專利名稱：改進(jìn)的2－脫氧－d－核糖－5－磷酸醛縮酶及其用于生產(chǎn)2,4,6－三脫氧己糖或其6－鹵 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下述酶的經(jīng)過(guò)分離的突變體，所述酶來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，所述野生型酶來(lái)自屬于由真核物種和原核物種構(gòu)成的組的天然來(lái)源，此類野生型酶每種都具有特定的生產(chǎn)率因子(productivity factor)，這是通過(guò)在由乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(下文中也稱為CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定的。在本文中，提高的生產(chǎn)率因子指下述變化的組合(且有利的)結(jié)果此類醛縮酶針對(duì)α-離去基團(tuán)取代的乙醛和乙醛的抗性、催化活性和親和性方面的變化。測(cè)定所述生產(chǎn)率因子的方法被描述于本文實(shí)驗(yàn)部分，在下文中將被稱為“DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)”(下文中一些時(shí)候也稱為DPFT)。野生型酶是可從天然來(lái)源或環(huán)境樣品分離出的酶；此類酶的天然存在的突變體(即，也可從天然來(lái)源或環(huán)境樣品分離出的突變體，在本專利申請(qǐng)范圍內(nèi)也被認(rèn)為是野生型酶)。因此，對(duì)本專利申請(qǐng)而言，術(shù)語(yǔ)“突變體”僅用于表示，它們是通過(guò)對(duì)編碼野生型酶的DNA(核酸)進(jìn)行有目的的突變，已從或正從野生型酶獲得的(通過(guò)隨機(jī)誘變，例如，在PCR協(xié)助下、或通過(guò)UV照射的手段；或通過(guò)定點(diǎn)突變，例如，通過(guò)PCR方法、飽和誘變等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可選地，采用此類突變的重組，例如，通過(guò)WO/010311所述的重組技術(shù))。
在自然界中，2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，例如，來(lái)自E.coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA，EC 4.1.2.4)已知能以對(duì)映異構(gòu)體選擇性方式催化乙醛和D-甘油醛-3-磷酸酯之間的(可逆)醛醇縮合反應(yīng)，形成2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯。就本專利申請(qǐng)的目的而言，能以對(duì)映異構(gòu)體選擇性方式催化該反應(yīng)，或能對(duì)映異構(gòu)體選擇性方式催化從α-離去基團(tuán)取代的乙醛和乙醛的反應(yīng)形成2，4，6-三脫氧己糖的任何酶都被認(rèn)為具有DERA活性。
如，例如US-A-5,795,749所述，某些2，4，6-三脫氧己糖的合成可通過(guò)使用2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶作為對(duì)映異構(gòu)體選擇性催化劑來(lái)完成。在所述方法中，使用乙醛和2-取代的乙醛作為反應(yīng)物，通過(guò)4-取代的-3-羥基正丁醛中間產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。因此，例如，按照Gijsen&Wong in JACS116(1994)，8422頁(yè)所述，2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶可被用于合成半縮醛6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷的過(guò)程。如上所述，該半縮醛化合物在本文中也被稱為CTeHP。其在對(duì)某些(4R，6S)-2-(6-取代的-1，3-二氧雜環(huán)己烷-4-基)乙酸衍生物(本申請(qǐng)中其將被成為CtBDAc)(例如，其叔丁酯)的生產(chǎn)過(guò)程中是合適的中間產(chǎn)物。此類2，4，6-三脫氧己糖和6-鹵代或6-氰基取代的其衍生物，以及此類(4R，6S)-2-(6-取代的-1，3-二氧雜環(huán)己烷-4-基)乙酸衍生物，和可被認(rèn)為與它們等同的其它化合物，在對(duì)具有降膽固醇性質(zhì)或抗腫瘤性質(zhì)的重要藥物產(chǎn)品組的生產(chǎn)中，是有價(jià)值的手性構(gòu)建基材(building block)。此類藥物的重要例子是所謂的斯達(dá)汀(statin)，例如，伐他汀(vastatin)，瑞舒伐他汀(rosuvastatin)(Crestor_，AstraZeneca的商品名)或阿托伐他汀(atorvastatin)(Lipitor_，Pfizer的商品名)。斯達(dá)汀的其它例子是洛伐他汀(lovastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)和氟伐他汀(fluvastatin)。這些斯達(dá)汀通常已知作為所謂的HMG-CoA還原酶抑制劑發(fā)揮作用。此外，此類藥物化合物(或其中間產(chǎn)物)的多種衍生物也已知是人們有興趣的，例如，半縮醛6-氰基-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(在本申請(qǐng)中其被稱為CyTeHP)，其可能是生產(chǎn)阿托斯達(dá)汀的替代性中間產(chǎn)物。
如WO 03/006656所述，US-A-5,795,749(上文所述)的酶催化的醛醇縮合的已知缺點(diǎn)是，生產(chǎn)能力低。因此WO 03/006656中成功地克服了此類生產(chǎn)能力低的問(wèn)題，這是通過(guò)以相對(duì)高濃度的反應(yīng)物來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，以及通過(guò)優(yōu)選使用來(lái)自E.coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA，EC 4.1.2.4)組合α-氯乙醛作為乙醛之外的優(yōu)選底物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
但是，如本發(fā)明的發(fā)明人在他們得到本發(fā)明的研究中所觀察到的，不幸的是，DERA酶迄今為止顯示出對(duì)醛類底物僅具有相當(dāng)?shù)偷目剐?特別是對(duì)于乙醛，對(duì)于α-L-取代的乙醛甚至更顯著)。具體而言，如果離去基團(tuán)L是氯的話，在有用于生物合成三脫氧己糖的濃度下，觀察到了DERA酶的非常高的失活。此外，如本發(fā)明的發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的，已知的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶對(duì)氯乙醛底物看起來(lái)具有非常低的親和性和活性。就這些理由而言，事實(shí)上，需要相對(duì)大量的(昂貴的)DERA酶來(lái)獲得良好的合成反應(yīng)產(chǎn)量。因此，人們非常需要找到具有提高的生產(chǎn)率因子(即，此類酶針對(duì)α-L-取代的乙醛和乙醛的抗性、催化活性的變化的組合結(jié)果應(yīng)當(dāng)是有利的)的DERA酶。當(dāng)然，優(yōu)選地，還應(yīng)當(dāng)提高向三脫氧己糖的合成路徑的生產(chǎn)能力。
應(yīng)當(dāng)注意到，W.A.Greenberg et al.，in PNAS，vol.101，p.5788-5793(2004)的近來(lái)文章描述了下述嘗試發(fā)現(xiàn)在DERA反應(yīng)中具有提高的定體積生產(chǎn)率的野生型DERA酶，并且公開(kāi)了來(lái)自一種未知來(lái)源的生物的野生型DERA的氨基酸序列。如下文將要討論的，該文章還描述了用于發(fā)現(xiàn)DERA酶的篩選方法的特定途徑。但是，作者主要關(guān)注底物抑制，而沒(méi)有真正解決DERA酶與(相對(duì)高)濃度的例如氯乙醛組合使用時(shí)固有的問(wèn)題，即，酶的強(qiáng)烈失活。事實(shí)上，作者試圖通過(guò)以等同于底物被反應(yīng)消耗的速率補(bǔ)充底物，來(lái)最小化底物抑制的問(wèn)題。
如上所述，自然界中，2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶能以對(duì)映異構(gòu)體選擇性方式催化乙醛和D-甘油醛-3-磷酸酯之間的(可逆)醛醇縮合反應(yīng)，形成2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯。就本專利申請(qǐng)的目的而言，該天然反應(yīng)，更準(zhǔn)確地，其逆反應(yīng)(即，2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯降解為乙醛和D-甘油醛-3-磷酸酯)將被用作為參照反應(yīng)之一，以建立針對(duì)提供的突變體酶的抗性(即，穩(wěn)定性)數(shù)據(jù)。因此，該降解反應(yīng)在下文中被稱為DERA天然底物反應(yīng)。但是，為評(píng)估突變體酶的生產(chǎn)率，除DERA天然底物反應(yīng)之外，還將使用另外的檢驗(yàn)分析反應(yīng)，即，DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)(DPFT)，其用氯乙醛和乙醛作為底物。如前文所述，生產(chǎn)率表示活性、抗性(穩(wěn)定性)和親和性的改變的組合(即，綜合(net))效果。
在本發(fā)明的上下文中，每種情況下，DERA突變體在所述DERA天然底物反應(yīng)和/或DPFT反應(yīng)中的抗性和生產(chǎn)率將與從中獲得突變體的野生型酶的相比，和/或?qū)⑴cE.coli K12 DERA(野生型DERA)相比。
優(yōu)選地，在對(duì)兩種酶的特定生產(chǎn)率因子加以比較時(shí)，使用相同條件?！跋嗤瑮l件”表示，除了編碼兩種不同的酶的不同核酸序列之外，兩種DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)之間，設(shè)置上沒(méi)有任何實(shí)質(zhì)性不同。這意味著，例如溫度、pH、不含細(xì)胞的提取物(cfe)、氯乙醛和乙醛的濃度的參數(shù)，遺傳背景(例如表達(dá)系統(tǒng)，即表達(dá)載體和宿主細(xì)胞等)優(yōu)選保持為一樣的。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“提高的生產(chǎn)率因子”由此指，在本文實(shí)驗(yàn)部分所述的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)條件下，抗性、催化活性和親和性改變的(有利)結(jié)果，尤其要考慮DPFT反應(yīng)結(jié)果。本申請(qǐng)中使用的生產(chǎn)率因子因此更為準(zhǔn)確地對(duì)應(yīng)于CTeHP形成值。在DERA天然底物反應(yīng)和/或DPFT反應(yīng)中，根據(jù)本發(fā)明提供的DERA突變體比突變體來(lái)源的野生型DERA酶，和/或比E.coliK12 DERA至少高產(chǎn)10％。因此，在存在α-離去基團(tuán)取代的乙醛和乙醛的情況下，它們具有實(shí)質(zhì)上更好的抗性(即，在給定的時(shí)間段，它們的活性水平保持為更高的百分比)，或者在天然底物DERA反應(yīng)中通常實(shí)質(zhì)上更具活性。
本發(fā)明還特別涉及一種方法，用于從2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的組中篩選出下述野生型酶，在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定時(shí)，所述野生型酶的生產(chǎn)率因子比來(lái)自Escherichia coliK12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子高至少10％。
本發(fā)明還特別涉及一種方法，從2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的組中篩選出下述突變體酶，在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定時(shí)，所述突變體酶的生產(chǎn)率因子比相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％。更具體地，其還涉及一種方法，從2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的組中篩選出下述酶，所述酶的生產(chǎn)率因子比來(lái)自Echerichiacoli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子高至少10％。SEQ ID NO.1的序列在下文序列表中<400>1下示出。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“突變體(酶)”被用來(lái)包括下述突變體通過(guò)對(duì)編碼野生型DERA酶的DNA(核酸)進(jìn)行遺傳工程改造，導(dǎo)致在編碼野生型DERA酶(例如，E.coli K12 DERA)的氨基酸序列中出現(xiàn)替換或取代、缺失、截短和/或插入而獲得的突變體，所述核酸序列例如SEQ IDNO.6(見(jiàn)序列表，<400>6下)的核酸，其編碼來(lái)自E.coli K12的野生型DERA酶。
本發(fā)明還將涉及經(jīng)過(guò)分離的核酸，其編碼上述突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，當(dāng)與獲得突變體的野生型DERA酶相比，和/或與E.coliK12 DERA相比時(shí)，所述突變體酶具有更高的和提高的生產(chǎn)率因子；本發(fā)明還涉及包含此類經(jīng)過(guò)分離的核酸的載體，所述核酸編碼根據(jù)本發(fā)明的突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶；涉及包含此類核酸和/或載體的宿主細(xì)胞。
最后，本發(fā)明還涉及對(duì)前文提到的藥物產(chǎn)品或其衍生物和中間產(chǎn)物的改進(jìn)合成方法，這是通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，或通過(guò)使用編碼此類突變體的核酸，或通過(guò)使用包含此類核酸的載體，或通過(guò)使用包含此類核酸和/或載體的宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
經(jīng)過(guò)詳細(xì)研究后，本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，已可獲得大量的突變體DERA酶，在用于生產(chǎn)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)時(shí)，所述酶具有提高的生產(chǎn)率因子。即，本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，可從屬于由真核物種和原核物種構(gòu)成的組的天然來(lái)源獲得下述酶的經(jīng)過(guò)分離的突變體，所述酶來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，所述野生型酶每種都具有特定的生產(chǎn)率因子，這是通過(guò)在由乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)CTeHP的生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定的，其中，所述經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比從中獲得突變體的相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，并且其中，突變體和相應(yīng)野生型酶兩者的生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的。
根據(jù)本發(fā)明的、來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組的酶的經(jīng)過(guò)分離的突變體可從來(lái)自真核生物來(lái)源的DERA獲得，或者更優(yōu)選地，可從原核生物來(lái)源的DERA獲得。當(dāng)DERA來(lái)自真核生物來(lái)源時(shí)，它們是從含有由膜束縛的細(xì)胞核和細(xì)胞器的一種或多種真核細(xì)胞構(gòu)成的生物體獲得的。真核細(xì)胞，例如，可以是來(lái)自人、動(dòng)物(例如，小鼠)、植物和真菌以及來(lái)自被統(tǒng)稱為“原生生物界(Protista)”的其它組的細(xì)胞。合適的DERA，例如，可從屬于后生生物界(Metazoa)的真核來(lái)源獲得，即，從海綿和原生動(dòng)物之外的動(dòng)物獲得，例如，從線蟲、節(jié)肢動(dòng)物和脊椎動(dòng)物獲得，例如，來(lái)自Caenorhabditis elegans、Drosophila melanogaster、Mus musculus和Homo sapiens。
但是，更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA來(lái)自原核生物來(lái)源，即，來(lái)自沒(méi)有細(xì)胞核的單細(xì)胞生物，通常屬于古生菌(Archaea，包含Crenarchaeota和Euryarchaeota門)和細(xì)菌界。
對(duì)從中獲得根據(jù)本發(fā)明的合適的DERA突變體的、屬于古生菌界的物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的調(diào)查展示于表1中。最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明得經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA來(lái)自細(xì)菌來(lái)源。對(duì)從中獲得根據(jù)本發(fā)明的合適的DERA突變體的、屬于古生菌界的物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的調(diào)查展示于表1中。表1和表2中，GI代表用于從NCBI Entrez瀏覽器獲取氨基酸序列的通用標(biāo)識(shí)符；GI之后的數(shù)字可被用于訪問(wèn)野生型DERA的氨基酸序列和編碼所述氨基酸序列的核酸序列，例如，通過(guò)在可由下述站點(diǎn)/搜索引擎NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)訪問(wèn)的數(shù)據(jù)庫(kù)中使用這些數(shù)字來(lái)訪問(wèn)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，通過(guò)本身已知的方法，在蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，例如使用上述站點(diǎn)/搜索引擎，可以容易地發(fā)現(xiàn)除了表1和標(biāo)2中所提到的那些之外的野生型DERA氨基酸序列和編碼這些野生型DERA的核酸序列。
