專利名稱：：真菌脂肪分解酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的真菌脂肪分解酶，并涉及編碼一種或多種新的真菌脂肪分解酶的一種或多種多核苷酸。本發(fā)明也涉及制備真菌脂肪分解酶的方法，及其用途。本發(fā)明還涉及經(jīng)改善的食品的制備，特別是經(jīng)改善的烘烤產(chǎn)品的制備。具體地說，本發(fā)明提供新的真菌脂肪分解酶，該酶能使食物產(chǎn)品(包括烘烤產(chǎn)品)具有更好的特性。
背景技術(shù)：
：多年來已經(jīng)知道脂肪分解酶(E.C.3.1.1.x)在食品和/或飼料工業(yè)應用中的有益用途。例如，在EP0585988中聲稱脂肪酶加入生面團可引起保鮮效果的加強。有人提出從Rhizopusarrhizus獲得的脂肪酶，在聯(lián)合起酥油/脂肪進行使用時，加入生面團后可提高所得面包的品質(zhì)。WO9404035教導了通過將脂肪酶加到生面團而不將任何額外的脂肪/油加到生面團，可改善面包松軟性。Castello(P.ESEGP，1999年12月10日，赫爾辛基)報道了外源脂肪酶可調(diào)節(jié)面包體積。在小麥粉中脂肪酶的底物是1.5-3％內(nèi)源性小麥脂質(zhì)，這是極性和非極性的脂質(zhì)的復雜混合物。極性脂質(zhì)可分為糖脂和磷脂。這些脂質(zhì)由用兩個脂肪酸和一個極性基團酯化的甘油組成。極性基團導致了這些脂質(zhì)的表面活性。酶催化裂解這些脂質(zhì)中的一個脂肪酸，可產(chǎn)生具有顯著更高表面活性的脂質(zhì)。眾所周知具有高表面活性的乳化劑例如DATEM，被加入生面團時，是非常具功能性的。脂肪分解酶水解來自食物中存在的脂質(zhì)的一種或多種的脂肪酸，這引起在食品中形成強有力的乳化劑分子，這可提供商業(yè)上有價值的功能性。帶來最重要的乳化劑特征的分子是部分水解的產(chǎn)物，例如溶血磷脂、溶血糖脂和單甘油酯分子。極性脂質(zhì)水解產(chǎn)物，即溶血磷脂和溶血糖脂，是特別有益的。在面包制作中，這種原位衍生的乳化劑可與添加的乳化劑，例如DATEM，產(chǎn)生相等的功能性。然而，也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脂肪分解酶的活性引起游離脂肪酸的累積，這可在食品中產(chǎn)生有害的作用。脂肪分解酶的這種內(nèi)在活性限制了它們的功能。對面包體積的副作用經(jīng)常解釋為用量過大。用量過大可引起面筋彈性的下降，這可產(chǎn)生太堅硬的生面團，并因而引起體積縮小。另外，或者，所述的脂肪酶可降解被加到生面團的起酥油、油或乳脂，引起生面團和烘烤食品的變味。用量過大和變味已經(jīng)被認為是游離脂肪酸、特別是短鏈脂肪酸在生面團中累積的結(jié)果。高水平的游離脂肪酸(FFA)在原料或食物產(chǎn)品中的存在通常被認為是質(zhì)量缺陷，并且在食品規(guī)范中食品加工者以及消費者通常包含最大量的FFA水平。過量FFA水平帶來的影響可以為感官性缺陷和/或功能性缺陷。在EP1193314中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)對糖脂具有活性的脂肪分解酶的用途特別有利于應用于面包制作中，因為作為部分水解產(chǎn)物的溶血糖脂具有很高的乳化劑作用，這與游離脂肪酸的有害累積相比，可明顯引起較高比例的積極乳化劑作用。然而，也發(fā)現(xiàn)該酶對甘油三酯具有明顯的非選擇性活性，這產(chǎn)生不必要的高游離脂肪酸。在WO02/094123中提出了這種高甘油三酯活性的問題，其中發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過選擇對生面團中極性脂質(zhì)(糖脂和磷脂)有活性的、但對甘油三酯或1-單-甘油酯基本上是無活性的脂肪分解酶，可實現(xiàn)改良的功能性。商業(yè)上優(yōu)選的脂肪酶來源是絲狀真菌，例如曲霉屬(Aspergillusspp.)和鐮孢屬(Fusariumspp.)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從絲狀真菌分離的脂肪酶具有工業(yè)上的應用特征，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其通常在異源性生產(chǎn)系統(tǒng)例如在米曲霉(Aspergillusoryzae)、鐮孢屬(鐮孢菌屬)和酵母中表達。在EP0130064中鑒定了來自尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)的脂肪酶，并且Hoshino等人((1992)Biosci.Biotech.Biochem56660-664)已經(jīng)提出尖孢鐮孢脂肪酶在食品應用中的應用。EP0869167描述了尖孢鐮孢脂肪酶的克隆和表達及其在烘烤中的用途。該酶被描述為具有磷脂酶活性?，F(xiàn)在NovozymesA/S(丹麥)出售該酶，商品名為LipopanFTM。WO02/00852公開了從F.venenatum、F.sulphureum、A.berkeleyanum、F.culmorum和F.solafni分離的五種脂肪酶以及它們的編碼多核苷酸。所有的五種酶被描述為具有三酰甘油水解活性、磷脂酶活性和半乳糖脂酶活性。這些酶中的三種具有與EP0869167中描述的尖孢鐮孢酶相等的活性F.venenatum、F.sulphureum、F.culmorum。因此，明顯的是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些鐮孢屬脂肪酶(包括LipopanFTM)具有對極性脂質(zhì)(包括磷脂和糖脂)的附帶的活性(sideactivity)。盡管在EP0869167中被描述為磷脂酶(phospholipase)，來自尖孢鐮孢的脂肪酶(lipase)具有高脂肪酶活性。該酶也具有糖脂酶(glycolipase)活性。然而，盡管對極性脂質(zhì)具有顯著的活性，但由于高脂肪酶(即甘油三酯)活性，通過利用該酶所獲得的功能性是有限的。Nagao等人(J.Biochem116(1994)536-540)描述了來自異孢鐮孢的脂肪酶；其中該酶的主要起水解甘油三酯的脂肪酶(E.C.3.1.1.3)的作用。這與根據(jù)本發(fā)明的酶很不相同。已經(jīng)生產(chǎn)具有特異氨基酸取代和融合的脂肪分解酶變體，其中一些與野生型親本酶相比，對極性脂質(zhì)具有增強活性。WO01/39602描述了所述的變體(稱為SP979)，它是Thermomyceslanuginosus脂肪酶和EP0869167中描述的尖孢鐮孢脂肪酶的融合體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與對甘油三酯的活性相比，該變體對磷脂和糖脂具有顯著高的活性比。然而，在本發(fā)明之前，還未教導天然的真菌脂肪分解酶特別是來自鐮孢屬(Fusariumspp.)的脂肪分解酶，其與對甘油三酯的活性相比，對極性脂質(zhì)具有高活性比。發(fā)明概述在主要方面中，本發(fā)明涉及與對甘油三酯的活性相比，對極性脂質(zhì)(磷脂和/或糖脂)具有更高活性比的真菌脂肪分解酶，特別是與對甘油三酯的活性相比，涉及對糖脂具有更高活性比的真菌脂肪分解酶。在另外的主要方面中，本發(fā)明涉及與對甘油三酯的活性相比，對極性脂質(zhì)(磷脂和/或糖脂)具有更高活性比的野生型真菌脂肪分解酶，特別是與對甘油三酯的活性相比，對糖脂具有更高活性比的野生型真菌脂肪分解酶。在另外的主要方面中，本發(fā)明還涉及編碼本文所述的新的真菌脂肪分解酶的核酸。在一個主要方面中，本發(fā)明涉及制備食品(優(yōu)選蛋制食品)的方法，方法包括將本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入一種或多種食品成分中。本發(fā)明涉及制備生面團的方法，方法包括將根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入生面團的一種或多種組分中，并進行混和以形成生面團。本發(fā)明另一個主要方面涉及從生面團制備烘烤食品的方法，方法包括將根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入生面團。還提供制備根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶的方法，方法包括用包含編碼真菌脂肪分解酶的核苷酸序列的重組核酸來轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中所述宿主細胞能表達編碼真菌脂肪分解酶的多肽的核苷酸序列，在表達核酸的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞以及收獲真菌脂肪分解酶。在另外的主要的方面中，本發(fā)明提供在低溫下可保持活性的脂肪分解酶，即低溫型脂肪分解酶。本發(fā)明的上述方面存在于權(quán)利要求書和下列注釋中。涉及可用于本發(fā)明的核苷酸序列的其它方面包括包含本發(fā)明的序列的構(gòu)建體；包含用于本發(fā)明的序列的載體；包含用于本發(fā)明的序列的質(zhì)粒；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化細胞；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化組織；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化器官；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化宿主；包含用于本發(fā)明的序列的轉(zhuǎn)化有機體。本發(fā)明也包括使用相同的方法表達用于本發(fā)明的核苷酸序列的方法，例如在宿主細胞中表達；包括轉(zhuǎn)移宿主細胞的方法。本發(fā)明還包括分離核苷酸序列的方法，例如從宿主細胞中分離。涉及本發(fā)明中用到的氨基酸序列的其它方面包括編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的構(gòu)建體；編碼用于本發(fā)明中的氨基酸序列的載體；編碼用于本發(fā)明的氨基酸序列的質(zhì)粒；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化細胞；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化組織；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化器官；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化宿主；表達用于本發(fā)明的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化有機體。本發(fā)明也包括使用本發(fā)明的方法純化用于本發(fā)明的氨基酸序列的方法，例如在宿主細胞中表達；包括轉(zhuǎn)移宿主細胞并然后純化所述序列的方法。為了便于參考，在以下合適的章節(jié)標題中現(xiàn)在討論本發(fā)明的這些和另外方面。然而，每個章節(jié)中所提供的教導不必然被局限于每個特定的章節(jié)。發(fā)明詳述在一個方面中，與對甘油三酯的活性相比，本發(fā)明提供對極性脂質(zhì)具有更高活性比(ratioofactivity)的野生型真菌脂肪分解酶(lipolyticenzyme)。在一個方面中，本發(fā)明提供包含如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6中所示的氨基酸序列或與其具有至少90％同一性的氨基酸序列的真菌脂肪分解酶。在另外的方面中，本發(fā)明提供編碼包含如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6中所示的氨基酸序列或與其具有至少90％同一性的氨基酸序列的真菌脂肪分解酶的核酸。圖37中顯示了SEQIDNo.1，圖38中顯示了SEQIDNo.2，圖40中顯示了SEQIDNo.4以及圖42中顯示了SEQIDNo.6。在另外的方面本發(fā)明提供編碼真菌脂肪分解酶的核酸，其中核酸選自下列中的一種或多種a)包含如SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7中所示的核苷酸序列的核酸；b)通過遺傳密碼子的簡并性，與SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸。圖39中顯示了SEQIDNo.3，圖41中顯示了SEQIDNo.5以及圖43中顯示了SEQIDNo.7。在本發(fā)明另一個方面提供了根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作食品中的用途，例如用于生面團、烘烤食品、蛋、蛋制品、面條產(chǎn)品、乳酪產(chǎn)品、玉米粉圓餅(torfilla)產(chǎn)品、動物飼料產(chǎn)品、植物油或食用油。有利地的是，將本發(fā)明的酶加入食品中可隨著游離脂肪酸的較低累積帶來改進的乳化作用。在另外的方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作生面團和/或烘烤食品中的用途，包括將所述的脂肪分解酶加入生面團中，并(任選地)烘烤生面團直到制成適于下列一種或多種的烘烤食品減少生面團的粘性；提高生面團的可機械加工性；在烘烤食品的烘烤過程中減少起泡；改善面包體積和/或松軟度；延長烘烤食品和/或生面團的保存期；提高烘烤食品和/或生面團的保鮮效果；改善烘烤食品的團粒結(jié)構(gòu)(crumbstructure)；減少烘烤食品的氣孔不均一性；提高烘烤食品的氣孔均一性；減少烘烤食品的平均孔徑；提高生面團的面筋指數(shù)；改善烘烤產(chǎn)品的香味和/或氣味，改善烘烤產(chǎn)品外殼的色澤。有利地是，根據(jù)本發(fā)明的酶在低pH時比常規(guī)的脂肪分解酶具有更高活性，因此比常規(guī)的脂肪分解酶更有利地適于用于低pH的酸生面團環(huán)境中。在本發(fā)明的另一個方面中，提供制作生面團和/或制作烘烤食品的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入生面團并(任選地)烘烤生面團以制備烘烤產(chǎn)品。在另外的方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作蛋制品中的用途，來用于改善質(zhì)地、減少平均粒徑、減少平均顆粒分布、改善熱穩(wěn)定性、改善微波性能和/或穩(wěn)定性。在本發(fā)明的另一個方面中，提供處理蛋或蛋制品的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入蛋或蛋制品中。在本發(fā)明的另一個方面中，提供制作面條，或面條生面團或面條制品的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入面條、面條生面團或面條制品中。在本發(fā)明一個方面中，提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作面條或面條制品中的用途，來用于改善色澤/黃色、穩(wěn)定色澤特征、降低亮度、減少脂肪含量、改善質(zhì)地和口感(咀嚼性)、降低水活動性、降低斷裂、提高核堅實性以及在加工中提高形狀保持性中的一種或多種用途。在本發(fā)明的另一個方面，提供制作玉米粉圓餅或玉米粉圓餅生面團的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明真菌脂肪分解酶加入玉米粉圓餅或玉米粉圓餅生面團中。本發(fā)明的另外方面提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作玉米粉圓餅或玉米粉圓餅生面團中的用途，來用于提高玉米粉圓餅的可滾動性(rollability)、提高玉米粉圓餅的可撓性、提高玉米粉圓餅和/或玉米粉圓餅生面團的保鮮特性、提高松軟性和/或降低玉米粉圓餅和/或玉米粉圓餅生面團中的變味。通過聯(lián)合使用乳化劑例如DATEM，可提高脂肪分解酶在玉米粉圓餅和/或面條中的功能性。在本發(fā)明的另一個方面中，提供處理奶、乳酪用乳、乳酪或乳酪制品的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入乳酪或乳酪制品中。本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作乳酪或乳酪制品中的用途，用于改善香味、質(zhì)地和/或穩(wěn)定性、減少乳酪中的脫油效應和/或提高乳酪生產(chǎn)中的乳酪產(chǎn)量中的一種或多種用途。在本發(fā)明的另一個方面中，提供處理動物飼料的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶加入動物飼料中。本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作動物飼料中的用途，來用于改善下列中的一種或多種飼料利用和/或飼料轉(zhuǎn)化率、體重增加、可消化性、氮的攝取、干物質(zhì)的代謝能力以及可口性。在另外的方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制備溶血磷脂(如溶血卵磷脂)過程中的用途，所述過程通過酶處理磷脂(如卵磷脂)來生產(chǎn)部分水解產(chǎn)物，即溶血磷脂。在本發(fā)明的另一個方面中，提供制備溶血磷脂例如溶血卵磷脂的方法，該方法包括用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶來處理磷脂(如卵磷脂)。在另外的方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制備溶血糖脂(例如雙半乳糖甘油一酯(DGMG)或單半乳糖甘油一酯(MGMG))方法中的用途，其中用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理糖脂(如雙半乳糖甘油二酯(DGDG)或單半乳糖甘油二酯(MGDG))，來生產(chǎn)部分水解產(chǎn)物，即溶血糖脂。在另外的方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制備溶血糖脂(例如雙半乳糖甘油一酯(DGMG)或單半乳糖甘油一酯(MGMG))方法中的用途，其中用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理糖脂(如雙半乳糖甘油二酯(DGDG)或單半乳糖甘油二酯(MGDG))，來生產(chǎn)部分水解產(chǎn)物，即溶血糖脂。在另外的方面中，提供制備溶血糖脂(例如雙半乳糖甘油一酯(DGMG)或單半乳糖甘油一酯(MGMG))的方法，該方法包括用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶處理糖脂(如雙半乳糖甘油二酯(DGDG)或單半乳糖甘油二酯(MGDG))。本發(fā)明還提供植物油或食用油的酶促脫膠方法，包括用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶處理食用油或植物油，來水解大部分的極性脂質(zhì)(如磷脂和/或糖脂)。為了避免疑惑，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應知道適于實施酶催化處理食用油的方法(例如參見EP0869167)。當實施本發(fā)明時可以適當?shù)厥褂靡阎姆椒ǎ灰酶鶕?jù)本發(fā)明的酶替換已知酶。在另外的方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在制作植物油或食用油中的用途，來用于降低植物油或食用油中的磷脂量、同時維持所述油的甘油三酯含量和/或防止或降低游離脂肪酸的累積。在另外的方面中，本發(fā)明還提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在包括處理磷脂來水解脂酰基的方法中的用途。在另一個方面中，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在用于降低食用油中磷脂含量的方法中的用途，包括用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶處理食用油以便水解大部分磷脂、并從油中分離含有水解的磷脂的水相。在另外的方面中，本發(fā)明提供在低溫下保持活性的脂肪分解酶，即低溫型脂肪分解酶。本發(fā)明另外的方面包括低溫型脂肪分解酶在本發(fā)明的真菌脂肪分解酶的方法中以及本文中所述的用途。優(yōu)選地，與對甘油三酯的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶對極性脂質(zhì)(如糖脂和/或磷脂)具有更高的活性比。優(yōu)選地，與對甘油三酯的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶對磷脂具有更高的活性比。優(yōu)選地，與對甘油三酯的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶對糖脂具有更高的活性比。適當?shù)?，與對甘油三酯的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶對磷脂和磷脂都具有更高的活性比。更優(yōu)選地，與對甘油三酯的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶對雙半乳糖甘油二酯(DGDG)具有更高的活性比。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶分別將DGDG或MGDG水解成DGMG或MGMG。本文中提到的術(shù)語“對極性脂質(zhì)更高的活性比”指與商業(yè)性酶LipopanFTM(NovozymesA/S，丹麥)相比，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶具有更高的極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比。本文所用的術(shù)語“極性脂質(zhì)”指磷脂和/或糖脂。優(yōu)選地，本文中提到的術(shù)語“極性脂質(zhì)”指磷脂和糖脂。本文中提到的術(shù)語“對糖脂更高的活性比”和“對磷脂更高的活性比”指分別與用商業(yè)性酶LipopanFTM(NovozymesA/S，丹麥)所得到的相應活性比相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶具有更高的糖脂∶甘油三酯的水解活性比或磷脂∶甘油三酯的水解活性比。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可具有至少為4的極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比可大于8，優(yōu)選大于9、更優(yōu)選大于10、甚至更優(yōu)選大于15。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶可具有至少為4的磷脂∶甘油三酯的水解活性比。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比可大于8，優(yōu)選大于9、更優(yōu)選大于10、甚至更優(yōu)選大于15。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶可具有至少為1.5、優(yōu)選至少為1.8、優(yōu)選至少為2、優(yōu)選至少為3、優(yōu)選至少為4的糖脂∶甘油三酯的水解活性比。適當?shù)?，糖脂∶甘油三酯的水解活性比可大?。合適的是，糖脂∶甘油三酯的水解活性比可大于5。在另外的方面中，本發(fā)明提供具有至少為4的極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比的真菌脂肪分解酶。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯水解活性比可大于8，優(yōu)選大于9、更優(yōu)選大于10、甚至更優(yōu)選大于15。