步負(fù)責(zé)ES細(xì)胞至定形內(nèi)胚層系，也代表向胰內(nèi)胚層、內(nèi)分泌內(nèi)胚層或胰島/β-細(xì)胞的進(jìn)一步分化事件前的第一步。途徑的第二步顯示SOX17-陽(yáng)性/PDX1-陰性的定形內(nèi)胚層向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層的轉(zhuǎn)化。在介導(dǎo)這些轉(zhuǎn)化中起作用的因子用斜體字表示。定義靶細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物用下劃線表示。
圖2是人SOX17 cDNA的示意圖，顯示了保守區(qū)的位置并突出顯示了用于通過(guò)GENOVAC的免疫步驟的區(qū)域。
圖3是關(guān)系樹狀圖，顯示SOX17與SOX7關(guān)系最近，與SOX18關(guān)系稍遠(yuǎn)。在同源物種中SOX17蛋白質(zhì)比相同物種中的SOX群F亞族的其它成員的相關(guān)性強(qiáng)得多圖4是用兔抗SOX17抗體作探針的Western印跡，該印跡證明這個(gè)抗體對(duì)成纖維細(xì)胞(1道)中過(guò)表達(dá)的SOX17有特異性，而缺乏與EGFP(2道)或最接近的SOX家族成員SOX7(3道)的免疫反應(yīng)性。
圖5A-B是顯示大量AFP+共標(biāo)記細(xì)胞的SOX17+細(xì)胞簇的顯微照片。這與其他SOX17+簇(B)形成顯著對(duì)比，因?yàn)樵谄渌鸖OX17+簇中只能觀察到很少或者就根本沒有AFP+細(xì)胞。
圖6A-C是顯示體壁內(nèi)胚層和SOX17的顯微照片。圖A顯示隨機(jī)分化的hES細(xì)胞培養(yǎng)物中體壁內(nèi)胚層細(xì)胞表面的人血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。圖B顯示與圖A相同的區(qū)域，對(duì)TM和SOX17雙標(biāo)記。圖C是用DAPI標(biāo)記核的相同區(qū)域的相差圖。注意DAPI標(biāo)記的核和SOX17標(biāo)記的完全對(duì)應(yīng)。
圖7A-B是顯示定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)的SOX17基因表達(dá)和SOX17-特異性抗體檢測(cè)的抗SOX17陽(yáng)性細(xì)胞的條形圖。圖A顯示相對(duì)于未分化的對(duì)照培養(yǎng)基(SR20)活化素A增加SOX17基因表達(dá)，而視黃酸(RA)強(qiáng)烈抑制SOX17表達(dá)。圖B顯示在SOX17+細(xì)胞數(shù)量上反映了相似的模式以及這些變化的相似倍數(shù)，表明Q-PCR檢測(cè)SOX17基因表達(dá)可以在單個(gè)細(xì)胞水平反映出變化。
圖8A是條形圖，顯示活化素A存在下正在分化的hESC培養(yǎng)物保持低水平的AFP基因表達(dá)，而在10％小牛血清(FBS)中隨機(jī)分化的細(xì)胞顯示AFP的強(qiáng)烈上調(diào)。表達(dá)水平的差異大約是7倍。
圖8B-C是兩張顯微圖片，顯示活化素A對(duì)AFP表達(dá)的抑制在單個(gè)細(xì)胞水平也很顯著，因?yàn)橄鄬?duì)于單用10％FBS(頂部)，在活化素A處理的條件(底部)下只能觀察到非常少和小的AFP+細(xì)胞簇。
圖9A-B是顯示使用流式細(xì)胞儀定量的AFP+細(xì)胞數(shù)的對(duì)比圖片。這個(gè)圖證明在活化素A存在(左圖)或缺失(右圖)的條件下，AFP基因表達(dá)(圖8A)的改變倍數(shù)完全對(duì)應(yīng)于AFP+細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)一步支持了使用Q-PCR分析來(lái)指示單個(gè)細(xì)胞水平上發(fā)生的變化。
圖10A-F是顯示使hESC暴露于nodal、活化素A和活化素B(NAA)5天后SOX17+細(xì)胞數(shù)目顯著增加(A-C)的顯微圖片。通過(guò)比較每個(gè)區(qū)域SOX17+細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)目(如DAPI染色的核(D-F)所示)的相對(duì)豐度，可以看出在用NAA處理5天后約30-50％的細(xì)胞對(duì)SOX17顯示免疫反應(yīng)性。
圖11是證明活化素A(0，10，30或100ng/ml)劑量依賴的增加正在分化的hESC中SOX17基因表達(dá)的條形圖。在粘附培養(yǎng)時(shí)處理3天后增加的表達(dá)已經(jīng)很高，并一直持續(xù)到隨后懸浮培養(yǎng)的1、3和5天。
圖12A-C是證明活化素A對(duì)MIXL1(圖A)、GATA4(圖B)和HNF3b(圖C)的表達(dá)的影響的條形圖。也觀察到活化素A劑量依賴的增加定形內(nèi)胚層3種其他標(biāo)志物MIXL1、GATA4和HNF3b。與活化素劑量對(duì)應(yīng)的表達(dá)增加的倍數(shù)與對(duì)SOX17所觀察到的非常相似，表明活化素A特異化共表達(dá)所有4種基因(SOX17+、MIXL1+、GATA4+和HNF3b+)的細(xì)胞群。
圖13A-C是證明活化素A對(duì)AFP(圖A)、SOX7(圖B)和SPARC(圖C)的表達(dá)的影響的條形圖。內(nèi)臟內(nèi)胚層標(biāo)志物AFP的表達(dá)對(duì)活化素A顯示劑量依賴性的降低。原始內(nèi)胚層標(biāo)志物(SOX7)和體壁內(nèi)胚層標(biāo)志物(SPARC)保持不變或在一些時(shí)間點(diǎn)顯示抑制，表明活化素A不起特異化這些胚外內(nèi)胚層細(xì)胞類型的作用。這進(jìn)一步支持了以下事實(shí)SOX17、MIXL1、GATA4和HNF3b表達(dá)的增加歸因于對(duì)應(yīng)活化素A的定形內(nèi)胚層細(xì)胞數(shù)目的增加。
圖14A-B是顯示活化素A對(duì)ZIC1(圖A)和Brachyury(圖B)的表達(dá)的影響的條形圖。神經(jīng)標(biāo)志物ZIC1穩(wěn)定的表達(dá)證明活化素A對(duì)神經(jīng)分化沒有劑量依賴效應(yīng)。Brachyury的表達(dá)降低顯示100ng/ml活化素A處理顯著抑制了中胚層分化。這可能是從中內(nèi)胚層前體向定形內(nèi)胚層特異化增加的結(jié)果。相對(duì)于未處理的對(duì)照培養(yǎng)物，低水平的活化素A(10和30ng/ml)處理在分化的較后期保持brachyury的表達(dá)。
圖15A-B是顯示響應(yīng)活化素處理的體壁內(nèi)胚層分化降低的顯微圖片。在只有血清的條件下分化時(shí)，體壁內(nèi)胚層Tmhi區(qū)域存在于所有培養(yǎng)物中(A)，而包含活化素A時(shí)，向TM+細(xì)胞的分化非常少，TM免疫反應(yīng)性的總強(qiáng)度較低。
圖16A-D是顯示響應(yīng)活化素A和活化素B處理的標(biāo)志物表達(dá)的顯微圖片。hESC用活化素A和活化素B連續(xù)處理4天，用SOX17、AFP和TM抗體三重標(biāo)記。圖A-SOX17；圖B-AFP；圖C-TM；圖DPhase/DAPI。注意到許多SOX17陽(yáng)性細(xì)胞伴隨著AFP(B)和TM(C)免疫反應(yīng)性的完全缺失。
圖17是顯示在體外從hESC出現(xiàn)定形內(nèi)胚層和內(nèi)臟內(nèi)胚層的顯微圖片。通過(guò)AFPhi/SOX17lo/-鑒定內(nèi)臟內(nèi)胚層區(qū)域，而定形內(nèi)胚層顯示完全相反的模式SOX17hi/AFPlo/-。因?yàn)檫@兩個(gè)區(qū)域互相靠近，所以選擇了這個(gè)區(qū)域。但是，在從AFPhi細(xì)胞的任意區(qū)域的完全分離物中經(jīng)常會(huì)觀察到SOX17hi/AFPlo/-區(qū)域，表明來(lái)自內(nèi)臟內(nèi)胚層的定形內(nèi)胚層的單獨(dú)起源。
圖18是描述TGFβ家族的配體和受體的圖表。激活A(yù)R Smads和BR Smads的因子可以在從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生定形內(nèi)胚層的過(guò)程中起作用(參見J Cell Physiol.187265-76)。
圖19是顯示作為經(jīng)單一或組合的TGFβ因子處理結(jié)果的SOX17表達(dá)的誘導(dǎo)隨時(shí)間變化的條形圖。
圖20是顯示作為經(jīng)組合的TGFβ因子處理結(jié)果的SOX17+細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間變化的條形圖。
圖21是顯示作為經(jīng)組合的TGFβ因子處理結(jié)果的SOX17表達(dá)的誘導(dǎo)隨時(shí)間變化的條形圖。
圖22是顯示活化素A劑量依賴性地誘導(dǎo)SOX17+細(xì)胞數(shù)目增加的條形圖。
圖23是條形圖，顯示向活化素A和活化素B處理的培養(yǎng)物中添加Wnt3a促使SOX17的表達(dá)水平高于只用活化素A和活化素B誘導(dǎo)的表達(dá)水平。
圖24A-C是顯示低FBS條件增強(qiáng)向定形內(nèi)胚層分化的條形圖。在含2％FBS的培養(yǎng)基中用活化素A和活化素B處理(2AA)hESC，可導(dǎo)致SOX17的表達(dá)水平比在含10％FBS的培養(yǎng)基中經(jīng)相同處理(10AA)的SOX17的表達(dá)水平高2至3倍(圖A)。定形內(nèi)胚層標(biāo)志物MIXL1(圖B)的誘導(dǎo)也以相同方式受影響，在2％FBS中對(duì)AFP(內(nèi)臟內(nèi)胚層)的抑制比在10％FBS條件下更強(qiáng)(圖C)。
圖25A-D是顯示培養(yǎng)物中SOX17+細(xì)胞分裂的顯微圖片。SOX17免疫反應(yīng)性細(xì)胞存在于hESC克隆的分化邊緣(C、D)，被增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)標(biāo)記(圖B)，但不被OCT4共標(biāo)記(圖C)。此外，在SOX17+細(xì)胞(箭頭)以及OCT4+細(xì)胞，未分化的hESCs(箭頭頭部)中用DAPI標(biāo)記核均可看到清晰的有絲分裂圖(D)。
圖26是顯示在不同培養(yǎng)基條件下正在分化的hESC中CXCR4的相對(duì)表達(dá)水平的條形圖。
圖27A-D是顯示一組定形內(nèi)胚層標(biāo)志物在如同圖26顯示的相同分化處理下如何與CXCR4共享非常相似的表達(dá)模式的條形圖。
圖28A-E是條形圖，顯示中胚層標(biāo)志物(BRACHYURY，MOX1)、外胚層標(biāo)志物(SOX1，ZIC1)和內(nèi)臟內(nèi)胚層標(biāo)志物(SOX7)在如同圖26顯示的相同處理下如何表現(xiàn)出與CXCR4表達(dá)相反的關(guān)系。
圖29A-F是顯示在圖26-28中展示的三種培養(yǎng)基條件下SOX17免疫反應(yīng)性細(xì)胞的相對(duì)差異的顯微圖片。
圖30A-C是流式細(xì)胞點(diǎn)圖，證明CXCR4+細(xì)胞數(shù)目隨添加至分化培養(yǎng)基的活化素A的濃度的增加而增加。
圖31A-D是條形圖，顯示從高劑量活化素A處理(A100-CX+)分離的CXCR4+細(xì)胞比親代群(A100)進(jìn)一步富集定形內(nèi)胚層標(biāo)志物。
圖32是條形圖，顯示使用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)分離的CXCR4+和CXCR4-細(xì)胞的基因表達(dá)以及親代群中的基因表達(dá)。這證明CXCR4+細(xì)胞基本包含了每個(gè)親代細(xì)胞群中所有的CXCR4基因表達(dá)，CXCR4-細(xì)胞群包含很少或沒有CXCR4基因表達(dá)。
圖33A-D是條形圖，證明從高劑量活化素A處理分離的CXCR4+細(xì)胞中中胚層(BRACHYURY，MOX1)、外胚層(SOX1，ZIC1)和內(nèi)臟內(nèi)胚層(SOX7)基因表達(dá)的缺失，這些非定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)已經(jīng)受到抑制。
圖34A-M是顯示可用于鑒定定形內(nèi)胚層細(xì)胞的標(biāo)志物基因的表達(dá)模式的條形圖。圖G-L分別顯示了定形內(nèi)胚層標(biāo)志物FGF 17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1的表達(dá)分析。圖A-F分別顯示了前面描述的細(xì)胞系標(biāo)記基因SOX17、SOX7、SOX17/SOX7、TM、ZIC1和MOX1)的表達(dá)分析。圖M顯示了CXCR4的表達(dá)分析。對(duì)于圖A-M的每一圖，標(biāo)注hESC的列表示來(lái)自純化的人胚胎干細(xì)胞的基因表達(dá)；2NF表示細(xì)胞經(jīng)過(guò)2％FBS處理，不添加活化素；0.1A100表示細(xì)胞經(jīng)0.1％FBS和100ng/ml活化素A處理；1A100表示細(xì)胞經(jīng)過(guò)1％FBS和100ng/ml活化素A處理；2A100表示細(xì)胞經(jīng)過(guò)2％FBS和100ng/ml活化素A處理。
圖35是顯示在含有或不含活化素的條件下培養(yǎng)4天和6天的hESC培養(yǎng)物中PDX1基因相對(duì)表達(dá)的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)和成纖維生長(zhǎng)因子(FGF-10)。
圖36A-F是顯示在含有或不含活化素的條件下培養(yǎng)4天和6天的hESCs培養(yǎng)物中標(biāo)志物基因相對(duì)表達(dá)的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)和成纖維生長(zhǎng)因子(FGF-10)。各圖顯示了下列標(biāo)志物基因表達(dá)的相對(duì)水平(A)SOX17；(B)SOX7；(C)AFP；(D)SOX1；(E)ZIC1；和(F)NFM。
圖37A-C是顯示在含有或不含活化素的條件下培養(yǎng)4天和8天的hESC培養(yǎng)物中標(biāo)志物基因相對(duì)表達(dá)的圖表，其中在第4天添加視黃酸(RA)、成纖維生長(zhǎng)因子(FGF-10)和成纖維生長(zhǎng)因子(FGF-4)的組合。各圖顯示了下列標(biāo)志物基因表達(dá)的相對(duì)水平(A)PDX1；(B)SOX7和(C)NFM。
圖38A-G是顯示在與50ng/ml FGF-10接觸的定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物中標(biāo)志物基因的相對(duì)表達(dá)的圖表，其中在第4天添加1μM、0.2μM或0.04μM視黃酸(RA)與50ng/ml FGF-10聯(lián)合使用。各圖顯示了下列標(biāo)志物基因表達(dá)的相對(duì)水平(A)PDX1；(B)HOXA3；(C)HOXC6；(D)HOXA13；(E)CDX1；(F)SOX1和(G)NFM。