在細(xì)菌界中，突變體DERA最優(yōu)選基于來(lái)自Proteobacteria門的野生型DERA，其中，更具體地，來(lái)自Gamma-proteobacteria綱，尤其是來(lái)自Enterobacteriaceae科所屬于的Enterobacteriales目。所述科包括Escherichia等屬。
因此，用于本發(fā)明上下文的合適的突變體DERA，例如可通過(guò)對(duì)編碼來(lái)自下述原核生物來(lái)源的野生型酶的DNA進(jìn)行有目的的突變來(lái)獲得，所述原核生物來(lái)源被概括于表3中，其排列順序大致為與Escherichia coliK12的相同性百分比升序(從大約20％的相同性至大約100％的相同性)。
表1古生菌
表2細(xì)菌
表2(續(xù))細(xì)菌
表3用于合適的突變體的原核生物來(lái)源Thermoplasma volcanium、Thermoplasma acidophilum、Aeropyrumpernix、Aquifex aeolicus、Sinorhizobium meliloti、Oceanobacillusiheyensis，、Pyrobaculum aerophilum、Thermococcus kodakaraensis、Lactobacillus plantarum、Methanothermobacter thermoautotrophicus、Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma pirum、Mycoplasma genitalium、Mycoplasma hominis、Mycoplasma pulmonis、Thermotoga maritima、Synechocystis sp.PCC 6803、Treponema pallidum、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、Nostoc sp.PCC 7120、Halobacterium sp.NRC-1、Haemophilus influenzae、Haemophilus ducreyi、Yersinia pestis、Ureaplasma parvum、Staphylococcus aureus subsp.aureus Mu50、respectively subsp.aureus MW2、Staphylococcus epidermidis、Pasteurellamulticoda、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium leprae、Lactococcus lactis subsp.lactis、Enterococcus faecalis、Corynebacteriumglutamicum、Thermoanaerobacter tengcongensis、Bacillus subtilis、Bacillushalodurans、Bacillus cereus、Bacillus anthracis菌株Ames、Listeriainnocua、Listeria monocytogenes、Clostridium perfringens、Clostridiumacetobutylicum、W.A.Greenberg et al.in PNAS，vol.101，p.5788-5793(2004)的文章中提到的環(huán)境樣品、Deinococcus radiodurans、Pseudomonassyringae、Streptomyces coelicolor、Agrobacterium tumefaciens strain C58、Burkholderia mallei、Burkholderia pseudomallei、Chromobacteriumviolaceum、Shewanella oneidensis、Vibrio cholerae、Vibrio vulnificus、Vibrio parahaemolyticus、Photorhabdus luminescens、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium、Shigella flexneri、Escherichia coli O157:H7、Escherichia coli CFT073、Escherichia coli K12。
根據(jù)本發(fā)明獲得的、用于比較突變體的特定生產(chǎn)率因子的非常合適的野生型參照DERA是來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)，其從N-末端到C-末端具有SEQ ID NO.1的野生型酶序列
1020 30 40 50 60MTDLKASSLR ALKLMDLNTL NDDDTDEKVI ALCHQAKTPV GNTAAICIYP RFIPIARKTL7080 90100110120KEQGTPEIRI ATVTNFPHGN DDIDIALAET RAAIAYGADE VDVVFPYRAL MAGNEQVGFD130 140150160170180LVKACKEACA AANVLLKVII ETGELKDEAL IRKASEISIK AGADFIKTST GKVAVNATPE190 200210220230240SARIMMEVIR DMGVEKTVGF KPAGGVRTAE DAQKYLAIAD ELFGADWADA RHYRFGASSL250 259LASLLKALGH GDGKSASSY因此，本發(fā)明還涉及下述酶的經(jīng)過(guò)分離的突變體，所述酶來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，所述野生型酶來(lái)自屬于由真核物種和原核物種構(gòu)成的組的天然來(lái)源，此類野生型酶每種都具有特定的生產(chǎn)率因子，這是通過(guò)在由乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定的，其中，經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，并且其中，突變體和相應(yīng)野生型酶兩者的生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的，并且其中，經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1的野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，并且其中，突變體和Escherichia coli K12酶兩者的生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的。
應(yīng)當(dāng)注意，E.coli K12(W3110)DERA酶的野生型序列(259個(gè)氨基酸；SEQ ID NO.1)，以及編碼所述DERA酶的核苷酸序列(780個(gè)核苷酸，SEQ ID NO.6，見(jiàn)序列表)，已由P.Valentin-Hansen et al.在“Nucleotide sequence of the deoC gene and the amino acid sequence of theenzyme”，Eur.J.Biochem.125(3)，561-566(1982)中進(jìn)行了描述。
DeSantis et al.，2003，Bioorganic&Medicinal Chemistry 11，pp 43-52公開(kāi)了對(duì)來(lái)自E.coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)進(jìn)行的五處定點(diǎn)突變的設(shè)計(jì)，所述突變位于E.coli DERA的磷酸酯結(jié)合袋中K172E、R207E、G205E、S238D和S239E。這些突變體DERA酶中，S238D和S239E顯示出較之野生型酶，其針對(duì)非磷酸化的天然底物(2-脫氧-D-核糖)具有更高的活性。US 2003/0232416中也公開(kāi)了E.coli的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的這些同樣的突變體。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在以缺省設(shè)置(矩陣Gonnet 250；GAPOPEN10；END GAPS10；GAP EXTENSION0.05；GAPDISTANCES8)，使用ClustalW，版本1.82 http://www.ebi.ac.uk/clustalw多序列比對(duì)進(jìn)行的序列比對(duì)研究中，可被用于獲得根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過(guò)分離的突變體的、真核和原核生物來(lái)源的DERA與來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)的SEQ ID NO.1的野生型酶序列的相同性百分比可在很寬的范圍內(nèi)變化。甚至在大約20％的相同性百分比處，仍能發(fā)現(xiàn)非常合適的、可用作為獲得本發(fā)明突變體的起始點(diǎn)的DERA。
發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與SEQ ID NO.1的野生型酶序列比較時(shí)，可用于本發(fā)明的所有DERA(以及由其獲得的突變體)都共同具有至少八個(gè)保守的氨基酸，即，F(xiàn)76、G79、E100、D102、K167、T170、K201和G204。因此，下文所述的所有突變都發(fā)生于不同于這些保守位點(diǎn)的位點(diǎn)。可能注意到，按照Heine et al.in“Observation of covalent intermediates in an enzymemechanism at atomic resolution”，Science 294，369-374(2001)，K167是重要的活性位點(diǎn)賴氨酸，其與乙醛形成Schiff堿中間產(chǎn)物；K201和D102涉及“激活”K167的催化性質(zhì)子傳遞(proton relay)系統(tǒng)。其它五個(gè)殘基迄今還未被描述為保守的，或?qū)τ诶绲孜镒R(shí)別或催化來(lái)說(shuō)重要的。
優(yōu)選地，經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA具有比突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子。所述生產(chǎn)率因子比相應(yīng)野生型酶優(yōu)選高至少20％，更優(yōu)選至少30％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少40％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少100％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少200％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少500％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少1000％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少1500％。
更優(yōu)選地，經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA具有比E.coli K12 DERA的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子。所述生產(chǎn)率因子比E.coli K12 DERA優(yōu)選高至少20％，更優(yōu)選至少30％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少40％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少100％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少200％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少500％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少1000％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少1500％。
已被發(fā)現(xiàn)為非常有用于目標(biāo)反應(yīng)的、一組非常重要的經(jīng)過(guò)分離的突變體是來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1野生型酶序列)的經(jīng)過(guò)分離的突變體。這些經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA具有比SEQ ID NO.1的酶序列的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子。所述生產(chǎn)率因子比SEQ ID NO.1的酶序列優(yōu)選高至少20％，更優(yōu)選至少30％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少40％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少50％，以及進(jìn)一步更優(yōu)選至少100％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少200％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少500％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少1000％，進(jìn)一步更優(yōu)選至少1500％。
本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，非常合適的經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA是這樣獲得的，其中，突變體在SEQ ID NO.1的K13、T19、Y49、N80、D84、A93、E127、A128、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200或S239位點(diǎn)，或與之對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)中的一處或多處，優(yōu)選地，在位點(diǎn)F200或與之相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)，具有至少一種氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO.1的位點(diǎn)S258或Y259的至少一個(gè)氨基酸缺失，可選地，組合C-末端延伸，優(yōu)選地，延伸為片段TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)之一；和/或組合N-末端延伸。
編碼SEQ ID NO.2的核酸序列的一種例子被給為SEQ ID NO.7。編碼SEQ ID NO.3的核酸序列的一種例子被給為SEQ ID NO.8。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，可通過(guò)對(duì)在SEQ ID NO.1中的上述位點(diǎn)或其對(duì)應(yīng)位點(diǎn)之一，例如，在F200位點(diǎn)(或?qū)?yīng)位點(diǎn))進(jìn)行飽和誘變來(lái)進(jìn)行定點(diǎn)突變。飽和誘變指，氨基酸被每種可能的蛋白質(zhì)原氨基酸所取代，例如，被丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸或纈氨酸所取代，例如，通過(guò)產(chǎn)生變體酶文庫(kù)來(lái)進(jìn)行，其中，每種變體在SEQ ID NO.1的第200位含有特定的氨基酸交換。優(yōu)選地，飽和誘變是通過(guò)用每種可能的核酸三體去替換編碼氨基酸的核酸三體來(lái)進(jìn)行的，例如，按照實(shí)施例4所述。因此，這些突變體在上述位置中的一處或多處具有不同于SEQ IDNO.1(或按照上述ClustalW程序發(fā)現(xiàn)的相同性百分比與其相對(duì)應(yīng)的、來(lái)自另一種天然來(lái)源的任何其它野生型酶的氨基酸序列)的序列，而仍具有至少八個(gè)保守氨基酸，即上述F76、G79、E100、D102、K167、T170、K201和G204。因此，“相應(yīng)突變”被用來(lái)表示這些突變發(fā)生于特定的“相應(yīng)野生型酶的氨基酸序列”(即，具有DERA活性的酶的序列)中。
通過(guò)以缺省設(shè)置(矩陣Gonnet 250；GAP OPEN10；ENDGAPS10；GAP EXTENSION0.05；GAP DISTANCES8)，運(yùn)行ClustalW，版本1.82多序列比對(duì)(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)，可鑒定出野生型或突變的蛋白序列中，對(duì)應(yīng)于E.coli K12 DERA野生型氨基酸序列(SEQ ID NO.1)中氨基酸殘基位點(diǎn)的氨基酸殘基。此類比對(duì)中，被放置于與E.coli K12野生型DERA序列(SEQ ID NO.1給出的)的氨基酸殘基同一列的氨基酸殘基被確定為與E.coli K12野生型DERA(SEQ IDNO.1)的該個(gè)別氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)。
本文中使用的序列以及其中不同位點(diǎn)中的氨基酸被表示為它們的單字母編碼(分別地，表示為它們的三字母編碼)，如下所示
可按照不同性質(zhì)對(duì)上面列出的氨基酸加以分類，這對(duì)于序列特定位點(diǎn)可能是重要的。例如，一些氨基酸屬于帶正電荷的氨基酸的類，即，尤其是賴氨酸、精氨酸和組氨酸。另一類氨基酸是親水性氨基酸，由絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺構(gòu)成。疏水性氨基酸是異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。還有一類芳香族氨基酸，即，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另有一種可能，將氨基酸按照其大小分類以大小減少的順序，氨基酸可被列為W＞Y＞F＞R＞K＞L，I＞H＞Q＞V＞E＞T＞N＞P＞D＞C＞S＞A＞G。