在另一個方面本發(fā)明提供具有至少為4的磷脂∶甘油三酯的水解活性比的真菌脂肪分解酶。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯的水解活性比可大于5。合適的是，極性脂質(zhì)∶甘油三酯水解活性比可大于8，優(yōu)選大于9、更優(yōu)選大于10、更優(yōu)選大于15。在另外的方面中，本發(fā)明還提供具有至少為1.5、優(yōu)選至少為1.8、優(yōu)選至少為2、優(yōu)選至少為3、優(yōu)選至少為4、優(yōu)選至少為5、優(yōu)選至少為10、優(yōu)選至少為15的糖脂∶甘油三酯的水解活性比的真菌脂肪分解酶。與甘油三酯脂酶(E.C.3.1.1.3)的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶具有對極性脂質(zhì)優(yōu)選至少1.5倍的活性(如磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)的活性和/或磷脂酶A1(E.C.3.1.1.32)的活性和/或糖脂酶(E.C.3.1.1.26)的活性)、更優(yōu)選至少2倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍。與甘油三酯脂酶(E.C.3.1.1.3)的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶優(yōu)選具有至少1.5倍、更優(yōu)選至少2倍、更優(yōu)選至少3倍、更優(yōu)選至少4倍的糖脂酶(E.C.3.1.1.26)的活性。對于通過利用實施例3中詳述的微烘烤分析而提供最適面包體積的劑量而言，將DGDG水解成甘油三酯(TG)的比例優(yōu)選是至少1.7％、優(yōu)選是至少1.8％、優(yōu)選是至少2％、優(yōu)選是至少3％、優(yōu)選是至少4％、優(yōu)選是至少5％、優(yōu)選是至少10％、優(yōu)選是至少20％、優(yōu)選是至少40％、優(yōu)選是至少50％。本文中提到的術(shù)語“糖脂酶活性”包括“半乳糖脂酶活性”。使用本文下列的分析法，可確定糖脂酶活性、磷脂酶活性和甘油三酯脂酶的活性。半乳糖脂酶活性的測定(糖脂酶活性分析)底物將0.6％雙半乳糖甘油二酯(SigmaD4651)、0.4％Triton-X100(SigmaX-100)以及5mMCaCl2溶于0.05M、pH7的HEPES緩沖液中。分析過程將400μl底物加入1.5mLEppendorf管并放入Eppendorf熱混合器(Thermomixer)，37℃5分鐘。當時間t＝0分鐘時，加入50μl酶液。也可分析用水代替酶的空白。將樣品在Eppendorf熱混合器中以10*100rpm在37℃下混勻10分鐘。當時間t＝10分鐘時，將Eppendorf管放入另一個熱混合器中并在99℃放置10分鐘，來終止反應。通過使用購自WAKOGmbH的NEFAC試劑盒分析樣品中的游離脂肪酸。通過分析條件下每分鐘產(chǎn)生的微摩爾脂肪酸，來計算在pH7時的酶活GLU。磷脂酶活性的測定(磷脂酶活性分析)使用能產(chǎn)生可比較的結(jié)果的兩種不同方法測量磷脂酶活性。根據(jù)本發(fā)明，這些方法中任何一種可用于測定磷脂酶活性。優(yōu)選地，將PLU分析法用于測定任何酶的磷脂酶活性。用于測定磷脂酶活性的“PLU分析法”底物將0.6％的L-α卵磷脂、95％Plant(Avanti#441601)、0.4％Triton-X100(SigmaX-100)以及5mMCaCl2溶于0.05M、pH7的HEPES緩沖液中。分析過程將400μl底物加入1.5mLEppendorf管并放入Eppendorf熱混合器，37℃5分鐘。當時間t＝0分鐘時，加入50μl酶液。也可分析用水代替酶的空白。將樣品在Eppendorf熱混合器中以10*100rpm在37℃下混勻10分鐘。當時間t＝10分鐘時，將熱混合器管放入另一個熱混合器中并在99℃放置10分鐘，來終止反應。通過使用購自WAKOGmbH的NEFAC試劑盒分析樣品中的游離脂肪酸。通過分析條件下每分鐘產(chǎn)生的微摩爾脂肪酸，來計算在pH7時的酶活PLU-7。用于測定磷脂酶活性的“TIPU分析法”1TIPU(磷脂酶滴定單位)定義為在分析條件下每分鐘釋放1μmol游離脂肪酸的酶量。通過分別從位點和2釋放游離脂肪酸，磷脂酶A1和A2將卵磷脂轉(zhuǎn)換成溶血卵磷脂。通過連續(xù)滴定在酶反應期間從卵磷脂釋放的脂肪酸可測定磷脂酶活性，因為堿的消耗量等于釋放的脂肪酸量。底物4％卵磷脂、4％TritonX100以及6mMCaCl2通過磁力攪拌，將12g卵磷脂粉末(Avanti極性脂質(zhì)#44160)和12gTritonX100(Merck108643)分散到約200ml脫礦物質(zhì)水中。加入3.0ml0.6MCaCl2(p.a.Merck1.02382)。用脫礦質(zhì)水調(diào)節(jié)體積至300ml，并用UltraThurax均質(zhì)化乳狀液。每天制備新鮮底物。分析過程通過加入300μl酶來制備可產(chǎn)生滴定曲線的斜率在0.06和0.18ml/min之間的酶液。已知活性的對照樣品已包括在內(nèi)。將樣品溶于脫礦質(zhì)水，并以300rpm攪拌15分鐘。在用0.05MNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0之前，將25.00ml底物在37℃溫育10-15分鐘。將300μl酶液加入底物中，并使用pH-Stat滴定儀(Phm290，MettlerToledo)通過0.05MNaOH進行連續(xù)滴定。以各自比例進行兩種活性測定。8分鐘后終止滴定，并計算5和7分鐘之間的滴定曲線的斜率。檢測極限是3TIPU/ml的酶液。計算根據(jù)下列方式計算磷脂酶活性(TIPU/g酶)TIPU/g=α·N·106μmolmol·10-3lml·V1m·V2=α·N·103·V1m·V2]]>其中α是在反應時間5至7分鐘之間的滴定曲線的斜率(ml/min)；N是所用的NaOH的當量濃度(mol/l)V1是所溶解的酶體積(ml)；m是加入V1的酶量(g)；V2是加入底物的酶液體積(ml)。三?；视王ブ傅幕钚詼y定基于甘油三酯(三丁酸甘油酯)作為底物的分析(LIPU)根據(jù)食品化學藥典(第四版，NationalAcademyPress，1996，p803)測量基于三丁酸甘油酯的脂酶活性，其中修改了將樣品溶于去離子水而不是甘氨酸緩沖液，并將起始pH(pHstat)設定為5.5而不是7。1LIPU定義為在分析條件下每分鐘釋放1mol丁酸的酶量?；趯Π肴樘侵?GLU)、磷脂(PLU)和甘油三酯(LIPU)的活性分析，可以計算PLU/LIPU和GLU/LIPU的比值。對LipopanFTM和根據(jù)本發(fā)明衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶進行分析，得到下列結(jié)果。LipopanFTM和樣品209的相對活性比是LipopanF樣品209磷脂/甘油三酯PLU/LIPU39半乳糖脂/甘油三酯GLU/LIPU14適當?shù)?，本文使用的術(shù)語“協(xié)同作用”或“協(xié)同效應”指與單獨使用各個組分(即酶)相比，聯(lián)合使用可產(chǎn)生更好的效果?？赏ㄟ^分別和聯(lián)合加入各種組分(即，酶)來制備食品如生面團和/或烘烤食品并比較其效果，從而確定協(xié)同作用。如本文所用的術(shù)語“真菌脂肪分解酶”指酶的天然來源是真菌。然而，為了免除疑惑，該術(shù)語可包括分離自真菌的、在真菌宿主(天然或非天然真菌)中表達的或在非真菌宿主中(例如在細菌或酵母)表達的真菌酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶是野生型酶。如本文所用的術(shù)語“天然的”和“野生型”指天然存在的酶。也就是當和內(nèi)源性產(chǎn)生的成熟蛋白質(zhì)序列(在共轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后剪切事件后)相比，通過內(nèi)源性遺傳密碼表達的并從其內(nèi)源性宿主有機體分離的酶，和/或異源性產(chǎn)生的、未突變(即，不含有氨基酸缺失、添加或取代)的酶。本發(fā)明的天然的和野生型蛋白質(zhì)可由對異源表達密碼子優(yōu)化的多核苷酸編碼，并且蛋白質(zhì)也可包含被選擇用于在宿主中表達的非內(nèi)源性信號肽。如本文所用的術(shù)語“非內(nèi)源性信號肽”指在共轉(zhuǎn)錄剪切之前不天然存在于脂肪分解酶的新生多肽鏈中的信號肽。在根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶中，非內(nèi)源性信號肽的部分或整體例如前肽，可仍然附著于成熟多肽-這落入如本文所用的術(shù)語“野生型”的范圍。如上所述，如本文所用的術(shù)語“天然的”和“野生型”指天然存在的酶。然而，這不排除利用人工的或化學合成的多肽，所述多肽包含與天然存在的成熟脂肪分解酶相同的多肽序列。如本文所用的術(shù)語“變體”指當與成熟蛋白質(zhì)序列中的天然或野生型序列相比，通過非內(nèi)源性遺傳密碼表達的、并導致一種或多種氨基酸改變(即，氨基酸缺失、添加或取代)的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶優(yōu)選是在低溫下保持活性的脂肪分解酶，即是低溫型脂肪分解酶。術(shù)語“低溫型脂肪分解酶”指在5-15℃具有顯著活性的酶，優(yōu)選是在10℃具有顯著活性的酶。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的低溫型脂肪分解酶并不是如WO2004/064987中公開的包含氨基酸序列基序GDSX的脂肪分解酶，其中X是下列的一種或多種氨基酸殘基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S。根據(jù)本發(fā)明的低溫型脂肪分解酶可以是如通過NEFAC法對游離脂肪酸的測定中所測定的，在10℃、和在脂肪分解酶最適pH的20％中的pH時，對卵磷脂底物具有至少5％、優(yōu)選至少7％、更優(yōu)選至少10％的相對活性的酶(參見實施例5，在pH7下實施)。實施例6提供用于確定脂肪分解酶最適pH的方法。根據(jù)本發(fā)明的低溫型脂肪分解酶可以是如通過NEFAC法對游離脂肪酸的測定中所測定的，在20℃、和在脂肪分解酶最適pH的20％中的pH時，對卵磷脂底物具有至少10％、優(yōu)選至少15％、更優(yōu)選至少20％、更優(yōu)選至少25％以及最優(yōu)選至少30％的相對活性的酶(參見實施例5，在pH7下實施)。實施例6提供用于確定脂肪分解酶最適pH的方法。在5℃下，根據(jù)本發(fā)明的低溫型脂肪分解酶也可顯示對蛋黃卵磷脂的顯著活性，其特征在于在酶劑量等于20U/g蛋黃、480分鐘反應時間后，使用實施例9中描述的和圖24和25中舉例說明的測定法，低溫型脂肪分解酶能釋放至少1％、優(yōu)選至少1.5％、更優(yōu)選至少2％的游離脂肪酸。優(yōu)選地，從絲狀真菌可獲得根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶(優(yōu)選獲得)。更優(yōu)選地，從鐮孢屬(Fusariumspp)可獲得真菌脂肪分解酶(優(yōu)選獲得)。優(yōu)選地，從異孢鐮孢或半裸鐮孢(Fusariumsemitectum)可獲得根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶。適當?shù)?，從異孢鐮?CBS782.83)或半裸鐮孢(IBT9507)可獲得根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶(優(yōu)選獲得)。因此在一個方面中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶優(yōu)選是絲狀真菌脂肪分解酶，優(yōu)選絲狀真菌野生型脂肪分解酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶包含與如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2、SEQIDNo.4或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列具有至少90％、優(yōu)選至少95％、優(yōu)選至少98％、優(yōu)選至少99％的同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，編碼根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶的核酸包含與SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7中所示的核苷酸序列具有至少90％、優(yōu)選至少95％、優(yōu)選至少98％、優(yōu)選至少99％的同一性的核苷酸序列。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶并不是包含了來自Thermomyces蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列與來自鐮孢屬蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列融合的融合蛋白。具體地說，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明真菌脂肪分解酶不是包含來自Thermomyceslanuginosa蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列與來自Fusaiumoxysporum蛋白質(zhì)或其部分的氨基酸序列融合的融合蛋白。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶不從Thermomyceslanuginosa中獲得，和/或不是從Thermomyceslanuginosa中獲得的該酶的變體。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶從異孢鐮孢CBS782.83或半裸鐮孢(IBT9507)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。適當?shù)?，通過液相層析純化酶。通過Edman裂解法和MALDI-TOF分析法，可確定純化的真菌脂肪分解酶的氨基酸序列。在小規(guī)模烘烤試驗和半工業(yè)規(guī)模(pilotscale)烘烤試驗中，已經(jīng)測試了來自異孢鐮孢CBS782.83的部分純化的脂肪分解酶，具有很好的效果。發(fā)現(xiàn)來自異孢鐮孢CBS782.83的真菌脂肪分解酶的烘烤效果優(yōu)于LipopanFTM，這種效果與對甘油三酯的活性相比，對極性脂質(zhì)(具體是糖脂，例如雙半乳糖甘油二酯(DGDG))的增高的活性比有關(guān)。另外，已經(jīng)測試來自半裸鐮孢IBT9507的脂肪分解酶對生面團漿液中的面粉脂質(zhì)的活性，具有很好的效果。與LipopanFTM相比，來自F.semitectumIBT9507的脂肪分解酶顯示對生面團中的半乳糖脂具有顯著的活性，并對甘油三酯具有相對較小的活性。適當?shù)?，如本文所用的術(shù)語“食品”指適于人和/或動物食用的物質(zhì)。適當?shù)?，如本文所用的術(shù)語“食品”指以可馬上被食用的形式存在的食品。然而，作為選擇或另外地，如本文所用的術(shù)語食品指用于制備食品的一種或多種食物材料。僅僅舉例來說，術(shù)語食品包括由生面團產(chǎn)生的烘烤品以及用于制備所述烘烤品的生面團。在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供如以上定義的食品，其中食品選自下列一種或多種蛋、蛋制品，包括但不限于蛋黃醬、色拉調(diào)味料、調(diào)味汁、冰淇淋、蛋粉、改良的蛋黃及其制作的產(chǎn)品；烘烤品，包括面包、蛋糕、甜面團制品、分層生面團、液態(tài)奶蛋糊、松餅、油炸圈餅、餅干、脆餅以及小甜餅；糖果，包括巧克力、蜜餞、焦糖、芝麻酥糖(halaWa)；香糖，包括無糖香糖和加糖香糖、泡泡糖、軟泡泡糖、香糖以及布?。槐鶅霎a(chǎn)品，包括果汁冰糕，優(yōu)選冰凍乳制品，包括冰淇淋和牛奶凍；乳制品，包括乳酪、黃油、乳、低脂奶油(coffeecream)、生奶油、乳蛋糕乳脂、牛奶飲料以及酸乳酪；奶油凍、攪打過的植物奶油；食用油和脂肪、充氣和非充氣攪打食品、水包油乳化劑、油包水乳化劑、人造黃油、起酥油以及涂抹食品(spread)包括低脂以及極低脂涂抹食品；調(diào)味品、蛋黃醬、蘸醬(dip)、以奶油為基礎的調(diào)味汁、以奶油為基礎的湯、飲料、香料乳劑以及調(diào)味汁。在一個方面中，根據(jù)本發(fā)明的食品是生面團產(chǎn)品或烘烤制品，例如面包、油炸制品、點心、蛋糕、餡餅、核仁巧克力餅、小甜餅、面條、方便面、玉米粉圓餅，和例如薄脆餅干、全麥餅干、椒鹽卷餅、以及馬鈴薯片的點心，以及意大利面食。在另一個方面中，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是動物飼料。在一個方面中，優(yōu)選食品選自下列一種或多種蛋、蛋制品，包括蛋黃醬、色拉調(diào)味料、調(diào)味汁、冰淇淋、蛋粉、改良的蛋黃及以其制作的食品。在本文提到的一些應用中、特別是食物應用例如面包房應用中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可與一種或多種常規(guī)乳化劑進行使用，包括例如單酸甘油酯、脂肪酸甘油單酯和脂肪酸甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、硬脂酰乳酸鈉(SSL)以及卵磷脂。在具有添加的脂肪的面包配方中，特別優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶；這被認為是由于根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶對甘油三酯的低活性，這引起減少游離脂肪酸的累積并對于短鏈甘油三酯而言，減少或避免了異味。在本文范圍中，術(shù)語“添加的脂肪”用于表明沒有脂質(zhì)或油加入面團中。此外或者作為選擇，根據(jù)本發(fā)明的酶可與一種或多種其它適宜的食品級酶進行使用。因此，除了本發(fā)明的脂肪分解酶之外，至少一種另外的酶可被加入烘烤食品和/或生面團中也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述另外的酶包括淀粉降解酶例如內(nèi)淀粉酶或外淀粉酶、支鏈淀粉酶、脫支酶，半纖維素酶包括木聚糖酶、纖維素酶，氧化還原酶例如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巰基氧化酶，碳水化合物氧化酶例如氧化麥芽糖的酶(例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶、磷脂酶、己糖氧化酶、蛋白酶、以及?；D(zhuǎn)移酶(例如在WO04/064987中描述的那些酶)。在生產(chǎn)食品中，特別優(yōu)選本發(fā)明的脂肪分解酶與α淀粉酶聯(lián)合使用。具體地是，淀粉酶可以是非生麥芽糖淀粉酶，例如具有非生麥芽外淀粉酶活性，具體是葡聚糖1，4-α-maltotetrahydrolase(EC3.2.1.60)活性(如WO05/003339中所公開的)。市場上可買到合適的非生麥芽糖淀粉酶，如PowersoftTM(購自DaniscoA/S，丹麥)。也可利用生麥芽糖淀粉酶，例如NovamylTM(NovozymesA/S，丹麥)。在一個實施方案中，可在生面團和/或所制作的烘烤食品例如面包、蛋糕、油炸圈餅、油炸餅(cakedoughnuts)或百吉餅的生產(chǎn)中，聯(lián)合使用α淀粉酶和本發(fā)明的脂肪分解酶。α淀粉酶聯(lián)合本發(fā)明的脂肪分解酶，也被認為是優(yōu)選用于玉米粉圓餅(例如小麥和/或玉蜀黍玉米粉圓餅)的生產(chǎn)方法中。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可聯(lián)合木聚糖酶進行使用以生產(chǎn)食品產(chǎn)品。GRINDAMYTM和POWERBake7000是購自DaniscoA/S的、商業(yè)上可獲得木聚糖酶的實例。在WO03/020923和WO01/42433中描述了木聚糖酶的其它實例。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可聯(lián)合木聚糖酶和α淀粉酶進行使用。適當?shù)?，α淀粉酶可以是生麥芽或非生麥芽α淀粉?例如GRINDAMYLTM或POWERSoft，購自DaniscoA/S)，或其組合。本發(fā)明的脂肪分解酶還可優(yōu)選聯(lián)合氧化酶進行使用，例如麥芽糖氧化酶(MOX)、例如己糖氧化酶(HOX)。在WO03/099016中描述了適宜的方法。商業(yè)上可獲得的麥芽糖氧化酶GRINDAMYLTM和SUREBake購自DaniscoA/S。任選地，α-淀粉酶例如非生麥芽外淀粉酶和/或生麥芽糖淀粉酶、和/或麥芽糖氧化酶(MOX)可聯(lián)合根據(jù)本發(fā)明的酶用于制備生面團、烘烤食品、玉米粉圓餅、蛋糕、方便面/油炸點心、或乳制品例如乳酪的方法中。通過本領(lǐng)域的已知方法，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶通?？砂谑称坊蚱渌M合物中。所述的方法包括將脂肪分解酶直接加入食品或組合物中，添加聯(lián)合了穩(wěn)定劑和/或載體的脂肪分解酶，和添加包含脂肪分解酶和穩(wěn)定劑和/或載體的混合物。用于本發(fā)明的合適的穩(wěn)定劑包括但不限于無機鹽(例如NaCl、硫酸銨)、山梨糖醇、乳化劑和去污劑(例如Tween20、Tween80、無甘油三酯的PanodanAB100、聚甘油酯、脫水山梨糖醇單油酸酯(sorbitanmonoleate))、油(例如菜籽油、葵花籽油和大豆油)、果膠、海藻糖以及甘油。用于本發(fā)明的合適的載體包括但不限于淀粉、磨碎的小麥、小麥粉、NaCl以及檸檬酸鹽。通過來自PertenInstruments(瑞典)的Glutomatic2200，測量面筋指數(shù)。測量面筋指數(shù)發(fā)面后；立即稱取15g生面團并放入Glutomatic，用500ml2％NaCl溶液洗滌10分鐘。然后將洗過的生面團轉(zhuǎn)入面筋指數(shù)離心機2015，并測量兩種面筋餾份，以及根據(jù)下列方程式計算面筋指數(shù)。面筋指數(shù)＝(留在100目篩的面筋重量)/面筋總重。相對于未添加多肽的生面團，優(yōu)選在生面團中面筋指數(shù)增加至少5％，并且通過上述的Glutomatic2200儀可確定面筋指數(shù)。另外的優(yōu)選方面存在于所附的權(quán)利要求和下列說明書及實施例中。優(yōu)點令人驚訝的和意想不到的是，與以前確定的真菌脂肪分解酶(特別是LipopanFTM)相比，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶對極性脂質(zhì)(磷脂和/或糖脂)∶甘油三酯具有更高的活性比。這特別令人驚訝，因為在本發(fā)明之前沒有已知的真菌野生型脂肪分解酶顯示這種活性。盡管已經(jīng)開展研究來調(diào)查脂肪分解酶變體(即，已暴露在非天然致突變作用和/或以其它方式進行改變的酶變體)，但沒有預想到來自真菌的天然的、野生型酶具有這樣高度有利的特征。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當用于烘烤應用中，所鑒定的酶具有優(yōu)越的功能。與其它來自真菌的脂肪分解酶、特別是LipopanFTM相比，利用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶可有利地引起顯著提高生面團和/或烘烤產(chǎn)品的特性。有利的是，在低溫下保持活性的脂肪分解酶(即，低溫脂肪分解酶)可適于低溫應用中，因此無需加熱底物。