圖39A-E顯示在含有或不含活化素，存在視黃酸(RA)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-10)和下列之中的一種血清替代物(SR)，小牛血清(FBS)或B27構(gòu)成的組合的條件下培養(yǎng)4天和8天的hESC培養(yǎng)物中標(biāo)志物基因的相對(duì)表達(dá)。各欄顯示了下列標(biāo)志物基因表達(dá)的相對(duì)水平(A)PDX1；(B)SOX7；(C)AFP；(D)ZIC1和(E)NFM。
圖40A-B是顯示6天(剛好在添加RA之前)后和9天(暴露于RA 3天后)時(shí)hESC培養(yǎng)物中胰(PDX1、HNF6)和肝(HNF6)的標(biāo)志物基因的相對(duì)表達(dá)的圖表。包括了不同的條件的比較，在25ng/ml(A25)或50ng/ml(A50)的條件下添加了10ng/ml(a10)、25ng/ml(a25)或50ng/ml(a50)的活化素B。不含任何活化素A和活化素B(NF)的條件作為產(chǎn)生定形內(nèi)胚層和PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層的陰性對(duì)照。各圖顯示了下列標(biāo)志物基因表達(dá)的相對(duì)水平(A)PDX1和(B)HNF6。
圖41A-C顯示在含有100ng/ml(A100)、50ng/ml(A50)或不含(NF)活化素A的條件下培養(yǎng)5天(剛好在添加視黃酸之前)時(shí)和添加RA后2、4和6天(分別是第7、9和11天)的hESCs培養(yǎng)物中標(biāo)志物基因的相對(duì)表達(dá)。每個(gè)柱圖下直接標(biāo)記的百分比表明分化3至5天期間的FBS劑量。從第7天開始，用RA處理(R)的細(xì)胞在包含0.5％FBS的RPMI培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。RA的濃度在第7天是2μM，第9天是1μM，第11天是0.2μM。各圖顯示了下列標(biāo)志物基因表達(dá)的相對(duì)水平(A)PDX1；(B)ZIC1和(C)SOX7。
圖42A-B顯示首先在低FBS中用活化素A處理誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層(第5天)，然后用包含25ng/ml活化素A和RA或各種條件培養(yǎng)基(MEFCM、CM#2、CM#3和CM#4)和RA的新鮮(A25R)培養(yǎng)基誘導(dǎo)PDX1-表達(dá)內(nèi)胚層。在第5、6、7、8和9天檢測(cè)標(biāo)志物表達(dá)。各圖顯示了下列標(biāo)志物基因表達(dá)的相對(duì)水平(A)PDX1和(B)CDX1。
圖43顯示了首先在低FBS中用活化素A處理誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層，然后用新鮮培養(yǎng)基處理，該新鮮培養(yǎng)基在以新鮮培養(yǎng)基稀釋的條件培養(yǎng)基中包含活化素A和視黃酸(A25R)或者不同量的RA。培養(yǎng)基的總體積均是5ml。
圖44是Western印跡，顯示PDX1在添加RA和50ng/ml活化素A后3天(d8)和4天(d9)時(shí)RA-處理的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的免疫沉淀。
圖45是一個(gè)概要圖表，顯示遺傳標(biāo)記了在PDX1啟動(dòng)子控制下的EGFP報(bào)告基因的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)的結(jié)果。
圖46為顯示分選的活細(xì)胞(Live)、EGFP-陰性細(xì)胞(Neg)和EGFP-陽(yáng)性細(xì)胞(GFP+)的群在相對(duì)于管家基因校正后的相對(duì)PDX1表達(dá)水平的圖表。
圖47為顯示分選的活細(xì)胞(Live)、EGFP-陰性細(xì)胞(Neg)、一半帶有最低EGFP信號(hào)強(qiáng)度(Lo)的EGFP-陽(yáng)性細(xì)胞群和一半帶有最高EGFP信號(hào)強(qiáng)度(Hi)的EGFP-陽(yáng)性細(xì)胞群的群相對(duì)于管家基因校正后的相對(duì)PDX1表達(dá)水平。
圖48A-E顯示分選的活細(xì)胞(Live)、EGFP-陰性細(xì)胞(Neg)和EGFP-陽(yáng)性細(xì)胞(GFP+)的群相對(duì)于管家基因校正后5種胰內(nèi)胚層標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)水平。各圖A-NKX2.2；B-GLUT2；C-HNF3β；D-KRT19和E-HNF4α。
圖49是顯示分選的活細(xì)胞(Live)、EGFP-陰性細(xì)胞(Neg)和EGFP-陽(yáng)性細(xì)胞(GFP+)的群在相對(duì)管家基因校正后兩種非胰內(nèi)胚層標(biāo)志物的相對(duì)表達(dá)水平。各圖A-ZIC1和B-GFAP。
詳細(xì)描述稱為原腸胚形成的早期人發(fā)育中的重要階段發(fā)生于受精后2～3周。原腸胚形成非常重要，因?yàn)樵谶@個(gè)階段三種主要胚層第一次特異化和組織化(Lu et al.，2001；Schoenwolf和Smith，2000)。外胚層負(fù)責(zé)身體外表和整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的最終形成，而中胚層衍生出心、血、骨、骨骼肌和其他結(jié)締組織。確定的內(nèi)胚層被定義為負(fù)責(zé)整個(gè)腸管(包括食道、胃、小腸和大腸)以及腸管衍生的器官(如肺、肝、胸腺、甲狀旁腺、甲狀腺、膽囊和胰腺)形成的胚層(Grapin-Botton和Melton，2000；Kimelman和Griffin，2000；Tremblay et al.，2000；Wells和Melton，1999；Wells和Melton，2000))。定形內(nèi)胚層與稱為原始內(nèi)胚層的完全分離細(xì)胞系有重要區(qū)別。原始內(nèi)胚層主要負(fù)責(zé)胚外組織的形成，主要是胎盤卵黃囊的腔壁和內(nèi)臟內(nèi)胚層部分和Reichert’s膜的胞外基質(zhì)物質(zhì)。
在原腸胚形成期，定形內(nèi)胚層形成過(guò)程起始于細(xì)胞遷移，其中中內(nèi)胚層細(xì)胞(有形成中胚層或內(nèi)胚層能力的細(xì)胞)遷移穿過(guò)稱為原條的結(jié)構(gòu)。定形內(nèi)胚層衍生自一些遷移穿過(guò)原條前部及節(jié)(在原條最前部區(qū)域的特化結(jié)構(gòu))的細(xì)胞。當(dāng)遷移發(fā)生時(shí)，定形內(nèi)胚層首先集中于最前部腸管，隨后以腸管后端的形成而終止。
發(fā)育過(guò)程中PDX1基因表達(dá)PDX1(也稱為STF-1、IDX-1和IPF-1)是胰和喙十二指腸(rostralduodenum)發(fā)育必需的轉(zhuǎn)錄因子。PDX1首先在胰內(nèi)胚層表達(dá)，胰內(nèi)胚層來(lái)自后部前腸內(nèi)胚層，產(chǎn)生外分泌和內(nèi)分泌細(xì)胞，在小鼠中開始于E8.5。其后，PDX1限定于β-細(xì)胞和一些δ-細(xì)胞。這種表達(dá)模式在成年后也保持。發(fā)育早期PDX1也在鄰近形成中的胰的十二指腸內(nèi)胚層表達(dá)，然后在十二指腸的腸細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞、胃竇及膽總管、膽囊和膽管中表達(dá)。在胰表達(dá)受限時(shí)，這個(gè)表達(dá)區(qū)域主要限于喙十二指腸。
PDX1陽(yáng)性細(xì)胞和與其相關(guān)的步驟本發(fā)明的實(shí)施方案涉及產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞的新的確定明方法，其中PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，能夠分化為衍生自腸管的前腸/中腸區(qū)域(PDX1-陽(yáng)性前腸/中腸內(nèi)胚層)的細(xì)胞、組織或器官。此處使用的“多潛能”或“多潛能細(xì)胞”涉及這樣的細(xì)胞類型，其可產(chǎn)生有限數(shù)量的其他細(xì)胞類型。此處使用的“前腸/中腸”指腸管前部及中部細(xì)胞，包括前腸/中腸連接部的細(xì)胞。
本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案涉及產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，這些PDX1陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，能夠分化為衍生自腸管前部(PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層)的細(xì)胞、組織或器官。
其他優(yōu)選的實(shí)施方案涉及產(chǎn)生腸管后部的PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。在一些實(shí)施方案中，這些PDX1陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞，能夠分化為衍生自腸管的前腸區(qū)域的后部的細(xì)胞、組織或器官。
PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，例如那些根據(jù)此處描述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞，可用于產(chǎn)生完全分化的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)分化基本上不表達(dá)PDX1的定形內(nèi)胚層細(xì)胞(PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞；此處也指定形內(nèi)胚層)產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞?？墒褂么颂幟枋龅姆椒ɑ蚱渌魏我阎椒ǚ只嗄苄约?xì)胞(如胚胎干細(xì)胞)來(lái)制備PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞。2004年12月23日提交的標(biāo)題為“定形內(nèi)胚層”的第11/021,618號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)描述了一種從多能性細(xì)胞方便高效產(chǎn)生PDX1-陰性定形內(nèi)胚層的方法。
產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的方法為從多能性細(xì)胞高效產(chǎn)生胰腺組織(如腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和胰島細(xì)胞)提供了基礎(chǔ)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，人PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞衍生自人PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞，而這些細(xì)胞又衍生自hESC。然后這些人PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞被用于產(chǎn)生功能性的產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞。為得到有效量的產(chǎn)生的胰島素β細(xì)胞，希望在分化為胰島/β-細(xì)胞終點(diǎn)前每個(gè)分化步驟都有高分化效率。因?yàn)镻DX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化代表產(chǎn)生功能性胰島/β-細(xì)胞的一個(gè)早期步驟(如圖1所示)，尤其希望在這一步具有高分化效率。
考慮到需要PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的有效分化，本發(fā)明的一些方面涉及體外方法學(xué)，它會(huì)導(dǎo)致約2％～25％的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)化。典型地，該方法包括以確定的和短暫特定的方式使用培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子條件。通過(guò)使用與PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞特異結(jié)合的試劑從細(xì)胞群中的其他細(xì)胞中分離和/或純化PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，可進(jìn)一步在細(xì)胞群中富集PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞?；蛘?，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可用諸如綠色熒光蛋白(GFP)的報(bào)告基因標(biāo)記，以使得能夠檢測(cè)PDX1表達(dá)。這種熒光標(biāo)記的細(xì)胞可用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)純化。本發(fā)明更深入的方面涉及細(xì)胞培養(yǎng)物和包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的富集的細(xì)胞群，以及鑒定在向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層和從PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層分化中有用的因子。
為測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的數(shù)量，需要一種在培養(yǎng)物或細(xì)胞群中從其他細(xì)胞區(qū)分這種細(xì)胞類型的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及細(xì)胞標(biāo)志物及檢測(cè)和確定這些標(biāo)志物表達(dá)的方法，這些標(biāo)志物的存在、缺失和/或相對(duì)表達(dá)水平是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的指示。此處使用的“表達(dá)”指材料或物質(zhì)的產(chǎn)生以及材料或物質(zhì)產(chǎn)生的水平或數(shù)量。因此，檢測(cè)特定標(biāo)志物的表達(dá)指測(cè)定表達(dá)標(biāo)志物的相對(duì)或絕對(duì)量，或僅僅檢測(cè)標(biāo)志物的存在或缺失。此處使用的“標(biāo)志物”指任何可被觀察或檢測(cè)的分子。例如，標(biāo)志物包括但不局限于、核苷酸(如特定基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)、基因的多肽產(chǎn)物、非基因產(chǎn)物多肽、糖蛋白、糖類、糖脂、脂、脂蛋白或小分子(如分子量小于10,000amu的分子)。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用定量PCR(Q-PCR)測(cè)定標(biāo)志物的存在、缺失和/或表達(dá)水平。例如，某些遺傳標(biāo)志物，如PDX1、SOX17、SOX7、SOX1、ZIC1、NFM、α-胎蛋白(AFP)、同源框A13(HOXA13)、同源框C6(HOXC6)和/或此處描述的其他標(biāo)志物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量用Q-PCR確定。其他實(shí)施方案中，用免疫組化方法檢測(cè)上述基因表達(dá)的蛋白。在其他實(shí)施方案中，使用Q-PCR和免疫組化兩種方法鑒定和檢測(cè)這些標(biāo)志物的量和相對(duì)比例。