因此，要求保護(hù)的每種突變體將與其來(lái)源的野生型序列相比。這意味著，僅當(dāng)下述標(biāo)準(zhǔn)中的至少前兩條滿足時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的突變體才可被認(rèn)為是突變體(a)突變應(yīng)當(dāng)對(duì)應(yīng)于針對(duì)E.coli K12示出的突變之一；(b)突變?cè)谕蛔凅w來(lái)源的野生型酶中不存在；(c)至少八個(gè)保守氨基酸，即F76、G79、E100、D102、K167、T170、K201和G204仍存在于對(duì)應(yīng)位點(diǎn)上。
最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA具有在SEQ IDNO.1中進(jìn)行的下述氨基酸取代或?qū)?yīng)于這些取代的取代中的至少一種，所述氨基酸取代選自由下述取代構(gòu)成的組a.K13和/或K196被帶正電荷氨基酸替換，優(yōu)選地，被R或H替換；b.T19和/或M185被另一種氨基酸替換，優(yōu)選地，被選自由下述組的另一種氨基酸所替換，所述組由親水氨基酸和/或疏水氨基酸構(gòu)成，其中，親水氨基酸特別是由S、T、C、Q和N構(gòu)成的，疏水氨基酸特別是由V、L和I構(gòu)成的；c.Y49被選自由F和W構(gòu)成的組的芳香族氨基酸所取代；d.N80和/或I166和/或S239被選自由T、S、C、Q和N構(gòu)成的親水氨基酸組的另一種氨基酸替換；e.D84和/或A93和/或E127被選自下述小氨基酸組的另一種、優(yōu)選更小的氨基酸所替換，所述組由按照大小降序的E、T、N、P、D、C、S、A和G構(gòu)成；f.A128和/或K146和/或K160和/或A174和/或F200被選自由L、M、V、F和Y構(gòu)成的疏水氨基酸組的另一種氨基酸所替換；和/或在SEQ ID NO.1的S258和Y259位點(diǎn)，或與之對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)處，至少一個(gè)氨基酸的缺失，可選地，組合C-末端延伸，優(yōu)選地，延伸為片段TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)之一；和/或組合N-末端延伸。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，在本發(fā)明的經(jīng)過(guò)分離的突變體中，可通過(guò)缺失至少一個(gè)氨基酸殘基來(lái)截短C-末端，例如，通過(guò)缺失S258和/或Y259或與之對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)，然后延伸C-末端，優(yōu)選地，通過(guò)片段TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)之一來(lái)延伸。
為清楚之故，短句“在SEQ ID NO.1中進(jìn)行的氨基酸取代或?qū)?yīng)于這些取代的取代”指，這些取代是SEQ ID NO.1中的取代，或是在并非E.coli K12的野生型序列中，在對(duì)應(yīng)于E.coli中上述編號(hào)位點(diǎn)的位點(diǎn)發(fā)生的取代。
最優(yōu)選地，經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA具有SEQ ID NO.1中的下述突變或?qū)?yīng)于這些突變的突變中的一種或多種，所述突變選自下述組K13R、T19S、Y49F、N80S、D84G、A93G、E127G、A128V、K146V、K160M、I166T、A174V、M185T、M185V、K196R、F200I、F200M、F200V、S239C、ΔS258、ΔY259、TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)的C-末端延伸和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的C末端延伸。
在本文中，SEQ ID NO.1中氨基酸位點(diǎn)編號(hào)前的單字母編碼表示存在于所述野生型E.coli酶中的氨基酸，SEQ ID NO.1中氨基酸位點(diǎn)編號(hào)之后的單字母編碼表示存在于突變體中的氨基酸。氨基酸位點(diǎn)編號(hào)反映了SEQID NO.1的DERA中的位點(diǎn)編號(hào)，以及來(lái)自其它來(lái)源的其它DERA野生型中與之對(duì)應(yīng)的任何位點(diǎn)。
更具體地，經(jīng)過(guò)分離的突變體DERA具有SEQ ID NO.1中的下述兩種突變或?qū)?yīng)于這兩種突變的突變，所述突變選自下述組F200I和ΔY259、F200M和ΔY259、F200V和ΔY259、F200I和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的C末端延伸、F200M和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的C末端延伸以及F200V和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的C末端延伸。
本發(fā)明還涉及一種方法，用于從2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的組中篩選出下述野生型酶，在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定時(shí)，所述野生型酶的生產(chǎn)率因子比來(lái)自Escherichia coliK12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子高至少10％，其中(A)依次地，(i)分離總和/或基因組DNA和/或cDNA；(ii)制備所述經(jīng)過(guò)分離的DNA的表達(dá)文庫(kù)，所述文庫(kù)由包含所述經(jīng)過(guò)分離的DNA的個(gè)體克隆構(gòu)成；(iii)將來(lái)自獲得的表達(dá)文庫(kù)的個(gè)體克隆與底物乙醛和氯乙醛的混合物一起培養(yǎng)；(iv)分離出來(lái)自下述一種或多種克隆的一種或多種基因，所述克隆顯示能將這些底物轉(zhuǎn)化為4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)和/或6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)，將所述一種或多種基因再克隆進(jìn)與SEQ ID NO.16同樣的遺傳背景；
以及，其中(B)表達(dá)步驟(iv)中獲得的再克隆的基因編碼的DERA酶，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)的方法對(duì)其加以檢驗(yàn)，由此獲得針對(duì)每種此類野生型酶的生產(chǎn)率因子；以及，其中(C)將來(lái)自步驟(B)的針對(duì)這些野生型酶的生產(chǎn)率因子與來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子相比較，選出編碼下述DERA酶的一種或多種基因并進(jìn)行分離，所述DERA酶在所述比較中具有至少高10％的生產(chǎn)率因子。
如上文中步驟(i)所示的對(duì)總和/或基因組DNA和/或cDNA的分離可以，例如從微生物或從環(huán)境樣品，例如土壤和水來(lái)進(jìn)行。步驟(ii)中制備的經(jīng)過(guò)分離的DNA的表達(dá)文庫(kù)由個(gè)體克隆構(gòu)成，所述克隆包含所述經(jīng)過(guò)分離的DNA，所述DNA編碼一種或多種不同的酶。上述步驟(iii)中所述的與乙醛和氯乙醛的混合物一起培養(yǎng)，可用下述混合物來(lái)進(jìn)行，所述混合物中上述底物分子比例范圍較寬，例如，0.2∶1至5∶1。將清楚對(duì)這些底物向4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)和/或6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的轉(zhuǎn)化的定量評(píng)估，已可提供對(duì)來(lái)自步驟(ii)表達(dá)文庫(kù)的個(gè)體克隆中存在的基因的有效性的第一種指示。
因此，在此階段，可對(duì)編碼DERA酶的多種基因的活性建立一些排序。這種評(píng)估允許分離出最有前途的基因。但是，鑒于篩選方法的最終目的是發(fā)現(xiàn)下述(野生型)DERA，即在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定時(shí)，所述DERA的生產(chǎn)率因子比來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的生產(chǎn)率因子高至少10％，因此，這些選出的基因，或其中理想的更小數(shù)量，被分離出來(lái)并被再克隆進(jìn)與SEQ ID NO.6相同的遺傳背景。該步驟確保了待檢驗(yàn)的酶以與來(lái)自Escherichia coli K12的野生型DERA酶的表達(dá)可相比較的方式正確表達(dá)。通過(guò)DPFT的方法進(jìn)行篩選和檢驗(yàn)，并與來(lái)自Escherichia coli K12的野生型DERA酶的DPFT結(jié)果進(jìn)行正確比較之后，非常容易找到合適的野生型DERA，例如，接著可被用作為獲得根據(jù)本發(fā)明的突變體的起始點(diǎn)的那些DERA。
此外，本發(fā)明涉及一種方法，從2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的組中篩選出下述突變體酶，在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定時(shí)，所述突變體酶的生產(chǎn)率因子比相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％，或比來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子高至少10％。在所述方法中，(A)依次地，(i)用本身已知的手段，對(duì)編碼野生型2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的基因進(jìn)行突變，并將其克隆進(jìn)與編碼E.coli K12 DERA的基因(具有SEQ ID NO.6)相同的遺傳背景，分別克隆進(jìn)與突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型基因相同的遺傳背景，由此獲得克隆的表達(dá)文庫(kù)，所述克隆來(lái)自由此制備的突變體；以及，其中(B)表達(dá)克隆中的DERA酶，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)的方法對(duì)其加以檢驗(yàn)，由此獲得針對(duì)每種突變體酶的生產(chǎn)率因子；以及，其中(C)將針對(duì)突變體酶的生產(chǎn)率因子與相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子，或與來(lái)自Escherichia coliK12的野生型酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1)的生產(chǎn)率因子相比較，選出編碼下述DERA突變體的一種或多種基因并進(jìn)行分離，所述DERA突變體在分別的比較中具有至少高10％的生產(chǎn)率因子。
更具體地，本發(fā)明涉及一種方法，其中，(A)依次地，(i)用本身已知的手段，對(duì)編碼野生型2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的基因進(jìn)行突變，并將其克隆進(jìn)與E.coli K12 DERA相同的遺傳背景，分別克隆進(jìn)與突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型基因相同的遺傳背景，由此獲得克隆的表達(dá)文庫(kù)，所述克隆來(lái)自由此制備的突變體；(ii)將來(lái)自獲得的表達(dá)文庫(kù)的個(gè)體克隆與底物乙醛和氯乙醛的混合物一起培養(yǎng)；(iii)選出下述一種或多種克隆，所述克隆顯示了將這些底物轉(zhuǎn)化為4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)和/或6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的最高轉(zhuǎn)化率；(B)表達(dá)從步驟(iii)選出的克隆中的DERA基因，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)的方法對(duì)其加以檢驗(yàn)，由此獲得針對(duì)每種突變體酶的生產(chǎn)率因子；以及，(C)將針對(duì)篩選出的突變體酶的生產(chǎn)率因子與相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子，或與來(lái)自Escherichia coli K12的野生型酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQID NO.1)的生產(chǎn)率因子相比較，選出編碼下述DERA突變體的一種或多種基因并進(jìn)行分離，所述DERA突變體在分別的比較中具有至少高10％的生產(chǎn)率因子。
上述第二種類型的突變體篩選，是從已知編碼野生型2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的基因(例如，使用根據(jù)本發(fā)明篩選野生型DERA酶的方法獲得的)，或是從編碼，例如，表1或2提到的DERA酶的基因開(kāi)始的。首先用本身已知的手段對(duì)這些基因進(jìn)行突變，并將其克隆進(jìn)與E.coli K12DERA相同的遺傳背景，分別克隆進(jìn)與突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型基因相同的遺傳背景。所述基因，例如，可從微生物或從環(huán)境樣品，例如土壤或水來(lái)獲得。前述突變和克隆產(chǎn)生了來(lái)自由此制備的突變體的克隆的表達(dá)文庫(kù)。事實(shí)上，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，此類表達(dá)文庫(kù)可通過(guò)如下方法來(lái)制備依次地，制備突變體的DNA文庫(kù)，將每種個(gè)體DNA克隆進(jìn)載體，將載體轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)宿主。上述步驟(ii)中所述的與乙醛和氯乙醛的混合物一起培養(yǎng)，可用下述混合物來(lái)進(jìn)行，所述混合物中上述底物分子比例范圍較寬，例如，0.2∶1至5∶1。接著，對(duì)這些底物向4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)和/或6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的轉(zhuǎn)化的定量評(píng)估，可提供對(duì)這些底物向4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)和/或6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的轉(zhuǎn)化程度的第一種排序，展示出最高轉(zhuǎn)化率的克隆中的一種或多種可被選出，用于通過(guò)DPFT手段進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)價(jià)。無(wú)須說(shuō)明，待檢驗(yàn)酶的正確表達(dá)應(yīng)被確保，使得檢驗(yàn)結(jié)果可以很容易地與針對(duì)來(lái)自Escherichia coli K12的野生型DERA酶表達(dá)的結(jié)果，分別針對(duì)突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型基因的結(jié)果進(jìn)行比較。用這種方式，非常容易找到并分離隨后可合適地用于對(duì)有價(jià)值的藥物產(chǎn)品(例如，斯達(dá)汀)進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)的、編碼突變體DERA的合適基因。
應(yīng)當(dāng)注意到，上文所述的篩選方法不同于前面提到的W.A.Greenberget al.，in PNAS，vol.101，p.5788-5793(2004)所用的。所述文章的作者使用了熒光探測(cè)試驗(yàn)，這是R.Pérez Carlón et al.in Chem.Eur.J.，6，p.4154-4162(2000)已描述過(guò)的。所述探測(cè)試驗(yàn)是非常間接的方法，其中，通過(guò)2-脫氧-D-核糖底物的熒光傘形酮來(lái)確定DERA活性。但是，所述方法不太適合(因?yàn)?，需要額外的試驗(yàn)，用于測(cè)定用被取代的醛進(jìn)行的目標(biāo)反應(yīng)中的目標(biāo)活性)用于在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中來(lái)測(cè)定DERA生產(chǎn)率(以及活性)，因?yàn)?，首先，僅獲得了展示出非常類似于DERA天然底物反應(yīng)的逆醛醇縮合反應(yīng)的酶，在額外的、第二次篩選中針對(duì)目標(biāo)反應(yīng)來(lái)對(duì)它們進(jìn)行檢驗(yàn)。為克服此類問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人開(kāi)發(fā)了他們自己的、直接的篩選方法，并且還開(kāi)發(fā)了所謂的DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)。
合適地，在針對(duì)第一步中突變體的所述篩選中，對(duì)編碼野生型2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的基因加以突變，所述基因來(lái)自表1、2和3中示出的來(lái)源之一。
本發(fā)明因此還涉及可通過(guò)上述篩選方法中的任何方法獲得的經(jīng)過(guò)分離的核酸，特別是可通過(guò)下述篩選方法獲得的，所述方法被應(yīng)用于編碼下述野生型2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的基因，所述來(lái)自表1、2和3中示出的來(lái)源之一。