這在例如蛋黃的酶促處理、食用油的酶脫膠以及牛奶或乳制品的處理(例如在乳酪制造之前乳酪用乳的處理)中的應用中具有特別的優(yōu)勢。使用低溫脂肪分解酶的更多優(yōu)點在于食品和/或動物飼料中，其中在低操作溫度下保持顯著的活性使得在降低微生物、特別是細菌污染的風險下進行酶促處理。此外，當在低溫下酶的穩(wěn)定性更大時，這使得在工業(yè)應用中減少酶的有效劑量并延長酶的有效使用期。技術(shù)效果對于烘烤食品例如面包、饅頭和美國白面包(whitepanbread)，添加本發(fā)明的脂肪分解酶可帶來下列一種或多種改善面包體積和松軟度、延長保存期和/或保鮮效果、改善團粒結(jié)構(gòu)、降低氣孔不均勻性、降低平均孔徑、提高面筋指數(shù)、改善香味和/或氣味，以及改善外殼色澤。有利的是，根據(jù)本發(fā)明的酶可用于代替食品(例如生面團和/或烘烤食品)中的乳化劑。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可與乳化劑(例如DATEM、SSL、CSL、甘油一酯、聚山梨酸酯以及Tween)具有協(xié)同作用。因此，根據(jù)本發(fā)明脂肪分解酶可聯(lián)合一種或多種乳化劑進行使用。有利的是，與當不使用根據(jù)本發(fā)明的酶所需要的乳化劑量相比，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶與一種或多種乳化劑的聯(lián)合使用，可降低使用的乳化劑總量。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶也可與水狀膠質(zhì)、瓜耳膠、xanthum和果膠以及與麥芽糖氧化酶例如己糖氧化酶具有協(xié)同作用。例如對于油炸圈餅、油炸餅、百吉餅、快餐餅以及松餅，使用本發(fā)明的脂肪分解酶，當與一種或多種α-淀粉酶、生麥芽α-淀粉酶以及非生麥芽α-淀粉酶聯(lián)合使用時，可帶來協(xié)同作用。例如對于蛋糕、松糕以及棕櫚蛋糕(palmcake)，使用本發(fā)明的脂肪分解酶當與一種或多種水狀膠質(zhì)(例如瓜耳膠)和/或一種或多種乳化劑(例如DATEM)聯(lián)合使用時可帶來協(xié)同作用。例如對于餅干，使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可帶來改善的可滾動性和操作特性，特別是冷環(huán)境下(冷可滾動性)。有利的是，例如在蛋黃醬及其他蛋制品中，使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可導致改善質(zhì)地、降低平均顆粒大小、和/或降低平均顆粒分布、提高熱穩(wěn)定性、提高微波性能和/或穩(wěn)定性。在蛋糕中，使用本發(fā)明的酶可有利地導致改善松軟度、體積，提高保存性能和保存期限。例如對于面條或面條制品(如方便面)，本發(fā)明的脂肪分解酶可帶來一種或多種下列的特征改善色澤/黃色、更加穩(wěn)定的色澤特征、降低亮度、減少脂肪含量、改善質(zhì)地和感(咀嚼性)、降低水活性、減少折斷、提高核心硬度以及在加工期間提高形狀保持性。優(yōu)選地，本發(fā)明的脂肪分解酶可用于降低面條或面條制品(例如方便面)的脂肪含量。例如在玉米粉圓餅中，使用根據(jù)本發(fā)明的酶可導致下列一種或多種例如通過提高可塑性來降低玉米粉圓餅的可軋制性、提高保鮮度、提高松軟度和/或降低異味。有利的是，提高可滾動性和/或可塑性在滾動時可導致降低玉米粉圓餅破裂的可能性。例如在乳酪和/或乳酪制品中，使用根據(jù)本發(fā)明的酶可導致下列一種或多種改善香味、質(zhì)地和/或穩(wěn)定性，減少乳酪中的脫油效應和/或增加乳酪產(chǎn)量。如本文所用的術(shù)語“脫油效應”指當乳酪熔化時釋放游離油。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可用于生產(chǎn)低脂肪乳酪。有利的是，本發(fā)明的酶可使奶中的脂肪穩(wěn)定和/或增強香味。本發(fā)明的一個優(yōu)點是酶可在低溫下起作用(并且實際上具有高活性)。這具有許多優(yōu)點，其中這取決于加入酶的用途。例如，在乳酪制作中，該功能可降低酶促處理期間的微生物污染和微生物生長的風險。該原因在于在酶促處理期間，乳酪可保持冷的狀態(tài)。因此，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可特別適于在低溫下使乳酪成熟以改善香味。例如在動物飼料中，根據(jù)本發(fā)明的酶可有利地導致下列一種或多種提高動物中的飼料利用和/或飼料轉(zhuǎn)化率、促進動物的體重增加、提高飼料的消化率、提高動物例如從飼料中的氮吸收、提高飼料的干物質(zhì)代謝能力以及提高飼料的可性。在食用油(例如植物油)的脫膠過程中，本發(fā)明的脂肪分解酶在低溫下具有高活性。這可有利地在酶處理之前或之中降低加熱油的需要。在處理期間這具有減少所需能量總量的有利效果。與甘油三酯相比，根據(jù)本發(fā)明的酶可提高對降低磷脂的選擇性。在食用油(例如植物油)中，與對磷脂的活性相比，根據(jù)本發(fā)明的酶具有降低的對甘油三酯的水解活性。這導致更少的甘油三酯被水解(與常規(guī)的/磷脂酶相比)，并且導致在油產(chǎn)量中較少的損失和/或減少游離脂肪酸在油中的累積(與常規(guī)的脂肪分解/磷脂酶相比)。用途根據(jù)本發(fā)明的酶具有許多用途。具體地說，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶可用于食品的制作中。例如，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶可特別用于蛋或蛋制品的加工中。磷脂酶，特別是磷脂酶A2(E.C.3.1.1.4)，已經(jīng)多年被用于加工蛋或蛋制品(例如，參見美國4,034,124和Dutihl&Groger1981J.Sci.FoodAgric.32，451-45)。在加工蛋或蛋制品期間，磷脂酶活性可導致起乳化劑作用的極性溶血卵磷脂的累積。使用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶來處理蛋或蛋制品，可提高穩(wěn)定性，熱處理過程(例如巴氏滅菌法)中的熱穩(wěn)定性，并導致相當?shù)某砻?。蛋制品包括但不限于蛋糕、蛋黃醬、色拉調(diào)味料、調(diào)味汁、冰淇淋等等。根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶特別適于制作烘烤食品例如從生面團制作的烘烤食品，包括面包、蛋糕、甜面團食品、分層生面團、液態(tài)奶蛋糊、松餅、油炸圈餅、餅干、脆餅以及小甜餅。，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶也可用于改良面包的添加劑，如生面團組合物、生面團添加劑，面團性質(zhì)改進劑，預混合物和在制作面包或其它烘烤食品的過程中通常加入面粉和/或生面團中來提供面包或其它烘烤食品的改良品質(zhì)的相似制劑。因此，本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在內(nèi)的面包改良組合物和/或生面團改良組合物；也涉及包含所述的面包改良組合物和/或生面團改良組合物在內(nèi)的生面團或烘烤食品。除根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶之外，面包改良組合物和/或生面團改良組合物可包括其它物質(zhì)，該物質(zhì)通常被用于烘烤來提高生面團和/或烘烤產(chǎn)品的品質(zhì)。面包改良組合物和/或生面團改良組合物可包括一種或多種常規(guī)烘烤劑，例如下列的一種或多種組分奶粉、面筋、乳化劑、?；尽⒀趸瘎?、氨基酸、糖、鹽、面粉或淀粉。合適乳化劑的實例是甘油一酯、脂肪酸甘油一酯及脂肪酸甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、糖酯、硬脂酰乳酸鈉(SSL)以及卵磷脂。面包和/或生面團改良組合物還可包括另一種酶，例如一種或多種其它合適的食品級酶，包括淀粉降解酶例如內(nèi)淀粉酶或外淀粉酶、支鏈淀粉酶、脫支酶，半纖維素酶包括木聚糖酶、纖維素酶，氧化還原酶例如葡萄糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、巰基氧化酶，或碳水化合物氧化酶例如氧化麥芽糖的酶(例如己糖氧化酶(HOX))，脂肪酶、磷脂酶、己糖氧化酶、蛋白酶、以及?；D(zhuǎn)移酶(例如在WO04/064987中描述的那些酶)。如本文所用的術(shù)語“改良的品質(zhì)”指可通過本發(fā)明的真菌脂肪分解酶的作用而改良的任何品質(zhì)。具體地說，使用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶導致一種或多種下列特征提高烘烤產(chǎn)品的體積、改善烘烤產(chǎn)品的團粒結(jié)構(gòu)、在烘烤食品中抗變質(zhì)的品質(zhì)、提高生面團的強度、提高穩(wěn)定性、減少生面團的粘性和/或提高生面團的可機械加工性。通過與不添加根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶所制作的生面團和/或烘烤產(chǎn)品進行比較，評價改良的品質(zhì)。如本文所用的術(shù)語“烘烤產(chǎn)品”包括從生面團制作的產(chǎn)品。有利地通過本發(fā)明制作的烘烤食品(無論白色、淺色或深色的類型)的實例包括下列一種或多種典型的是以塊狀或卷狀或烤片形狀的面包(包括白面包、全麥面包以及黑面包)、法式長棍面包、pitta面包、玉米粉圓餅、炸玉米粉卷、蛋糕、薄烤餅、餅干、脆面包、意大利面食、面條等等。按照本發(fā)明的生面團可以是發(fā)酵的生面團或?qū)⒁M行發(fā)酵的生面團?？梢远喾N方式發(fā)酵生面團，例如加入小蘇打等等、或加入合適的酵母培養(yǎng)物例如釀酒酵母(面包酵母)培養(yǎng)物。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶在生產(chǎn)意大利面食生面團，優(yōu)選從硬粒小麥面粉或類似品質(zhì)的面粉制作所述的面團。根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶可用于植物油或食用油的酶脫膠用途。在植物油或食用油的加工中，用根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶處理食用油或植物油，以使得水解大部分極性脂質(zhì)(如磷脂和/或糖脂)。優(yōu)選地，從極性脂質(zhì)水解脂?；?。脫膠過程通常引起食用油中的極性脂質(zhì)(特別是磷脂)含量的減少，這歸應于大部分(即，超過50％)極性脂質(zhì)(如糖脂和/或磷脂)的水解。典型地，從油分離含有水解的極性脂質(zhì)(如磷脂和/或糖脂)的水相。適當?shù)兀畛跏秤糜突蛑参镉?用根據(jù)本發(fā)明的酶進行預處理)可具有50-250ppm的含磷量。此外，本發(fā)明指導了使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶用于處理乳酪產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶也特別適于制備動物飼料的用途。如技術(shù)人員所知，如本文所用的術(shù)語“脫膠”指通過將磷脂(例如卵磷脂、磷酸脂質(zhì)和滯留油)轉(zhuǎn)化成水合性磷脂來煉制油。已被脫膠的油是更流動的，因此比未被脫膠的油具有更好的處理性質(zhì)。下表僅僅用于常規(guī)的指導，并提供適于在不同應用中所需的、根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的劑量水平的概述。例如，當與乳化劑聯(lián)合使用時，該表還提供涉及適于根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的劑量水平的指導。當然，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言顯而易見的是使用適于任何某個應用的常規(guī)試驗法，易于確定最適酶量、反應溫度和反應時間。分離的在一個方面中，序列優(yōu)選是分離的形態(tài)。術(shù)語“分離的”指序列至少實質(zhì)上不含至少一種與該序列在天然狀態(tài)下相關(guān)的和如在天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的其它組分。純化的在一個方面中，序列優(yōu)選是純化的形態(tài)。術(shù)語“純化的”指序列處于相對純凈的狀態(tài)--如至少約90％的純度、或至少約95％的純度或至少約98％的純度。核苷酸序列本發(fā)明范圍包括編碼具有如本文定義的特殊性質(zhì)的酶的核苷酸序列。如本文所用的術(shù)語“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其變體、同系物、片段和衍生物(例如其部分)。核苷酸序列可以是基因組的或人工的或重組體來源，該序列可以是雙鏈或單鏈，不管其代表有義或反義鏈。本發(fā)明涉及的術(shù)語“核苷酸序列”包括基因組DNA、cDNA、合成DNA以及RNA。優(yōu)選它是編碼本發(fā)明的DNA、更優(yōu)選是cDNA。在優(yōu)選的實施方案中，當涉及和包括在本發(fā)明的本身范圍內(nèi)時，核苷酸序列不包括當在其天然環(huán)境中并連接它的天然關(guān)聯(lián)序列(這些相關(guān)序列也在它或它們的天然環(huán)境中)時的根據(jù)本發(fā)明的天然的核苷酸序列。為了便于參照，將這個優(yōu)選實施方案稱為“非天然核苷酸序列”。對于這一點，術(shù)語“天然核苷酸序列”指處于其天然環(huán)境中的、并當可操作連接到與它天然關(guān)聯(lián)的完整啟動子時的完整核苷酸序列，其中啟動子也在它的天然的環(huán)境中。然而，本發(fā)明范圍所包括的氨基酸序列可以在核苷酸序列在其天然有機體中表達之后分離和/或純化。優(yōu)選地，然而，本發(fā)明范圍所包括的氨基酸序列可通過在其天然有機體中的核苷酸序列表達，但是其中核苷酸序列不受在該有機體中與它天然關(guān)聯(lián)的啟動子的控制。核苷酸序列的制備一般，使用重組DNA技術(shù)(即，重組DNA)制備本發(fā)明范圍所包括的核苷酸序列。然而，在本發(fā)明另一種實施方案中，利用本領(lǐng)域中眾所周知的化學法，可全部或部分合成核苷酸序列(參見CaruthersMH等，(1980)NucAcidsResSympSer215-23和HornT等，(1980)NucAcidsResSympSer225-232)。從產(chǎn)生所述酶的任何細胞或有機體中，可鑒定和/或分離和/或純化編碼具有如文中所定義的特定特性的酶的核苷酸序列。在本領(lǐng)域中，用于鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列的各種方法是眾所周知的。例如，一旦已經(jīng)鑒定和/或分離和/或純化了合適的序列，可利用PCR擴增技術(shù)來制備更多的序列。通過另外的實例，利用來自產(chǎn)生酶的有機體的染色體DNA或信使RNA，可構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果酶的氨基酸序列或酶的部分氨基酸序列是已知的，可合成標記寡核苷酸探針并用于在從有機體制備的基因組文庫中鑒定酶編碼克隆?；蛘撸瑢c另一種已知的酶基因同源的序列的標記寡核苷酸探針用于鑒定酶編碼克隆。在后一種情況中，可使用低嚴謹?shù)碾s交和洗滌條件。或者，通過將基因組DNA片段插入表達載體例如質(zhì)粒中、用所得的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶陰性細菌、隨后將轉(zhuǎn)化的細菌鋪在含有酶底物(如適于葡糖苷酶(麥芽糖酶)的麥芽糖)的瓊脂平板上、由此鑒定表達酶的克隆，來鑒定酶編碼克隆。還在另外的選擇中，通過已建立的標準方法，如根據(jù)BeucageS.L等((1981)TetrahedronLetters22，p1859-1869)或Matthes等((1984)EMBOJ.3，p801-805)所述的phosphoroamidite法可人工制備編碼酶的核苷酸序列。例如，在phosphoroamidite法中，在例如自動DNA合成儀中合成寡核苷酸、純化、退火，并連接和克隆在合適的載體中。核苷酸序列可以為混合的基因組和合成來源，混合的合成和cDNA來源、混合的基因組和cDNA來源、根據(jù)標準技術(shù)通過連接合成來源、基因組來源或cDNA來源(視情況而定)的片段而制備。每個連接片段對應于全部核苷酸序列的各個部分。也可通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用特異性引物，來制備DNA序列，例如在美國專利4,683,202中或在SaikiRK等人(Science(1988)239，pp487-491)所述。由于遺傳密碼的簡并性，易于生產(chǎn)核苷酸序列，其中對于原始核苷酸序列編碼的一些或所有氨基酸的三聯(lián)體密碼子使用，已經(jīng)發(fā)生改變，從而產(chǎn)生與原始核苷酸序列具有低同源的、但編碼與原始核苷酸序列編碼的相同氨基酸序列或其變體。例如，對于多數(shù)氨基酸而言，遺傳密碼簡并性位于三聯(lián)體密碼子的第三位(擺動位點)(參見Stryer，Lubert，Biochemistry，ThirdEdition，F(xiàn)reemanPress，ISBN0-7167-1920-7)因此，所有三聯(lián)體密碼子已經(jīng)在第三位發(fā)生“擺動”的核苷酸序列約66％相同于原始核苷酸序列。然而，修飾的核苷酸序列可編碼與原始核苷酸序列相同、或變體一組氨基酸序列。因此，本發(fā)明還涉及具有對編碼三聯(lián)體密碼的至少一個氨基酸具有可替換的三聯(lián)體密碼使用、但編碼與原始核苷酸序列編碼的多肽序列相同、或變體的多肽序列。此外，特定有機體通常具有用于編碼氨基酸的三聯(lián)體密碼子的偏好性。優(yōu)選的密碼子選擇表是普遍可得到的，并可用于制備密碼子優(yōu)化的基因。所述的密碼子優(yōu)化技術(shù)通常地用于優(yōu)化在異源宿主中轉(zhuǎn)基因的表達。氨基酸序列本發(fā)明范圍也包括具有如本文中定義的特定特性的酶的氨基酸序列。如本文所用的，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”的意義是一樣的。在有些情況下，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”的意義是一樣的。在有些情況下，術(shù)語″氨基酸序列″與術(shù)語″酶″的意義是一樣的?？蓮暮线m的來源制備/分離氨基酸序列，或人工制備或利用重組DNA技術(shù)制備氨基酸序列。本發(fā)明中所包括的酶可聯(lián)合其它酶進行使用。因此本發(fā)明也包括酶的組合，其中組合包含本發(fā)明的酶和另一種酶的酶組合，其中另一種酶可以是根據(jù)本發(fā)明的另一種酶。氨基酸序列當涉及并落入本發(fā)明的自身范圍內(nèi)時優(yōu)選不是天然的酶。對于這一點，術(shù)語“天然酶”指在其天然環(huán)境中并通過其天然核苷酸序列得到表達的完整酶。同一性/同源性本發(fā)明也包括酶的任何氨基酸序列或編碼所述酶的任何核苷酸序列的同系物的用途。本文中，術(shù)語“同系物”指與氨基酸序列和核苷酸序列具有某種同源性的實體。本文中，術(shù)語“同源性”與“同一性”等同。本文中可交換使用這些術(shù)語。在本文中，規(guī)定同源氨基酸序列包括是至少92％、優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％相同于該序列的氨基酸序列。通常，同系物包括例如與目標氨基酸相同的活性位點等等。盡管也可根據(jù)相似性(即，具有相似的化學性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)來判斷同源性，但在本發(fā)明的范圍中優(yōu)選用序列同一性來表示同源性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的同源氨基酸序列是在至少30、更優(yōu)選40個連續(xù)氨基酸區(qū)域上，具有至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在本文中，規(guī)定同源核苷酸序列包括是至少92％、優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％相同于編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列(目標序列)。通常，同系物包括例如與目標序列編碼活性位點的相同的序列等等。盡管也可根據(jù)相似性(即，具有相似的化學性質(zhì)/功能的氨基酸殘基)來判斷同源性，但在本發(fā)明的范圍中優(yōu)選用序列同一性來表示同源性。根據(jù)本發(fā)明的同源氨基酸序列是在至少30、優(yōu)選40、更優(yōu)選60個連續(xù)氨基酸區(qū)域上，具有至少90％同一性、更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。對于氨基酸序列和核苷酸序列，通過肉眼或更多地借助于可方便獲得的序列比較程序，實施同源性比較。這些商業(yè)上可獲得的計算機程序可計算兩個或更多序列之間的％同源性?？蓪B續(xù)序列計算％同源性即，將一條序列與另一條序列對齊，并將一條序列中的每個氨基酸直接與另一條序列中相應的氨基酸進行比較，每次比較一個殘基。這稱為“無空位(ungapped)”比對。通常，僅僅對于數(shù)目相對較少的殘基進行所述的無空位比對。盡管這是非常簡單和一致的方法，但它未能考慮到一些情況例如當進行全序列對比時，在一對在其它方面完全相同的序列對中的一個插入或缺失將引起隨后的氨基酸殘基無法對齊，因此可能導致極大地降低％同源性。因此，將大多數(shù)序列比較方法設計成可得到最佳對比結(jié)果，所述的對比考慮了可能的插入和缺失而不對同源性總分數(shù)過度罰分。通過在序列對比中插入“空位”來使局部同源性盡力最大化，可實現(xiàn)上述目的。然而，這些更復雜的方法對存在于隊列中的每個缺給予“空位罰分”，使得對于相同數(shù)目的相同氨基酸而言，具有盡可能少的空位的序列對比(這表明在兩種被對比序列之間的較高相關(guān)性)與具有許多空位的序列比對相比，可獲得較高分。通常使用“親族空位代價”來對存在空位付出相對較高代價以及對空位中每個隨后殘基處以較小罰分。這是最普遍用到的空位計分系統(tǒng)。高空位罰分自然得到具有較少空位的最佳對比。大多數(shù)對比程序允許修飾空位罰分。然而，當使用這種軟件用于序列比較時，優(yōu)選使用默認值。例如，當使用GCGWisconsinBestfit程序包時，用于氨基酸序列的默認空位罰分是空位是-12，每個延長是-4。因此最大％同源性的計算首先需要產(chǎn)生最佳比對并考慮到空位罰分。用于實施所述對比的合適的計算機程序是GCGWisconsinBestfit程序包(Devereux等，1984Nuc.AcidsResearch12p387)?？蛇M行序列比較的其它軟件的實例包括但不限于，BLAST程序包(參見Ausubel等，1999ShorrProtocolsinMolecularBiology，4thEd-Chapter18)、FASTA(Altschul等，1990J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS系列比較工具。BLAST和FASTA都可用于脫機和聯(lián)機檢索(參見Ausubel等.，1999，ShortProtocolsinMolecularBiology，pages7-58to7-60)。然而，對于一些應用，優(yōu)選使用GCGBestfit程序。被稱為BLAST2Sequences的新工具，也可用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(參見FEMSMicrobiolLett1999174(2)247-50；FEMSMicrobiolLett1999177(1)187-8andtatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。