使用此處描述的分化和檢測(cè)方法就可能在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中鑒定PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞以及確定這些細(xì)胞的比例。例如，本發(fā)明一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)PDX1基因的水平比PDX1-陰性細(xì)胞或細(xì)胞群高至少約2個(gè)數(shù)量級(jí)。其他實(shí)施方案中，產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞和細(xì)胞群表達(dá)PDX1基因的水平比PDX1-陰性細(xì)胞或細(xì)胞群高2個(gè)以上數(shù)量級(jí)。在其他實(shí)施方案中，產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞群表達(dá)一種或多種選自PDX1、SOX17、HOXA13或HOXC6的標(biāo)志物的水平比PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞高約2個(gè)或2個(gè)以上數(shù)量級(jí)。
此處描述的組合物和方法有幾個(gè)有用的特性。例如，包含PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層的細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞群以及產(chǎn)生該細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)胞群的方法有利于模擬人發(fā)育的早期階段。此外，此處描述的組合物與方法也可用于疾病狀態(tài)(如糖尿病)的治療性干預(yù)。例如，因?yàn)镻DX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層用作有限數(shù)量組織的來(lái)源，它可被用于純組織或細(xì)胞類型的開發(fā)。
從多能性細(xì)胞產(chǎn)生PDX1-陰性定形內(nèi)胚層(定形內(nèi)胚層)從多能性細(xì)胞產(chǎn)生包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞群，首先要產(chǎn)生PDX1-陰性定形內(nèi)胚層(也稱為“定形內(nèi)胚層”)。下面簡(jiǎn)單描述了分化多能性細(xì)胞以產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集的細(xì)胞群的方法，詳細(xì)步驟見2004年12月23日提交的標(biāo)題為“定形內(nèi)胚層”的第11/021,618號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)。在一些方法中，作為起始材料的多能性細(xì)胞是干細(xì)胞。某些方法中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物和包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞的富集的細(xì)胞群產(chǎn)自胚胎干細(xì)胞。此處使用的“胚胎的”指有機(jī)體的一系列發(fā)育階段，開始于單一受精卵，結(jié)束于多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種多細(xì)胞結(jié)構(gòu)除了發(fā)育的配子生殖細(xì)胞外不再包含多能或全能細(xì)胞。除了來(lái)自配子融合的胚胎，術(shù)語(yǔ)“胚胎的”也指來(lái)自體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的胚胎。優(yōu)選的獲得定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法利用人胚胎干細(xì)胞作為起始材料產(chǎn)生定形內(nèi)胚層。該多能性細(xì)胞可以是源自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚胎生殖嵴的細(xì)胞?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的方法在培養(yǎng)基中維持人胚胎干細(xì)胞基本未分化的多能狀態(tài)。在如第5,453,357、5,670,372、5,690,926、5,843,780、6,200,806和6,251,671號(hào)美國(guó)專利中描述了這些方法。
在產(chǎn)生定形內(nèi)胚層細(xì)胞的一些方法中，hESC維持在飼養(yǎng)層上。該方法中，可使用任何能使得hESC維持在多能狀態(tài)的飼養(yǎng)層。一種常用的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層是小鼠成纖維細(xì)胞層。最近，人成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層已用于培養(yǎng)hESC(參見第2002/0072117號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng))。產(chǎn)生定形內(nèi)胚層的被選方法允許不用飼養(yǎng)層就可維持多能hESC。在第2003/0175956號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中描述了無(wú)飼養(yǎng)層條件下維持多能hESC的方法。
此處使用的人胚胎干細(xì)胞可在含或不含血清的培養(yǎng)基中維持。在一些胚胎干細(xì)胞維持步驟中，使用血清替代物。在其他步驟中，使用例如第2003/0190748號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)描述的無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)。
干細(xì)胞在培養(yǎng)基中通過(guò)常規(guī)傳代保持多能狀態(tài)，直到需要分化為定形內(nèi)胚層。一些方法中，通過(guò)向干細(xì)胞培養(yǎng)物中添加有效量的促進(jìn)向定形內(nèi)胚層分化的TGFβ超家族的生長(zhǎng)因子以獲得向定形內(nèi)胚層的分化。對(duì)產(chǎn)生定形內(nèi)胚層有用的TGFβ超家族的生長(zhǎng)因子選自Nodal/活化素(activin)或BMP亞組。在一些優(yōu)選的分化方法中，生長(zhǎng)因子選自Nodal、活化素A、活化素B和BMP4。此外，生長(zhǎng)因子Wnt3a和其他Wnt家族成員有利于定形內(nèi)胚層細(xì)胞的產(chǎn)生。某些分化步驟中，可使用任意上述生長(zhǎng)因子的組合。
對(duì)于多能干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化的一些方法，添加上述生長(zhǎng)因子到細(xì)胞中使培養(yǎng)基中生長(zhǎng)因子的濃度足以促使至少一部分干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化。一些方法中，細(xì)胞培養(yǎng)基中上述生長(zhǎng)因子的濃度是至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、至少約1000ng/ml、至少約2000ng/ml、至少約3000ng/ml、至少約4000ng/ml、至少約5000ng/ml或多于約5000ng/ml。
在多能干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化的某些方法中，先添加上述生長(zhǎng)因子，然后再?gòu)募?xì)胞培養(yǎng)物中去除。例如，生長(zhǎng)因子可在添加約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天后去除。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，生長(zhǎng)因子在添加約4天后去除。
定形內(nèi)胚層的培養(yǎng)物可在含減少的血清或無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在某些培養(yǎng)條件下，血清濃度范圍從約0.05％v/v至約20％v/v。例如，在一些分化步驟中，培養(yǎng)基中血清濃度可低于約0.05％(v/v)、低于約0.1％(v/v)、低于約0.2％(v/v)、低于約0.3％(v/v)、低于約0.4％(v/v)、低于約0.5％(v/v)、低于約0.6％(v/v)、低于約0.7％(v/v)、低于約0.8％(v/v)、低于約0.9％(v/v)、低于約1％(v/v)、低于約2％(v/v)、低于約3％(v/v)、低于約4％(v/v)、低于約5％(v/v)、低于約6％(v/v)、低于約7％(v/v)、低于約8％(v/v)、低于約9％(v/v)、低于約10％(v/v)、低于約15％(v/v)或低于約20％(v/v)。一些方法中，定形內(nèi)胚層在無(wú)血清或在血清替代物的條件下生長(zhǎng)。其他方法中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞在含B27的條件下生長(zhǎng)。該方法中，B27添加物的濃度范圍從約0.1％v/v至約20％v/v。
監(jiān)控多能性細(xì)胞向PDX1-陰性定形內(nèi)胚層(定形內(nèi)胚層)的分化通過(guò)測(cè)定定形內(nèi)胚層特異標(biāo)志物的表達(dá)可監(jiān)控hESC培養(yǎng)物向定形內(nèi)胚層的分化進(jìn)程。在一些方法中，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物的存在或缺失確定某種標(biāo)志物的表達(dá)?；蛘?，某些標(biāo)志物的表達(dá)通過(guò)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中細(xì)胞的標(biāo)志物的水平來(lái)確定。在該方法中，標(biāo)志物表達(dá)的檢測(cè)可以是定性的，也可以是定量的。使用定量PCR(Q-PCR)是對(duì)標(biāo)志物基因產(chǎn)生的標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)行定量的一種方法。進(jìn)行Q-PCR的方法在本領(lǐng)域是公知的。也可用本領(lǐng)域公知的其他方法對(duì)標(biāo)志物基因的表達(dá)進(jìn)行定量。例如，使用針對(duì)感興趣的標(biāo)志物基因產(chǎn)物特異的抗體，檢測(cè)標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)。某些方法中，確定定形內(nèi)胚層特異標(biāo)志物基因的表達(dá)及缺乏hECS和其他細(xì)胞類型特異標(biāo)志物基因的顯著表達(dá)。
如以下實(shí)施例進(jìn)一步描述的，定形內(nèi)胚層可靠的標(biāo)志物是SOX17基因。因此，用此處描述的方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)SOX17標(biāo)志物基因，從而產(chǎn)生SOX17基因產(chǎn)物。定形內(nèi)胚層其他的標(biāo)志物是MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)SOX17標(biāo)志物基因的水平高于表達(dá)SOX7標(biāo)志物基因的水平，而這是原始和內(nèi)臟內(nèi)胚層的特征(見表1)，所以在一些步驟中，SOX17和SOX7的表達(dá)均被監(jiān)控。其他步驟中，監(jiān)控了hESC特異的SOX17和OCT4標(biāo)志物基因的表達(dá)。此外，因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細(xì)胞中SOX17標(biāo)志物基因的表達(dá)水平比AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標(biāo)志物基因的表達(dá)水平高，所以這些基因的表達(dá)也被監(jiān)控。
定形內(nèi)胚層另一個(gè)標(biāo)志物是CXCR4基因。CXCR4基因編碼細(xì)胞表面趨化因子受體，這個(gè)受體的配體是化學(xué)引誘物SDF-1。在成體中含CXCR4受體的細(xì)胞的主要作用被認(rèn)為是造血細(xì)胞向骨髓的遷移、淋巴細(xì)胞運(yùn)輸以及各種B細(xì)胞和巨噬血細(xì)胞系的分化[Kim，C.和Broxmeyer，H.J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]。CXCR4受體還作為HIV-1進(jìn)入T細(xì)胞的共受體[Feng，Y.，et al.Science，272，872-877(1996)]。在[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]進(jìn)行的一系列廣泛的研究中，描繪了在小鼠的早期發(fā)育和成年時(shí)期趨化因子受體CXCR4和它唯一的配體SDF-1[Kim，C.和Broxmeyer，H.，J.Leukocyte Biol.65，6-15(1999)]的表達(dá)。在發(fā)育中CXCR4/SDF1的相互作用非常明顯，因?yàn)橐炎C實(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中破壞CXCR4和SDF1中任一基因[Nagasawa et al.Nature，382，635-638(1996)；Ma，Q.，et al Immunity，10，463-471(1999)]，均會(huì)導(dǎo)致小鼠在胚胎晚期死亡。McGrath等人利用RNase保護(hù)和原位雜交結(jié)合的方法證明在原腸形成胚胎早期(E7.5)CXCR4使檢測(cè)到的最豐富的趨化因子受體信使RNA。在原腸形成胚胎期，CXCR4/SDF-1信號(hào)可能主要參與誘導(dǎo)原條胚層細(xì)胞的遷移，并在此時(shí)的定形內(nèi)胚層、中胚層和胚外中胚層表達(dá)。在E7.2-7.8小鼠胚胎中，CXCR4和α-胎蛋白是互斥的，表明內(nèi)臟內(nèi)胚層中表達(dá)的缺失[McGrath，K.E.et al.Dev.Biology 213，442-456(1999)]。