本發(fā)明還涉及編碼突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的經(jīng)過(guò)分離的核酸，其中，所述經(jīng)過(guò)分離的核酸編碼下述突變體，其中，所述經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比從中獲得突變體的相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，并且其中，突變體和相應(yīng)野生型酶兩者的生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的。
此外，還涉及編碼突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的經(jīng)過(guò)分離的核酸，其中，所述經(jīng)過(guò)分離的核酸編碼下述突變體，其中，經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，以及其中，突變體和相應(yīng)野生型酶兩者的生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的，以及其中，經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比來(lái)自Escherichia coliK12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1的野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，以及其中，突變體和Escherichia coli K12酶兩者的生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的。
此外，本發(fā)明還涉及編碼下述突變體的經(jīng)過(guò)分離的核酸，所述突變體來(lái)自Escherichia coli K12(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1的野生型酶序列)。此外，本發(fā)明還涉及下述經(jīng)過(guò)分離的核酸，其編碼突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，所述酶在SEQ ID NO.1的K13、T19、Y49、N80、D84、A93、E127、A128、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200或S239位點(diǎn)，或與之對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)中的一處或多處，優(yōu)選地，在位點(diǎn)F200或與之相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)，具有至少一種氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO.1的位點(diǎn)S258或Y259或與之相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)，具有至少一個(gè)氨基酸缺失，可選地，組合C-末端延伸，優(yōu)選地，延伸為片段TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)之一；和/或組合N-末端延伸。
優(yōu)選地，所述經(jīng)過(guò)分離的核酸編碼下述突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，所述酶具有在SEQ ID NO.1中進(jìn)行的下述氨基酸取代或?qū)?yīng)于這些取代的取代中的至少一種，所述氨基酸取代選自由下述取代構(gòu)成的組a.K13和/或K196被帶正電荷氨基酸替換，優(yōu)選地，被R或H替換；b.T19和/或M185被另一種氨基酸替換，優(yōu)選地，被選自由下述組的另一種氨基酸所替換，所述組由親水氨基酸和/或疏水氨基酸構(gòu)成，其中，親水氨基酸特別是由S、T、C、Q和N構(gòu)成的，疏水氨基酸特別是由V、L和I構(gòu)成的；c.Y49被選自由F和W構(gòu)成的組的芳香族氨基酸所取代；d.N80和/或I166和/或S239被選自由T、S、C、Q和N構(gòu)成的親水氨基酸組的另一種氨基酸替換；e.D84和/或A93和/或E127被選自下述小氨基酸組的另一種、優(yōu)選更小的氨基酸所替換，所述組由按照大小降序的E、T、N、P、D、C、S、A和G構(gòu)成；f.A128和/或K146和/或K160和/或A174和/或F200被選自由L、M、V、F和Y構(gòu)成的疏水氨基酸組的另一種氨基酸所替換；
和/或在SEQ ID NO.1的S258和Y259位點(diǎn)，或與之對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)處，至少一個(gè)氨基酸的缺失，可選地，組合C-末端延伸，優(yōu)選地，延伸為片段TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)之一；和/或組合N-末端延伸。
最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過(guò)分離的核酸編碼下述突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，所述酶具有SEQ ID NO.1中的下述突變或?qū)?yīng)于這些突變的突變中的一種或多種，所述突變選自下述組K13R、T19S、Y49F、N80S、D84G、A93G、E127G、A128V、K146V、K160M、I166T、A174V、M185T、M185V、K196R、F200I、F200V、F200M和S239C，和/或在SEQ ID NO.1的ΔS258和ΔY259位點(diǎn)，或與之對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)處，至少一個(gè)氨基酸的缺失，可選地，組合片段TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)之一的C末端延伸。
更具體地，根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過(guò)分離的核酸編碼下述突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，所述酶具有SEQ ID NO.1中的下述兩種突變或?qū)?yīng)于這兩種突變的突變，所述突變選自下述組F200I和ΔY259、F200M和ΔY259、F200V和ΔY259、F200I和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的C末端延伸、F200M和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的C末端延伸以及F200V和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的C末端延伸。
此外，本發(fā)明涉及包含上述此類核酸中任何核酸的載體，以及涉及包含下述突變體的宿主細(xì)胞，所述突變體來(lái)自前述2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，或者涉及可根據(jù)前述篩選方法獲得的此類突變體酶，和/或宿主細(xì)胞，其包含前文所述的經(jīng)過(guò)分離的核酸和/或包含前述載體。
本發(fā)明還涉及一種方法，用于制備突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，所述酶的生產(chǎn)率因子比相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子和/或來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)(具有SEQ ID NO.1野生型酶序列)的生產(chǎn)率因子高至少10％，其中，使用如前文所述的核酸，或如前文所述的載體，或前述宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種改進(jìn)方法，用于生產(chǎn)結(jié)構(gòu)式1的2，4，6-三脫氧己糖或2，4-二脫氧己糖， 其中，R1和Rx每種獨(dú)立代表H或保護(hù)基團(tuán)，其中，X代表鹵素；甲苯磺酸(tosylate)基；甲磺酸(mesylate)基；酰氧基；苯乙酰氧基；烷氧基或芳氧基，所述生產(chǎn)是從乙醛和結(jié)構(gòu)式為HC(O)CH2X的相應(yīng)被取代的乙醛來(lái)生產(chǎn)的，其中，X如上文所定義，其中使用根據(jù)本發(fā)明的、或根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的、或可由根據(jù)本發(fā)明的篩選突變體酶的方法獲得的突變體酶，以及其中，R1和/或Rx代表保護(hù)基團(tuán)的情況下，形成的化合物中的羥基以本身已知的方式被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。
優(yōu)選地，X代表鹵素，更優(yōu)選地，Cl、Br或I；或者代表酰氧基，更優(yōu)選地，乙酰氧基。
在上述反應(yīng)中，可使用本領(lǐng)域中針對(duì)用野生型DERA酶進(jìn)行的反應(yīng)所述的反應(yīng)條件，來(lái)利用突變體DERA酶，例如，使用US 5,795,749，例如其中第4欄第1-18行中所述的反應(yīng)條件，或例如使用W.A.Greenberg etal.，PNAS，vol.101，pp 5788-5793，(2004)所述的補(bǔ)料分批反應(yīng)條件。
優(yōu)選地，使用WO03/006656中所述的條件，來(lái)在上述反應(yīng)中使用本發(fā)明的突變體DERA酶羰基濃度，這是醛、2-取代的醛和醛與2-取代的醛之間的反應(yīng)中形成的中間產(chǎn)物(即，4-取代的-3-羥基-丁醛中間產(chǎn)物)濃度的總和，合成過(guò)程期間優(yōu)選保持為小于6摩爾/1的值。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚知道，(非常)短時(shí)間內(nèi)濃度略高幾乎沒(méi)有影響。更優(yōu)選地，羰基濃度被選用為每升反應(yīng)混合物0.1至5摩爾之間，最優(yōu)選地，每升反應(yīng)混合物0.6至4摩爾之間。
反應(yīng)溫度和pH并不重要，它們作為底物的函數(shù)被選用。優(yōu)選地，反應(yīng)在液相進(jìn)行。反應(yīng)可在例如-5至+45℃之間的反應(yīng)溫度下，以及大約5.5至9之間，優(yōu)選6至8之間的pH下進(jìn)行。
反應(yīng)優(yōu)選在或多或少恒定的pH下進(jìn)行，例如使用緩沖液或自動(dòng)滴定來(lái)實(shí)現(xiàn)。緩沖液例如可以使用碳酸氫鈉和碳酸氫鉀，磷酸鈉和磷酸鉀，三乙醇胺/HCl，bis-tris-丙烷/HCl以及HEPES/KOH。優(yōu)選地，應(yīng)用碳酸氫鉀或碳酸氫鈉，例如，以20至400mmol/l反應(yīng)混合物的濃度使用。
醛的總量和2-取代的醛的總量之間的摩爾比并不非常重要，其優(yōu)選在1.5∶1至4∶1之間，特別是1.8∶1和2.2∶1之間。
用于本發(fā)明方法中的突變體DERA酶的量原則上并不重要。針對(duì)酶反應(yīng)確定酶的最優(yōu)濃度是常規(guī)實(shí)驗(yàn)，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定將使用的突變體DERA酶的量。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，R1和Rx都表示H。在本發(fā)明的一種進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)式(1)的化合物是富含對(duì)映異構(gòu)體的。
可被R1和Rx所代表的保護(hù)基團(tuán)包括醇保護(hù)基團(tuán)，其例子是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。具體例子包括四氫吡喃基團(tuán)。優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是甲硅烷基(例如，三芳基和優(yōu)選地三烷基甲硅烷基)以及烴基。進(jìn)一步更優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是苯甲基、甲基、三乙基甲硅烷基、叔丁基甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基。
可被R1和Rx所代表的保護(hù)基團(tuán)可以是相同的或不同的。當(dāng)保護(hù)基團(tuán)R1和Rx不同時(shí)，有利地，這可以允許選擇性地僅除去R1和Rx。優(yōu)選地，當(dāng)保護(hù)基團(tuán)R1和Rx不同時(shí)，R1是苯基或甲硅烷基，Rx是甲基。
其中Rx代表H的結(jié)構(gòu)式(1)的化合物可用于WO04/096788、WO05/012246或WO04/027075所述的方法(或類似方法)。因此，本發(fā)明還涉及一種方法，其中，可根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)結(jié)構(gòu)式(1)的化合物，其中X和R1如上文所定義，并且其中Rx代表H，隨后將上述化合物與氧化劑反應(yīng)，形成相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(2)的化合物，
其中，X和R1如上文所定義，隨后結(jié)構(gòu)式(2)的化合物與氰離子反應(yīng)，形成結(jié)構(gòu)式(3)的化合物 其中，R1如上文定義。
就此反應(yīng)而言，可使用WO04/096788中第2頁(yè)第10行-第3頁(yè)第13行關(guān)于該工藝步驟所述的工藝條件。或者，可以使用WO 05/012246(見(jiàn)，例如，第5頁(yè)第19-26行)所述的或WO 04/027075(例如，實(shí)施例2所述)所述的工藝條件。
在本發(fā)明的一種不同實(shí)施方式中，可先將結(jié)構(gòu)式(1)的化合物與氰離子反應(yīng)，例如，在WO 05/012246所述的工藝條件下進(jìn)行，或使用WO04/096788或WO 04/027075的工藝條件，形成結(jié)構(gòu)式(4)的化合物 其中，R1和Rx獨(dú)立代表H或保護(hù)基團(tuán)，之后，在Rx代表保護(hù)基團(tuán)的情況下，除去保護(hù)基團(tuán)Rx后，結(jié)構(gòu)式(4)的化合物可與氧化劑反應(yīng)，形成相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(3)的化合物，其中，R1如上文所定義。
對(duì)上述氰化反應(yīng)而言，水可作為溶劑與其它溶劑組合使用，例如，組合四氫呋喃、CH3CN、醇、二氧雜環(huán)己烷、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、甲苯、二乙醚和/或甲基叔丁基醚。優(yōu)選地，使用在其它溶劑中的至少5％w/w，更優(yōu)選至少10％w/w，進(jìn)一步更優(yōu)選至少20％w/w，進(jìn)一步更優(yōu)選至少30％w/w，進(jìn)一步更優(yōu)選至少40％w/w，進(jìn)一步更優(yōu)選至少50％w/w，進(jìn)一步更優(yōu)選至少60％w/w，進(jìn)一步更優(yōu)選至少70％w/w，進(jìn)一步更優(yōu)選至少80％w/w，最優(yōu)選至少90％w/w的水。就實(shí)踐理由而言，特別優(yōu)選用水作為唯一的溶劑。
使用WO04/096788(例如，第5頁(yè)第14行-第7頁(yè)第3行)所述的方法和反應(yīng)條件，隨后可將結(jié)構(gòu)式(4)的化合物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)式(5)的化合物 其中，R2、R3和R4每個(gè)獨(dú)立代表具有例如1至12個(gè)C原子，優(yōu)選1-6個(gè)C原子的烷基，具有例如1至12個(gè)C原子，優(yōu)選1-6個(gè)C原子的烯烴基，具有例如3-7個(gè)C原子的環(huán)烷基，具有例如3-7個(gè)C原子的環(huán)烯基，具有例如6-10個(gè)C原子的芳香基，或者具有例如7至12個(gè)C原子的芳烷基，R2、R3和R4可被取代，其中，R2和R3可與將它們連接起來(lái)的C原子一起形成環(huán)，所述轉(zhuǎn)化使用合適的縮醛形成試劑，在酸催化劑存在的情況下來(lái)進(jìn)行，例如，如WO 02/06266所述。
根據(jù)WO 04/096788，其中R2、R3和R4如上文定義的結(jié)構(gòu)式5的化合物隨后可被水解，形成相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式6的鹽，
其中，Y代表堿金屬，例如，鋰、鈉、鉀，優(yōu)選地，鈉；堿土金屬，例如，鎂或鈣，優(yōu)選地，鈣；或被取代的或未被取代的銨基，優(yōu)選地，四烷基銨基，例如，WO04/096788中第7頁(yè)第4行-第8頁(yè)第16行所述的?？蛇x地，水解之后向其中Y是H的相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(6)的化合物轉(zhuǎn)化，例如，如WO 02/06266所述。
根據(jù)WO04/096788，結(jié)構(gòu)式(6)的鹽還可以以本身已知的方式(例如，如WO 02/06266所述)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(7)的酯 其中，R2和R3如上文所定義，并且其中，R5可以代表與針對(duì)R2和R3給出的基團(tuán)相同的基團(tuán)。
例如，R5可以代表甲基、乙基、丙基、異丁基或叔丁基?？赏ㄟ^(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法制備的一組重要的結(jié)構(gòu)式8的酯是叔丁基酯(R5代表叔丁基)。
在本發(fā)明的一個(gè)特別的方面，通過(guò)下述方法將結(jié)構(gòu)式(6)的鹽轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(7)的酯按照WO03/106447和WO04/096788中第9頁(yè)第2行-第10頁(yè)第2行所述的方法，在惰性溶劑(例如甲苯)中將結(jié)構(gòu)式(6)的鹽與氯化物形成試劑接觸，以形成相應(yīng)的酸性氯化物，以及在存在N-甲基嗎啉(NMM)的情況下，將形成的酸性氯化物與結(jié)構(gòu)式R5OH的醇接觸，其中，R5如上文所定義。