盡管可根據(jù)同一性測量最終的％同源性，比對過程本身通常不以“全或無”的配對比較為基礎。相反，通常使用分等級的相似性計分矩陣，其中根據(jù)化學相似性或進化距離對每個成對比較進行計分。通常用到的這種矩陣的實例是BLOSUM62矩陣--BLAST程序系列的默認矩陣。GCGWisconsin程序通常使用公眾默認值或用戶符號比較表(如果提供的話)，具體詳情參見用戶手冊。對于一些應用，對GCG程序包而言優(yōu)選使用公眾默認值，或?qū)ζ渌浖?，?yōu)選使用默認矩陣例如BLOSUM62?；蛘?，使用在DNASISTM(HitachiSoftware)中的多重對比特征，根據(jù)類似于CLUSTAL(HigginsDG&SharpPM(1988)，Gene73(1)，237-244)的算法，來計算百分比同源性。一旦軟件產(chǎn)生最佳對比結(jié)果，有可能來計算％同源性，優(yōu)選是％序列同一性。通常軟件作為序列比較的一部分進行此操作，并得到數(shù)值結(jié)果。序列也可具有產(chǎn)生沉默突變并導致功能等價物的氨基酸殘基的缺失、插入或取代。根據(jù)氨基酸性質(zhì)(例如極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或殘基的兩親性質(zhì))的相似性，可進行有意的氨基酸取代，因此這可用于將氨基酸分成功能性的組?？蓛H基于氨基酸的側(cè)鏈特性將氨基酸分成組。然而，更有用的是也包括了突變數(shù)據(jù)。因此，出于結(jié)構(gòu)原因，衍生的氨基酸組很可能是保守的?？梢跃S恩圖(LivingstoneC.D.和BartonG.J.(1993)″Proteinsequencealignmentsastrategyforthehierarchicalanalysisofresidueconservation″Comput.ApplBiosci.9745-756)(TaylorW.R.(1986)″Theclassificationofaminoacidconservation″J.Theor.Biol.119；205-218)的形式描述這些氨基酸組。例如根據(jù)描述了公認的維恩圖氨基酸分組的下表，可制備保守性取代。本發(fā)明也包括同源取代(本文提到的取代和替換都指存在的氨基酸殘基與另一種殘基進行互換)，其可發(fā)生相似對相似的取代，例如堿性對堿性、酸性對酸性、極性對極性等等。也可存在非同源取代，即從一個種類的殘基到另一種類的殘基，或者涉及包含非天然氨基酸，例如鳥氨酸(以下稱為Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(以下稱為B)、正亮氨酸鳥氨酸(以下稱為O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸以及苯基甘氨酸。也可通過非天然氨基酸進行取代。變體氨基酸序列包括可插入序列的任何兩種氨基酸殘基之間的合適間隔子基團，包括烷基例如甲基、乙基或丙基，此外還有氨基酸間隔子例如甘氨酸或β-丙氨酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員非常清楚另外形式的變體，其涉及以類肽形式存在的一種或多種氨基酸殘基。為了消除疑惑，“類肽形式”用于指變體氨基酸殘基，其中α-碳取代基在殘基的氮原子上而不是α-碳上。類肽形式的肽的制備方法是本領(lǐng)域已知的，例如SimonRJ等人的“PNAS(1992)89(20)，9367-9371”和HorwellDC的“TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134”。用于本發(fā)明的核苷酸序列其中包括合成或修飾的核苷酸。本領(lǐng)域中對寡核苷酸的許多不同種類的修飾是已知的。這些修飾包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯主鏈和/或在分子的3′端和/或5′端摻入吖啶或聚賴氨酸鏈。出于本發(fā)明目的，可以理解的是本文描述的核苷酸序列可通過本領(lǐng)域中任何有效的方法進行修飾?？蓪嵤┧龅男揎椧栽鰪姳景l(fā)明的核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命。本發(fā)明也包括與本文提到的序列或任何衍生物、片段或其衍生物互補的核苷酸序列的用途。如果序列與某個片段是互補的，則序列可作為探針來鑒定其它有機體中相似的編碼序列等等。以多種方法可獲得與本發(fā)明的序列不是100％同源、但也落入本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸。例如通過探測由大量個體(例如來自不同群體的個體)制備的DNA文庫，可得到本文所述序列的其它變體。此外，可獲得其它同系物，所述的同系物及其片段通常能與本文序列表中所示的序列選擇性雜交。通過探測由來自其它物種的基因組DNA所制備的cDNA文庫，并且在中度至高度嚴謹?shù)臈l件下，用包含所附序列表中的任何一條序列的全部或部分的探針，探測所述的文庫可獲得所述的序列。類似的考慮可用于獲得本發(fā)明多肽或核苷酸序列的物種同系物和等位變體。使用簡并PCR也可獲得變體和菌株/物種同系物，其中簡并PCR使用設計成能靶向變體和編碼本發(fā)明序列中保守氨基酸序列的同系物中的序列的引物。例如對來自幾個變體/同系物的氨基酸序列進行比對，可預測保守序列。使用本領(lǐng)域已知的計算機軟件可實施序列比對。例如GCGWisconsinPileUp程序被普遍地使用。簡并PCR中用到的引物含有一種或多種簡并位點，并且在與通過靶向已知序列的單序列引物來隆序列相比，更低的嚴謹條件下使用?；蛘?，通過位點定向誘變特征序列，可獲得所述的多核苷酸。這在例如需要沉默密碼子序列改變，來優(yōu)化表達多核苷酸序列的特殊宿主細胞的密碼子偏愛性時是有用的?？尚枰渌男蛄型蛔儊韺胂拗菩詢?nèi)切酶識別位點，或改變由多核苷酸編碼的多肽的性質(zhì)或功能。本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于生產(chǎn)引物如PCR引物，用于可替換的擴增反應的引物、探針，如使用放射性的或非放射性的標記，通過傳統(tǒng)方法用有展示作用的標記標記的探針，或可將多核苷酸克隆入載體。這種引物、探針及其它片段是至少15、優(yōu)選是至少20、例如至少25、30或40核苷酸長度，同時落入如本文所用的術(shù)語本發(fā)明的多核苷酸的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^重組法、合成法或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何方法，生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，例如DNA多核苷酸和探針。它們也可通過標準技術(shù)克隆。通常，可通過合成方法生產(chǎn)引物，包括一次合成一個核苷酸來逐步制備預期的核酸序列。使用自動化技術(shù)用于完成引物生產(chǎn)的技術(shù)是本領(lǐng)域中易于得到的。通常使用重組法例如使用PCR(聚合酶鏈式反應)克隆技術(shù)，生產(chǎn)更長的多核苷酸?？蓪⒁镌O計成能含有合適的限制性內(nèi)切酶識別位點以便將擴增的DNA克隆入合適的克隆載體。生物學活性優(yōu)選地，變體序列等等至少具有與本文所示序列具同樣的生物學活性。如本文所用的“生物學活性”指具有與天然存在的序列相似的結(jié)構(gòu)功能(但不必達到相同的程度)、和/或相似的調(diào)節(jié)功能(但不必達到相同的程度)、和/或相似的生物化學功能(但不必達到相同的程度)的序列。雜交本發(fā)明也包括與本發(fā)明的核酸序列互補的序列，或包括能與本發(fā)明的序列或與其互補序列雜交的序列。如本文所用的術(shù)語“雜交”包括“將核酸鏈與互補鏈通過堿基配對連接的過程”以及包括如在聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)中實施的擴增過程。本發(fā)明也包括能與本文所示的核酸序列互補的序列進行雜交的核苷酸序列(或任何衍生物、片段或其衍生物)的用途。術(shù)語“變體”也包括與能雜交本文所示的核苷酸序列的序列互補的序列。優(yōu)選地，術(shù)語“變體”包括與在嚴謹條件下(如50℃、0.2xSSC{1xSSC＝0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0})能雜交本文所示的核苷酸序列的序列互補的序列。優(yōu)選地，術(shù)語“變體”包括與在高度嚴謹條件下(如65℃、0.1xSSC{1xSSC＝0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0})能雜交本文所示的核苷酸序列的序列互補的序列。本發(fā)明也涉及與本發(fā)明的核苷酸序列(包括與本文所示的序列互補的序列)雜交的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及與可與本發(fā)明的核苷酸序列(包括本文所示序列的互補序列)的雜交的序列發(fā)生互補的核苷酸序列。在中等直到最高嚴謹?shù)臈l件下，能與本文所示的核苷酸序列雜交的多核苷酸序列也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的方面中，本發(fā)明包括在嚴謹條件下(如50℃、0.2xSSC)，能與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。在更優(yōu)選的方面中，本發(fā)明包括在高嚴謹條件下(如65℃、0.1xSSC)，能與本發(fā)明的核苷酸序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。重組在一個方面中，用于本發(fā)明的序列是重組序列，即使用重組DNA技術(shù)制備的序列。這些重組DNA技術(shù)是在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。在文獻中解釋了所示的技術(shù)，例如J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis的“1989，MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEdition，Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress”。合成在一個方面中，用于本發(fā)明的序列是合成的序列，即在體外通過化學法或酶促合成法制備的序列。它包括但不限于通過適于宿主有機體(例如畢赤氏酵母和漢遜酵母甲基營養(yǎng)酵母)的最佳密碼子使用而制備的序列。酶的表達用于本發(fā)明的核苷酸序列可摻入重組可復制載體。在和/或從相容性宿主細胞中，載體可用于復制和以酶的形式表達核苷酸序列。使用控制序列如調(diào)控序列來控制表達。宿主重組細胞通過核苷酸序列的表達而產(chǎn)生的酶，可以是分泌性的或可包含于細胞內(nèi)，這取決于使用的序列和/或載體。編碼序列可設計成具有信號序列，所述信號序列可指導物質(zhì)編碼序列穿過特定的原核或真核細胞膜分泌。表達載體術(shù)語“表達載體”指能在體內(nèi)或體外表達的構(gòu)建體。優(yōu)選地，將表達載體摻入合適的宿主有機體的基因組中。術(shù)語“摻入”優(yōu)選包括穩(wěn)定地摻入基因組中。本發(fā)明的核苷酸序列可存在于載體中，其中核苷酸序列可操作地連接到能利于通過合適宿主有機體表達核苷酸序列的調(diào)控序列。可將用于本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化入如下所述的合適宿主細胞，來提供本發(fā)明的多肽的表達。載體的選擇如質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體，常常取決于它被導入的宿主細胞。用于本發(fā)明的載體可含有一種或多種選擇標記基因，例如賦予抗生素抗性(如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性)的基因?；蛘撸ㄟ^共轉(zhuǎn)化來完成選擇(如WO91/17243中所述)。載體可在體外使用，例如用于生產(chǎn)RNA或用于轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或感染宿主細胞。因此，在另外的實施方案中，通過將本發(fā)明的核苷酸序列導入可復制載體、將載體導入相容性宿主細胞并在引起載體復制的條件下培育宿主細胞，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的核苷酸序列的方法。載體還進一步包含能使載體在所述的宿主細胞中復制的核苷酸序列。所述序列的實例是質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1以及pIJ702的復制起點。調(diào)控序列在一些應用中，將用于本發(fā)明的核苷酸序列可操作地連接到能提供核苷酸序列(例如通過選擇的宿主細胞)表達的調(diào)控序列。舉例來說，本發(fā)明包括包含可操作地連接所述調(diào)控序列的本發(fā)明核苷酸序列的載體，即，載體是表達載體。術(shù)語“可操作地連接”指所述的組分處于允許它們以預定方式起作用的相互關(guān)系中的并列位置?！翱刹僮鞯剡B接”至編碼序列的調(diào)控序列是在與控制序列相容的條件下實現(xiàn)編碼序列表達的方式進行連接。術(shù)語“調(diào)控序列”包括啟動子和增強子及其它表達調(diào)控信號。術(shù)語“啟動子”用于本領(lǐng)域的常規(guī)意義使用，如RNA聚合酶結(jié)合位點。通過選擇異源調(diào)控區(qū)域(如啟動子、分泌前導序列和終止子區(qū)域)，也可實現(xiàn)編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的增強表達。優(yōu)選地，將根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列可操作地連接至少一個啟動子。在細菌、真菌或酵母宿主中，用于指導核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是本領(lǐng)域中眾所周知的。構(gòu)建體術(shù)語“構(gòu)建體”-其和術(shù)語例如“綴合物”、“盒”、“雜交物”同義-包括直接或間接附著于啟動子的根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。間接附著的實例是提供了位于啟動子和本發(fā)明的核苷酸序列之間的合適間隔區(qū)，例如內(nèi)含子序列，例如Sh1內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。對于涉及本發(fā)明的術(shù)語“融合”而言同樣是如此，該術(shù)語包括直接或間接的附著。有時，該術(shù)語不包括用于編碼通常與野生型基因啟動子有關(guān)的并當他們均在其天然環(huán)境中時的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的天然組合。構(gòu)建體甚至可含有或表達便于選擇遺傳構(gòu)建體的標記。對于一些應用，優(yōu)選本發(fā)明的構(gòu)建體至少包括可操作地連接啟動子的本發(fā)明的核苷酸序列。宿主細胞本發(fā)明所涉及的術(shù)語“宿主細胞”，包括含有如上所述的核苷酸序列或表達載體、并用于重組產(chǎn)生具有本文所定義特定特性的酶的任何細胞。因此，本發(fā)明另外的實施方案提供用表達本發(fā)明的酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。可選擇與所述載體相容的細胞，例如原核的(例如細菌)、真菌、酵母或植物細胞。優(yōu)選宿主細胞不是人細胞。合適的細菌宿主有機體的實例是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌物種。取決于編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列的性質(zhì)、和/或根據(jù)進一步加工表達的蛋白質(zhì)的需要，優(yōu)選真核宿主例如酵母或其它真菌。通常，酵母細胞優(yōu)于真菌細胞，因為它們易于操作。然而，一些蛋白質(zhì)很少從酵母細胞分泌，或有時不被適當?shù)丶庸?如在酵母中的超糖基化)。在這些情況下，應選擇不同的真菌宿主有機體。使用適宜宿主細胞-例如酵母、真菌以及植物宿主細胞，可提供轉(zhuǎn)錄后修飾(如十四烷酰化、糖基化、截斷、lapidation以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化作用)，如當需要對本發(fā)明的重組表達產(chǎn)品給予最適生物活性時。宿主細胞可以是蛋白酶缺陷型或蛋白酶負型菌株。可修飾宿主細胞的基因型來提高表達。宿主細胞修飾的實例包括蛋白酶缺陷、補充稀有tRNA以及修飾細胞質(zhì)中還原能力以促進二硫鍵形成。例如，宿主細胞E.coli可過表達稀有tRNA來提高異源蛋白質(zhì)的表達，如Kane(CurrOpinBiotechnol(1995)，6，494-500″Effectsofrarecodonclustersonhigh-levelexpressionofheterologousproteinsinE.coli")舉例說明/描述。宿主細胞可缺乏許多還原酶，因此有利于形成穩(wěn)定的二硫化物鍵，如Bessette(ProcNatlAcadSciUSA(1999)，96，13703-13708″EfficientfoldingofproteinswithmultipledisulphidebondsintheEscherichiacolicytoplasm")舉例說明/描述。有機體涉及本發(fā)明的術(shù)語“有機體”包括可包含編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的核苷酸序列和/或由此獲得的產(chǎn)品的任何有機體，并且/或者其中當存在于有機體中時，啟動子可允許表達根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。合適的有機體可包括原核生物、真菌、酵母或植物。涉及本發(fā)明的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因有機體”包括包含用于編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的核苷酸序列的任何有機體和/或由此獲得的產(chǎn)物，并且/或者其中啟動子允許在有機體中表達根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列。優(yōu)選將核苷酸序列摻入有機體基因組中。當核苷酸受到它們的、同樣是在天然環(huán)境中的天然啟動子控制時，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因有機體”不包括在天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有機體包括可包含選擇下列任何一個或其組合的有機體編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的核苷酸序列、根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體、根據(jù)本發(fā)明的載體、根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒、根據(jù)本發(fā)明的細胞、根據(jù)本發(fā)明的組織或其產(chǎn)物。例如，轉(zhuǎn)基因有機體也可包括在異源啟動子控制下的編碼本發(fā)明的酶的核苷酸序列。宿主細胞/有機體的轉(zhuǎn)化如早前所示，宿主有機體是原核或真核有機體。合適的原核宿主的實例包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。關(guān)于轉(zhuǎn)化原核宿主的教導是本領(lǐng)域中熟知的，例如參見Sambrook等MolecularCloningALaboratoryManual，2ndedition，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress)。如果使用原核宿主，則可能需要在轉(zhuǎn)化之前適宜地修飾核苷酸序列-例如除去內(nèi)含子。使用本領(lǐng)域中已知不同方法，轉(zhuǎn)化絲狀真菌細胞，例如涉及原生質(zhì)體形成和轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體、隨后以已知方式再生細胞壁的方法。在EP0238023中描述了曲霉屬用作宿主微生物。另一種宿主有機體是植物。在Potrykus的論文(AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol42205-225)和在Christou的論文(Agro-Food-IndustryHi-TechMarch/April199417-27)中可找到用于轉(zhuǎn)化植物的常規(guī)技術(shù)評論。在EP-A-0449375中還可找到關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的教導。在下文中列出了關(guān)于轉(zhuǎn)化真菌、酵母和植物的常規(guī)教導。轉(zhuǎn)化的真菌宿主有機體可以是真菌例如絲狀真菌。合適的所述宿主實例包括屬于Thermomyces、支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)、脈孢菌屬(Neurospora)、木霉屬(Trichoderma)等等的成員。在US-A-5741665中評述了關(guān)于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的教導，其中指出用于轉(zhuǎn)化絲狀真菌并培養(yǎng)真菌的標準技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如可在Davis和deSerres的“MethodsEnzymol(1971)17A79-143”中找到應用于N.crassa的技術(shù)的大量綜述。在US-A-5674707中還評述了關(guān)于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的進一步教導。在一個方面中，宿主有機體可以是曲霉屬、例如黑曲霉。例如，通過下列TurnerG1994(Vectorsforgeneticmanipulation.InMartinelliS.D.，KinghornJ.R.(Editors)Aspergillus50yearson.Progressinindustrialmicrobiologyvol29.ElsevierAmsterdam1994.pp.641-666，)的教導，可制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉屬。在Punt等人的“(2002)TrendsBiotechnol2002May；20(5)200-6，Archer&PeberdyCritRevBiotechnol(1997)17(4)273-306”，已經(jīng)評述了在絲狀真菌中的基因表達。轉(zhuǎn)化的酵母在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因有機體可以是酵母。例如，在“MethodsMolBiol(1995)，49341-54，andCurrOpinBiotechnol(1997)Oct；8(5)554-60”中，提供了在酵母中異源基因表達的原理的評述。在這點上，酵母，例如釀酒酵母或畢赤氏酵母(參見FEMSMicrobiolRev(200024(1)45-66)，可作為載體用于異源基因表達。EHinchcliffeEKenny教導了在釀酒酵母中異源基因表達和基因產(chǎn)物的分泌的原理評述(1993，″Yeastasavehiclefortheexpressionofheterologousgenes″，Yeasts，Vol5，AnthonyHRoseandJStuartHarrison，Eds.