因?yàn)橥ㄟ^(guò)分化多能性細(xì)胞產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)CXCR4標(biāo)志物基因，所以可通過(guò)監(jiān)控CXCR4的表達(dá)以追蹤定形內(nèi)胚層細(xì)胞的產(chǎn)生。此外，用此處描述的方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞還表達(dá)定形內(nèi)胚層的其他標(biāo)志物，這些標(biāo)志物包括但不限于SOX17、MIXL1、GATA4、HNF3b、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQ1、CMKOR1和CRIP1。因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層表達(dá)CXCR4標(biāo)志物基因的水平高于表達(dá)SOX7基因的水平，所以可監(jiān)控CXCR4和SOX7兩種基因的表達(dá)。其他方法中，CXCR4標(biāo)志物基因和OCT4標(biāo)志物基因的表達(dá)均被監(jiān)控。此外，因?yàn)槎ㄐ蝺?nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)CXCR4標(biāo)志物基因的水平高于表達(dá)AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標(biāo)志物基因的水平，也可以監(jiān)控這些基因的表達(dá)。
應(yīng)了解內(nèi)胚層細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)不妨礙SOX17的表達(dá)。用此處描述的方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞將大量表達(dá)SOX17和CXCR4，但不大量表達(dá)AFP、TM、SPARC或PDX1。
定形內(nèi)胚層的富集、分離和/或純化用任意上述方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞，可通過(guò)利用對(duì)這些細(xì)胞特異的親和標(biāo)簽進(jìn)行富集、分離和/或純化。對(duì)定形內(nèi)胚層細(xì)胞特異的親和標(biāo)簽的例子是抗體、配體或其他對(duì)標(biāo)志物分子特異的結(jié)合試劑，例如多肽，其中所述標(biāo)志物分子存在于定形內(nèi)胚層細(xì)胞表面上，而基本上不存在于在用此處描述的方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物中可以找到的其他細(xì)胞類型上。一些方法中，使用與CXCR4結(jié)合的抗體作為親和標(biāo)簽，以富集、分離或純化定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在其他方法中，使用趨化因子SDF-1或基于SDF-1的其他分子作為親和標(biāo)簽。這些分子包括但不限于SDF-1片段、SDF-1融合物或SDF-1模擬物。
制備抗體和利用抗體進(jìn)行細(xì)胞分離的方法在本領(lǐng)域是公知的，這些方法可用于此處描述的抗體和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè)方法中，將結(jié)合CXCR4的抗體偶聯(lián)到磁珠上，然后與細(xì)胞培養(yǎng)物中的定形內(nèi)胚層細(xì)胞結(jié)合，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)酶處理以減少細(xì)胞間和底物的粘附。隨后將細(xì)胞/抗體/磁珠混合物置于可動(dòng)磁場(chǎng)中，用于分離與磁珠結(jié)合的定形內(nèi)胚層細(xì)胞和未結(jié)合的細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層細(xì)胞與其他細(xì)胞進(jìn)行了物理分離后，抗體結(jié)合被破壞，細(xì)胞重新種于合適的組織培養(yǎng)基中。
也可用其他方法獲得富集的、分離的或純化的定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物或群。例如，在一些實(shí)施方案中，使CXCR4抗體與含定形內(nèi)胚層的細(xì)胞培養(yǎng)物孵育，其中該培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)處理以減少細(xì)胞間和底物的粘附。洗滌、離心和重懸細(xì)胞。細(xì)胞懸浮物與二抗(例如能夠與一抗結(jié)合的FITC偶聯(lián)的抗體)孵育。洗滌、離心并在緩沖液中重懸細(xì)胞。然后用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)對(duì)細(xì)胞懸浮物進(jìn)行分析和分選。收集于CXCR4-陰性細(xì)胞分離后的CXCR4-陽(yáng)性細(xì)胞，從而分離了這種細(xì)胞類型。如果需要，可使用另一親和方法或增加分選次數(shù)對(duì)分離的細(xì)胞組分進(jìn)一步純化，利用的是特異于定形內(nèi)胚層細(xì)胞的相同或不同的標(biāo)志物。
在其他方法中，利用與CXCR4結(jié)合的配體或其他分子富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細(xì)胞。一些方法中，這種分子是SDF-1或其片段、融合物或模擬物。
優(yōu)選方法中，在誘導(dǎo)干細(xì)胞培養(yǎng)物向定形內(nèi)胚層系分化后，從其他非定形內(nèi)胚層細(xì)胞富集、分離和/或純化定形內(nèi)胚層細(xì)胞。應(yīng)了解上述富集、分離和純化步驟可用于該培養(yǎng)物分化的任意階段。
除了剛剛描述的步驟外，還可以用其他細(xì)胞分離技術(shù)分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞。此外，通過(guò)在促進(jìn)定形內(nèi)胚層細(xì)胞選擇性存活或選擇性擴(kuò)增的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行系列傳代培養(yǎng)的方法富集或分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
使用此處描述的方法，富集的、分離的和/或純化的定形內(nèi)胚層細(xì)胞群和/或組織可在體外從多能性細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群產(chǎn)生，例如已經(jīng)進(jìn)行了至少部分分化的干細(xì)胞培養(yǎng)物或群。在一些方法中，細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分化。但在優(yōu)選方法中，細(xì)胞主要定向分化為定形內(nèi)胚層。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生定形內(nèi)胚層。使用此處描述的方法，細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物中的定形內(nèi)胚層含量與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，至少富集了約2至約1000倍。
包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層(定形內(nèi)胚層)的組合物上述方法產(chǎn)生的細(xì)胞組合物包括包含定形內(nèi)胚層的細(xì)胞培養(yǎng)物和富集定形內(nèi)胚層的細(xì)胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少約50～80％的細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。因?yàn)榉只椒ǖ男士赏ㄟ^(guò)改變某些參數(shù)(這些參數(shù)包括但不限于，細(xì)胞生長(zhǎng)條件、生長(zhǎng)因子濃度和培養(yǎng)步驟的時(shí)間控制)來(lái)調(diào)整，此處描述的分化方法可導(dǎo)致約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％或超過(guò)約95％的多能性細(xì)胞向定形內(nèi)胚層的轉(zhuǎn)化。在采用分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法中，例如，通過(guò)使用結(jié)合CXCR4受體的親和試劑，可獲得基本上純的定形內(nèi)胚層細(xì)胞群。
從PDX1-陰性定形內(nèi)胚層產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層此處描述的包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物和群由PDX1-陰性定形內(nèi)胚層產(chǎn)生，其中該P(yáng)DX1-陰性定形內(nèi)胚層如上所述由多能性細(xì)胞產(chǎn)生。一個(gè)優(yōu)選的方法利用人胚胎干細(xì)胞作為起始材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，hESC首先轉(zhuǎn)化為PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)化為PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。但應(yīng)了解用于PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞產(chǎn)生的起始材料并不限于用多能性細(xì)胞分化方法產(chǎn)生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。而且，任何PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞都可用于此處描述的方法，與它們的來(lái)源無(wú)關(guān)。
本發(fā)明一些實(shí)施方案中，包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群可用于進(jìn)一步向包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或富集的細(xì)胞群分化。例如，可使用包含人PDX1-陰性、SOX17-陽(yáng)性的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群可能包含從前面分化步驟(即分化多能性細(xì)胞為定形內(nèi)胚層細(xì)胞的步驟)保留的分化因子，如活化素、nodal和/或BMP。其他實(shí)施方案中，在添加用于PDX1-陰性、SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的因子前，從細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中去除前面分化步驟中的因子。其他實(shí)施方案中，用富集PDX1-陰性、SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群作為產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的來(lái)源。
通過(guò)向包含PDX1-陰性、SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中添加促進(jìn)細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子(前腸分化因子)，培養(yǎng)基中的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞可分化為PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明一些實(shí)施方案中，前腸分化因子是類視黃醇，例如視黃酸(RA)。一些實(shí)施方案中，類視黃醇與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如FGF-4和FGF-10)聯(lián)用。其他實(shí)施方案中，類視黃醇與生長(zhǎng)因子TGFβ超家族成員和/或條件培養(yǎng)基聯(lián)用。
“條件培養(yǎng)基”是指與基本培養(yǎng)基比較發(fā)生了改變的培養(yǎng)基。例如，培養(yǎng)基的條件化可能造成從培養(yǎng)基的初始水平添加或去除分子，例如營(yíng)養(yǎng)物和/或生長(zhǎng)因子。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)在一定條件下使一定類型的細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或維持一定時(shí)間段而使培養(yǎng)基條件化。例如，通過(guò)使hESC在一定溫度、一定組成的培養(yǎng)基中擴(kuò)增、分化或維持一定的時(shí)間而使培養(yǎng)基條件化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，細(xì)胞、培養(yǎng)基類型、持續(xù)時(shí)間和環(huán)境條件的眾多組合可用于產(chǎn)生接近無(wú)窮排列的條件培養(yǎng)基。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)在包含約1％至約20％血清濃度的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或維持分化的多能性細(xì)胞來(lái)?xiàng)l件化培養(yǎng)基。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)使分化的多能性細(xì)胞在包含約1ng/ml至約1000ng/ml活化素A的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)或維持來(lái)?xiàng)l件化培養(yǎng)基。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)使分化的多能性細(xì)胞在包含約1ng/ml至約1000ng/ml BMP4的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或維持來(lái)?xiàng)l件化培養(yǎng)基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)使分化的hESC在包含約25ng/ml活化素A和約2μMRA的培養(yǎng)基(如RPMI)中生長(zhǎng)或維持來(lái)制備條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用于條件化培養(yǎng)基(這些培養(yǎng)基用于增強(qiáng)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層的分化)的細(xì)胞是在含約0％至約20％血清和/或一種或多種TGFβ超家族生長(zhǎng)/分化因子的培養(yǎng)基(方案如RPMI)中從多能性細(xì)胞(如hESC)分化超過(guò)5天的細(xì)胞。