使用本發(fā)明的方法制備的化合物特別有用于制備藥物制劑的活性成分，例如，制備HMG-CoA還原酶抑制劑，更具體地，用于制備斯達(dá)汀，例如，洛伐他汀、西立伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀和氟伐他汀，特別用于ZD-4522，其被描述于Drugs of the future(1999)，24(5)，511-513 by M.Watanabe et al.，Bioorg&Med.Chem.(1997)，5(2)，437-444中。本發(fā)明因此提供了一種有經(jīng)濟(jì)吸引力的新路徑，用于制備化合物，特別是結(jié)構(gòu)式(1)的化合物，其可被用于合成斯達(dá)汀。此類制劑的特別令人感興趣的例子是阿托伐他汀鈣的制劑，如A.Kleemann，J.Engel；pharmaceutical substances，synthesis，patents，applications 4th edition，2001Georg Thieme Verlag，p.146-150所述。
因此，本發(fā)明還涉及一種方法，其中，使用本發(fā)明的方法和本身已知的其它工藝步驟，降根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的化合物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為斯達(dá)汀，優(yōu)選地，阿托伐他汀或其鹽，例如，其鈣鹽。此類工藝是本領(lǐng)域公知的。
現(xiàn)在將通過(guò)下述實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)本發(fā)明加以解釋，而并非以任何方式加以限制。
實(shí)驗(yàn)通用部分鑒定具有提高的抗性或生產(chǎn)率的DERA突變體的方法可以使用兩種方法來(lái)鑒定具有提高的抗性或生產(chǎn)率的DERA突變體。一種方法檢查DERA突變體針對(duì)氯乙醛的抗性，另一種評(píng)估使用氯乙醛和乙醛作為底物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)中DERA突變體的生產(chǎn)率。第一種方法使用標(biāo)準(zhǔn)DERA天然底物活性試驗(yàn)的基于微滴定的形式，來(lái)檢查DERA突變體對(duì)氯乙醛的抗性，其中使用天然DERA的底物2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯作為底物。第二種方法使用與質(zhì)譜分析方法偶聯(lián)的高通量氣相色譜(GC/MS)，分析在用乙醛和氯乙醛作為底物生產(chǎn)4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)的過(guò)程中DERA突變體的生產(chǎn)率，CHBA是DERA催化的乙醛和氯乙醛每種一個(gè)分子進(jìn)行的醛醇縮合反應(yīng)的產(chǎn)物，因此也是向CTeHP的反應(yīng)中的中間產(chǎn)物。
測(cè)定溶液中的蛋白濃度使用經(jīng)改良的蛋白染料結(jié)合方法(如Bradford in Anal.Biochem.72248-254(1976)所述)，來(lái)測(cè)定溶液，例如，不含細(xì)胞的提取物(cfe)中的蛋白濃度。在室溫下，每種樣品取50μl的適當(dāng)稀釋液，與950μl試劑(100mg Brilliant Blue G250，溶解于46ml乙醇和100ml 85％正磷酸中，補(bǔ)充milli-Q水至1,000ml)一起孵育至少五分鐘。在Perkin ElmerLambda20 UV/VIS分光光度計(jì)中測(cè)量595nm的波長(zhǎng)處每種樣品的吸光度。使用用含有已知濃度的牛血清清蛋白(BSA，范圍從0.025mg/ml至0.25mg/ml)測(cè)定的校正線，對(duì)樣品中的蛋白濃度加以校正。
DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)可使用DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)，針對(duì)其在CTeHP形成中的生產(chǎn)率，對(duì)從兩種方法選出的克隆(其展示出對(duì)氯乙醛的提高的抗性，或增加的CHBA形成)加以分析。為進(jìn)行此分析，將含有1.0至1.4mg cfe的一定體積的cfe與0.1M NaHCO3緩沖液(終pH＝7.2)中的0.093mmol乙醛和0.04mmol氯乙醛在攪拌下一起孵育于0.2ml的總體積中。16h后，通過(guò)加入9倍體積的丙酮或乙腈來(lái)終止反應(yīng)，在16,000xg下離心10分鐘。通過(guò)使用FID探測(cè)器在Chrompack CP-SIL8CB柱(Varian)上進(jìn)行氣相色譜，對(duì)上清液中CTeHP和CHBA含量來(lái)進(jìn)行分析。采用0.2M氯乙醛和0.4M乙醛的底物濃度，室溫(25℃)、pH7.2下，16小時(shí)內(nèi)，通過(guò)1mg不含細(xì)胞的提取物蛋白(含有野生型或突變的DERA)形成的CTeHP的以mmol表示的量被定義為“DERA生產(chǎn)率因子”。
DERA天然底物活性試驗(yàn)為評(píng)估DERA活性，可在室溫(RT)下測(cè)定DERA天然底物反應(yīng)，2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯向乙醛和D-甘油醛-3-磷酸酯的醛醇分解中的起始活性。將10μl不含細(xì)胞的提取物轉(zhuǎn)移到140μl50mM三乙醇胺緩沖液(pH7.5)中。通過(guò)加入50μl輔助酶和底物的混合溶液(0.8mMNADH、2mM 2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯、丙糖磷酸異構(gòu)酶(30U/ml，Roche Diagnostics)和甘油磷酸脫氫酶(10U/ml，Roche Diagnostics))來(lái)起始活性試驗(yàn)。30秒后，通過(guò)加入50μl終止溶液(6M鹽酸胍、100mM磷酸氫鈉、10mM TrisHCl pH7.5)來(lái)終止反應(yīng)。通過(guò)測(cè)量樣品在340nm波長(zhǎng)的UV吸收來(lái)測(cè)定存在的起始DERA活性。一分子NADH的消耗對(duì)應(yīng)于一分子2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯的分解。
實(shí)施例1 具有提高的針對(duì)氯乙醛的抗性的DERA突變體通過(guò)隨機(jī)誘變來(lái)構(gòu)建E.coli變體deoC文庫(kù)為構(gòu)建E.coli K12 deoC基因(SEQ ID NO.6)(其編碼E.coli K12DERA酶(SEQ ID NO.1))的隨機(jī)誘變文庫(kù)，使用Clonetech DiversifyPCR隨機(jī)誘變?cè)噭┖?。按照廠商說(shuō)明書，以變動(dòng)的MnSO4濃度(其中，上述濃度越高，引入的突變?cè)蕉?來(lái)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，從而將1至3個(gè)點(diǎn)突變引入Escherichia coli K12 deoC基因，導(dǎo)致DERA酶氨基酸序列中1至2個(gè)氨基酸替換。為擴(kuò)增編碼E.coli 2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(SEQ IDNO.1)的E.coli deoC基因(SEQ ID NO.6)，引物DAI 13600和DAI13465(分別對(duì)應(yīng)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)被分別用作為正向和反向引物。兩個(gè)引物都含有與使用Gateway Technology(Invitrogen)通過(guò)定點(diǎn)重組克隆獲得的PCR擴(kuò)增deoC基因片段相容的位點(diǎn)。
正向引物(DAI 13600)的序列5’GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGATAG AAC CAT GAC TGA TCT GAA AGC AAG CAG CC 3’SEQ ID NO.4反向引物(DAI 13465)的序列5’GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GTA GCTGCT GGC GCT C3’ SEQ ID NO.5易錯(cuò)(error-prone)PCR擴(kuò)增使用下述溫度程序94℃ 2分鐘，94℃30秒和68℃ 1分鐘的25個(gè)循環(huán)，接著68℃ 10分鐘。首先將易錯(cuò)PCR片段克隆進(jìn)pDONR(Invitrogen)載體，制備大規(guī)模pENTR克隆載體制備物，起始超過(guò)20,000個(gè)菌落。然后使用pDEST14載體(Invitrogen)，用這些pENTR制備物構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體。然后將表達(dá)構(gòu)建圖轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài)E.coli BL21 Star(DE3)，用于表達(dá)突變的E.coli K12 deoC基因，其編碼DERA酶突變體。
突變的deoC基因在深孔微滴定板中的表達(dá)使用Genetix Q-pics從Q-trays上挑取菌落，接種微滴定板(MTP)中的200μl 2*TY培養(yǎng)基(含有100μg/ml的氨芐青霉素)，然后在旋轉(zhuǎn)搖床上于25℃對(duì)這些預(yù)培養(yǎng)物進(jìn)行2天的培養(yǎng)，或在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。從預(yù)培養(yǎng)物取100μl用于接種深孔板中的500μl表達(dá)培養(yǎng)物(2*TY，100μg/ml氨芐青霉素，1mM IPTG)；然后將這些表達(dá)培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)搖床上于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。
微滴定板DERA穩(wěn)定性試驗(yàn)為檢查突變的DERA酶針對(duì)氯乙醛的抗性，進(jìn)行一項(xiàng)試驗(yàn)，所述試驗(yàn)基于DERA天然底物反應(yīng)。以每分鐘4,000轉(zhuǎn)(rpm)對(duì)深孔表達(dá)培養(yǎng)物進(jìn)行15分鐘的離心，在400μl B-PER裂解緩沖液(25％v/v B-PERII(Pierce)，75％(v/v)50mM三乙醇胺緩沖液，pH7.5加100mg/lRNAse A)中對(duì)獲得的E.coli細(xì)胞沉淀進(jìn)行裂解。對(duì)高于120mM氯乙醛的氯乙醛濃度，使用200mM三乙醇胺。通過(guò)離心(4,000rpm，4℃，進(jìn)行15分鐘)移除細(xì)胞殘骸，從每個(gè)孔中轉(zhuǎn)出210μl不含細(xì)胞的提取物進(jìn)新的微滴定板。為評(píng)估DERA活性，使用上文所述的DERA天然底物活性試驗(yàn)測(cè)定DERA天然底物反應(yīng)中的起始活性。通過(guò)取殘余的200μl體積的不含細(xì)胞的提取物，加入50μl氯乙醛溶液，來(lái)檢查DERA突變體對(duì)氯乙醛的抗性。
在第一輪篩選中，使用600mM的氯乙醛貯液，對(duì)篩選第一次重組的突變體文庫(kù)，使用1.0M的貯液，針對(duì)篩選第二次重組的突變體文庫(kù)，使用1.5M的貯液，分別得到終濃度為120、200和300mM的氯乙醛。在所有情況下，暴露時(shí)間為2分鐘。之后，分別取50μl樣品(易錯(cuò)PCR文庫(kù))、30μl樣品(第一次重組的突變體文庫(kù))或25μl樣品(第二次重組的突變體文庫(kù))，將它們轉(zhuǎn)入含有50mM三乙醇胺緩沖液(pH7.5，終體積為200μl)的微滴定板。類似起始DERA活性，通過(guò)加入50μl輔助酶/底物混合武來(lái)測(cè)定針對(duì)DERA天然底物反應(yīng)的剩余DERA活性。令DERA天然反應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行30秒，之后加入50μl終止溶液終止反應(yīng)。為測(cè)定消耗的NADH的量，在340nm處測(cè)量樣品的UV吸收。
使用平末端(blunt-end)限制性酶(BERE)重組來(lái)重組有利的突變(根據(jù)WO03/010311)將從易錯(cuò)PCR文庫(kù)選出的突變體克隆用作為基礎(chǔ)，通過(guò)重組它們的突變來(lái)進(jìn)行對(duì)DERA的進(jìn)一步改進(jìn)。從貯液培養(yǎng)物中分離出選出的突變體克隆的質(zhì)粒DNA，將其用作為模板以擴(kuò)增突變的基因。用平末端切割的限制性內(nèi)切酶去消化得到的突變體基因PCR片段，使用連接酶(ampligase)和Hercules DNA聚合酶將獲得的基因片段重新裝配進(jìn)全長(zhǎng)基因。為進(jìn)行重組，使用限制性內(nèi)切酶HaeIII、HinCII和FspI(庫(kù)A)和CacI8或BstUI(庫(kù)B)來(lái)制備兩個(gè)基因片段庫(kù)。為進(jìn)行連接酶反應(yīng)(總體積為50μl)，從每個(gè)庫(kù)中取0.5μg基因片段DNA，使用下述溫度程序94℃ 2分鐘，94℃ 30秒和60℃ 1分鐘的30個(gè)循環(huán)，以及最后的60℃ 10分鐘的循環(huán)。對(duì)20μl連接酶反應(yīng)物進(jìn)行乙醇沉淀，將DNA沉淀(大約0.4μgDNA)溶解于40μl滅菌水中，將其作為模板用于重組突變體基因的PCR擴(kuò)增。針對(duì)使用Hercules DNA聚合酶(5 U)進(jìn)行的PCR反應(yīng)(50μl體積)，使用引物DAI 13600(SEQ ID NO.4)和DAI 13465(SEQ ID NO.5)分別作為正向和反向引物。使用下述PCR程序72℃ 5分鐘，94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 45秒的15個(gè)循環(huán)，最后循環(huán)為72℃ 10分鐘。使用Qiagen PCR純化試劑盒純化獲得的全長(zhǎng)突變體基因片段，使用上文所述的定點(diǎn)重組將其克隆進(jìn)pDEST14載體。
對(duì)具有提高的氯乙醛抗性的DERA突變體進(jìn)行再檢查從冷凍的甘油樣板(master plate)接種DERA酶突變體預(yù)培養(yǎng)物，180rpm的振蕩下于25℃培養(yǎng)過(guò)夜。將預(yù)培養(yǎng)物小份用于接種25ml表達(dá)培養(yǎng)物(2*TY培養(yǎng)基，100μg/ml氨芐青霉素，1mM IPTG)，在25℃(以180rpm振蕩)培養(yǎng)36小時(shí)。通過(guò)離心(5,000rpm，15分鐘)收獲細(xì)胞，使用2.5ml B-PER II來(lái)裂解細(xì)胞沉淀。首先通過(guò)在5,000rpm離心15分鐘去除細(xì)胞殘骸，然后使用Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘(4℃)。用獲得的不含細(xì)胞的提取物在時(shí)間段實(shí)驗(yàn)中以及多種濃度范圍上去檢查表達(dá)的DERA突變體酶對(duì)氯乙醛的抗性。
為進(jìn)行時(shí)間段實(shí)驗(yàn)，以四份重復(fù)來(lái)測(cè)定樣品中存在的初始DERA天然底物反應(yīng)活性。將具有合適量的DERA活性的定體積提取物暴露給200mM氯乙醛，在加入氯乙醛后的時(shí)間點(diǎn)t＝1、t＝5、t＝10、t＝15和t＝20分鐘時(shí)，撤出小份，采用四份重復(fù)進(jìn)行DERA天然底物活性試驗(yàn)，來(lái)測(cè)量DERA活性的殘值。測(cè)得的初始DERA天然底物活性被設(shè)定為100％，在指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的活性被表示為相對(duì)于所述初始起點(diǎn)DERA天然底物活性的百分比。
氯乙醛抗性方法的結(jié)果使用上述抗性方法，對(duì)大約10,000個(gè)克隆進(jìn)行了檢查。在初始穩(wěn)定性檢測(cè)活動(dòng)中，將易錯(cuò)PCR獲得的突變體，DERA酶暴露給150mM氯乙醛，暴露2分鐘。為篩選重組變體，在第一輪和第二輪重組中，將氯乙醛的濃度分別增加為200mM和300mM。采用同樣的設(shè)置，以三份重復(fù)對(duì)選出的突變體克隆進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。選出表現(xiàn)類似于初始結(jié)果的克隆，對(duì)其進(jìn)行分離。
使用BERE方法(如上所述)，對(duì)這些選出的克隆的庫(kù)突變deoC基因進(jìn)行隨機(jī)重組。在第一輪重組中，以200mM氯乙醛對(duì)1,000個(gè)克隆進(jìn)行了研究。分離出22個(gè)克隆，它們展示出至少提高了50％的對(duì)氯乙醛的抗性。然后再?gòu)臉影逯蟹蛛x出這些突變體克隆，純化表達(dá)載體，通過(guò)PCR擴(kuò)增突變基因，建庫(kù)。在第二輪篩選中，鑒定出了41個(gè)DERA酶突變體，2分鐘培養(yǎng)時(shí)間后，這些酶突變體顯示出對(duì)300mM氯乙醛的抗性較之E.coli K12野生型DERA增加了至少兩倍。
應(yīng)用DERA天然底物反應(yīng)活性試驗(yàn)，針對(duì)對(duì)200mM氯乙醛的抗性，從25ml表達(dá)培養(yǎng)物對(duì)第二輪的10個(gè)最好的突變體進(jìn)行了再次檢驗(yàn)，檢驗(yàn)平行于E.coli K12野生型DERA進(jìn)行。結(jié)果是三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，其作為殘余DERA活性較之0mM氯乙醛時(shí)的分別的值的百分比，被展示于表4中，表4包括了對(duì)DERA酶突變體的命名和氨基酸改變。
表4Escherichia coli K12 DERA酶突變體和E.coli K12野生型
DERA對(duì)氯乙醛的抗性和DERA生產(chǎn)率因子
實(shí)施例2 具體提高的針對(duì)CHBA的生產(chǎn)率的DERA突變體酶為篩選出具有提高的對(duì)4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA，氯乙醛和乙醛每種一個(gè)分子醛醇縮合形成的)的生產(chǎn)率的DERA突變體，構(gòu)建出大約3,000個(gè)突變體克隆的文庫(kù)。按照實(shí)施例1所述來(lái)進(jìn)行易錯(cuò)PCR、Gateway克隆和DERA突變體的表達(dá)，不同之處在于，不分離pENTR載體就將易錯(cuò)PCR片段被直接克隆進(jìn)pDEST14載體，以使表達(dá)文庫(kù)的遺傳多樣性最大化。