，2ndedition，AcademicPressLtd.)。已經(jīng)研究了酵母轉(zhuǎn)化的幾種轉(zhuǎn)化方法。例如，通過下列Hinnen等人的“1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA75，1929”和Beggs，JD的“1978，Nature，London，275，104”以及Ito，H等人的“1983，JBacteriology153，163-168”的教導，制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因酵母。使用不同的選擇標記(例如營養(yǎng)缺陷型標記、顯性抗生素抗性標記)，可選擇轉(zhuǎn)化的酵母細胞。轉(zhuǎn)化的植物/植物細胞用于本發(fā)明的宿主有機體可以是植物。在Potrykus的論文(AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol42205-225)和Christou的論文(Agro-Food-IndustryHi-TechMarch/April199417-27)中，可找到對常規(guī)技術(shù)的評述。培養(yǎng)和生產(chǎn)在利于生產(chǎn)所編碼的酶的、并利于從細胞和/或培養(yǎng)基回收該酶的條件下，培養(yǎng)用本發(fā)明的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞。用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是適于培育所述的宿主細胞并獲得酶的表達的任何常規(guī)培養(yǎng)基。在細胞表面可顯示由重組細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。酶可從宿主細胞分泌，并且使用公知方法可便利地從培養(yǎng)基回收酶。分泌通常，期望將酶從表達宿主分泌到更易于回收酶的培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明，可基于期望的表達宿主選擇分泌前導序列。本發(fā)明范圍中也可使用雜交信號序列。異源性分泌前導序列的典型實例是源自真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(如來自曲霉屬的18氨基酸和24氨基酸的glaA)、α因子基因(酵母，如酵母、克魯維氏酵母和漢遜氏酵母)或α淀粉酶基因的序列。舉例來說，在MethodsEnzymol(1990，182132-43)中評述了異源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的分泌。檢測用于檢測和測定氨基酸序列表達的各種方法是本領(lǐng)域中已知的。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)和熒光激活細胞分類法(FACS)。各種標記和偶聯(lián)技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員都是已知的，并可用于各種核酸和氨基酸測定中。許多公司例如PharmaciaBiotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和USBiochemicalCorp(Cleveland，OH)，提供用于這些方法的商業(yè)化試劑盒及操作步驟。適宜的報告分子或標記包括放射性核素、酶、熒光、化學發(fā)光或顯色劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等等。教導了使用所述標記的專利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149以及US-A-4,366,241。如US-A-4,816,567中所示，也可生產(chǎn)重組免疫球蛋白。融合蛋白根據(jù)本發(fā)明使用的氨基酸序列，可生產(chǎn)作為融合蛋白，例如有助于提取和純化。融合蛋白配偶體的實例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活區(qū))以及(β-半乳糖苷酶)。也可方便地在融合蛋白配偶體和目的蛋白質(zhì)序列之間含有允許除去融合蛋白序列的蛋白水解剪切位點。優(yōu)選地，融合蛋白不影響蛋白質(zhì)序列的活性。在“CurrOpinBiotechnol(1995)6(5)501-6”中已經(jīng)評述了在大腸桿菌中的基因融合表達系統(tǒng)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，氨基酸序列可連接異源序列以編碼融合蛋白。例如，為了從肽庫篩選能影響物質(zhì)活性的試劑，編碼可表達被商業(yè)上可獲得的抗體識別的異源表位的嵌合物質(zhì)可能是有用的。大規(guī)模應用在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，氨基酸序列用于大規(guī)模應用。在培養(yǎng)宿主有機體后，優(yōu)選以每升細胞培養(yǎng)物總體積1g至約每升2g的量生產(chǎn)氨基酸序列。在培養(yǎng)宿主有機體后，優(yōu)選以每升細胞培養(yǎng)物總體積100mg至約每升900mg的量生產(chǎn)氨基酸序列。在培養(yǎng)宿主有機體后，優(yōu)選以每升細胞培養(yǎng)物總體積250mg至約每升500mg的量生產(chǎn)氨基酸序列。食品本發(fā)明的組合物可用作(或用于制備)食品。本文中，術(shù)語“食品”以廣義使用，并包括適于人的食品以及適于動物的食品(即，飼料)。在優(yōu)選的方面中，食品用于人的食用。食品可以是溶液或固體的形式，這取決于應用的用途和/或方式和/或服用的方式。食品成分本發(fā)明的組合物可用作食品成分。如本文所用的術(shù)語“食品成分”，包括被或可被加入功能性食品(food)或食品(foodstuff)中的制劑，以及包括能在需要例如酸化或乳化的各種產(chǎn)品中以低水平使用的制劑。食品成分可以是溶液或固體的形式，這取決于應用的用途和/或方式和/或服用的方式。食品產(chǎn)品本發(fā)明的組合物可用于制作食品產(chǎn)品，例如一種或多種糖果產(chǎn)品、乳制品、禽制品、魚制品和烘烤食品。本發(fā)明也提供制作食品或食品成分的方法，方法包括將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶與另一種食品成分混合。實施例現(xiàn)在通過參照僅僅用于舉例說明的下圖，描述本發(fā)明圖1顯示IEC層析后，獲得的脂肪酶活性(用陰影部分表示，標記為集合組B)和蛋白質(zhì)(虛線)的圖。圖2顯示施加到凝膠上(NUPAGE，4-12％，Mes緩沖液，根據(jù)制造商的描述進行制備，Novex，美國)然后進行考馬斯亮藍染色的純化真菌脂肪分解酶(泳道3-5)。圖3顯示色譜圖#61。圖4顯示來自丁基瓊脂糖凝膠柱的餾份的SDS-PAGE(P集合組#172-174，100U/mL，1∶10稀釋；Std＝標準蛋白質(zhì)組)。圖5顯示小烘烤試驗，其中1)Chr#61級分9.2)集合組#172-#174；3)Chr.#61級分14.4)對照；5)脂肪酶#3044。圖6顯示來自BS8948-2的生面團脂質(zhì)雙半乳糖甘油二酯(DGDG)和雙半乳糖甘油一酯(DGMG)的氣液色譜分析。圖7顯示將所有CBS肽的氨基酸序列與異孢鐮孢日本株(Nagao等，1994)的對比。在序列下方，分別用*和·標記相同和相似的(保守的)氨基酸。圖8顯示融合了合成α信號序列的合成異孢鐮孢(CBS782.83)脂肪分解酶基因的核苷酸序列及翻譯的氨基酸序列。在核苷酸序列下方是氨基酸序列。對含有限制性內(nèi)切酶位點EcoRI和BamHI的核苷酸進行下劃線，并對翻譯起始和終止密碼子進行雙下劃線。箭頭標示在α信號序列和脂肪分解酶基因之間的融合位點。箭頭表明用于基因組裝的引物。圖9顯示含有融合了合成α信號序列(αss)的合成異孢鐮孢(CBS782.83)脂肪分解酶基因(LIPASE)的漢遜酵母表達載體pB14示意圖。URA3，是適于在漢遜酵母中篩選的尿嘧啶互補的乳清苷-5′-磷酸-脫羧酶基因。HARS，是適于在漢遜酵母中復制的自主復制序列。FMD-P，是適于在漢遜酵母中表達的FMD啟動子。圖10顯示篩選的含有合成異孢鐮孢脂肪分解酶基因的多態(tài)漢遜酵母克隆的磷脂酶活性。將卵磷脂作為底物，并使用NEFA試劑盒(Roche)測定游離脂肪酸。圖11顯示用增加劑量(PLU)的磷脂酶樣品205和LipopanFTM烘烤的小面包。圖12顯示生面團脂質(zhì)的氣液色譜分析。DGDG＝雙半乳糖甘油二酯。DGMG＝雙半乳糖甘油一酯?？偤停紻GDG+DGMG(實施例3)。圖13顯示HPTLC色譜圖，A)參照1.分餾的面粉脂質(zhì)；2.水解的DGDG；3.DGDG。B)從生面團提取的脂質(zhì)4.對照；5.2000PLU-7/kg的樣品205；6.40ppmLipopanFTM。圖14顯示在用衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶處理的生面團中，異構(gòu)體半乳糖-甘油一酯的氣液色譜分析。圖15顯示衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶活性，其中通過在pH7.0、各種溫度時對卵磷脂底物進行酶反應10分鐘、并隨后通過NEFAC法測定游離脂肪酸而測定脂肪分解酶活性。圖16顯示衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶活性，其中在3TIPU/ml的50mM磷酸鹽緩沖液中和各種溫度(50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.0)下溫育30分鐘后，通過在37℃、pH7.0時對卵磷脂底物(無CaCl2)進行酶反應10分鐘、并隨后通過NEFAC法測定游離脂肪酸而測定脂肪分解酶活性。圖17顯示衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶活性，其中在37℃和各種pH(50mM磷酸鹽緩沖液)下對卵磷脂底物(無CaCl2)進行酶反應10分鐘并隨后通過NEFAC法測定游離脂肪酸之后而測定脂肪分解酶活性。圖18顯示衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶活性，其中在3TIPU/ml的50mM磷酸鹽緩沖液中和各種pH(50mM磷酸鹽緩沖液)下溫育30分鐘后，通過在37℃、pH7.0時對卵磷脂底物(無CaCl2)進行酶反應10分鐘、并隨后通過NEFAC法測定游離脂肪酸而測定脂肪分解酶活性。圖19a和圖19b顯示通過SDS-PAGE法鑒定衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶的分子量。圖20描述根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的最適溫度。在各種溫度下實施酶反應。圖21描述在酶修飾型蛋黃中與反應時間有關(guān)的卵磷脂量。A30℃，B40℃，C50℃。通過LC/MS-MS分析卵磷脂量，并可用蛋黃百分率表示。圖22描述在酶修飾型蛋黃中與反應時間有關(guān)的溶血卵磷脂量。A30℃，B40℃，C50℃。通過LC/MS-MS分析卵磷脂量，并可用蛋黃百分率表示。圖23描述在酶修飾型蛋黃中與反應時間有關(guān)的游離脂肪酸量。A30℃，B40℃，C50℃。通過NEFAC法分析游離脂肪酸量，并可用蛋黃百分率表示。圖24描述用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶進行酶轉(zhuǎn)化蛋黃(實施例4)。與反應時間有關(guān)的溶血卵磷脂(A)、游離脂肪酸(B)、卵磷脂(C)量。誤差線表明兩次測定的標準偏差(n＝2)。通過LC/MS-MS測定卵磷脂量和溶血卵磷脂量，并通過NEFAC法測定游離脂肪酸量。結(jié)果用蛋黃百分率表示。圖25描述用來自NovozymesA/S的LecitaseUltra磷脂酶進行酶轉(zhuǎn)化蛋黃(實施例4)。與反應時間有關(guān)的溶血卵磷脂(A)、游離脂肪酸(B)、卵磷脂(C)量。誤差線表明兩次測定的標準偏差(n＝2)。通過LC/MS-MS測定卵磷脂量和溶血卵磷脂量，并通過NEFAC法游離脂肪酸量。結(jié)果可用蛋黃百分率表示。圖26顯示來自修飾的蛋黃脂質(zhì)提取物的薄層色譜分析(溶劑是氯仿∶甲醇∶水(65∶24∶4))(實施例4)。1PC和LPC標準。2在10℃、240分鐘時，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。3在20℃、240分鐘時，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。4在53℃、240分鐘時，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。5在20℃、1440分鐘時，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。6在10℃、4h時，LecitaseUltra。7在20℃、240分鐘時，LecitaseUltra。8在53℃、4h時，LecitaseUltra。9在20℃、1440分鐘時，LecitaseUltra。10對照樣品。薄層色譜板的左側(cè)所列的化合物是膽固醇(C)、甘油三酰酯(TG)、甘油二酰酯(DG)、游離脂肪酸(FFA)、甘油一酰酯(MG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、以及溶血卵磷脂(LPC)。圖27描述在分別用本發(fā)明的脂肪分解酶和LecitaseUltra磷脂酶對蛋黃進行酶反應的期間，在溶血卵磷脂和游離脂肪酸含量變化的關(guān)系(實施例4)。結(jié)果以溶血卵磷脂的摩爾量523和游離脂肪酸的摩爾量283為基準。通過NEFAC法測定游離脂肪酸。通過LC/MS-MS測定溶血卵磷脂和卵磷脂。圖28顯示來自修飾的蛋黃的脂質(zhì)提取物的高效薄層色譜分析(溶劑是對-醚∶MTBE∶乙酸(50∶50∶1))(實施例4)。薄層色譜板的左邊列出的化合物是甘油三酰酯(TG)、游離脂肪酸(FFA)、1，3甘油二酰酯(1，3DG)、1，2甘油二酰酯(1，2DG)、膽固醇(C)、甘油一酰酯(MG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂(PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、以及溶血卵磷脂(LPC)。圖29顯示用來自SanofaA/S的酶處理的蛋黃而制備的蛋黃醬進行薄層色譜分析(溶劑IV)(實施例5)。圖30顯示用來自SanofaA/S的酶處理的蛋黃而制備的蛋黃醬在微波爐中進行熱處理(實施例5)。樣品1是添加水而不是酶液的對照，樣品2含有30U/g的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶以及樣品3含有30U/g的LecitaseUltra。圖31顯示單獨用不同濃度的、根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶或聯(lián)合PanodanM2020DATEM乳化劑所烘烤的硬殼面包卷的具體體積，同時針對LipopanFTM和DATEM以及純LipopanFTM或純DATEM的組合進行了測試。圖32顯示單獨用不同濃度的、根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶或聯(lián)合PanodanA2020DATEM或SSLP55乳化劑所烘烤的硬殼面包卷的具體體積，并且針對LipopanFTM/SSLP55或LipopanTM/DATEM以及純LipopanF、純DATEM和純SSLP55的組合進行了測試。圖33顯示F.semitectum(IBT9507)脂肪酶cDNA的核苷酸序列(SEQIDNo.5)和推導的氨基酸序列(SEQIDNo.4)。核苷酸序列上方為推導的氨基酸序列。箭頭表示用于擴增cDNA的引物。圖34顯示含有融合了α信號序列(αss)的F.semitectum脂肪酶(Lipase)的漢遜酵母表達載體pDB14-alp-sem示意圖。AP(R)、URA3，是用于篩選的尿嘧啶互補的乳清苷-5′-磷酸-脫羧酶基因。HARS，是適于在漢遜酵母中復制的自主復制序列。FMD-P，是適于在漢遜酵母中表達的FMD啟動子。圖35顯示與溫度有關(guān)的、來自半裸鐮孢IBT9507的脂肪分解酶的磷脂酶活性。圖36顯示與pH有關(guān)的、來自半裸鐮孢IBT9507的脂肪分解酶的磷脂酶活性。圖37顯示衍生于異孢鐮孢的真菌脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQIDNo.1)。圖38顯示衍生于異孢鐮孢的真菌脂肪分解酶的、并包含N端信號序列(下劃線)的氨基酸序列(SEQIDNo.2)。圖39顯示編碼根據(jù)本發(fā)明的、并衍生于異孢鐮孢的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列(SEQIDNo.3)。圖40顯示衍生于半裸鐮孢的脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQIDNo.4)。圖41顯示編碼衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶的核苷酸序列(SEQIDNo.5)。圖42顯示衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQIDNo.6)，其中EAEA是最初來自α因子信號序列的前肽。圖43顯示衍生于異孢鐮孢的包含α因子信號序列的脂肪分解酶的核苷酸序列(SEQIDNo.7)。實施例1.異孢鐮孢脂肪分解酶的表達、純化、測序和烘烤試驗。發(fā)酵從CentraalbureauvoorSchimmelcultures(荷蘭)處獲得異孢鐮孢CBS782.83株。培養(yǎng)基葡萄糖-酵母抽提瓊脂酵母抽提物4g/LKH2PO41g/LMgSO4，7H2O0.5g/L葡萄糖15g/L瓊脂20g/L高壓滅菌后加入葡萄糖1.4預發(fā)酵培養(yǎng)基豆粉50g/L單水合葡萄糖50g/LKH2PO42g/LNa2HPO43g/L大豆油1g/L在帶檔板的500mL搖瓶中制備培養(yǎng)基，并每搖瓶加入100mL培養(yǎng)基。將大豆油分別加入每個燒瓶。高壓滅菌后加入葡萄糖。制備培養(yǎng)基蛋白胨10g/LTweenTM-8012g/LMgSO4，7H2O2g/LCaCl2，2H2O0.1g/L在帶檔板的500mL搖瓶中制備培養(yǎng)基，并每搖瓶加入100mL培養(yǎng)基。將TM-80分別加入每個燒瓶中。高壓滅菌前將pH調(diào)至6.0。培養(yǎng)條件將異孢鐮孢CBS782.83接種到葡萄糖-酵母提取物瓊脂平板上，并在24℃進行培養(yǎng)直至產(chǎn)生孢子。用含有良好孢子形成培養(yǎng)物的、4cm2的瓊脂塊接種含有預發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶。將搖瓶在30℃和200RPM下進行培養(yǎng)。生長三天后，用5mL來自預發(fā)酵搖瓶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基分別接種30個生產(chǎn)培養(yǎng)基搖瓶。將生產(chǎn)培養(yǎng)基搖瓶在30℃和200RPM下進行培養(yǎng)。在生長2、3和4天后，收集十個生產(chǎn)培養(yǎng)基搖瓶。通過離心隨后將上清通過來自GelmanLaboratory的0.2μm過濾器(VacuCap90FilterUnitw/0.2μmSuporMembrane)進行過濾除菌，來除去生物量。過濾后，將濾液在-80℃冰凍并保藏，直到用于分析。分析步驟根據(jù)前述的“PLU分析法”，測定磷脂酶活性。應用TLC分析在加熱櫥中活化薄層色譜板(110℃)1/2小時。將100mL洗脫緩沖液倒入有蓋的層析小室。用濾紙(Whatman2)包裹室壁以用溶劑蒸汽飽和小室。將薄層色譜板放入框架，并將樣品加到距離底部2厘米的薄層色譜板上。然后將薄層色譜板放入有所選洗脫緩沖液的薄層色譜小室。當洗脫緩沖液到達距離平板底部14厘米時，取出薄層色譜板并在通風板(fumeboard)上干燥，隨后放在加熱櫥中于110℃放置10分鐘。然后將薄層色譜板浸于顯色劑中，并在加熱櫥中于110℃干燥15分鐘。洗脫緩沖液Nr.IV氯仿∶甲醇∶H2O(65∶25∶4)Nr.I對-醚∶甲基叔丁醚(MTBE)∶乙酸(60∶40∶1)顯色緩沖液(釩酸鹽緩沖液)將32gNa2CO3加入300mLH2O(1M)。當在“BACO-LINE”烘箱中慢慢加熱和烘烤6分鐘時，加入并溶解18.2g五氧化釩(V2O5)。溶液冷卻至室溫。小心加入460mL2.5MH2SO4(460mLH2O+61mLH2SO4)。加水直至1000mL。氣相色譜PerkinElmer8420毛細管氣相色譜儀，配備有WCOT熔融硅柱(12.5m×0.25mmID×0.1μm，5％苯基甲基硅酮(CPSil8CB來自Crompack)。載氣氦氣。注射器1.5μL，并有裂口。檢測器FID，385℃。恒溫箱程序1234恒溫箱溫度[℃]80200240360等溫時間[分鐘]20010溫度速率[℃/分鐘]201012樣品制備將50mg小麥脂質(zhì)溶于含有2mg/mL十七烷內(nèi)標物的12mL庚烷吡啶(2∶1)。將500μl樣品轉(zhuǎn)入曲管中。加入100μlMSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷-三氟乙酰胺)，并將反應物在90℃下溫育15分鐘。計算從這些組分的參照混合物，測定對于甘油一酸酯、甘油二酸酯、甘油三酯、游離脂肪酸以及半乳糖脂的反應系數(shù)。根據(jù)這些反應系數(shù)，計算生面團中的脂質(zhì)。小烘烤測試將下列成分加入50gBrabrender混料罐并在30℃揉捏5分鐘50g面粉、10g干酵母、0.8g糖、0.8g鹽、70ppm抗壞血酸以及水(直至400Brabender單位的生面團稠度)。在34℃靜置10分鐘。每個生面團稱取15g的生面團。然后在可將生面團在木板和有機玻璃框之間進行滾軋的特殊裝置中進行制模。將生面團在罐中于34℃下發(fā)面45分鐘，并在Voss家庭烤箱中于225℃下烘烤8分鐘。烘烤后，面包冷卻至室溫并放置20分鐘。稱取面包，并通過油菜籽取代法測定體積。切開面包，評價團粒以及面包皮。實驗性烘烤試驗(硬皮面包卷)將改良的丹麥面粉1500g、壓縮酵母90g、糖24g、鹽24g、水400Brabender單位+2％在Hobart攪拌器中，用鉤以低速2分鐘和以高速9分鐘進行捏制。生面團溫度是26℃。稱取1350克生面團。將生面團在30℃下靜置10分鐘，并用Fortuna模具進行制模。然后將生面團在34℃下發(fā)面45分鐘。將生面團在Bago烤箱中于220℃烘烤18分鐘并蒸12秒。冷卻后，稱取面團卷，并通過油菜籽取代法測量面包卷體積。具體的面包體積具體體積＝(面包體積，ml)/(面包重量，克)結(jié)果與討論發(fā)酵分析發(fā)酵樣品的磷脂酶活性，結(jié)果如表1所示。表1發(fā)酵結(jié)果已經(jīng)知道磷脂酶活性在第2天、第3天和第4天是幾乎相同的，因此可集中所有的樣品，并命名為JBS-2254-97-3。純化和測序使用陰離子交換層析法從粗提物純化磷脂酶根據(jù)制造商(AmershamBio.)所述，制作層析柱(Q-SepharoseFF，1.5X2.8cm，5mL凝膠)，然后在20mMtris/HCl緩沖液、0.1MNaCl(pH7.5，緩沖液A)中平衡。對樣品(15mL)添加0.1MNaCl，并以3.5mL/分鐘的流速施加到層析柱上。用0-0.6MNaCl線性梯度的緩沖液A洗脫脂肪分解酶(參見圖1)。在整個過柱期間，收集3.5mL餾份。將10μl每種餾份進行點滴板測定。通過三丁酸甘油酯和卵磷脂點滴板測定法，來測定脂肪酶活性(將10μl每種餾份轉(zhuǎn)入孔中，并將平板在40℃下溫育。在瓊脂糖膠中暈的形成可作為時間函數(shù)。也可將沒有酶的空白加入一個孔中來用于對比)。然后將含有解脂活力的餾份進行SDS-PAGE(參見圖2)和N末端分析。