添加分化因子(例如活化素A和BMP4)的濃度范圍從約1ng/ml至約1000ng/ml。本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，用于條件化培養(yǎng)基的細(xì)胞在低血清RPMI中從hESC分化超過(guò)5天。根據(jù)一些實(shí)施方案，低血清RPMI指含有低血清的培養(yǎng)基，其中血清濃度在一定時(shí)間段內(nèi)逐漸增加。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，低血清RPMI在細(xì)胞生長(zhǎng)第一天包含濃度約0.2％的胎牛血清(FBS)，細(xì)胞生長(zhǎng)第二天約0.5％FBS，細(xì)胞生長(zhǎng)第3至5天約2％FBS。在另一個(gè)實(shí)施方案中，低血清RPMI第一天包含血清濃度約0％，第二天約0.2％，第3～6天約2％。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，低血清RPMI中添加一種或多種分化因子，方案如活化素A和BMP4。除了制備用于條件化培養(yǎng)基的細(xì)胞，低血清RPMI也可用作PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的培養(yǎng)基。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)了解用于制備條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基不只是RPMI，前提是這種培養(yǎng)基不干擾PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的生長(zhǎng)或維持。還應(yīng)了解用于條件化培養(yǎng)基的細(xì)胞可以是不同的類型。在使用新鮮分化的細(xì)胞來(lái)?xiàng)l件化培養(yǎng)基的實(shí)施方案中，這種細(xì)胞可以在不同于RPMI的培養(yǎng)基中分化，前提是這種培養(yǎng)基不會(huì)抑制這種細(xì)胞的生長(zhǎng)或維持。此外，技術(shù)人員應(yīng)了解條件化的持續(xù)時(shí)間或制備用于條件化的細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間不是分別必須是24小時(shí)或5天，因?yàn)槠渌臅r(shí)間長(zhǎng)度也足以獲得此處報(bào)道的效果。
通常，類視黃醇與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(生長(zhǎng)因子TGFβ超家族的成員)、條件培養(yǎng)基或任意這些前腸分化因子的組合聯(lián)用，都可以造成比單用類視黃醇更強(qiáng)的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層的分化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，添加RA和FGF-10到PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞在含有條件培養(yǎng)基、活化素A、活化素B和RA的培養(yǎng)基中分化。
就此處描述的分化方法的一些實(shí)施方案而論，將上述前腸分化因子添加到細(xì)胞中，使細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中前腸分化因子的濃度足以促進(jìn)至少部分PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化。當(dāng)涉及細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞群時(shí)，術(shù)語(yǔ)“部分”表示細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群任意不為零的數(shù)量，范圍從單個(gè)細(xì)胞到整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，向培養(yǎng)物的細(xì)胞中添加類視黃醇使其濃度至少約0.01μM、至少約0.02μM、至少約0.04μM、至少約0.08μM、至少約0.1μM、至少約0.2μM、至少約0.3μM、至少約0.4μM、至少約0.5μM、至少約0.6μM、至少約0.7μM、至少約0.8μM、至少約0.9μM、至少約1μM、至少約1.1μM、至少約1.2μM、至少約1.3μM、至少約1.4μM、至少約1.5μM，、至少約1.6μM、至少約1.7μM、至少約1.8μM、至少約1.9μM、至少約2μM、至少約2.1μM、至少約2.2μM、至少約2.3μM、至少約2.4μM、至少約2.5μM、至少約2.6μM、至少約2.7μM、至少約2.8μM、至少約2.9μM、至少約3μM、至少約3.5μM、至少約4μM、至少約4.5μM、至少約5μM、至少約10μM、至少約20μM、至少約30μM、至少約40μM或至少約50μM。此處使用的“類視黃醇(retinoid)”指視黃醇、視黃醛或視黃酸以及這些化合物的任何衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，類視黃醇是視黃酸。
本發(fā)明其他實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中存在一種或多種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的分化因子。例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中FGF-4的濃度至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml或至少約1000ng/ml。本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中FGF-10的濃度至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、或至少約1000ng/ml。在一些實(shí)施方案中，從FGF-4和FGF-10中選擇一個(gè)與RA一起添加到細(xì)胞培養(yǎng)物中。優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中RA濃度為1μM，F(xiàn)GF-10濃度為50ng/ml。
本發(fā)明一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)物中存在TGFβ超家族的生長(zhǎng)因子和/或條件培養(yǎng)基。這些分化因子可與RA和/或其它中前腸分化因子(包括但不限于FGF-4和FGF-10)聯(lián)用。例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中可存在活化素A和/或活化素B，其濃度為至少約5ng/ml、至少約10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml或至少約1000ng/ml。本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中存在條件培養(yǎng)基，其濃度是總培養(yǎng)基的至少約1％、至少約5％、至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％或至少約100％。一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物中添加有活化素A、活化素B以及條件培養(yǎng)基和RA。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在包含1μM RA、約25ng/ml活化素A和低血清RPMI培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已被分化的hESC條件化約24小時(shí)，其中分化的hESC已在包含100ng/ml活化素A的低血清RPMI中分化約5天)的培養(yǎng)物中PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化為PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中還存在活化素B和/或FGF-10，其濃度分別是25ng/ml和50ng/ml。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，上述前腸分化因子在添加后從細(xì)胞培養(yǎng)物去除。例如，前腸分化因子可以在添加后約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天或約10天內(nèi)去除。
PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可在含有降低血清濃度的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。血清濃度范圍可從約0.05％(v/v)至約20％(v/v)。在一些實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞生長(zhǎng)在含血清替代物的條件下。例如，在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基的血清濃度可低于約0.05％(v/v)、低于約0.1％(v/v)、低于約0.2％(v/v)、低于約0.3％(v/v)、低于約0.4％(v/v)、低于約0.5％(v/v)、低于約0.6％(v/v)、低于約0.7％(v/v)、低于約0.8％(v/v)、低于約0.9％(v/v)、低于約1％(v/v)、低于約2％(v/v)、低于約3％(v/v)、低于約4％(v/v)、低于約5％(v/v)、低于約6％(v/v)、低于約7％(v/v)、低于約8％(v/v)、低于約9％(v/v)、低于約10％(v/v)、低于約15％(v/v)或低于約20％(v/v)。在一些實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可以在無(wú)血清的條件下生長(zhǎng)。在其他實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞在含血清替代物的條件下生長(zhǎng)。
在其他實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞在B27存在下生長(zhǎng)。在這些實(shí)施方案中，B27可以從約0.1％(v/v)至約20％(v/v)的濃度范圍或者大于20％(v/v)的濃度添加到培養(yǎng)基中。在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中B27的濃度約0.1％(v/v)、約0.2％(v/v)、約0.3％(v/v)、約0.4％(v/v)、約0.5％(v/v)、約0.6％(v/v)、約0.7％(v/v)、約0.8％(v/v)、約0.9％(v/v)、約1％(v/v)、約2％(v/v)、約3％(v/v)、約4％(v/v)、約5％(v/v)、約6％(v/v)、約7％(v/v)、約8％(v/v)、約9％(v/v)、約10％(v/v)、約15％(v/v)或約20％(v/v)?；蛘撸砑拥腂27添加物的濃度可根據(jù)商品化的B27存儲(chǔ)液濃度的倍數(shù)來(lái)計(jì)算。例如，Invitrogen(Carlsbad，CA)提供50×的B27存儲(chǔ)液。向足夠體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加足量這種存儲(chǔ)液可以產(chǎn)生含所需量B27的培養(yǎng)基。例如，向90ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加10ml 50×B27存儲(chǔ)液將得到添加了5×B27的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中B27添加物的濃度可以是約0.1×、約0.2×、約0.3×、約0.4×、約0.5×、約0.6×、約0.7×、約0.8×、約0.9×、約1×、約1.1×、約1.2×、約1.3×、約1.4×、約1.5×、約1.6×、約1.7×、約1.8×、約1.9×、約2×、約2.5×、約3×、約3.5×、約4×、約4.5×、約5×、約6×、約7×、約8×、約9×、約10×、約11×、約12×、約13×、約14×、約15×、約16×、約17×、約18×、約19×、約20×和高于約20×。
監(jiān)控PDX1-陰性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層的分化如同多能性細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化的情況，PDX1-陰性、SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層分化的進(jìn)程可通過(guò)測(cè)定這些細(xì)胞類型特征性的標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)監(jiān)控。這種監(jiān)控使得能決定在不同條件下(例如一種或多種分化因子濃度和環(huán)境條件)足以產(chǎn)生所需量PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層需要的時(shí)間。優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)PDX1的表達(dá)來(lái)決定足以產(chǎn)生所需量PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層所需的時(shí)間。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)志物的存在或缺失來(lái)測(cè)定某些標(biāo)志物的表達(dá)?；蛘撸ㄟ^(guò)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞中標(biāo)志物存在的水平來(lái)測(cè)定某些標(biāo)志物的表達(dá)。在這些實(shí)施方案中，標(biāo)志物表達(dá)的測(cè)量可以是定性或定量的。如上所述，優(yōu)選的定量檢測(cè)由標(biāo)志物基因產(chǎn)生的標(biāo)志物表達(dá)的方法是使用Q-PCR。在具體實(shí)施方案中，Q-PCR被用于通過(guò)定量檢測(cè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層特征性的標(biāo)志物基因的表達(dá)和其他細(xì)胞類型特征性的標(biāo)志物基因表達(dá)的缺失，來(lái)監(jiān)控PDX1-陰性、SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層培養(yǎng)物向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的進(jìn)程。也可以用本領(lǐng)域其他公知的方法定量檢測(cè)標(biāo)志物基因表達(dá)。例如，可利用對(duì)感興趣的標(biāo)志物基因產(chǎn)物特異的抗體來(lái)檢測(cè)標(biāo)志物基因產(chǎn)物的表達(dá)。本發(fā)明一些實(shí)施方案中，測(cè)定了PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層特征性的標(biāo)志物基因的表達(dá)以及PDX-1陰性定形內(nèi)胚層、hESC和其他細(xì)胞類型特征性的標(biāo)志物基因的顯著表達(dá)的缺失。