樣品制備，用于使用GC/MS進(jìn)行的生產(chǎn)率方法為進(jìn)行基于GC/MS的生產(chǎn)率方法(使用200mM氯乙醛和乙醛作為底物，檢查CHBA產(chǎn)物形成)，采用類似于氯乙醛抗性篩選中使用的方法，從600μl表達(dá)培養(yǎng)物制備不含細(xì)胞的提取物。對(duì)已在深孔板中于振蕩搖床上培養(yǎng)了24小時(shí)的表達(dá)培養(yǎng)物進(jìn)行離心(4000rpm，15分鐘)。在350μl 50％(v/v)B-PER II、50％(v/v)250mM NaCO3、pH7.5中對(duì)獲得的細(xì)胞沉淀加以裂解。按照上文所述通過(guò)離心去除細(xì)胞殘骸。將含有突變的E.coli K12 DERA酶的100μl cfe與100μl 400mM乙醛和氯乙醛溶液混合。RT下1小時(shí)的培養(yǎng)后，每種反應(yīng)體系取100μl，加入到900μl含有0.05％(w/w)環(huán)己基苯的乙腈中，其被用作為針對(duì)產(chǎn)物定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(IS)。通過(guò)離心去除蛋白沉淀，每種樣品取500μl轉(zhuǎn)移到新的深孔微滴定板中。
通過(guò)高通量GC/MS對(duì)4-氯-3-羥基-丁醛進(jìn)行分析在偶聯(lián)HP 5973質(zhì)量探測(cè)儀(Agilent)的Hewlett Packard 6890型氣相色譜上，針對(duì)其CHBA含量對(duì)樣品進(jìn)行分析。通過(guò)自動(dòng)注射器，直接從微滴定板將樣品注射到Chrompack CP-SIL 13CB(Varian)柱上。以1.1ml/分鐘的恒定流速，用氦作為載氣，在兩分鐘內(nèi)進(jìn)行從100℃到250℃的溫度程序。通過(guò)單離子監(jiān)測(cè)(SIM)來(lái)探測(cè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(M＝45，從t＝0至2.80分鐘)和CHBA(M＝160，從t＝2.80分鐘至方法結(jié)束)的特征離子。對(duì)于一種樣品而言，總循環(huán)時(shí)間(從注射到注射)小于五分鐘。
生產(chǎn)率方法提供了E.coli K12 DERA的7種酶突變體，它們較之E.coli K12野生型DERA，具有至少3倍的CHBA濃度增加。使用上述DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)，對(duì)選出的突變體克隆進(jìn)行再次檢測(cè)，將它們與E.coli K12野生型DERA相比，并測(cè)定它們的DERA生產(chǎn)率因子(以16小時(shí)中，cfe中每mg蛋白產(chǎn)生的以mmol表示的CTeHP)。
用每種重轉(zhuǎn)化突變體克隆的單個(gè)菌落去接種2.5ml Luria Bertani培養(yǎng)基(LB)預(yù)培養(yǎng)物(含有100μg/ml羧芐青霉素)，在每分鐘180轉(zhuǎn)(rpm)的振蕩及28℃下培養(yǎng)過(guò)夜。用這些預(yù)培養(yǎng)物接種50ml LB表達(dá)培養(yǎng)物，至細(xì)胞密度為OD620nm等于0.05，在旋轉(zhuǎn)搖床上(180rpm)于28℃進(jìn)行培養(yǎng)。三小時(shí)培養(yǎng)后，于大約0.4的光密度，通過(guò)加入1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)來(lái)誘導(dǎo)突變體DERA的表達(dá)。21小時(shí)后，通過(guò)離心(5,000xg下，5分鐘)收獲細(xì)胞，將其重新懸浮于1ml 50mM三乙醇胺緩沖液(pH7.2)中。通過(guò)對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行5分鐘(10秒脈沖，接著10秒暫停)的超聲波處理，以及在4℃和16,000xg下離心1小時(shí)來(lái)獲得不含細(xì)胞的提取物(cfe)。將cfe貯藏于4℃，直到在DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)中進(jìn)一步使用。對(duì)所述生產(chǎn)率方法發(fā)現(xiàn)的DERA酶突變體的命名和氨基酸改變列于表5中。
表5Escherichia coli K12 DERA酶突變體和E.coli K12野生型DERA的CHBA形成和DERA生產(chǎn)率因子
實(shí)施例3 用DERA突變體9-11H進(jìn)行規(guī)模擴(kuò)大的CTeHP合成按照實(shí)施例2所述，分別用質(zhì)粒pDEST14-Ecol-deoC和pDEST14_9-11H(F200I突變體)對(duì)化學(xué)感受態(tài)E.coli BL21 Star(DE3)(Invitrogen)進(jìn)行新鮮轉(zhuǎn)化。用來(lái)自分別的轉(zhuǎn)化瓊脂平板的單個(gè)菌落接種兩份50ml的LB預(yù)培養(yǎng)物(含有100μg/ml羧芐青霉素)，在旋轉(zhuǎn)搖床上(180rpm)于28℃培養(yǎng)過(guò)夜。
第二天，用50ml預(yù)培養(yǎng)物去接種含有1l LB培養(yǎng)基的滅菌Erlenmeyer瓶(每瓶具有100μg/ml羧芐青霉素)，至起始細(xì)菌密度為OD620＝0.05，在振蕩(180rpm)下于28℃進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞密度為OD620≈0.6時(shí)，通過(guò)加入1mM IPTG來(lái)誘導(dǎo)E.coli K12野生型DERA和由此獲得的突變體DERA 9-11H(含有氨基酸改變F200I)的表達(dá)。在同樣條件下進(jìn)一步培養(yǎng)培養(yǎng)物，直到總培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到21小時(shí)。在該時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)離心(5000xg下，5分鐘)收獲兩種培養(yǎng)物，將細(xì)胞沉淀重新懸浮于25ml 50mM三乙醇胺緩沖液(pH7.2)中。通過(guò)對(duì)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行2次5分鐘(10秒脈沖接著10秒暫停，大探針)的超聲波處理，并于4℃、39,000xg離心1小時(shí)來(lái)獲得不含細(xì)胞的提取物。將cfe貯藏于4℃直到進(jìn)一步使用。用上述所述的DERA天然底物活性試驗(yàn)(但其中使用5mM2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯)測(cè)得的兩種cfe的特定活性在相同范圍內(nèi)。
對(duì)規(guī)模擴(kuò)大的反應(yīng)而言，在室溫及輕柔攪拌下，于總體積為50ml的含有0.1M NaHCO3緩沖液(pH7.2)中，將10mmol氯乙醛和23mmol乙醛與1.5kU的野生型和突變體DERA F200I分別進(jìn)行培養(yǎng)。反應(yīng)進(jìn)行五小時(shí)，在反應(yīng)過(guò)程中不同的時(shí)間點(diǎn)取100μl樣品。5小時(shí)后，通過(guò)加入900μl乙腈，以及在16,000xg離心10分鐘來(lái)終止樣品中的酶反應(yīng)。通過(guò)使用FID探測(cè)器在Chrompack CP-SIL8CB柱(Varian)上進(jìn)行氣相色譜，對(duì)上清液中CTeHP和CHBA含量進(jìn)行分析。這些樣品中測(cè)得的分別濃度可在表6中找到。
使用每mmol氯乙醛150U時(shí)，兩小時(shí)和四小時(shí)后，E coli K12 DERA突變體F200I分別展示出從存在的氯乙醛向CTeHP的轉(zhuǎn)化率為81％和86％。U表示酶的一個(gè)單位，這是在DERA天然底物活性試驗(yàn)條件下，1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol 2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯所必需的酶的量。僅在反應(yīng)的開(kāi)始時(shí)，可探測(cè)到少量的中間產(chǎn)物CHBA。在用每mmol氯乙醛150U野生型E coli K12 DERA進(jìn)行的反應(yīng)中，不能探測(cè)到CHBA，僅能探測(cè)到少量的CTeHP。對(duì)野生型DERA而言，兩小時(shí)和四小時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間后，野生型DERA的從氯乙醛到CTeHP的轉(zhuǎn)化率分別為7％和8％。因此，在同樣的時(shí)間段內(nèi)，發(fā)現(xiàn)的E coli K12突變體DERA F200I展示出是來(lái)自E coliK12的野生型DERA的大約11至12倍高的轉(zhuǎn)化率。
表6采用每mmol氯乙醛150U，通過(guò)E coli K12野生型和突變體DERA F200I形成的CTeHP和CHBA。(-＝低于探測(cè)極限)
實(shí)施例4 對(duì)野生型E coli K12 DERA的F200進(jìn)行飽和誘變F200X位點(diǎn)突變的引入按照廠商說(shuō)明書，使用QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene)來(lái)將E coli K12野生型deoC基因(SEQ ID NO.6)中編碼E coli K12野生型DERA氨基酸序列(SEQ ID NO.1)的第200位處氨基酸殘基苯丙氨酸的DNA序列改變?yōu)槿?4種可能的編碼序列(X被定義為前文列出的20種蛋白原性氨基酸和3個(gè)終止密碼子)，其中使用下述誘變引物F200X_for435’GC GTA GAA AAA ACC GTT GGT NNN AAA CCG GCG GGC GGC GTG CG 3’SEQ ID NO.9F200X_rev435’CG CAC GCC GCC CGC CGG TIT NNN ACC AAC GGT TTT TTC TAC GC3’SEQ ID NO.10(N代表A、C、G和T四種核苷酸中的任何一種)。E coli K12野生型deoC基因作為模板使用，已按照WO03/006656所述的方案，將其克隆進(jìn)了質(zhì)粒pBAD/Myc-HisC(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)的NcoI和EcoRI限制性位點(diǎn)。涂布到含有100μg/ml羧芐青霉素的選擇性LB培養(yǎng)基上之后，用隨機(jī)選出的、獨(dú)立的菌落去接種4塊深孔微滴定板(含有1ml 2*TY培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有100μg/ml羧芐青霉素)，每孔用一種獨(dú)立菌落。在每塊板上，對(duì)三個(gè)孔接種含有下述pBAD/Myc-HisC的E coli TOP10菌落用作為對(duì)照，下述pBAD/Myc-HisC中分別具有克隆的E coli野生型deoC基因(SEQ ID No.6)和顯示出SEQ ID No.6中T706A突變(導(dǎo)致E coliDERA氨基酸序列(SEQ ID No.1)中第200位處發(fā)生從苯丙氨酸到異亮氨酸的氨基酸改變)的E coli deoC基因。
對(duì)F200X文庫(kù)的培養(yǎng)、表達(dá)和篩選在Kühner ISF-1-W旋轉(zhuǎn)搖床上(50mm的振蕩幅度)于25℃和300rpm下，對(duì)接種的深孔微滴定板進(jìn)行2天的培養(yǎng)，將其作為預(yù)培養(yǎng)物，用于在深孔微滴定板中對(duì)突變的deoC變體的表達(dá)培養(yǎng)物。為此目的而言，從每個(gè)孔中取65μl轉(zhuǎn)移進(jìn)深孔微滴定板(含有935μl滅菌的2*TY培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有100μg/ml羧芐青霉素和0.02％(w/v)L-阿拉伯糖)的相應(yīng)孔中，誘導(dǎo)基因表達(dá)。
隨后在在Kühner ISF-1-W旋轉(zhuǎn)搖床上(50mm的振蕩幅度；37℃；300rpm)對(duì)表達(dá)培養(yǎng)物進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)。按照實(shí)施例2所述來(lái)進(jìn)行細(xì)胞收獲和裂解，不同之處在于每個(gè)孔使用總體積為500μl的裂解緩沖液。按照實(shí)施例2所述來(lái)進(jìn)行底物培養(yǎng)，但是進(jìn)行20小時(shí)。通過(guò)向每個(gè)孔中加入1ml含有1000ppm環(huán)己基苯的乙腈(其在GC/MS分析中被用作為針對(duì)產(chǎn)物定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))來(lái)終止反應(yīng)。在按照實(shí)施例2所述通過(guò)GC/MS分析進(jìn)行產(chǎn)物定量之前，通過(guò)離心沉淀蛋白(5,000rpm，于4℃，進(jìn)行30分鐘)。
鑒定出了總共14個(gè)克隆中具有至少2.5倍升高的CTeHP形成(見(jiàn)表7)。這14個(gè)克隆中，7個(gè)含有突變?yōu)槔i氨酸的F200突變，6個(gè)突變?yōu)楫惲涟彼幔?個(gè)突變?yōu)榧琢虬彼幔謩e具有對(duì)這三種氨基酸的每種來(lái)說(shuō)都是全部可能的密碼子。根據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果，所有這14種克隆中，deoC基因中沒(méi)有發(fā)生其它額外突變。
用DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)對(duì)F200X“擊中(hit)”進(jìn)行再次檢測(cè)按照上文所述的DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)，對(duì)這14種克隆進(jìn)行再次檢測(cè)，與E coli K12野生型DERA進(jìn)行比較。為此目的而言，以50ml的規(guī)模培養(yǎng)14種克隆，按照實(shí)施例2所述來(lái)制備不含細(xì)胞的提取物，不同之處在于，使用基于E coli TOP10/pBAD/Myc-HisC的系統(tǒng)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，通過(guò)加入0.02％(w/v)L-阿拉伯糖代替1mM IPTG來(lái)誘導(dǎo)E coli K12deoC基因變體的表達(dá)。
F200V變體顯示出與從該篩選獲得的F200I變體可相比較的篩選中CTeHP形成和DERA生產(chǎn)率因子。F200M變體顯示出比F200V和F200I變體略低的DERA生產(chǎn)率因子，但較之E coli K12野生型DERA生產(chǎn)率因子仍高出10倍(超過(guò)1000％)。
表7Escherichia coli K12 DERA F200X酶突變體和E coli K12野生型DERA的篩選CTeHP形成和DERA生產(chǎn)率因子
擴(kuò)大規(guī)模的F200X反應(yīng)為更為詳細(xì)地研究通過(guò)對(duì)E coli K12 DERA的F200位點(diǎn)進(jìn)行的飽和誘變發(fā)現(xiàn)的三種氨基酸取代F200I、F200V和F200M，對(duì)選出的克隆的確定量的不含細(xì)胞的提取物加以研究，研究針對(duì)它們?cè)?.6M的氯乙醛濃度和1.2M的乙醛濃度下進(jìn)行的CTeHP形成中的表現(xiàn)。
通過(guò)對(duì)其分別的cfe中15μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，針對(duì)其表達(dá)水平對(duì)克隆1-D10(F200M)、2-H8(F200V)和3-C10(F200I)進(jìn)行研究。突變體酶的表達(dá)水平被證明為與野生型E coli K12 DERA相同。采用2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯的DERA天然底物反應(yīng)中，酶活性分別為F200M，29U/mg；F200V，38U/mg；F200I，36U/mg；以及E coli K12的野生型DERA，54U/mg。
為進(jìn)行CIAA反應(yīng)，將來(lái)自分別的不含細(xì)胞的提取物的3mg總蛋白用于1ml的總體積。所有反應(yīng)都在室溫和輕柔攪拌下于0.1M NaHCO3緩沖液(pH7.2)中進(jìn)行。為對(duì)CTeHP形成進(jìn)行定量，在反應(yīng)期間不同時(shí)間點(diǎn)取100μl樣品。通過(guò)加入900μl乙腈(含有1,000ppm環(huán)己基苯作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))以及在16,000xg下離心10分鐘來(lái)終止樣品中的酶反應(yīng)。通過(guò)使用FID探測(cè)器在Chrompack CP-SIL8CB柱(Varian)上進(jìn)行氣相色譜，對(duì)上清液的CTeHP含量加以分析。該分析結(jié)果示于表8中。
表8通過(guò)以每ml反應(yīng)體積3mg蛋白含有野生型DERA和DERA突變體F200M(克隆1-D10)、F200V(克隆2-H8)和F200I(3-C10)的不含細(xì)胞的提取物，從0.6M CIAA和1.2M乙醛進(jìn)行CTeHP形成的時(shí)間過(guò)程。(-＝低于探測(cè)極限)
這些結(jié)果證明，F(xiàn)200I、F200V和F200M取代是在F200位點(diǎn)進(jìn)行的有利于CIAA和乙醛向CTeHP轉(zhuǎn)化的突變。
實(shí)施例5 F200I突變組合ΔY259；F200I突變組合Δ259以及SEQ ID No.3的C末端延伸使用基于PCR的定點(diǎn)誘變技術(shù)，將F200I改變與(i)C-末端Y259殘基的缺失和(ii)其取代加氨基酸序列KTQLSCTKW(SEQ ID No.3)對(duì)E.coli K12 DERA C-末端的延伸重組。分別以正向和反向，合成包含分別的突變的PCR引物，所述引物為大約30至50個(gè)核苷酸。在兩種單獨(dú)的PCR反應(yīng)中，將這些引物分別組合Gateway系統(tǒng)(Invitrogen)特異性正向和反向引物，或其它誘變正向或反向引物，在pDEST14(Invitrogen)中克隆的來(lái)自E.coli K12的野生型deoC基因(SEQ ID No.6)上使用。
Gateway系統(tǒng)特異性正向引物序列5’GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG 3’SEQ ID No.11Gateway系統(tǒng)特異性反向引物序列5’GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC 3’SEQ ID No.12F200I正向5′CCG TTG GTA TCA AAC CGG CGG GCG G 3’SEQ ID No.13F200I反向5′CCG CCC GCC GGT TTG ATA CCA ACG G 3’SEQ ID No.14