根據(jù)MALDI-TOF和氨基酸測序法的酶促指紋圖譜用二硫蘇糖醇還原蛋白質(zhì)，并使用碘乙酰胺通過羧甲基化作用保護半胱氨酸殘基。通過胰蛋白酶裂解蛋白質(zhì)，并通過MALDI-TOF分析來檢驗胰蛋白酶肽的片段化方式。通過在C18反相高效液體色譜層析柱上層析來分離肽，并通過MALDI-TOF分析監(jiān)測純化度。根據(jù)以前在TR6452中詳細所述，根據(jù)Edman降解法測定氨基酸序列。已經(jīng)確定異孢鐮孢脂肪分解酶的全部氨基酸序列。通過胰蛋白酶的消化，可得到非常特殊的肽，其中確實可測定其分子量(MW)(MALDI-TOF)。根據(jù)Edman降解法也可確定所有肽的氨基酸序列。根據(jù)Edman降解法確定的氨基酸序列，包括異孢鐮孢脂肪分解酶99.64％的多肽鏈。表2中顯示了MALDI-TOF和Edman降解法研究的概要。表2來自異孢鐮孢脂肪分解酶的胰蛋白酶肽的酶促指紋圖譜和分子量，和根據(jù)Edman裂解法全部氨基酸序列的測定。+＝根據(jù)Edman測序法證實的*＝氧化的色氨酸序列覆蓋率＝99.64％在SEQIDNo.1中顯示異孢鐮孢脂肪分解酶的氨基酸全序列(參見圖37)。應用試驗通過在Amicon超濾裝置上進行超濾(10kDa濾徑)，將2升來自異孢鐮孢的三種樣品(表1)的集合組(標記的集合組#172-174)進行濃縮。250ml滯留物含有約100PLU-7/ml。將滯留物調(diào)節(jié)至1M乙酸銨并施加到27ml丁基瓊脂糖凝膠層析柱上(2.5cmid.)，并用緩沖液A(20mMTEA中的1M乙酸銨，pH7.4)和緩沖液B(20mMTEA，pH7.4)進行洗脫。圖3中顯示了純化的色譜圖(#61)。圖4中顯示了通過SDS-PAGE，分析來自色譜圖#61的餾份。從該層析柱收集10mL餾份，并如表3中所示，進行分析磷脂酶活性。這些結(jié)果表明在色譜主峰洗脫的餾份中，具有相當高的磷脂酶活性量。少量活性不結(jié)合層析柱，而是在之前被洗脫的。盡管SDS膠不會跑得如此完美，可觀察到餾份含有幾種蛋白質(zhì)，但是餾份14和餾份15含有一條主要帶，預計這是真菌脂肪分解酶。表3來自色譜#61的餾份9和餾份14可用于小烘烤試驗，并且在小烘烤試驗中測試了未純化的集合組#172-174。表4顯示了這些烘烤實驗的結(jié)果。結(jié)果清楚地表明就改善面包體積而言，來自異孢鐮孢CBS782.83的、純化的脂肪分解酶產(chǎn)生很好的烘烤結(jié)果。未純化的樣品也利于很好的面包體積。如圖5所示，異孢鐮孢脂肪分解酶也可很大改善面包的團粒結(jié)構(gòu)，并評價其優(yōu)于來自Pseudomonascepacia#3044的脂肪酶。表4用水飽和的丁醇抽提微烘烤實驗中的生面團，并通過薄層色譜分析脂質(zhì)。薄層色譜分析證實脂肪酶#3044比來自異孢鐮孢樣品的脂肪分解酶，具有對甘油三酯更高的活性。游離脂肪酸(FFA)的數(shù)量，也高于脂肪酶#3044。在溶劑IV中的薄層色譜表明與甘油三酯水解脂肪酶#3044相比，組分(DGMG)在用異孢鐮孢處理生面團脂質(zhì)的樣品中含量明顯更高。在實驗性烘烤試驗中，也可測試來自異孢鐮孢的純化餾份，其結(jié)果如表5所示。表5在實驗性烘烤試驗中來自異孢鐮孢的純化層析餾份的用途和對面包體積的影響。用水飽和的丁醇抽提來自烘烤試驗的生面團，并通過氣液色譜(GLC)分析生面團脂質(zhì)，其結(jié)果如表6所示。表6生面團脂質(zhì)的氣液色譜分析。GL＝甘油。FFA＝游離脂肪酸。MGMG＝單半乳糖甘油一酯。DAG＝甘油二酯。DGMG＝雙半乳糖甘油一酯。MGDG＝單半乳糖甘油二酯。DGDG＝雙半乳糖甘油二酯。TRI＝甘油三酯。在表7中顯示了與甘油三酯水解作用相比，DGDG水解作用比率。在圖6中，也圖解說明了半乳糖脂的氣液色譜分析。氣液色譜結(jié)果證實在生面團中，由異孢鐮孢產(chǎn)生的DGMG量高于40ppmLipopanF(#3016)的產(chǎn)生量。結(jié)果也表明MGDG比DGDG具有更高程度的水解的作用。結(jié)果也表明與正常甘油三酯水解酶如來自P.cepacia的#3044相比，水解的甘油三酯的數(shù)量更低。試驗規(guī)模的烘烤結(jié)果和脂質(zhì)分析證實來自異孢鐮孢CBS782.83的脂肪分解酶，對于在生面團中雙半乳糖甘油二酯(DGDG)和雙半乳糖甘油一酯(DGMG)的形成具有明顯的水解活性。表7與來自異孢鐮孢的純化層析餾份的甘油三酯水解作用相比，DGDG的水解作用比率4.結(jié)論研究中，通過在搖瓶中發(fā)酵，生產(chǎn)來自異孢鐮孢CBS782.83的真菌脂肪分解酶。純化酶并測定氨基酸序列。該酶與來自F.oxysporum的商業(yè)化脂肪酶(LipopanFTM)具有約83％同源性。就改善面包體積和團粒結(jié)構(gòu)而言，該酶在烘烤試驗中可產(chǎn)生很好的結(jié)果。對生面團脂質(zhì)分析，證實在生產(chǎn)半乳糖苷甘油一酯期間，酶對半乳糖脂是有活力的。不進行任何劑量優(yōu)化，烘烤結(jié)果表明來自異孢鐮孢CBS782.83的真菌脂肪分解酶至少相當于商業(yè)化酶LipopanF，并且比較DGDG對甘油三酯的活性表明與LipopanFTM相比，該酶在生面團環(huán)境中具有優(yōu)越的酶活性。實施例2.在多態(tài)漢遜酵母中，構(gòu)建和表達編碼來自異孢鐮孢(CBS782.83)的脂肪分解酶的合成基因。測定從異孢鐮孢(CBS782.83)分離的真菌脂肪分解酶的氨基酸序列，并用于設計和克隆適于在多態(tài)漢遜酵母中表達的合成脂肪分解酶基因。為了有利于高表達，優(yōu)化合成基因的密碼子以符合多態(tài)漢遜酵母的密碼子偏愛性。合成密碼子優(yōu)化的α-因子信號序列，同時克隆到合成脂肪分解酶基因的上游。將組配的構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入表達載體pB14并轉(zhuǎn)化入多態(tài)漢遜酵母。pB14是無抗生素抗性基因的質(zhì)粒，因此可用于生產(chǎn)元件中。篩選大量的生產(chǎn)脂肪分解酶的鐮孢菌屬菌株，其中當與甘油三酯相比，所述的菌株對半乳糖脂和/或磷脂具有高活性比。已經(jīng)篩選了幾種菌株以生產(chǎn)目的脂肪分解酶。這些當中是異孢鐮孢(CBS782.83)。因此已分離來自該菌株的脂肪分解酶并已確定其氨基酸序列。將氨基酸序列反向翻譯為核酸序列，這可用于設計并構(gòu)建適于在多態(tài)漢遜酵母中表達的合成基因。實驗研究中用到的漢遜酵母株是尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型多態(tài)漢遜酵母株RB11(odcl)，購自RheinBiotechGmbH(Düsseldorf，德國)。根據(jù)MALDI-TOF和氨基酸測序法的酶促指紋圖譜。從異孢鐮孢(CBS782.83)分離具有脂肪分解酶活性的蛋白質(zhì)。用二硫蘇糖醇還原蛋白質(zhì)，并用碘乙酰胺通過羧甲基化作用保護半胱氨酸殘基。通過胰蛋白酶裂解蛋白質(zhì)，并通過MALDI-TOF分析法檢定胰蛋白酶肽的片段化方式。通過在C18反相高效液體色譜層析柱上進行層析來分離肽，并通過MALDI-TOF分析法監(jiān)測純化度。根據(jù)以前在TR6452中詳細地描寫，通過Edman降解法測定氨基酸序列。合成脂肪分解酶基因的設計和構(gòu)建通過與異孢鐮孢日本株(Nagao等，1994)進行比對，對肽片段的氨基酸序列進行排序。因此，將得到的完整氨基酸序列反向翻譯成核酸序列，以顯示所有可能的密碼子。根據(jù)在多態(tài)漢遜酵母中表達的基因的密碼子偏好表，對于每個密碼子，選擇最適于在多態(tài)漢遜酵母中表達的密碼子。合成每個約100核苷酸長、包括全長基因的合成寡核苷酸，并通過PCR組裝該基因。用上游引物(alps.cbss)和下游引物(cbss.t)最終擴增該基因，其中設計上游引物具有α因子信號序列3′端的最5′的核苷酸以允許框內(nèi)融合，設計下游引物具有適于克隆目的的BamHI限制性內(nèi)切酶位點(表8)。用寡核苷酸以偏好密碼子同樣合成編碼酵母α交配因子信號序列的核苷酸序列，并通過PCR擴增。用上游引物(alpsynt)和下游引物(cbss.alps)最終擴增α信號序列，其中設計上游引物具有適于克隆目的的EcoRI限制性內(nèi)切酶位點，設計下游引物具有合成的脂肪分解酶基因5′端的最5′序列以允許框內(nèi)融合(表8)。為了將合成的α因子信號序列融合到合成的脂肪分解酶基因，混合這兩種片段，并用外引物alpsynt和cbss.t重新擴增(表8)。將PCR產(chǎn)物克隆入載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)，并使用BigDyeTerminatorv3.0循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems)和ABIPrism3100Genetic分析儀(AppliedBiosystems)測定插入片段的核苷酸序列。表8.用于擴增和組裝合成的異孢鐮孢(CBS782.83)的脂肪分解酶基因和合成的α信號序列的引物序列。下劃線的是導入的、用于克隆目的的限制性內(nèi)切酶位點。所包括的允許合成的脂肪分解酶基因和合成的α信號融合的核苷酸加以雙下劃線。脂肪分解酶在多態(tài)漢遜酵母中的表達。將組合的α信號序列/脂肪分解酶基因在FMD啟動子之后插入漢遜酵母表達載體pB14(無抗生素抗性基因的質(zhì)粒)，來在漢遜酵母表達合成的異孢鐮孢(CBS782.93)脂肪分解酶基因。在E.coli中形成期望的組裝質(zhì)粒結(jié)構(gòu)后，將質(zhì)粒通過電穿孔法轉(zhuǎn)化入感受態(tài)多態(tài)漢遜酵母細胞。在YND平板上篩選轉(zhuǎn)化子，并通過在YND液體培養(yǎng)基中以1∶200稀釋度傳代3次和8次，進一步選擇基因多次整合的菌落。最后，通過在YPD培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移兩次，來穩(wěn)定選擇的培養(yǎng)物。為了進一步選擇高表達的培養(yǎng)物，將顯示高水平表達的各個培養(yǎng)物鋪平板以形成單個菌落，其中測定每個菌落的表達水平。為了確定脂肪分解酶基因的表達水平，將選擇的克隆在含1.8％甘油和0.2％葡萄糖的YPD中于24℃培養(yǎng)2天。酶活性分析培養(yǎng)基樣品對作為底物的卵磷脂或DGDG的脂肪分解酶活性，并使用等比例縮小至適于微滴度板的體積的NEFA試劑盒(Roche)來測定釋放的游離脂肪酸。結(jié)果根據(jù)MALDI-TOF的酶促指紋圖譜和氨基酸測序已經(jīng)確定異孢鐮孢脂肪分解酶的整個氨基酸序列(參見SEQIDNo.1，圖37)。用胰蛋白酶進行酶切消化，可得到可被明確測定分子量(MALDI-TOF)的非常具體的肽。也通過Edman降解法測定所有肽的氨基酸序列。通過Edman裂解法測定的氨基酸序列包含異孢鐮孢(CBS782.83)脂肪分解酶的99.64％多肽鏈。將所有肽的氨基酸序列比對異孢鐮孢日本株的脂肪酶(Nagao等，1994J.Biochem.116536-540)，由此表明鑒定成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列的肽排序。圖7顯示了比對。表9顯示MALDI-TOF和Edman降解法的研究概要，其中根據(jù)與Nagao序列的比對進行肽排序。表9.通過Edman裂解來自異孢鐮孢(CBS782.83)脂肪分解酶的胰蛋白酶肽，對整個氨基酸序列進行酶促指紋圖譜和分子量測定。由Edman降解法確定的肽序列標示為+。氧化色氨酸表示為*。序列覆蓋度＝99.64％。與其它鐮孢屬脂肪酶的同一性異孢鐮孢(CBS782.83)脂肪分解酶的氨基酸和核苷酸序列與來自其它鐮孢菌屬脂肪酶的序列對比，顯示在一些鐮孢菌屬脂肪酶之間的關(guān)系(表10)。表10.異孢鐮孢(CBS782.83)脂肪分解酶與其它鐮孢菌屬脂肪酶相比的氨基酸和核苷酸同一性。對脂肪分解酶基因和α信號序列的合成寡核苷酸進行混合和PCR擴增，產(chǎn)生被克隆和測序的DNA片段。使用表8所示的引物并通過重擴增，將含有正確序列的片段用于組裝全長基因。圖8中顯示具有其翻譯的氨基酸序列的、組裝的核苷酸序列，并用箭頭表示引物。利用導入的限制性內(nèi)切酶位點，將含有組裝的基因構(gòu)建體的DNA片段轉(zhuǎn)移入漢遜酵母表達載體pB14。圖9圖解顯示得到的質(zhì)粒pB14-alps.cbss。在選擇的克隆中，真菌脂肪分解酶活性的表達。對于已經(jīng)過選擇處理的克隆，分析脂肪分解酶的表達。將培養(yǎng)2天的培養(yǎng)物上清的10微升樣品與DGDG或卵磷脂溫育10分鐘，并通過NEFA試劑盒分析10微升的這些反應。圖10中顯示單菌落分離后，在克隆中的3個克隆結(jié)果。已測定來自異孢鐮孢(CBS782.83)株的脂肪分解酶的氨基酸序列，并已構(gòu)建和優(yōu)化了編碼該脂肪分解酶的合成基因以適于在多態(tài)漢遜酵母中表達。將編碼成熟酶的基因融合于衍生于酵母交配α因子的合成信號序列。以前已描述了α信號序列聯(lián)合漢遜酵母pB14載體的FMD啟動子，可適于表達鐮孢屬的脂肪酶。實施例3異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶在多態(tài)漢遜酵母中的表達和產(chǎn)物在烘烤試驗中的鑒定以補料分批法，對含有來自絲狀真菌異孢鐮孢CBS782.83的脂肪分解酶編碼基因的多態(tài)漢遜酵母株B148-3，8(DCDK0172)進行發(fā)酵。發(fā)酵160小時后，磷脂酶活性達到1200U/mL?；诎l(fā)酵制備了三種產(chǎn)物和進一步測試。將產(chǎn)物稱為下列樣品205、-206和-209。在小規(guī)模烘烤實驗中，測試來自異孢鐮孢的、在H.polymorpha表達的脂肪分解酶樣品205。通過氣液色譜和高效薄層色譜分析烘烤實驗中的生面團。小規(guī)模烘烤得到的烘烤結(jié)果證實脂肪分解酶樣品205對面包體積和團粒結(jié)構(gòu)有很強的改善作用。脂肪分解酶分析證實脂肪分解酶樣品205對雙半乳糖甘油二酯(DGDG)具有強水解活性，同時伴隨雙半乳糖甘油一酯(DGMG)的累積。該酶對生面團中甘油三酯僅有較小活性。在試驗規(guī)模烘烤試驗中，測試樣品206和樣品209，并證實對于增加面包體積和改善團粒結(jié)構(gòu)而言，脂肪分解酶具有良好的烘烤性能。根據(jù)烘烤試驗表明在直接面團法中，樣品206表現(xiàn)稍好于樣品209，然而這兩種產(chǎn)物并沒有進行直接相互比較，因此必須進行更多的烘烤試驗來證實這點。2.實驗發(fā)酵微生物本研究使用如在實施例2中所述通過含有來自異孢鐮孢CBS782.83的脂肪分解酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的H.polymorpha株。構(gòu)建物中用到的啟動子是來自H.polymorpha的甲酸脫氫酶啟動子。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件YNB甘油培養(yǎng)基用于制備生物反應器發(fā)酵接種物和用于在搖瓶中培養(yǎng)的培養(yǎng)基含有1.7g/L酵母氮基(YeastNitrogenBase)(DIFCO，底特律，美國，0335-15-9)、5g/L(NH4)2SO4、10g/L甘油、以及作為緩沖液的0.1M2-[N-嗎啉代]乙磺酸(MES)。用4MNaOH調(diào)節(jié)pH至6.1(MES的pKa)(高壓滅菌前)。高壓滅菌后，酵母氮基和(NH4)2SO4經(jīng)過濾除菌加至培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基用于在搖瓶中培養(yǎng)(在總體積500mL的搖瓶中，加250mL培養(yǎng)基)。YNB瓊脂用于存貯培養(yǎng)物(在25％(w/v)甘油中于-80℃保藏)鋪平板的確定成份培養(yǎng)基含有1.7g/L酵母氮基(DIFCO，底特律，美國，0335-15-9)、5g/L(NH4)2SO4、10g/L甘油、以及20g/L瓊脂(DIFCO，底特律，美國，0140-01)。高壓滅菌后將酵母氮堿和(NH4)2SO4經(jīng)過濾除菌加至培養(yǎng)基。YPD培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基用于在發(fā)酵罐中檢查污染。培養(yǎng)基含有10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨以及20g/L甘油。發(fā)酵研究中實施三次發(fā)酵HET0401、HET0402以及HET0410，所有使用上述的菌株。在三次發(fā)酵之間的差異在于分批培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基的成分。對于三次發(fā)酵而言，其它所有參數(shù)都相同。用于在6L發(fā)酵罐中發(fā)酵的分批培養(yǎng)基(3L)含有13.3g/LNH4H2PO4、3.0g/LMgSO4H2O、3.3g/LKCl、0.3g/LNaCl、15g/L甘油、以及3mL/LADDAPTFoamstopSin260(ADDAPTChemicalsAG、Helmond、荷蘭)、1.0g/LCaCl22H2O、67mg/L(NH4)2Fe(SO4)26H2O、5mg/LCuSO45H2O、20mg/LZnSO47H2O、21mg/LMnSO4H2O、67mg/LEDTA)、0.65mg/LNiSO46H2O、0.65mg/LCoCl2、0.65mg/LH3BO4、0.65mg/LKI、0.65mg/LNa2MoO42H2O)、2mg/LD-生物素以及0.67g/L鹽酸氯化硫胺素。除上述分批培養(yǎng)基之外，發(fā)酵HET0402在分批培養(yǎng)基中含有10g/L蛋白胨。除上述分批培養(yǎng)基之外，發(fā)酵HET0410在分批培養(yǎng)基中含有10g/LBacto胰蛋白胨。補料培養(yǎng)基HET0401和HET0402補料培養(yǎng)基含有635g/kg甘油和130g/kg甲酸。補料培養(yǎng)基HET0410補料培養(yǎng)基含有570g/kg甘油，120g/kg甲酸以及95g/kgBacto胰蛋白胨。通過添加25％(w/v)氨水控制pH。在公司自己建造的6L發(fā)酵罐中以補料分批法進行發(fā)酵。使用下列發(fā)酵條件pH5、通風1vvm、溫度26℃并以400至700rpm進行攪拌。用在25℃和180rpm下生長的、并具有OD600約為10的2*250mLYNB甘油培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐。在發(fā)酵中，根據(jù)釋放的二氧化碳積累量以及根據(jù)下列方程式來控制補料流速Feed-flow[g/h]＝0，AcCO2＜0.45Feed-flow[g/h]＝1.33·V·AccCO2，0.45≤AccCO2≤3.25Feed-flow[g/h]＝4.33·V，3.25≤AccCO2VThefermemationbrothvolume[L]AccCO2TheaccumulatedCO2evolution[moles]收集通過在16000×g離心10分鐘、隨后將上清經(jīng)過來自GelmanLaboratory的0.2μm濾菌器(VacuCap90FilterUnitw0.8/0.2μmSuporMembrane)進行過濾除菌，來收集發(fā)酵物。產(chǎn)物于4℃保存直到用于烘烤試驗。分析步驟脂肪酶活性的測定將發(fā)酵樣品(10mL)在9000×g離心10分鐘，并根據(jù)本文前面所教導的“PLU分析”將上清用于分析磷脂酶活性。生物量生長通過將10mL培養(yǎng)液在預稱重容器中以9000×g離心10分鐘，來測定培養(yǎng)液中的生物量濃度。離心后，除去上清并將生物量在100℃干燥24小時然后稱重。以每升培養(yǎng)液的細胞干重g來計算生物量濃度。酶鑒定和小烘烤試驗酶和面粉樣品205來自HET0401的樣品7(發(fā)酵161小時)磷脂酶LipopanF，#2938面粉改良(Reform)2003055小烘烤試驗將下列組分加入50gBrabrender混料罐并在30℃揉捏5分鐘50g面粉、10g干酵母、0.8g糖、0.8g鹽、70ppm抗壞血酸以及水(直至400Brabender單位的生面團稠度)。在34℃靜置10分鐘。每個生面團稱取15g的生面團。然后在可將生面團在木板和有機玻璃框之間進行滾軋的特殊裝置上進行鑄模。將生面團在罐中于34℃下發(fā)面45分鐘，并在Voss家庭烤箱中于225℃下烘烤8分鐘。烘烤后，面包冷卻至室溫放置20分鐘后，稱取面包，并通過菜籽取代法測定體積。也可切開面包，以用于評價團粒以及面包皮。提取脂質(zhì)立刻冰凍10g經(jīng)充分發(fā)面的生面團并且冷凍干燥。在咖啡磨碎機中磨碎冷凍干燥的生面團，并穿過800微米篩。稱取1.5g冷凍干燥的生面團放入有螺旋蓋的15mL離心管。加入7.5ml水飽和的丁醇(WSB)。將離心管放入沸水浴槽10分鐘。將離心管放入Rotamix并以45rpm于室溫旋轉(zhuǎn)20分鐘。然后再次放入沸水浴槽10分鐘并于室溫開啟Rotamix30分鐘。以3500g將管離心5分鐘。將5ml上清轉(zhuǎn)入小管中。在氮蒸汽中蒸干WSB。氣相色譜根據(jù)以上實施例1中的分析步驟所述，實施氣相色譜。高效薄層色譜進樣器LINOMAT5，CAMAG進樣器。高效薄層色譜板10×10cm，Merckno.1.05633使用前，將色譜板在烤箱中于180℃干燥20-30分鐘。進樣使用LINOMAT5進樣器，將1.0μL1％的于CHCl3∶MeOH＝85∶15中的溶液加到高效薄層色譜板上。洗脫緩沖液No.IV氯仿∶甲醇∶H2O(65∶25∶4)No.IP-醚∶甲基叔丁醚(MTBE)∶乙酸(60∶40∶1)進樣/洗脫時間洗脫緩沖液I11分鐘，洗脫緩沖液IV18分鐘。將色譜板在烤箱于180℃干燥10分鐘，冷卻并在6％乙酸銅、16％H3PO4中顯色。在180℃額外干燥10分鐘并直接評價。烘烤試驗待測產(chǎn)物#3016-含8700LIPU/g的LipopanFID菌株/宿主發(fā)酵樣本206，含390LIPU/g異孢鐮孢/H.polymohaHET0401+HET0402樣本209，含950LIPU/g異孢鐮孢/H.polymorphaHET0410配方用改良面粉2003159制備硬殼卷Bakers％數(shù)量，g面粉-改良20031591002000水58.51170干酵母6120鹽1.632糖1.632抗壞血酸10ppm0.02標準α淀粉酶GRINDAMYLTMA100090ppm0.180烘烤步驟Diosna攪拌器系統(tǒng)·緩慢干拌1分鐘·緩慢攪拌2分鐘+快速攪拌4分鐘·發(fā)面溫度26℃·稱取1350g·在加熱箱中靜置10分鐘·鑄模Fortuna3/17/7·發(fā)面45分鐘，34℃，85％相對濕度·烘烤Bago烤箱中，220℃處理13分鐘，蒸汽處理13秒鐘+放汽處理5分鐘·MIWEstonedeckprog.nrl·烘烤后，在稱重和測定體積之前，硬殼卷冷卻25分鐘。結(jié)果與討論發(fā)酵生理學和磷脂酶產(chǎn)生與HET0401-0402相比，將胰蛋白胨加入HET0410的分批培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基，可引起生物量的快速生成并最終得到較高水平的生物量。就磷脂酶活性產(chǎn)生而言，HET0401和HET0402幾乎是相同的，然而在HET0410中磷脂酶生產(chǎn)率明顯更高。收集在發(fā)酵168小時(HET0401-0402)和161小時(HET0410)后，收集發(fā)酵物。將產(chǎn)物保存于4℃直至用于烘烤試驗中。將HET0401的一些產(chǎn)物稱為樣品205，其含有約700PLU-7/mL。將來自HET0401和HET0402的一些產(chǎn)物集中一起，并稱為樣品206。該產(chǎn)物含有約390PLU-7/mL。與HET0401和HET0402的終產(chǎn)物相比，樣品206的酶活降低，可由貯存和過濾除茵所引起。將HET0410的產(chǎn)物稱為樣品209，其含有約950PLU-7/mL。酶鑒定和小烘烤試驗在小烘烤試驗中，測試來自發(fā)酵物HET0401的脂肪分解酶樣品205。以不同劑量與對照和LipopanFTM相比。表11顯示該烘烤試驗中，面包的具體體積。圖11中顯示了這些面包的照片。表11在小烘烤試驗中，來自異孢鐮孢的脂肪分解酶(樣品205)。對面包體積的影響。烘烤結(jié)果證實樣品205對改善面包體積具有很強的效果，并且在40ppm的標準劑量時，其體積效果優(yōu)于LipopanFTM。