如以下實(shí)施方案的進(jìn)一步描述，PDX1是與PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層相關(guān)的標(biāo)志物基因。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中測(cè)定了PDX1的表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，也測(cè)定了在PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層表達(dá)的其他標(biāo)志物的表達(dá)，這些標(biāo)志物包括但不限于SOX17、HOXA13和/或HOXC6。因?yàn)槟承┢渌?xì)胞類型(即內(nèi)臟內(nèi)胚層和某些神經(jīng)外胚層)也表達(dá)PDX1，所以本發(fā)明一些實(shí)施方案涉及證明與內(nèi)臟內(nèi)胚層和/或神經(jīng)外胚層有關(guān)的基因表達(dá)的缺失或基本上缺失。例如，在一些實(shí)施方案中，在內(nèi)臟內(nèi)胚層和/或神經(jīng)外胚層表達(dá)的標(biāo)志物(包括但不限于SOX7、AFP、SOX1、ZIC1和/或NFM)的表達(dá)被測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，用此處所述方法產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含表達(dá)SOX7、AFP、SOX1、ZIC1或NFM標(biāo)志物基因的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，用此處所述步驟產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含內(nèi)臟內(nèi)胚層、體壁內(nèi)胚層和/或神經(jīng)細(xì)胞。
PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層的富集，分離和/或純化根據(jù)本發(fā)明的其他方面，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可以被富集、分離和/或純化。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，富集PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞群通過(guò)從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離這種細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞用熒光標(biāo)記，然后用熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)來(lái)與未標(biāo)記細(xì)胞分離。在這類實(shí)施方案中，用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核苷酸或另一編碼可表達(dá)熒光標(biāo)志物基因的核苷酸標(biāo)記PDX1-陽(yáng)性細(xì)胞。例如，在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)拷貝的編碼GFP或其生物學(xué)活性片段的核苷酸被導(dǎo)入多能性細(xì)胞(優(yōu)選的是人胚胎干細(xì)胞)PDX1啟動(dòng)子的下游，以便GFP基因產(chǎn)物或其生物學(xué)活性片段的表達(dá)受PDX1啟動(dòng)子的控制。在一些實(shí)施方案中，編碼PDX1的核苷酸的整個(gè)編碼區(qū)域被編碼GFP或其生物學(xué)活性片段的核苷酸替換。在其他實(shí)施方案中，編碼GFP或其生物學(xué)活性片段的核苷酸與編碼PDX1的核苷酸的至少一部分進(jìn)行框內(nèi)(inframe)融合，從而產(chǎn)生融合蛋白。在這類實(shí)施方案中，融合蛋白保留與GFP相似的熒光能力。
如前所述，熒光標(biāo)記的細(xì)胞(例如上述的多能性細(xì)胞)分化為定形內(nèi)胚層，然后是PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層。因?yàn)镻DX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)熒光標(biāo)志物基因，而PDX1-陰性細(xì)胞不表達(dá)，這兩種細(xì)胞類型可被分離。在一些實(shí)施方案中，用FACS分選包含熒光標(biāo)記的PDX1-陽(yáng)性細(xì)胞和未標(biāo)記的PDX1-陰性細(xì)胞的混合物的細(xì)胞懸浮物。PDX1陽(yáng)性細(xì)胞從PDX1-陰性細(xì)胞分離后收集，從而分離這種細(xì)胞類型。如果需要，可使用相同的或不同的對(duì)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層特異的標(biāo)志物增加分選次數(shù)，以進(jìn)一步純化分離的細(xì)胞組合物。
除了剛剛描述的步驟，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞也可用細(xì)胞分離的其他技術(shù)進(jìn)行分離。此外，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞也可使用在促進(jìn)上述PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞選擇性存活或選擇性擴(kuò)增的生長(zhǎng)條件下進(jìn)行系列傳代培養(yǎng)的方法富集或分離定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
應(yīng)了解上述富集、分離和純化步驟可用于這類培養(yǎng)物的任意分化階段。
使用此處描述的方法，富集的、分離的和/或純化的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的群和/或組織可在體外從已經(jīng)進(jìn)行至少部分分化的PDX1-陰性、SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群得到。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分化。但在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞主要定向分化為PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。一些優(yōu)選的富集、分離和/或純化方法涉及在體外從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
使用此處描述的方法，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物中的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞含量可被富集至少約2至約1000倍。一些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約5至約500倍。其他實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約10至約200倍。其他實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約20至約100倍。其他實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約40至約80倍。某些實(shí)施方案中，與未處理的細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物相比，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞可被富集至少約2至約20倍。
包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層的組合物本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞是多潛能細(xì)胞(PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層)，可以分化為衍生自腸管前部的細(xì)胞、組織或器官。根據(jù)某些實(shí)施方案，PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在優(yōu)選實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞是人細(xì)胞。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及包含一種或多種選自hESC、PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞、PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞和中胚層細(xì)胞的細(xì)胞類型的細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中hESC少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％的全部細(xì)胞。其他實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞少于約90％、少于約85％、少于約80％、少于約75％、少于約70％、少于約65％、少于約60％、少于約55％、少于約50％、少于約45％、少于約40％、少于約35％、少于約30％、少于約25％、少于約20％、少于約15％、少于約12％、少于約10％、少于約8％、少于約6％、少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％的全部細(xì)胞。其他實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中中胚層細(xì)胞少于約90％、少于約85％、少于約80％、少于約75％、少于約70％、少于約65％、少于約60％、少于約55％、少于約50％、少于約45％、少于約40％、少于約35％、少于約30％、少于約25％、少于約20％、少于約15％、少于約12％、少于約10％、少于約8％、少于約6％、少于約5％、少于約4％、少于約3％、少于約2％或少于約1％的占全部細(xì)胞。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及用此處描述的方法產(chǎn)生的包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層作為主要細(xì)胞類型的組合物、例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。一些實(shí)施方案中，用此處描述的方法產(chǎn)生包含至少約99％、至少約98％、至少約97％、至少約96％、至少約95％、至少約94％、至少約93％、至少約92％、至少約91％、至少約90％、至少約85％、至少約80％、至少約75％、至少約70％、至少約65％、至少約60％、至少約55％、至少約54％、至少約53％、至少約52％或至少約51％的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞群。優(yōu)選的實(shí)施方案中、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞包含人細(xì)胞。其他實(shí)施方案中，用此處描述的方法產(chǎn)生包含至少約50％、至少約45％、至少約40％、至少約35％、至少約30％、至少約25％、至少約24％、至少約23％、至少約22％、至少約21％、至少約20％、至少約19％、至少約18％、至少約17％、至少約16％、至少約15％、至少約14％、至少約13％、至少約12％、至少約11％、至少約10％、至少約9％、至少約8％、至少約7％、至少約6％、至少約5％、至少約4％、至少約3％、至少約2％或至少約1％的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或細(xì)胞群。優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞包含人類細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的比例時(shí)不考慮殘留在培養(yǎng)物中的飼養(yǎng)細(xì)胞。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞和PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的混合物的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。例如，能夠產(chǎn)生包含約每95個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約5個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。其他實(shí)施方案中，能夠產(chǎn)生包含約每5個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約95個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。此外，預(yù)期可以得到包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞和PDX1-陰性定形內(nèi)胚層其他比例的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群。