ΔY259反向5′GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GTAGTG CTG GCG CTC TTA CC 3’SEQ ID No.15C-延伸3反向5′GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC CTA TTAGTT AGC TGC TGG CGC TC 3’SEQ ID No.16對(duì)產(chǎn)生的部分deoC基因進(jìn)行凝膠純化，防止對(duì)隨后用模板deoC片段DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)造成污染。獲得的片段被用于PCR反應(yīng)，以重新裝配含有目標(biāo)突變的變體全長(zhǎng)deoC基因。然后按照廠商提供的一管法方案，將全長(zhǎng)變體deoC片段亞克隆進(jìn)pDEST14載體。對(duì)插入進(jìn)行完全測(cè)序，以證實(shí)在想要的E.coli K12 deoC突變體表達(dá)構(gòu)建體中，沒(méi)有發(fā)生不想要的改變。
在不存在氯乙醛時(shí)，根據(jù)DERA天然底物活性試驗(yàn)，獲得的E.coliK12 DERA變體F200I/ΔY259和F200I/ΔY259+SEQ ID No.3針對(duì)2-脫氧-D-核糖-5-磷酸酯幾乎沒(méi)有顯示出催化活性。因此，按照Wong及其同事在J.Am.Chem.Soc.117(12)，3333-3339(1995)中所述的方法，通過(guò)離子交換色譜和硫酸銨分級(jí)分離(fractionation)來(lái)純化過(guò)量表達(dá)的DERA變體。按照實(shí)施例3所述，針對(duì)CTeHP合成，將重組變體F200I+ΔY259和F200I+ΔY259+SEQ ID No.3與DERA變體F200I和E.coli K12野生型DERA相比較，不同之處在于，每ml反應(yīng)體積中使用給定量為2.5mg的分別的純化DERA(野生型或變體)，來(lái)代替實(shí)施例3和4中所述的不含細(xì)胞的提取物。在底物濃度為0.5M CIAA和1.0M乙醛的情況下，用純化的F200I/ΔY259和F200I/ΔY259+SEQ ID No.3，在8小時(shí)后，分別獲得了61％和70％的從提供的醛向CTeHP的轉(zhuǎn)化率(表9)。用純化的F200I，在8小時(shí)后獲得了0.11M的CTeHP濃度，這對(duì)應(yīng)于23％的向目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。用純化的E.coli K12野生型DERA，僅形成了非常非常少的CTeHP。此時(shí)，提供的醛中僅有不到7％被轉(zhuǎn)化。
表9針對(duì)使用0.5M CIAA和1.0M乙醛和每ml反應(yīng)體積中2.5mg經(jīng)純化的DERA，用DERA變體F200I、F200I/ΔY259和F200I/ΔY259+SEQ ID No.3與E.coli K12野生型DERA進(jìn)行的比較
實(shí)施例6 針對(duì)CTeHP生產(chǎn)篩選野生型DERA對(duì)編碼Aeropyrum pernix K1(GI:24638457)、Bacillus subtilis str.168(GI:1706363)、Deinococcus radiodurans R1(GI:24636816)和Thermotogamaritima MSB8(GI:7674000)的野生型DERA的deoC基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中使用含有attB識(shí)別序列(用于Gateway克隆)的基因特異性引物。
A.pernix5’正向5’GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGGAGA TAG AAC CAT GAG AGA GGC GTC GGA CGG 3’SEQ ID No.17A.pernix3’反向5′GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA GACTAG GGA TTT GAA GCT CTC CAA AAC C 3’SEQ ID No.18
B.subtilis 5’正向5’GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGGAGA TAG AAC CAT GTC ATT AGC CAA CAT A AT TGA TCA TAC AG3’SEQ ID No.19B.subtilis 3’反向5′GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA ATAGTT GTC TCC GCC TGA TGC 3’SEQ ID No.20D.radiodurans 5’正向5’GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGGAGA TAG AAC CAT GTC ACT CGC CTC CTA CAT CGA CC 3’SEQ ID No.21D.radiodurans 3’反向5′GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA GTAGCC GGC TCC GTT TTC GC 3’SEQ ID No.22T.maritima 5’正向5’GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGGAGA TAG AAC C ATG ATA GAG TAC AGG ATT GAG GAG G 3’SEQ ID NO.23T.maritima 3’反向5′GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TCA ACCTCC ATA TCT CTC TTC TCC 3’
SEQ ID NO.24按照廠商的方法，將四種野生型deoC基因克隆進(jìn)pDEST14，用分別的pDEST14-deoC構(gòu)建體去轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)E.coli Rosetta(DE3)(Novagen)。將含有pDEST14-Ecol-deoC和pDEST14_9-11H的E.coliRosetta(DE3)菌株用作為對(duì)照，上述兩種載體分別含有E coli野生型deoC基因(SEQ ID No.6)和顯示出SEQ ID No.6中T706A突變(導(dǎo)致Ecoli DERA氨基酸序列(SEQ ID No.1)中第200位處發(fā)生從苯丙氨酸到異亮氨酸的氨基酸改變)的E coli K12 deoC基因。從LB瓊脂平板(含有100μg/ml羧芐青霉素和35μg/ml氯霉素)上，對(duì)上述六種菌株中的每種都取八個(gè)隨機(jī)選出的、獨(dú)立的菌落，用于接種深孔微滴定板(含有1ml2*YT培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有100μg/ml羧芐青霉素和35μg/ml氯霉素)。
對(duì)野生型DERA的培養(yǎng)、表達(dá)和篩選在Kühner ISF-1-W旋轉(zhuǎn)搖床上(50mm的振蕩幅度)于20℃和300rpm下，對(duì)接種的深孔微滴定板進(jìn)行2天的培養(yǎng)，將其作為預(yù)培養(yǎng)物，用于在深孔微滴定板中對(duì)突變的deoC變體的表達(dá)培養(yǎng)物。為此目的而言，從每個(gè)孔中取65μl轉(zhuǎn)移進(jìn)深孔微滴定板(含有935μl滅菌的2*TY培養(yǎng)基，其中補(bǔ)充有100μg/ml羧芐青霉素、35μg/ml氯霉素和1mM IPTG)的相應(yīng)孔中，誘導(dǎo)基因表達(dá)。
隨后在在Kühner ISF-1-W旋轉(zhuǎn)搖床上(50mm的振蕩幅度；25℃；300rpm)對(duì)表達(dá)培養(yǎng)物進(jìn)行24小時(shí)的培養(yǎng)。按照實(shí)施例2所述來(lái)進(jìn)行細(xì)胞收獲和裂解，不同之處在于每個(gè)孔使用總體積為500μl的裂解緩沖液，并且，裂解緩沖液由50mM MOPS緩沖液構(gòu)成，其pH為7.5，其中含有0.1mg/ml的DNAse I(Roche)、2mg/ml的溶菌酶(Sigma)、10mM二硫代蘇糖醇(DTT)和5mg MgSO4。按照實(shí)施例2所述來(lái)進(jìn)行底物培養(yǎng)，但是是用0.2M氯乙醛和0.4M乙醛的底物濃度進(jìn)行2.5小時(shí)。通過(guò)向每個(gè)孔中加入1ml含有1000ppm環(huán)己基苯的乙腈(其在GC/MS分析中被用作為針對(duì)產(chǎn)物定量的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))來(lái)終止反應(yīng)。在按照實(shí)施例2所述通過(guò)GC/MS分析進(jìn)行產(chǎn)物定量之前，通過(guò)離心沉淀蛋白(5,000rpm，于4℃，進(jìn)行30分鐘)。
在所用的篩選條件下，在使用E.coli K12野生型DERA、E.coli K12DERA變體F200I和Bacillus subtilis str.168 DERA的孔中，可探測(cè)到顯著的DERA活性和CHBA形成。在該篩選條件下，其它野生型DERA既沒(méi)有在DERA天然底物試驗(yàn)中顯示出活性，也沒(méi)有在生產(chǎn)率篩選方法中顯示出對(duì)CHBA或CTeHP的生產(chǎn)。E.coli K12變體F200I的CHBA形成平均值為E.coli K12野生型DERA的CHBA形成的大約四倍高，因此，與實(shí)施例2中以相同菌株背景獲得的值相當(dāng)。此外，B.subtilis str.168野生型DERA展示出比來(lái)自E.coli K12的野生型DERA高50％的CHBA生產(chǎn)，而在DERA天然底物活性方面略低(表10)。這表明，通過(guò)實(shí)施例2使用并描述的基于GC/MS的生產(chǎn)率方法，也能找到下述野生型DERA，它們具有比E.coli K12 DERA(具有SEQ ID No.1)更高的生產(chǎn)率，并能合成CHBA和CTeHP。
表10對(duì)能更好地形成CHBA的野生型DERA的篩選DERA天然底物活性和相對(duì)CHBA形成
序 列 表<110>帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>改進(jìn)的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶及其用于生產(chǎn)2，4，6-三脫氧己糖或其6-鹵代或6-氰基取代的衍生物的用途<130>21805WO<160>24<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>259<212>PRT<213>Escherichia coli K12<400>1Met Thr Asp Leu Lys Ala Ser Ser Leu Arg Ala Leu Lys Leu Met Asp1 5 10 15Leu Asn Thr Leu Asn Asp Asp Asp Thr Asp Glu Lys Val Ile Ala Leu20 25 30Cys His Gln Ala Lys Thr Pro Val Gly Asn Thr Ala Ala Ile Cys Ile35 40 45Tyr Pro Arg Phe Ile Pro Ile Ala Arg Lys Thr Leu Lys Glu Gln Gly50 55 60Thr Pro Glu Ile Arg Ile Ala Thr Val Thr Asn Phe Pro His Gly Ash65 70 75 80Asp Asp Ile Asp Ile Ala Leu Ala Glu Thr Arg Ala Ala Ile Ala Tyr85 90 95Gly Ala Asp Glu Val Asp Val Val Phe Pro Tyr Arg Ala Leu Met Ala100 105 110Gly Ash Glu Gln Val Gly Phe Asp Leu Val Lys Ala Cys Lys Glu Ala115 120 125
Cys Ala Ala Ala Asn Val Leu Leu Lys Val Ile Ile Glu Thr Gly Glu130 135 140Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ile Arg Lys Ala Ser Glu Ile Ser Ile Lys145 150 155 160Ala Gly Ala Asp Phe Ile Lys Thr Ser Thr Gly Lys Val Ala Val Asn165 170 175Ala Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ile Met Met Glu Val Ile Arg Asp Met180 185 190Gly Val Glu Lys Thr Val Gly Phe Lys pro Ala Gly Gly Val Arg Thr195 200 205Ala Glu Asp Ala Gln Lys Tyr Leu Ala Ile Ala Asp Glu Leu Phe Gly210 215 220Ala Asp Trp Ala Asp Ala Arg His Tyr Arg Phe Gly Ala Ser Ser Leu225 230 235 240Leu Ala Ser Leu Leu Lys Ala Leu Gly His Gly Asp Gly Lys Ser Ala245 250 255Ser Ser Tyr<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來(lái)自合成DNA的序列<400>2Thr Thr Lys Thr Gln Leu Ser Cys Thr Lys Trp1 5 10<210>3
<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來(lái)自合成DNA的序列<400>3Lys Thr Gln Leu Ser Cys Thr Lys Trp1 5<210>4<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatga ctgatctgaa60agcaagcagc c71<210>5<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5gggggaccac tttgtacaag aaagctgggt cttagtagct gctggcgctc50<210>6<211>780<212>DNA<213>Escherichia coli Kl2<400>6atgactgatc tgaaagcaag cagcctgcgt gcactgaaat tgatggacct gaacaccctg60aatgacgacg acaccgacga gaaagtgatc gccctgtgtc atcaggccaa aactccggtc
120ggcaataccg ccgctatctg tatctatcct cgctttatcc cgattgctcg caaaactctg180aaagagcagg gcaccccgga aatccgtatc gctacggtaa ccaacttccc acacggtaac240gacgacatcg acatcgcgct ggcagaaacc cgtgcggcaa tcgcctacgg tgctgatgaa300gttgacgttg tgttcccgta ccgcgcgctg atggcgggta acgagcaggt tggttttgac360ctggtgaaag cctgtaaaga ggcttgcgcg gcagcgaatg tactgctgaa agtgatcatc420gaaaccggcg aactgaaaga cgaagcgctg atccgtaaag cgtctgaaat ctccatcaaa480gcgggtgcgg acttcatcaa aacctctacc ggtaaagtgg ctgtgaacgc gacgccggaa540agcgcgcgca tcatgatgga agtgatccgt gatatgggcg tagaaaaaac cgttggtttc600aaaccggcgg gcggcgtgcg tactgcggaa gatgcgcaga aatatctcgc cattgcagat660gaactgttcg gtgctgactg ggcagatgcg cgtcactacc gctttggcgc ttccagcctg720ctggcaagcc tgctgaaagc gctgggtcac ggcgacggta agagcgccag cagctactaa780<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>7ctactaagac ccagctttct tgtacaaagt ggtga35<210>8<211>30<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成DNA<400>8aagacccagc tttcttgtac aaagtggtga30<210>9<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc feature<222>(21)..(23)<223>用于在F200位點(diǎn)進(jìn)行飽和誘變的可變核苷酸<400>9gcgtagaaaa aaccgttggt nnnaaaccgg cgggcggcgt gcg43<210>10<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<220>
<221>misc feature<222>(21)..(23)<223>在F200位點(diǎn)上進(jìn)行的飽和誘變<400>10cgcacgccgc ccgccggttt nnnaccaacg gttttttcta cgc43<210>11<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaagg36<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc30<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13ccgttggtat caaaccggcg ggcgg25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14ccgcccgccg gtttgatacc aacgg25<210>15<211>53<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>15ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ttagtagtgc tggcgctctt acc53<210>16<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>16ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctattagtta gctgctggcg ctc53<210>17<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>17ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatga gagaggcgtc60ggacgg66<210>18<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>18ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ttagactagg gatttgaagc tctccaaaac60c