從圖11也可得知，樣品205有助于大力改善團粒結(jié)構(gòu)和色澤。將來自該烘烤試驗的、已充分發(fā)面的生面團進行冷凍干燥，并用水飽和的丁醇進行提取，以及通過氣液色譜和高效薄層色譜分析分離的脂質(zhì)。生面團脂質(zhì)的氣液色譜分析(表12)證實脂肪分解酶樣品205伴隨雙半乳糖甘油一酯(DGMG)累積的對雙半乳糖甘油二酯(DGDG)的水解效果。該酶對DGMG的活性相當?shù)?，因為DGDG(mmol％＝mmol/100g冷凍干燥生面團)和DGMG(mmol％)的總摩爾量在酶量增加時保持不變。氣液色譜結(jié)果也表明樣品205對甘油三酯的極低活性。表12生面團脂質(zhì)的氣液色譜分析。FFA＝游離脂肪酸。MGMG＝單半乳糖甘油一酯。DGMG＝雙半乳糖甘油一酯。MGDG＝單半乳糖甘油二酯。DGDG＝雙半乳糖甘油二酯。TRI＝甘油三酯。mmol％＝mmol/100g凍干的生面團比較烘烤結(jié)果和脂質(zhì)分析結(jié)果，有趣的是注意到將DGDG完全水解成DGMG卻得不到最好的烘烤效果，但結(jié)果表明將DGDG部分水解成DGMG，可產(chǎn)生最好的烘烤性能。高酶量產(chǎn)生更多的DGMG，但也會產(chǎn)生更多的游離脂肪酸，這預計會產(chǎn)生負面的烘烤效果，這就是為什么優(yōu)選僅僅部分水解DGDG的另一種解釋。表13顯示從表12計算得到的DGDG與甘油三酯的比值。比較結(jié)果說明當使用DGDG對甘油三酯活性的比例是最大時的劑量，可獲得最好的烘烤效果。表13.來自氣液色譜分析生面團脂質(zhì)的DGDG和甘油三酯水解的比例如圖13所示，也可通過高效薄層色譜分析一些脂質(zhì)樣品。樣品4、樣品5和樣品6是來自烘烤試驗的生面團脂質(zhì)。高效薄層色譜分析證實，脂肪分解酶樣品205可水解DGDG并形成DGMG。使用上文教導的測定法，LipopanF和樣品209的極性脂質(zhì)甘油三酯的相對活性比是磷脂/甘油三酯(PLU/LIPU)LipopanF＝3樣品209＝9半乳糖脂/甘油三酯(GLU/LIPU)LipopanF＝1樣品209＝4在小規(guī)模烘烤試驗中，異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶可產(chǎn)生具有強烈地增加面包體積和改善團粒結(jié)構(gòu)的很好效果。在生面團中，脂質(zhì)分析證實了伴隨DGMG的累積的對DGDG的強水解活性。在生面團中，異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶表現(xiàn)對甘油三酯的低活性。實施例4.對在多態(tài)漢遜酵母中表達的異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶的脂質(zhì)底物的活性鑒定和位點特異性。如在實施例3中所述，在多態(tài)漢遜酵母中表達來自異孢鐮孢的、根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。分析步驟利用本文前述的“PLU分析法”，測定磷脂酶活性。利用本文前述的半乳糖脂酶測定法，測定半乳糖脂酶活性。利用本文前述的LIPU測定法，測定甘油三酯(三丁酸甘油酯)的活性。對葵花籽油(LUSol，pH-statpH6)的活性試劑將8.4阿拉伯樹膠溶于100ml去離子水中并加入100ml30mMCaCl2。在用Turrax攪拌器進行混合的期間(20000rpm)，緩緩加入36g葵花籽油。)測試在量杯中，將20ml向日葵油乳劑在30℃中平衡5分鐘。用pH恒定器調(diào)節(jié)pH至6.3-6.5。加入2毫升酶液，并連續(xù)加入0.05NNaOH并將pH在6.5保持10分鐘。計算作為時間函數(shù)的、加入的0.05NaOH的曲線斜率。1LUSol定義為在測定條件下每分鐘可釋放1μmol脂肪酸的酶量。根據(jù)上述的方法，分析脂肪分解酶對不同底物的活性。結(jié)果如表14所示。表14.根據(jù)本發(fā)明的異孢鐮孢脂肪分解酶對不同脂質(zhì)底物的活性。在生面團中，在多態(tài)漢遜酵母中表達的異孢鐮孢脂肪分解酶主要在半乳糖脂和磷脂的sn-1位點水解脂肪酸。通過將不同濃度的酶加入面包生面團，來研究酶的特異性。將已充分發(fā)面的生面團進行冰凍及冷凍干燥，并用水飽和的丁醇抽提生面團脂質(zhì)。通過氣液色譜和高效液體色譜分析法來分析生面團脂質(zhì)。根據(jù)氣液色譜分析，有可能分析雙半乳糖甘油二酯(DGDG)和雙半乳糖甘油一酯(DGMG)。還有可能分析雙半乳糖甘油一酯(1雙半乳糖1-甘油一酯和2雙半乳糖2-甘油一酯，參見以下結(jié)構(gòu)式)的位點異構(gòu)體。通過氣液色譜分離并定量這些組分。1R1＝H，R2＝脂肪?；?R1＝脂肪?；?，R2＝H在烘烤試驗中，為了生產(chǎn)硬殼卷，加入不同劑量的脂肪分解酶，并在已充分發(fā)面的生面團中分析半乳糖脂。表15顯示了和圖14圖解說明了異構(gòu)體雙半乳糖甘油一酯的總量。表15.在烘烤測試中，使用異孢鐮孢脂肪分解酶的異構(gòu)體雙半乳糖甘油一酯的總量。結(jié)論根據(jù)表15和圖14的結(jié)果，可以得出結(jié)論說，在生產(chǎn)雙半乳糖2-甘油一酯期間，雙半乳糖甘油二酯主要在1-位點發(fā)生水解。也觀測到雙半乳糖1-甘油一酯的少量增加。眾所周知，在脂質(zhì)中將發(fā)生酰基脂肪酸從2位點到1位點的?；D(zhuǎn)移作用。該?；D(zhuǎn)移作用取決于溫度，并且在雙半乳糖-2-甘油一酯與雙半乳糖1-甘油一酯之間存在作為時間函數(shù)的平衡。該現(xiàn)象可解釋也觀測到雙半乳糖1-甘油一酯的少量增加的事實。實施例五.測定衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶的最適溫度和穩(wěn)定性。在各種溫度下，根據(jù)如下所述的改良PLU-7法，測定衍生于F.Heterosporum的、并在多態(tài)漢遜酵母中表達的噴霧干燥的脂肪分解酶的酶活。底物是0.6％磷脂酰膽堿、0.4％TritonX-100、6mMCaCl2、50mMHEPES(pH7.0)的乳狀液。用脫礦質(zhì)水將噴霧干燥的脂肪分解酶酵素(ferment)稀釋至3TIPU/ml。將400μl底物在10、20、30、40、50、45、50和60℃恒溫加熱5分鐘，并加入50μl樣品。剛好10分鐘后，通過在99℃溫育另一個10分鐘來終止酶反應。最后，通過NEFAC法(WakoChemicalsGMbH，Neuss，德國)測定游離脂肪酸量。根據(jù)制造商的方法，制備顯色劑A和顯色劑B。將10μl再分散抽提的脂質(zhì)和100μl試劑A移液到微量滴定板，并在37℃溫育10分鐘。將200μl試劑B加到微量滴定板上并在37℃溫育10分鐘。測定540nm的吸光度。使用讀出的吸光度和基于油酸的標準曲線，測定游離脂肪酸量。結(jié)果如圖15所示。在各種溫度下測定噴霧干燥的脂肪分解酶酵素的酶穩(wěn)定性。用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)將噴霧干燥的脂肪分解酶酵素稀釋到3TIPU/ml。在20、30、37、40以及45℃中溫育30分鐘后，將樣品在冰上保存。隨后，根據(jù)如下所述的改良PLU-7法測定磷脂酶活性。底物是0.6％磷脂酰膽堿、0.4％TritonX-100、以及50mM磷酸鹽緩沖液的乳狀液。省去CaCl2以防止磷酸鈣的沉淀，這并不影響酶活。在37℃將400μl底物恒溫加熱5分鐘，并加入50μl樣品。剛好10分鐘后，通過在99℃溫育另一個10分鐘來終止酶反應。最后，根據(jù)NEFAC法(WakoChemicalsGmbH，Neuss，德國)測定游離脂肪酸量。根據(jù)制造商的方法制備顯色劑A和顯色劑B。將10μl再分散抽提的脂質(zhì)和100μl試劑A移液到微量滴定板，并在37℃溫育10分鐘。將200μl試劑B加到微量滴定板上并在37℃溫育10分鐘。測定540nm的吸光度。使用讀出的吸光度和基于油酸的標準曲線，測定游離脂肪酸量。結(jié)果如圖16所示。實施例6.確定衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶的最適pH和穩(wěn)定性。在各種pH下測定衍生于異孢鐮孢并在漢遜酵母Polymorpha中表達的噴霧干燥的脂肪分解酶的酶活。底物是0.6％磷脂酰膽堿、0.4％TritonX-100、以及50mM磷酸鹽緩沖液(pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0以及10.0)的乳狀液。省去CaCl2以防止磷酸鈣的沉淀，這并不影響酶活。用脫礦質(zhì)水將噴霧干燥的脂肪分解酶酵素稀釋至3TIPU/ml。在37℃將400μl底物恒溫加熱5分鐘，并加入50μl樣品。剛好10分鐘后，通過在99℃溫育另一個10分鐘來終止酶反應。最后，根據(jù)NEFAC法(WakoChemicalsGmbH，Neuss，德國)測定游離脂肪酸量。根據(jù)制造商的方法制備顯色劑A和顯色劑B。將10μl再分散抽提的脂質(zhì)和100μl試劑A移液到微量滴定板，并在37℃溫育10分鐘。將200μl試劑B加到微量滴定板上并在37℃溫育10分鐘。測定540nm的吸光度。使用讀出的吸光度和基于油酸的標準曲線，測定游離脂肪酸量。結(jié)果如圖[17]所示。在各種pH下測定噴霧干燥的脂肪分解酶酵素的酶穩(wěn)定性。用pH4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0以及10.0的50mM磷酸鹽緩沖液將噴霧干燥的脂肪分解酶酵素稀釋至3TIPU/ml。在37℃溫育30分鐘后，將樣品在冰上保存。隨后，根據(jù)如下所述的改良PLU-7法測定磷脂酶活性。底物是0.6％磷脂酰膽堿、0.4％TritonX-100、以及50mM磷酸鹽緩沖液(pH7)的乳狀液。省去CaCl2以防止磷酸鈣的沉淀，這并不影響酶活。在37℃將400ul底物恒溫加熱5分鐘，并加入50μl樣品。剛好10分鐘后，通過在99℃溫育另一個10分鐘來終止酶反應。最后，根據(jù)NEFAC法(WakoChemicalsGmbH，Neuss，德國)測定游離脂肪酸量。根據(jù)制造商的方法制備顯色劑A和顯色劑B。將10μl再分散抽提的脂質(zhì)和100μl試劑A移液到微量滴定板，并在37℃溫育10分鐘。將200μl試劑B加到微量滴定板上并在37℃溫育10分鐘。測定540nm的吸光度。使用讀出的吸光度和基于油酸的標準曲線，測定游離脂肪酸量。結(jié)果如圖18所示。實施例7.測定衍生于異孢鐮孢的純化脂肪分解酶的分子量。將衍生于異孢鐮孢的、根據(jù)本發(fā)明的純化脂肪分解酶在SDS-PAGE膠上電泳(圖19a和圖19b)。如表15所示，根據(jù)Novex標準指示物計算分子量。表15測定根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的分子量。計算出脂肪分解酶分子量是29.9kDa。實施例8.測定衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶的等電點(pI)。根據(jù)氨基酸序列SEQIDNO.6，理論上測定衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶的等電點(pI)。使用來自Informax(Invitrogen，CA，美國)的軟件VectorNTISuite9進行計算，結(jié)果是pI＝6.40。實施例9.在不同溫度下，通過異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶，鑒定在蛋黃中卵磷脂向溶血卵磷脂的酶轉(zhuǎn)化。通過釋放游離脂肪酸，脂肪分解酶可將卵磷脂(磷脂酰膽堿)轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂(溶血磷脂酰膽堿)。在蛋黃中，卵磷脂酶轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂可產(chǎn)生更好的乳化性質(zhì)，因為溶血卵磷脂是比卵磷脂更好的乳化劑。當制作耐熱的蛋黃醬及其他食品和食物應用時，例如但不限于蛋糕和乳酪的成熟，蛋黃的良好乳化性質(zhì)很重要。酶的制備將來自發(fā)酵物HET0420的、并在多態(tài)漢遜酵母中表達的異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶在小麥淀粉上進行噴霧干燥。通過本文以前所述的TIPU測定法，確定得到的酶制劑具有1265U/g的磷脂酶活性。通過將噴霧干燥的酶粉溶于脫礦質(zhì)水中，制備10％(w/v)或20％(w/v)酶儲液。攪拌15分鐘后，將溶液在1370×g離心五分鐘。上清作為酶儲液。酶反應建立兩種不同實驗來確定用于在蛋黃中將卵磷脂酶轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂的酶量、反應溫度和反應時間的最適組合。在第一個實驗中，用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在下列三種溫度下實施酶反應30℃、40℃和50℃，每個反應使用下列四種劑量5U/g蛋黃、10U/g蛋黃、20U/g蛋黃以及30U/g蛋黃。在第二個實驗中，分別使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶和來自NovozymesA/S(丹麥)的LecitaseUltra，在下列五種溫度下并使用30U/g蛋黃的酶量，實施酶反應5℃、10℃、15℃、20℃、以及53℃。在53℃下，也測試60U/g蛋黃的酶量。在兩種實驗中，將來自DanAEg(Christiansfeld，丹麥)的10.0g巴氏殺菌的蛋黃轉(zhuǎn)入Wheaton管中，并放入加熱塊恒溫箱直至合適的溫度。在磁力攪拌器上連續(xù)地混合樣品。當時間t＝0時，將酶儲液加入根據(jù)表16的蛋黃中。重復實施每個實驗。從根據(jù)表17的蛋黃/酶液取出1.0g樣品。根據(jù)表17的時間進行溫育后，在樣品中加入7.5ml有機溶劑(CHCl3∶MeOH＝2∶1)來終止酶促反應。表[16]將酶儲液加入蛋黃直至獲得不同酶量，包括對照。加入脫礦質(zhì)水至總量2.35ml來忽略在加入不同體積酶儲液后的任何體積差異。表[17]在不同實驗中，樣品提取物的反應時間。提取脂質(zhì)加入7.5ml有機溶劑(CHCl3∶MeOH＝2∶1)至樣品中不但終止酶反應，而且提取脂質(zhì)。此外，在用Whirley攪拌器分散樣品1分鐘之前，加入0.2ml脫礦物質(zhì)水。然后以110×g將樣品離心十分鐘。將約3ml有機相轉(zhuǎn)入另一個管中，并將該提取的脂質(zhì)用于各種分析。樣品保存于-18℃。游離脂肪酸的測定在氮氣中于50℃蒸發(fā)100μl提取的脂質(zhì)溶液。加入1.0ml脫礦質(zhì)水并用Whirley攪拌器分散脂質(zhì)。使用來自WAKOChemicalsGmbH(Neuss，德國)的NEFAC試劑盒測定游離脂肪酸量。根據(jù)制造商的方法制備顯色劑A和顯色劑B。將10μl再分散的提取脂質(zhì)和100μl溶液A移液到微量滴定板。將平板在37℃溫育10分鐘。將200μl溶液B加入微量滴定板，并將平板在37℃溫育10分鐘。測量540納米的吸光度。使用讀出的吸收度和基于油酸的標準曲線，測定游離脂肪酸量。通過LC/MS-MS測定卵磷脂和溶血卵磷脂材料丙酮、甲醇、氯仿全部來自LabScan(都柏林，愛爾蘭)，96％乙醇來自DeDanskeSpritfabrikker，以及甲酸來自AppliChem(Darmstadt，德國)。儀器高效液體色譜系統(tǒng)由四級泵(G1311A)、毛細泵(G1376A)、自動進樣器(G1377A)、以及柱室(G1316A)組成，所有都來自AgilentTechnologies(Waldbronn，德國)。使用來自LCPackings(Amsterdam，荷蘭)的AcurateTM流體分流器(ACM-CU-CR)來將層析柱流出物分流到質(zhì)譜儀，并導入極性補充溶劑。質(zhì)譜儀是來自ThermoFinnigan(SanJose，CA，美國)的LCQDeca離子阱。層析柱是來自ThermoHypersil-Keystone的HypersilSI，100×4.6mmid，5μm。色譜分析和MS條件流動相A不使用B氯仿C甲醇/甲酸(1000/0，190)D氯仿/甲醇/水/甲酸(300/550/150/0，190)補充物乙醇96％注射體積是5μl，柱溫是45℃。流體分流器LC-流速0.60ml/分鐘補充物流速100μl/分鐘ELSD/FC管100cm×0.100mmid(SS)MS管100cm×150μm(FS-150-MS)分流比(split)是約20∶1MS條件MS參數(shù)設置MS檢測器設置標準和樣品制備溶血磷脂酰膽堿(LPC)(蛋，雞)(89865)和磷脂酰膽堿(PC)(植物)(441601)來自AvantiPolarLipids，Inc，Alabaster，AL，美國。制備PC和LPC儲液(10mg/20mlCHCl3/MeOH)。制備本文中的稀釋度以包括50μg/ml到2.5μg/ml濃度范圍。將從1g蛋黃提取的7.5μl脂質(zhì)在1.5mlCHCl3∶MeOH(1∶1)中進行重建。薄層色譜分析如實施例1中所述，實施薄層色譜分析。為了觀察不同的甘油酯，通過自動的薄層色譜進樣器4(CAMAG)將2μl脂質(zhì)提取物以3mm帶加到高效薄層色譜二氧化硅60板(Merck)中。將二氧化硅板放入具有洗脫緩沖液I(P-醚∶甲基叔丁醚∶乙酸(50∶50∶1))的水平顯色室(CAMAG)中。將20ml洗脫緩沖液用于氣相，5ml用于洗脫板，并且洗脫板直到距離上樣位置約5cm處。將板在加熱櫥(160℃)中干燥5分鐘。最后，將薄層色譜板浸在顯色劑(在16％水性H3PO4中的6％Cu(CH3COO)2)并在加熱櫥(160℃)碳化10分鐘。結(jié)果為了確定用于在蛋黃中將卵磷脂酶轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂的酶量、反應溫度和反應時間的最適組合，在三種不同溫度和五種不同反應時間下測試四種不同酶量。根據(jù)本文未包括的初期試驗，四種酶量使用5U/g、10U/g、20U/g、30U/g，以及反應時間使用30分鐘、60分鐘、120分鐘、240分鐘、360分鐘。參見圖20，根據(jù)適于脂肪分解酶的最適溫度曲線，三種溫度選擇30℃、40℃和50℃。通過高效液體色譜和圖21和圖22所述，分析作為反應時間的函數(shù)的、在酶處理的蛋黃中卵磷脂量和溶血卵磷脂量。在圖23中，在酶處理的蛋黃中游離脂肪酸量被描述為反應時間的函數(shù)。實驗表明對于根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶將卵磷脂轉(zhuǎn)化成溶血卵磷脂而言，最適的是使用20U/g蛋黃的脂肪分解酶在30℃下反應120分鐘。選擇20U/g蛋黃量應歸于在30U/g蛋黃反應120分鐘到反應240分鐘期間，觀察到LPC水平的下降。根據(jù)該結(jié)果，檢驗根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶和LecitaseUltra在溫度低于30℃時是否對蛋黃脂質(zhì)起作用，并比較它們在53℃時的活性，所述的53℃是目前工業(yè)上使用LecitaseUltra的溫度。在蛋黃中，測試在五種不同溫度(5℃、10℃、15℃、20℃以及53℃)和六種不同反應時間時卵磷脂對溶血卵磷脂的酶轉(zhuǎn)化。測試30U/g蛋黃的酶量，因為涉及酶成本的緣故這是商業(yè)目的中最高的劑量，并且因為在該測試溫度下預計反應速率很低。通過TIPU測定所有已提到的酶單位。30U/g蛋黃也是LecitaseUltra的推薦劑量。此外，在53℃下測試60U/g蛋黃酶量。使用的反應時間是60分鐘、120分鐘、240分鐘、360分鐘、480分鐘以及1440分鐘。然而，在53℃下反應時間是15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘以及240分鐘。在53℃下使用60U/g樣品時，也可使用330分鐘反應時間。在圖24和圖25中，分別使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶和LecitaseUltra磷脂酶，把在酶處理的蛋黃中溶血卵磷脂量、游離脂肪酸量和卵磷脂量描述為反應時間的函數(shù)。通過LC-MS測定樣品的卵磷脂含量和溶血卵磷脂含量，并通過NEFAC法測定游離脂肪酸含量。如圖24和圖25中所示，對照樣品中的FFA量(結(jié)果未顯示)與溶血卵磷脂和卵磷脂總量在實驗期間保持不變。圖24顯示，用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶對蛋黃進行酶反應的結(jié)果。在53℃時，用30U/g蛋黃反應達到1.7％(w/w)的LPC水平30分鐘后，脂肪分解酶作用停止(圖24b)。分別用30U/g蛋黃和60U/g蛋黃，F(xiàn)FA水平是1.0％(w/w)和1.3％(w/w)。在使用30U/g蛋黃反應240分鐘后，使用LecitaseUltra，在15-240分鐘期間，LPC量和FFA量增加(圖19)，并產(chǎn)生2.7％(w/w)的LPC。在分別使用30和60U/g蛋黃反應240分鐘后，F(xiàn)FA的水平是1.4％(w/w)和2.1％(w/w)。在使用60U/g蛋黃反應330分鐘后，LecitaseUltra作用停止。本發(fā)明的脂肪分解酶比LecitaseUltra具有更高初始反應速率。在20℃和53℃時，初始反應速率與本發(fā)明的的脂肪分解酶相似(圖24)。在溫度5-20℃時，LPC量和FFA量在實驗期間增加。盡管在溫度低于20℃時，初速度隨溫度的降低而顯著地降低。在20℃時，用30U/g蛋黃反應60分鐘后，達到3.3％(w/w)的LPC水平和1.6％(w/w)的FFA水平。該水平與在53℃時用LecitaseUltra反應240分鐘相似。在20℃反應1440分鐘之后，不可能重懸浮用于FFA分析的無溶劑的脂質(zhì)提取物。在5℃和10℃反應1440分鐘之后，帶有脂肪分解酶的樣品具有不能進行攪拌的高度粘性。這很可能歸因于FFA的結(jié)晶。在上述任何實驗中，觀察不到在TN6642中用30U/g蛋黃在30℃下反應120到240分鐘所看到的LPC水平的降低。與LecitaseUltraat在53℃時的初速度相比，在20℃時用LecitaseUltra磷脂酶對蛋黃進行酶反應，可產(chǎn)生明顯下降的初速度和更低的溫度(圖25)。在20℃時，用30U/g蛋黃反應1440分鐘后，達到3.0％(w/w)的LPC水平和1.5％(w/w)的FFA水平。該水平與在53℃反應240分鐘的水平相似。圖26顯示從酶處理的蛋黃提取脂質(zhì)的薄層色譜分析。該分析證實了來自LC-MS的結(jié)果，并表明根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶和lecitaseUltra磷脂酶可提高溶血卵磷脂量。通過脂肪分解酶催化的酶促反應，可產(chǎn)生等量的溶血卵磷脂和游離脂肪酸?？赡艿暮筒槐匾母狈磻歉视腿ｕサ乃夥磻D27中顯示了在酶促反應期間，溶血卵磷脂量和游離脂肪酸量之間的變化關(guān)系。使用LecitaseUltra，可有等量形成溶血卵磷脂和游離脂肪酸的良好相關(guān)性(圖27)。然而，在大多數(shù)用LecitaseUltra處理的樣品中，很少有反應。用本發(fā)明的脂肪分解酶對蛋黃進行酶反應，導致在40mM以上的溶血卵磷脂水平和60mM以上的游離脂肪酸水平時，每形成一個溶血卵磷脂則產(chǎn)生一個以上的游離脂肪酸。使用LecitaseUltra的最大轉(zhuǎn)化率是30mM溶血卵磷脂和25mM游離脂肪酸。表18中顯示，具有游離脂肪酸對溶血卵磷脂的比值低于0.8或高于1.2(n/n)以及LPC含量高于1.0％(w/w)時的樣品。表18具有游離脂肪酸(FFA)對溶血卵磷脂(LPC)比值低于0.8或高于1.2(n/n)以及LPC含量高于1％(w/w)時的樣品。用脂肪分解酶或LecitaseUltra處理樣品。通過NEFAC法測定FFA。通過LC-MS測定LPC和PC。通常在延長的反應時間中或在含有低于1.0％PC(w/w)的樣品中，可發(fā)現(xiàn)具有游離脂肪酸對溶血卵磷脂的比值高于1.2(n/n)和LPC含量高于1.0％(w/w)的樣品。在所有樣品中，脂肪分解酶樣品在15℃時具有提高的游離脂肪酸對溶血卵磷脂比值。這表明在延長的反應時間中或當PC含量低時，酶改變了底物特異性。這可歸因于在蛋黃中發(fā)現(xiàn)了磷脂酰乙醇胺、雙半乳糖甘油二酰酯或甘油三酰酯的水解作用。