例如，預(yù)期可以得到包含約每1,000,000個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每100,000個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每10,000個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1000個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每500個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每100個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每10個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每5個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每4個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每2個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約2個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約4個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約5個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約10個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約20個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約50個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約100個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1000個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約10,000個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約100,000個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞、和約每1個(gè)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞對(duì)應(yīng)至少約1,000,000個(gè)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物。
本發(fā)明一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞衍生自人多能性細(xì)胞，例如人多能干細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，人多能性細(xì)胞衍生自桑椹胚、胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚胎生殖嵴。某些其他實(shí)施方案中，人多能性細(xì)胞衍生自發(fā)育已經(jīng)越過(guò)胚胎期的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的性腺組織或生殖組織。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案涉及包含人細(xì)胞(包括人PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層)的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中至少約2％的人細(xì)胞中PDX1標(biāo)志物的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物的表達(dá)。其他實(shí)施方案中，至少5％的人細(xì)胞中、至少10％的人細(xì)胞中、至少15％的人細(xì)胞中、至少20％的人細(xì)胞中、至少25％的人細(xì)胞中、至少30％的人細(xì)胞中、至少35％的人細(xì)胞中、至少40％的人細(xì)胞中、至少45％的人細(xì)胞中、至少50％的人細(xì)胞中、至少55％的人細(xì)胞中、至少60％的人細(xì)胞中、至少65％的人細(xì)胞中、至少70％的人細(xì)胞中、至少75％的人細(xì)胞中、至少80％的人細(xì)胞中、至少85％的人細(xì)胞中、至少90％的人細(xì)胞中、至少95％的人細(xì)胞中或至少98％的人細(xì)胞中、PDX1標(biāo)志物的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)物或群中人細(xì)胞(其中PDX1的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1，ZIC1和/或NFM的表達(dá))的比例時(shí)不考慮飼養(yǎng)細(xì)胞。
應(yīng)了解本發(fā)明的一些實(shí)施方案涉及包含人PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中從至少約2％到超過(guò)約98％的人細(xì)胞中一種或多種選自SOX17、HOXA13或HOXC6的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，至少約5％的人細(xì)胞中、至少約10％的人細(xì)胞中、至少約15％的人細(xì)胞中、至少約20％的人細(xì)胞中、至少約25％的人細(xì)胞中、至少約30％的人細(xì)胞中、至少約35％的人細(xì)胞中、至少約40％的人細(xì)胞中、至少約45％的人細(xì)胞中、至少約50％的人細(xì)胞中、至少約55％的人細(xì)胞中、至少約60％的人細(xì)胞中、至少約65％的人細(xì)胞中、至少約70％的人細(xì)胞中、至少約75％的人細(xì)胞中、至少約80％的人細(xì)胞中、至少約85％的人細(xì)胞中、至少約90％的人細(xì)胞中、至少約95％的人細(xì)胞中或至少約98％的細(xì)胞中，一種或多種選自SOX17、HOXA13或HOXC6的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1，ZIC1和/或NFM的表達(dá)。一些實(shí)施方案中，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)物或群中人細(xì)胞(一種或多種選自SOX17、HOXA13或HOXC6的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM的表達(dá))的比例時(shí)不考慮飼養(yǎng)細(xì)胞。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及包含哺乳動(dòng)物內(nèi)胚層細(xì)胞(例如人內(nèi)胚層細(xì)胞)的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中至少約2％的內(nèi)胚層細(xì)胞中PDX1標(biāo)志物的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物的表達(dá)。其他實(shí)施方案中，至少約5％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約10％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約15％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約20％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約25％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約30％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約35％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約40％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約45％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約50％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約55％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約60％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約65％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約70％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約75％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約80％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約85％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約90％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約95％的內(nèi)胚層細(xì)胞中或至少約98％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、PDX1標(biāo)志物的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物的表達(dá)。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案涉及包含哺乳動(dòng)物內(nèi)胚層細(xì)胞(例如人內(nèi)胚層細(xì)胞)的組合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，其中至少約2％的胚胎細(xì)胞中一種或多種選自SOX17、HOXA13和HOXC6的標(biāo)志物的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物的表達(dá)。其他實(shí)施方案中，至少約5％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約10％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約15％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約20％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約25％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約30％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約35％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約40％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約45％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約50％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約55％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約60％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約65％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約70％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約75％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約80％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約85％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約90％的內(nèi)胚層細(xì)胞中、至少約95％的內(nèi)胚層細(xì)胞中或至少約98％的內(nèi)胚層細(xì)胞中，一種或多種選自SOX17、HOXA13和HOXC6的標(biāo)志物的表達(dá)高于AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物的表達(dá)。
使用此處描述的方法，可產(chǎn)生基本上不含其他細(xì)胞類型的包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物。關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的細(xì)胞，術(shù)語(yǔ)“基本上不含”表示細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群不含的特異細(xì)胞類型在細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的所有細(xì)胞中占有的比例少于5％。本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用此處描述的方法產(chǎn)生的PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞群或細(xì)胞培養(yǎng)物基本上不含顯著表達(dá)AFP、SOX7、SOX1、ZIC1和/或NFM標(biāo)志物基因的細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)標(biāo)志物基因的表達(dá)對(duì)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的描述如下PDX1高、AFP低、SOX7低、SOX1低、ZIC1低和NFM低。
增加SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞中PDX1的表達(dá)本發(fā)明的一些方面涉及增加包含SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中表達(dá)PDX1基因產(chǎn)物的方法。在這類實(shí)施方案中，向SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞中添加足以增加PDX1基因產(chǎn)物表達(dá)量的分化因子。與分化因子接觸的SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞可以是PDX1-陰性或PDX1-陽(yáng)性。在一些實(shí)施方案中，分化因子可以是類視黃醇。某些實(shí)施例中，使SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞與濃度范圍約0.01μM至約50μM的類視黃醇接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類視黃醇是RA。