<210>19<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>19ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatgt cattagccaa60cataattgat catacag77<210>20<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>20ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ttaatagttg tctccgcctg atgc54<210>21<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>21ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatgt cactcgcctc60ctacatcgac c71<210>22<211>53<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>22ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcagtagccg gctccgtttt cgc53<210>23<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>23ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cgaaggagat agaaccatga tagagtacag60gattgaggag g71<210>24<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>24ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcaacctcca tatctctctt ctcc5權(quán)利要求
1.酶的經(jīng)過(guò)分離的突變體，所述酶來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，所述野生型酶來(lái)自屬于由真核物種和原核物種構(gòu)成的組的天然來(lái)源，此類野生型酶每種都具有特定的生產(chǎn)率因子，這是通過(guò)在由乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定的，其中，所述經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，并且其中，所述突變體和所述相應(yīng)野生型酶兩者的所述生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的。
2.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)過(guò)分離的突變體，來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，其中，所述經(jīng)過(guò)分離的突變體具有比具有SEQID NO.1的野生型酶序列的、來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)的生產(chǎn)率因子高至少10％的生產(chǎn)率因子，并且其中，所述突變體和所述Escherichia coli K12酶兩者的所述生產(chǎn)率因子都是在相同條件下測(cè)量的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)過(guò)分離的突變體，來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，其中，所述突變體是具有SEQ ID NO.1的野生型酶序列的、來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)的突變體。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過(guò)分離的突變體，來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，其中，所述突變體在SEQ ID NO.1的K13、T19、Y49、N80、D84、A93、E127、A128、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200或S239位點(diǎn)，或與上述位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)中的一處或多處，具有至少一種氨基酸取代，和/或在SEQ ID NO.1的位點(diǎn)S258或Y259，或與所述SEQ ID NO.1的位點(diǎn)S258或Y259相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)，具有至少一個(gè)氨基酸缺失，可選地，組合C-末端延伸和/或組合N-末端延伸。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過(guò)分離的突變體，來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，其中，所述突變體具有在SEQ IDNO.1中進(jìn)行的下述氨基酸取代或?qū)?yīng)于這些取代的取代構(gòu)成的組中的至少一種a.K13和/或K196被帶正電荷氨基酸替換，優(yōu)選地，被R或H替換；b.T19和/或M185被另一種氨基酸替換，優(yōu)選地，被選自由下述組的另一種氨基酸所替換，所述組由親水氨基酸和/或疏水氨基酸構(gòu)成，其中，親水氨基酸特別是由S、T、C、Q和N構(gòu)成的，疏水氨基酸特別是由V、L和I構(gòu)成的；c.Y49被選自由F和W構(gòu)成的組的芳香族氨基酸所取代；d.N80和/或I166和/或S239被選自由T、S、C、Q和N構(gòu)成的親水氨基酸組的另一種氨基酸替換；e.D84和/或A93和/或E127被選自下述小氨基酸組的另一種、優(yōu)選更小的氨基酸所替換，所述組由按照大小降序的E、T、N、P、D、C、S、A和G構(gòu)成；f.A128和/或K146和/或K160和/或A174和/或F200被選自由L、M、V、F和Y構(gòu)成的疏水氨基酸組的另一種氨基酸所替換；和/或在SEQ ID NO.1的S258和Y259位點(diǎn)，或與之對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)處，至少一個(gè)氨基酸的缺失，可選地，組合C-末端延伸，和/或組合N-末端延伸。
6.如權(quán)利要求4或5所述的經(jīng)過(guò)分離的突變體，其中，所述C-末端被片段TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)之一延伸。
7.如權(quán)利要求5或6所述的經(jīng)過(guò)分離的突變體，來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，其中，所述突變體具有SEQ ID NO.1中的下述突變或?qū)?yīng)于這些突變的突變中的一種或多種，所述突變選自下述組K13R、T19S、Y49F、N80S、D84G、A93G、E127G、A128V、K146V、K160M、I166T、A174V、M185T、M185V、K196R、F200I、F200M、F200V、S239C、ΔS258、ΔY259、TTKTQLSCTKW(SEQ ID NO.2)造成的C-末端延伸和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)造成的C末端延伸。
8.如權(quán)利要求7所述的經(jīng)過(guò)分離的突變體，來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組，其中，所述突變體具有選自下述組的SEQ ID NO.1中的下述兩種突變或?qū)?yīng)于這兩種突變的突變F200I和ΔY259、F200M和ΔY259、F200V和ΔY259、F200I和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)造成的C末端延伸、F200M和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)造成的C末端延伸，以及F200V和KTQLSCTKW(SEQ ID NO.3)的造成C末端延伸。
9.一種方法，用于從2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的組中篩選出下述野生型酶，在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定時(shí)，所述野生型酶的生產(chǎn)率因子比具有SEQ ID NO.1野生型酶序列的、來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)的生產(chǎn)率因子高至少10％，其中(A)依次地，(i)分離總和/或基因組DNA和/或cDNA；(ii)制備所述經(jīng)過(guò)分離的DNA的表達(dá)文庫(kù)，所述文庫(kù)由包含所述經(jīng)過(guò)分離的DNA的個(gè)體克隆構(gòu)成；(iii)將來(lái)自獲得的表達(dá)文庫(kù)的個(gè)體克隆與底物乙醛和氯乙醛的混合物一起培養(yǎng)；(iv)分離出來(lái)自下述一種或多種克隆的一種或多種基因，所述克隆顯示能將這些底物轉(zhuǎn)化為4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)和/或6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)，將所述一種或多種基因再克隆進(jìn)與SEQ ID NO.16同樣的遺傳背景；以及，其中(B)表達(dá)步驟(iv)中獲得的再克隆的基因編碼的DERA酶，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)的方法對(duì)其加以檢驗(yàn)，由此獲得針對(duì)每種此類野生型酶的生產(chǎn)率因子；以及，其中(C)將來(lái)自步驟(B)的針對(duì)這些野生型酶的生產(chǎn)率因子與具有SEQID NO.1野生型酶序列的、來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)的生產(chǎn)率因子相比較，選出編碼下述DERA酶的一種或多種基因并進(jìn)行分離，所述DERA酶在所述比較中具有至少高10％的生產(chǎn)率因子。
10.一種方法，用于從2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的組中篩選出下述突變體酶，在從乙醛和氯乙醛的至少等摩爾混合物對(duì)6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的生產(chǎn)過(guò)程中，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)測(cè)定時(shí)，所述突變體酶的生產(chǎn)率因子比相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％，或比具有SEQ ID NO.1野生型酶序列的、來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)的生產(chǎn)率因子高至少10％，其中，(A)依次地，(i)用本身已知的手段，對(duì)編碼野生型2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶的基因進(jìn)行突變，并將其克隆進(jìn)與編碼E.coli K12 DERA的基因(具有SEQ ID NO.6)相同的遺傳背景，分別克隆進(jìn)與突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型基因相同的遺傳背景，由此獲得克隆的表達(dá)文庫(kù)，所述克隆來(lái)自由此制備的突變體；以及，其中(B)表達(dá)克隆中的DERA酶，通過(guò)DERA生產(chǎn)率因子檢驗(yàn)的方法對(duì)其加以檢驗(yàn)，由此獲得針對(duì)每種突變體酶的生產(chǎn)率因子；以及，其中(C)將針對(duì)所述突變體酶的生產(chǎn)率因子與所述相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子，或與具有SEQ ID NO.1的、來(lái)自Escherichia coli K12的野生型酶(EC 4.1.2.4)的生產(chǎn)率因子相比較，選出編碼下述DERA突變體的一種或多種基因并進(jìn)行分離，所述DERA突變體在分別的比較中具有至少高10％的生產(chǎn)率因子。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，在步驟(A)(i)后，步驟(A)(ii)中，將來(lái)自獲得的表達(dá)文庫(kù)的個(gè)體克隆與底物乙醛和氯乙醛的混合物一起培養(yǎng)；之后，在步驟(A)(iii)中，選出下述一種或多種克隆，所述克隆顯示了將這些底物轉(zhuǎn)化為4-氯-3-(S)-羥基-丁醛(CHBA)和/或6-氯-2，4，6-三脫氧-D-赤六吡喃糖苷(CTeHP)的最高轉(zhuǎn)化率；以及，其中，選出的所述克隆被用于步驟B；
12.可通過(guò)權(quán)利要求10或11所述的篩選方法獲得的經(jīng)過(guò)分離的核酸。
13.一種經(jīng)過(guò)分離的核酸，編碼如權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，其中
14.一種載體，包含如權(quán)利要求12或13所述的核酸。
15.宿主細(xì)胞，其中包含如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的、來(lái)自2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶野生型酶的組的突變體，或可根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的篩選方法獲得的此類突變體酶，和/或宿主細(xì)胞，其中包含權(quán)利要求12或13所述的經(jīng)過(guò)分離的核酸，和/或包含權(quán)利要求14所述的載體。
16.一種方法，用于制備突變體2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶，所述酶的生產(chǎn)率因子比相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子和/或具有SEQ ID NO.1野生型酶序列的、來(lái)自Escherichia coli K12的2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.4)的生產(chǎn)率因子高至少10％，其中，使用權(quán)利要求12或13所述的核酸，或權(quán)利要求14所述的載體，或權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞。
17.一種方法，用于生產(chǎn)結(jié)構(gòu)式1的2，4，6-三脫氧己糖或2，4-二脫氧己糖， 其中，R1和Rx每種獨(dú)立代表H或保護(hù)基團(tuán)，其中，X代表鹵素；甲苯磺酸基；甲磺酸基；酰氧基；苯乙酰氧基；烷氧基或芳氧基，所述生產(chǎn)是從乙醛和結(jié)構(gòu)式為HC(O)CH2X的相應(yīng)被取代的乙醛來(lái)生產(chǎn)的，其中，X如上文所定義，其中使用權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的突變體DERA酶，或通過(guò)可通過(guò)權(quán)利要求10或11所述的方法獲得的核酸表達(dá)可獲得的突變體DERA酶，或權(quán)利要求16所述的方法獲得的突變體DERA酶，并且其中，R1和/或Rx代表保護(hù)基團(tuán)的情況下，形成的化合物中的羥基以本身已知的方式被保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，羰基濃度，即醛、2-取代的醛和醛與2-取代的醛之間的反應(yīng)中形成的中間產(chǎn)物(即，4-取代的-3-羥基-丁醛中間產(chǎn)物)濃度的總和，在合成過(guò)程期間被選用為每升反應(yīng)混合物0.1至5摩爾之間。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中，R1和Rx代表H。
20.使用權(quán)利要求17至19中任意一項(xiàng)所述的方法以及本身已知的其它工藝步驟來(lái)制備斯達(dá)汀的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及下述酶的經(jīng)過(guò)分離的突變體，所述酶來(lái)自2－脫氧－D－核糖－5－磷酸醛縮酶野生型酶的組，所述突變體的生產(chǎn)率因子(通過(guò)特定檢驗(yàn)測(cè)定)比突變體來(lái)源的相應(yīng)野生型酶的生產(chǎn)率因子高至少10％。突變體在對(duì)應(yīng)于Escherichia coli K12(EC 4.1.2.4)野生型酶序列中K13、T19、Y49、N80、D84、A93、E127、A128、K146、K160、I166、A174、M185、K196、F200和S239位點(diǎn)中的一處或多處具有至少一種氨基酸取代，和/或在對(duì)應(yīng)于其中S258和Y259的位點(diǎn)有至少一處氨基酸缺失，可選地，與特定C－末端延伸和/或N－末端延伸組合。本發(fā)明還涉及篩選方法，用于找到下述2－脫氧－D－核糖－5－磷酸醛縮酶(原樣或作為突變體)，所述酶具有比對(duì)照值高至少10％的生產(chǎn)率因子(由所述特定檢驗(yàn)測(cè)定，其形成篩選的重要部分)。此外，本發(fā)明涉及由所述篩選方法獲得的突變體酶以及編碼此類突變體的核酸，還涉及分別包含此類核酸或突變體的載體和宿主細(xì)胞。最后，本發(fā)明涉及此類(優(yōu)選地，突變體)酶、核酸、載體和宿主細(xì)胞在生產(chǎn)，例如，6－氯－2，4，6－三脫氧－D－赤六吡喃糖苷中的用途。
文檔編號(hào)C12P19/02GK1965084SQ200580018062
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2005年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者斯特凡·馬丁·詹尼維恩, 馬丁·舒爾曼, 約翰內(nèi)斯·海倫娜·邁克爾·默梅爾斯, 丹尼爾·米恩科, 麥克爾·沃爾波吉, 馬塞爾·格哈杜斯·烏博爾特斯 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司