在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，通過(guò)使SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的分化因子接觸來(lái)增加包含SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1基因產(chǎn)物的表達(dá)。這類分化因子可單獨(dú)使用或與RA聯(lián)用。一些實(shí)施方案中，使SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞與濃度范圍約10ng/ml至約1000ng/ml的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子接觸。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)GF生長(zhǎng)因子是FGF-10。
本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)使SOX17-陽(yáng)性細(xì)胞與B27接觸來(lái)增加包含SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1基因產(chǎn)物的表達(dá)。這類分化因子可以單獨(dú)使用或與FGF家族分化因子和類視黃醇中的一種或兩種聯(lián)用。一些實(shí)施方案中，使SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞與濃度范圍約0.1％(v/v)至約20％(v/v)的B27接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞與RA、FGF-10和B27接觸。
增加包含SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1基因產(chǎn)物表達(dá)的方法可在降低血清濃度或無(wú)血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行。一些實(shí)施方案中，血清濃度范圍從約0.05％(v/v)至約20％(v/v)。一些實(shí)施方案中，SOX17-陽(yáng)性定形內(nèi)胚層細(xì)胞在含血清替代物的條件下生長(zhǎng)。
能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的因子的鑒定本發(fā)明的其他方面涉及鑒定一種或多種能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子的方法。在這類方法中，獲得包含PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，并測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中PDX1的表達(dá)。在測(cè)定PDX1表達(dá)后，使細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞與候選分化因子接觸。在一些實(shí)施方案中，在使細(xì)胞與候選分化因子接觸時(shí)或與候選分化因子接觸后不久檢測(cè)PDX1的表達(dá)。然后在使細(xì)胞與候選分化因子接觸后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)PDX1表達(dá)。與接觸候選分化因子前的PDX1的表達(dá)相比，如果在接觸候選分化因子后PDX1的表達(dá)增加，候選分化因子可被鑒定為能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。
一些實(shí)施方案中，上述鑒定能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子的方法還包括測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中HOXA13和/或HOXC6基因的表達(dá)。在這類實(shí)施方案中，在使細(xì)胞與候選分化因子接觸前后分別測(cè)定HOXA13和/或HOXC6基因的表達(dá)。與接觸分化因子前PDX1和HOXA13的表達(dá)相比，如果在接觸候選分化因子后，PDX1和HOXA13的表達(dá)增加，就可鑒定候選分化因子能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。相似地，與接觸分化因子前比較，如果在接觸候選分化因子后，PDX1和HOXC6的表達(dá)增加，就可鑒定候選分化因子能夠促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在使細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞與候選分化因子接觸前后分別測(cè)定PDX1、HOXA13和HOXC6的表達(dá)來(lái)鑒定可以促進(jìn)PDX1-陰性定形內(nèi)胚層細(xì)胞向PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的候選分化因子。優(yōu)選實(shí)施方案中，用Q-PCR檢測(cè)PDX1、HOXA13和HOXC6的表達(dá)。
應(yīng)了解在一些實(shí)施方案中，在使細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中的細(xì)胞與候選分化因子接觸時(shí)或在接觸候選分化因子后不久檢測(cè)PDX1、HOXA13和HOXC6中一種或多種的表達(dá)，而不是在細(xì)胞接觸候選分化因子之前檢測(cè)。在這類實(shí)施方案中，將在使細(xì)胞與候選分化因子接觸時(shí)或在接觸候選分化因子后不久PDX1、HOXA13和HOXC6中的一種或多種的表達(dá)與在細(xì)胞接觸候選分化因子后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PDX1、HOXA13和HOXC6中的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)進(jìn)行比較。
在上述方法的一些實(shí)施方案中，在細(xì)胞與候選分化因子接觸后檢測(cè)PDX1表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的范圍可以從約1小時(shí)至約10天。例如，可以在細(xì)胞與候選分化因子接觸后約1小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約2小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約4小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約6小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約8小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約10小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約12小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約16小時(shí)、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約24小時(shí)，細(xì)胞與候選分化因子接觸后約2天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約3天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約4天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約5天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約6天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約7天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約8天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約9天、細(xì)胞與候選分化因子接觸后約10天或細(xì)胞與候選分化因子接觸后超過(guò)10天檢測(cè)PDX1的表達(dá)。
用于此處描述的方法的候選分化因子可以選自化合物，例如多肽和小分子。例如，候選多肽包括但不限于生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、胞外基質(zhì)蛋白和合成肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子來(lái)自FGF家族，例如FGF-10。候選小分子包括但不限于從組合化學(xué)合成的化合物和天然產(chǎn)物，例如類固醇、類異戊二烯、萜類化合物、類苯基丙烷(phenylpropanoid)、生物堿類和類黃酮。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解有數(shù)千種天然和合成的小分子可以利用，預(yù)期可用于此處描述的方法的小分子不限于以上舉例的種類。代表性地，小分子的分子量低于10,000amu。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，小分子是類視黃醇，例如RA。
能夠促進(jìn)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的因子的鑒定本發(fā)明的其他方面涉及鑒定一種或多種能夠促進(jìn)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞分化的分化因子的方法。在這類方法中，獲得包含PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，并測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群中標(biāo)志物的表達(dá)。在測(cè)定標(biāo)志物的表達(dá)后，使細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群的細(xì)胞與候選分化因子接觸。在一些實(shí)施方案中，在使細(xì)胞與候選分化因子接觸時(shí)或在接觸候選分化因子后不久檢測(cè)標(biāo)志物的表達(dá)。然后在細(xì)胞與候選分化因子接觸后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)相同標(biāo)志物的表達(dá)。與接觸分化因子前比較，如果在接觸候選分化因子后，標(biāo)志物的表達(dá)增加或降低，就可鑒定候選分化因子能夠促進(jìn)PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用Q-PCR檢測(cè)標(biāo)志物的表達(dá)。
在上述方法的一些實(shí)施方案中，在使細(xì)胞與候選分化因子接觸后檢測(cè)標(biāo)志物表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的范圍可以從約1小時(shí)至約10天。例如，可以在使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約1小時(shí)、使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約2小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約4小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約6小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約8小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約10小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約12小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約16小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約24小時(shí)，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約2天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約3天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約4天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約5天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約6天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約7天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約8天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約9天，使細(xì)胞與候選分化因子接觸后約10天或使細(xì)胞與候選分化因子接觸后超過(guò)10天檢測(cè)標(biāo)志物的表達(dá)。
如前面所述，用于此處描述的方法的候選分化因子可以選自例如多肽或小分子的化合物。
盡管此處公開的每種方法都關(guān)于PDX1-陽(yáng)性前腸內(nèi)胚層細(xì)胞，應(yīng)了解在某些實(shí)施方案中，該方法可用于產(chǎn)生包含此處描述的PDX1-陽(yáng)性前腸/中腸內(nèi)胚層細(xì)胞和/或此處描述的前腸后部的PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物。此外，本說(shuō)明書中公開的任何PDX1-陽(yáng)性內(nèi)胚層細(xì)胞類型都可用在此處描述的篩選方法中。
以上概括描述了本發(fā)明，可通過(guò)參照此處提供的某些具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
實(shí)施例以下很多實(shí)施例描述了人多能性細(xì)胞的使用。產(chǎn)生人多能性細(xì)胞的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，在許多科學(xué)出版物中都有描述，包括第5,453,357、5,670,372、5,690,926、6,090,622、6,200,806和6,251,671號(hào)美國(guó)專利及
發(fā)明者凱文·艾倫·達(dá)穆爾, 艾倫·D·阿古尼克, 蘇珊·埃利澤, 伊曼紐爾·E·貝特格 申請(qǐng)人:賽瑟拉公司