通常在53℃的反應溫度中，可發(fā)現(xiàn)具有游離脂肪酸對溶血卵磷脂的比值低于0.8(n/n)和LPC含量高于1.0％(w/w)的樣品(表18)。這可通過酯交換反應進行解釋。圖28表明在延長的反應時間或低濃度的PC時，本發(fā)明的脂肪分解酶確實具有對甘油三酰酯和1，3甘油二酰酯的水解活性。1，2甘油二酰酯的累積表明脂肪酶活性是1，3特異性的。甘油一酯的形成表明在20℃時LecitaseUltra具有對甘油三酰酯或甘油二酰酯的水解效應。不可能確定本發(fā)明的脂肪分解酶或LecitaseUltra磷脂酶是否具有最高的甘油三酰酯水解度，這因為LPC的形成水平千差萬別。降低脂肪分解酶的酶量和反應時間可減少水解作用。表18A顯示用于圖28中的泳道1-30中的實驗材料的反應時間、溫度和酶量。表18A對技術(shù)人員顯而易見的是，使用常規(guī)試驗方法，可容易地確定適于任何指定的食物應用的最適酶量、反應溫度和反應時間。結(jié)論使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶和LecitaseUltra磷脂酶，對來自DanAEgA/S的蛋黃進行酶反應，來測定卵磷脂向溶血卵磷脂的轉(zhuǎn)化。在五種溫度下(5-20℃以及53℃)和六種不同反應時間(60-1440分鐘，但在53℃是15-240分鐘)時，使用30U/g蛋黃的酶量，實施該操作以測定酶活性。53℃是目前工業(yè)上使用的、用于LecitaseUltra處理蛋黃的溫度。在所有的測試溫度中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶比LecitaseUltra具有更高的初始反應速率。在53℃時，僅僅反應30分鐘后，脂肪分解酶停止反應。在53℃、以30U/g蛋黃的酶量分別使用脂肪分解酶和lecitaseUltra時，LPC水平是1.7和2.7％(w/w)。在20℃時使用脂肪分解酶僅僅反應60分鐘后，LPC達到3.3％(w/w)的水平。在低溫(5-20℃)下，使用脂肪分解酶，卵磷脂向溶血卵磷脂的轉(zhuǎn)化明顯高于LecitaseUltra。與在15℃和更高溫度相比，在10℃和更低溫度時，脂肪分解酶的反應速度明顯降低。在5℃時脂肪分解酶是有活性的。在反應24小時后，可檢測到形成了超過2％(w/w)的溶血卵磷脂。同樣，與在較高溫度時相比，具有脂肪分解酶的樣品在10℃和更低溫度時更加粘稠。在延長反應時間或當PC含量很低時，發(fā)現(xiàn)脂肪分解酶改變了底物特異性并水解除磷脂之外的磷脂酰-乙醇胺、雙半乳糖甘油二酰酯或甘油三酰酯。通過使用更低的酶量和縮短反應時間可避免該情況，并證實需要徹底優(yōu)化所述每個產(chǎn)品的處理條件。在53℃時，酯交換反應可解釋使用脂肪分解酶和LecitaseUltra，每溶血卵磷脂可產(chǎn)生低于一個當量的游離脂肪酸?？傊鶕?jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是適于在低溫對蛋黃進行酶反應的潛在的候選物。所觀測的低溫活性也用于其它應用中。實施例10.使用異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶制備蛋黃醬蛋黃醬的制備將如實施例4所述制備的6.25g脂肪分解酶溶于50mL脫礦質(zhì)水，這相當于150U/mL的磷脂酶活性。攪拌15分鐘后，將溶液以1370×g離心五分鐘。根據(jù)表19，將上清用于酶反應來自SanofaA/S的150g蛋黃。根據(jù)該表，用LecitaseUltra(NovozymesA/S，丹麥)處理來自SanofaA/S的另一個150g蛋黃。在30℃下通過緩慢攪動180分鐘，來實施酶反應。如實施例4中所述，進行脂質(zhì)提取。表19分別使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶和LecitaseUltra，對來自SanofaA/S的蛋黃進行酶反應。所用的脂肪分解酶溶液具有150U/mL活性，LecitaseUltra具有34500U/mL的磷脂酶活性。使用Koruma攪拌器(DishoV60/10)，通過酶改變來自SanofaA/S的蛋黃來制作蛋黃醬。在加工期間，將蛋黃醬在95℃加熱五分鐘。表20用于制作蛋黃醬的成分。薄層色譜分析如上所述，實施薄層色譜分析。確定蛋黃醬的顆粒大小將2.0g蛋黃醬樣品溶于22.5g0.2％SDS中，并以300rpm攪拌最少30分鐘。然后在MalvernMastersizer上測定顆粒大小分布。結(jié)果為了用酶改變的蛋黃生產(chǎn)蛋黃醬，使用來自SanofaA/S的蛋黃。該蛋黃含有8％鹽(與來自DanAEg的蛋黃的0％相比)。初期試驗(不顯示)表明在來自SanofaA/S的蛋黃中較高鹽濃度影響脂解活力，因此使用30U/g的酶量而不是20U/g。薄層色譜分析經(jīng)酶改變的來自SanofaA/S的蛋黃的脂質(zhì)提取物(圖29)，表明根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶減少卵磷脂量，同時提高溶血卵磷脂量(圖29)。比較起來，當使用LecitaseUltra時，卵磷脂向溶血卵磷脂的轉(zhuǎn)化可以忽略不計。卵磷脂對溶血卵磷脂的高轉(zhuǎn)化率顯示，薄層色譜與對經(jīng)酶改變的來自SanofaA/S的蛋黃的脂質(zhì)提取物的游離脂肪酸測定具有很好的相關(guān)性。使用脂肪分解酶釋放的游離脂肪酸量比使用LecitaseUltra釋放的游離脂肪酸量高3.5倍。表21在經(jīng)酶改變的來自SanofaA/S的蛋黃中的游離脂肪酸量。通過NEFAC法分析游離脂肪酸量，并表示為蛋黃百分率。分析蛋黃醬中油珠的尺寸分布，來評價來自SanofaA/S、不同酶改變的蛋黃的乳化性質(zhì)。從中可知，與通過LecitaseUltra處理的蛋黃或未處理的蛋黃所產(chǎn)生的蛋黃醬相比，通過使用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理蛋黃而產(chǎn)生的蛋黃醬，具有最小平均粒徑以及粒徑分布最窄范圍。小的平均粒徑和粒徑分布窄范圍表明良好的乳化性質(zhì)，因此用脂肪分解酶改變的蛋黃具有最好的乳化性質(zhì)。表22在通過來自SanofaA/S、用酶處理的蛋黃而制作的蛋黃醬中的粒徑分布。為了評價通過酶改變來自SanofaA/S的蛋黃而制備的乳化劑熱穩(wěn)定性，將蛋黃醬在微波爐中加熱4秒鐘。如圖30中所示，含有酶改變蛋黃的蛋黃醬產(chǎn)生耐熱的乳化劑，而含有未處理的蛋黃的對照在微波爐熱處理中被析出，因此乳化劑是不耐熱的。結(jié)論薄層色譜分析和酶修飾來自SanofaA/S的蛋黃的游離脂肪酸的測定，與通過酶改變來自SanofaA/S的蛋黃而制備的蛋黃醬的粒徑分布和熱穩(wěn)定性測試非常相關(guān)。用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶改變的蛋黃，具有卵磷脂向溶血卵磷脂的最高轉(zhuǎn)化率，并具有最高量的游離脂肪酸。正如期望的，卵磷脂溶血卵磷脂的比值改變產(chǎn)生耐熱的并具有最適粒徑分布的蛋黃醬。使用LecitaseUltra來改變來自SanofaA/S的蛋黃，不會對卵磷脂溶血卵磷脂比值或游離脂肪酸高含量帶來很大變化。蛋黃醬的粒徑分布反映了卵磷脂向溶血卵磷脂的轉(zhuǎn)化不顯著，這與未改變的蛋黃的情況相似。然而，使用LecitaseUltra而發(fā)生的卵磷脂溶血卵磷脂比值的變化，足以使蛋黃醬耐熱。在30℃下，用30U/g脂肪分解酶改變來自SanofaA/S的蛋黃120分鐘，可顯示卵磷脂向溶血卵磷脂的高轉(zhuǎn)化率，并且用該蛋黃制作的蛋黃醬是耐熱的并具有最適粒徑分布。比較起來，在30℃下，用30U/gLecitaseUltra處理來自SanofaA/S的蛋黃120分鐘，可顯示在卵磷脂溶血卵磷脂比值中僅僅微小的改變，并且所制作的蛋黃醬具有類似于用未處理的蛋黃制作的蛋黃醬的粒徑分布，但事實上它是耐熱的。因此在蛋黃醬的生產(chǎn)中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶優(yōu)于LecitaseUltra。實施例11.對衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶與乳化劑的組合進行應用測試用于制備硬殼卷在該測試中，以單獨或聯(lián)合PanodanA2020DATEM及GRINDSTEDSSLP55使用根據(jù)本發(fā)明和衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶酵素來用于烘烤硬殼卷，其中上述兩種乳化劑都來自DaniscoA/S。將對具體面包體積的效果，與來自Novozymes的LipopanFTM對具體面包體積的單獨或聯(lián)合了乳化劑的效果進行比較。應用使用下列配方和烘烤步驟，烘烤硬殼卷。烘烤步驟Diosna攪拌系統(tǒng)1.緩慢干拌1分鐘2.緩慢攪拌2分鐘+快速攪拌4分鐘3.發(fā)面溫度26℃4.稱取生面團1350g5.在加熱箱中，于30℃靜置10分鐘。6.鑄模Fortuna3/17/7模具7.發(fā)面45分鐘，34℃，85％相對濕度8.烘烤Bago烤箱中，220℃處理13分鐘，蒸汽處理13秒鐘+放汽處理5分鐘9.MIWEstonedeckprog.nr110.烘烤后，在稱重之前，硬殼卷冷卻25分鐘。通過菜籽取代法測量面包卷的體積。具體面包體積具體體積＝面包的體積，ccm/面包的重量，g根據(jù)面粉加入噴霧干燥的脂肪分解酶。先將面粉與水、抗壞血酸和干酵母混合后，將酶加入面粉中。在步驟1中混合所有其它的干燥成分。結(jié)果將衍生于異孢鐮孢的、并噴霧干燥的脂肪分解酶與來自DaniscoA/S的PanodanM2020DATEM進行組合使用，并針對LipopanFTM/DATEM以及純LipopanFTM或純DATEM的組合進行了測試。結(jié)果如表23和圖31所示。表23將衍生于異孢鐮孢的、并冷凍干燥的脂肪分解酶與PanodanM2020和GRINDSTEDSSLP55進行組合使用，并針對LipopanFTM/SSL或LipopanFTM/DATEM以及純LipopanFTM、純DATEM和純SSL的組合進行了測試。結(jié)果如表24和圖32中所示。表24結(jié)論表23和圖31的結(jié)論是根據(jù)本發(fā)明的、并噴霧干燥的脂肪分解酶的最適劑量是約383ppm脂肪分解酶，并且該產(chǎn)品可聯(lián)合低劑量的DATEM乳化劑以低劑量進行使用。在平行試驗中，表明當脂肪分解酶量在574ppm到1912ppm時，具體面包體積下降(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)本發(fā)明的、383ppm脂肪分解酶的表現(xiàn)類似于40ppmLipopanFTM。當與乳化劑聯(lián)合使用時，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的表現(xiàn)也與LipopanFTM水平相同。根據(jù)使用如前所述的TIPU測定法的磷脂酶活性的測定結(jié)果，10ppmLipopanFTM是約每公斤面粉120TIPU，并且本發(fā)明的96ppm脂肪分解酶相當于每公斤面粉117TIPU。此外，根據(jù)表24和圖32的試驗結(jié)果，我們推斷根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可聯(lián)合SSL以及DATEM進行使用，并從而提高低乳化劑水平的效果。在相同劑量時，可將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶功能與LipopanFTM的功能比較。再次確定聯(lián)合乳化劑的磷脂酶活性的最適水平是約每公斤面粉100-150TIPU?？偨Y(jié)起來，根據(jù)本發(fā)明的純脂肪分解酶的最適劑量是約每公斤面粉500TIPU，并且當聯(lián)合乳化劑時，脂肪分解酶水平應是脂肪分解酶最適水平的1/5至1/4，即約每公斤面粉120TIPU。實施例12.衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶用于制備小麥玉米粉圓餅(wheattorfilla)的應用測試。如下列實施例所述，測試了根據(jù)本發(fā)明的和衍生于異孢鐮孢的脂肪分解酶對通過延胡索酸(美國方法)制備的小麥玉米粉圓餅的可滾動(rollability)的作用。使用表25中的成分烘烤小麥玉米粉圓餅表25制備小麥玉米粉圓餅的配方配方類型劑量(面粉％)克制備小麥玉米粉圓餅生面團的步驟1.所需生面團溫度32℃2.在Kemper攪拌器中，于室溫進行揉捏。3.把所有干燥成分放入攪拌罐(任選地，包含脂肪分解酶和/或乳化劑)。4.干拌1分鐘5.加水。6.以1檔速度攪拌11分鐘7.稱取1350g×38.在glimek切塊機/面包成圓機上成形成生面團球。9.在32℃靜置10分鐘。10.根據(jù)下列設置在玉米粉圓餅(torfilla)烤箱CFO40中烘烤頂部230℃，中部228℃以及底部160℃。11.在20℃、80％相對濕度中冷卻12分鐘。將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶以逐漸增加的濃度加入生面團(試驗no.3-7)。為了對比，包括對照(試驗no.1)和使用來自DaniscoA/S的Panodan205乳化劑(試驗no.2)。參見表26。當加入時，將脂肪分解酶、Panodan205以及L-半胱氨酸加入第一個混合過程(上面步驟3和步驟4)?？杉尤隠-半胱氨酸來提高所制作的生面團的伸展性，從而在烘烤之前改進生面團的壓面(pressing)加工。表26.試驗設置通過在室溫下進行的冰凍可滾動性測試，評價圓餅，其中圓餅繞著不同直徑的木棍進行滾動，開始時使用最大直徑的木棍。通過圓餅可繞其不間斷地環(huán)繞滾動的木棍數(shù)目來表示可滾動性。數(shù)目越多，可滾動性越好。從該結(jié)果，我們得出結(jié)論與控制系統(tǒng)相比，根據(jù)本發(fā)明的、200ppm或更多的劑量的分解脂肪的蛋白質(zhì)似乎可產(chǎn)生改善的可滾動性。使用前述的TIPU測定法，可測定為了改善可軋制性所需的活性水平(200ppm劑量)相當于約每公斤面粉650TIPU單位。從該結(jié)果，還可得出結(jié)論用于實施穿透測試的作用力在脂肪分解酶的較高水平是增加的，意味著提高了圓餅的抗性。通過利用由StableMicroSystem生產(chǎn)的質(zhì)地分析器TAXT2進行穿透測試，其中測量用于穿透/破碎圓餅所需的作用力。用下列參數(shù)設置儀器在Compression中測試作用力預測試速度10mm/s測試速度2mm/s測試后速度10mm/s破碎測試距離1mm距離25mm作用力1g時間5秒測壓儀5kg溫度20-22℃(室溫)實施例13.在多態(tài)漢遜酵母中對編碼半裸鐮孢(FusariumSemitectum)(IBT9507)的脂肪分解酶的合成基因的分子克隆、序列分析和異源表達。用引物通過PCR從基因組DNA克隆F.semitectum脂肪分解酶基因片段，其中從比對的來自不同鐮孢菌屬株的脂肪分解酶蛋白質(zhì)序列中的氨基酸保守區(qū)設計引物。使用計算機程序CODEHOP(Rose等，2003(NucleicAcidRes.，18:3763-3766))來設計簡并PCR引物。為了克隆基因末端，使用5′和3′RACE法(Frohman等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8998-9002)。從通過1％葵花籽油誘導的F.semitectum培養(yǎng)物分離全部RNA，并使用用CODEHOP引物得到的基因片段的序列設計所用的引物。將通過上述方法獲得的三種片段在計算機芯片上組裝來顯示全長cDNA序列。1236個核苷酸長度的cDNA序列的分析顯示開放讀碼框包含352個氨基酸(圖33)。為了在漢遜酵母中表達F.semitectum脂肪分解酶基因，向基因提供來自酵母α交配因子的信號序列，并在FMD啟動子之后插入漢遜酵母表達載體pB14中的。將得到的質(zhì)粒pB14-alp.sem(在圖34中圖解說明)通過電穿孔法轉(zhuǎn)入多態(tài)漢遜酵母感受態(tài)細胞。在YND平板上選擇轉(zhuǎn)化子，并通過在YND液體培養(yǎng)基中以1∶200稀釋度傳代10次，進一步選擇多次整合基因的菌落。最后，將選擇的培養(yǎng)物在YPD培養(yǎng)基中傳代兩次。為了確定脂肪分解酶基因的表達水平，將選擇的克隆在含1.8％甘油和0.2％葡萄糖的YPD中于37℃培養(yǎng)2天。實施例14.半裸鐮孢脂肪分解酶活性的最適pH和溫度的測定在用于測定磷脂酶和半乳糖脂酶活性的生面團勻漿的功能分析中，使用如實施例8中所述來自半裸鐮孢IBT9507的、并在多態(tài)漢遜酵母中表達的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶，并且研究了該酶活性與pH和溫度變化的關(guān)系。分析步驟氣相色譜分析在有蓋的12ml離心管中稱取0.8克小麥粉。加入含酶的水1.5ml。在Whirley儀上混合樣品，并放入加熱箱于30℃加熱60分鐘。加入6mln-丁醇∶乙醇9∶1，再次混合樣品直至面粉在溶劑中均勻分布。然后將管放入水浴槽中于95℃加熱10分鐘。然后再次混合并放在旋轉(zhuǎn)儀上以45rpm旋轉(zhuǎn)45分鐘。然后以2000g離心樣品10分鐘，并將2ml上清轉(zhuǎn)入10ml的打蘭杯中。在氮蒸汽中于70℃蒸干溶劑。通過氣液色譜分析分離的脂質(zhì)。根據(jù)實施例1中所述，實施氣相色譜和半乳糖脂酶活性測定。最適溫度磷脂酶活性對于作為溫度的函數(shù)的活性測定，如實施例1中所述實施磷脂酶測定，但溫度設定為30℃、37℃、45℃、52℃或60℃。最適pH磷脂酶活性對于作為pH的函數(shù)的活性測定，如實施例1中所述實施磷脂酶測定，但將0.6％L-α磷脂酰膽堿95％Plant(Avanti#441601)和0.4％Triton-X100(SigmaX-100)溶于pH5、pH6、pH7、pH8或pH9的0.05M磷酸鹽緩沖液中。結(jié)果將根據(jù)本發(fā)明的、來自半裸鐮孢IBT9507的脂肪分解酶用于分析磷脂酶活性PLU-7和半乳糖脂酶活性GLU，結(jié)果如表27中所示。表27.半裸鐮孢的酶活根據(jù)所述的方法，在生面團勻漿實驗中，通過加入1PLU-7至0.8克面粉，測試半裸鐮孢IBT9507。也制備有水而沒有酶的對照樣品，以及有LipopanFTM的樣品。通過氣液色譜分析從生面團提取的脂質(zhì)，結(jié)果如表28所示。表28.生面團脂質(zhì)的氣液色譜分析，％基于面粉重量。FFA＝游離脂肪酸，MGMG＝單半乳糖甘油一酯，DGMG＝雙半乳糖甘油一酯，MGDG＝單半乳糖甘油二酯，DGDG＝雙半乳糖甘油二酯，TRI＝甘油三酯。表28中的結(jié)果表明與LipopanFTM相比，來自半裸鐮孢的脂肪酶對半乳糖脂具有顯著的活性，并對甘油三酯具有相對較少的活性。也分析半裸鐮孢IBT9507對于作為溫度(表29)和pH(表30)的函數(shù)的活性。表29.作為溫度的函數(shù)的半裸鐮孢磷脂酶活性表30.作為pH的函數(shù)的半裸鐮孢磷脂酶活性表29和表30中所列的活性也在圖35和圖36中得到圖解舉例說明。結(jié)論根據(jù)本發(fā)明的、來自半裸鐮孢的脂肪分解酶對生面團中半乳糖脂顯示很強的活性，并且其對甘油三酯的活性低于LipopanFTM的甘油三酯活性。該酶酶活的最適溫度是約45℃并且最適pH是7。實施例15在動物飼料中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的用途。為了評價根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶效力，在肉仔雞(broilerchicken)完全生產(chǎn)時期的正常飼料中使用各種劑量水平的酶。總結(jié)初步的結(jié)果認為在肉仔雞的食物中加入根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是用于提高禽類表現(xiàn)、提高營養(yǎng)物保留以及減少氮排泄的有效營養(yǎng)策略。具體地說，初步研究認為將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶加到動物的食物中，可促進體重增加、飼料轉(zhuǎn)化率、動物的干物質(zhì)和氮代謝能力。日料配方和試驗時間表將食物制成含或不含根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的漿狀物。任意提供食物和水。在試驗期間，始終連續(xù)對測試食物進行補料。任選以330克/噸對飼料樣品補充根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶。當混合飼料時，酶以干酶形式加入。對如下進行觀察活重(籠養(yǎng)(cagebasis))第0、21和42天體重增加第0-21天、22-42天、0-42天飼料攝取第0-21天、22-42天、0-42天FCR(食物轉(zhuǎn)化率)第0-21天、22-42天、0-42天收集腸內(nèi)容物第21天和42天測定飼料和禽類的總籠重，以及在每個分析時期各籠的禽總死亡重量和數(shù)量。不校正死亡數(shù)而測定每籠的飼料消耗量。以每只活重和總重(包括死亡的重量)的全部消耗量為基礎測定飼料轉(zhuǎn)化率數(shù)據(jù)。在開始研究之前，檢查動物不健康和病害的病征。從研究中除去任何似乎情況不佳的個體。使用隨機化技術(shù)，將研究動物分配到它們的處理組。在開始投放測試飼料前，逐一確定動物和它們的圍欄。使用合適的統(tǒng)計測試法，將處理組的數(shù)據(jù)與它們的相關(guān)對照組數(shù)據(jù)進行比較，并設定低于0.05的概率水平來表示顯著性。通過方差分析和最小顯著差異檢測來分析體重、食物攝入和食物轉(zhuǎn)化率。動物處理數(shù)2重復次數(shù)第13至21天和第9至42天每次重復的動物第8至21天和第2至42天物種肉仔雞動物飼料糠皮性別雄待測動物天齡0-42天待測動物重～40克食物/禽舍食物信息參見上文食物形狀漿狀幼雛球蟲抑制劑無肥育雞球蟲抑制劑無幼雛生長促進劑無肥育雞生長促進劑無主要測量安排變量體重增加、飼料轉(zhuǎn)化、營養(yǎng)消化性時間第0-21天、22-42天酶/添加劑用到的酶(1)來自半裸鐮孢和/或異孢鐮孢的脂肪分解酶-330克/噸實施例16評價異孢鐮孢CBS782.83脂肪分解酶對由中國面粉制造方便面質(zhì)量的影響。導言在東南亞最近5-8年中，方便面(IN)市場出現(xiàn)顯著的發(fā)展，在歐洲和美國也出現(xiàn)一定程度的發(fā)展。甚至在傳統(tǒng)上以水稻和/或意大利面為主的市場的地區(qū)中，該發(fā)展是明顯的(FoodNavigator，2000)。IN的最新流行主要歸因于其可承受的成本、方便和干凈的生產(chǎn)過程。具有平均蛋白含量(9-11％)、低灰分值(～0.50％)、高L*(85)光澤以及b*(＞8.0)黃色和高淀粉糊粘度(＜750BU)的面粉，可生產(chǎn)奶油色/黃色方便面(IN)，并具有期望的口感特征。所吃的有幾種不同類型的面條，每種具有可影響成品質(zhì)量的特殊面粉質(zhì)量特性。由于最終產(chǎn)品的巨大數(shù)量和顧客期待的廣泛性，滿足最終用戶的需求在面粉工業(yè)中是極富挑戰(zhàn)性的。正確劑量的特別設計的成分和添加劑在改進最終成品的味道、質(zhì)地、外觀、保存期限和/或營養(yǎng)價值中起非常重要的作用。雖然不能低估煮熟的面條的色澤和質(zhì)地的重要性，顧客正具有更強的辨別力和健康意識，并尋找在不犧牲質(zhì)量情況下的低脂替代品。用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶對中國面粉進行測試，以評價對IN脂肪含量的影響，并研究在加工期間質(zhì)地和色澤的變化。材料與方法將用于IN生產(chǎn)的標準的農(nóng)業(yè)食品技術(shù)方法和延伸的評價法用于該項目。中國面粉作為對照面粉并在每天開始時進行測定。使用AACC(美國臨床化學協(xié)會)批準的方法，測定中國面粉的蛋白含量、水分、灰度、色澤、濕面筋以及淀粉酶活力。生面團流變學測試包括淀粉測定記錄圖、拉伸曲線圖(牽引45分鐘)、面團吹泡張力曲線圖以及淀粉粘焙力曲線圖。IN生產(chǎn)概括如下每批IN由350g面粉制成，并在逐步加入含有1％氯化鈉和0.2％堿性鹽(比值6∶4的碳酸鉀∶碳酸鈉)的33份水性鹽溶液的期間，進行低速混合。對于給定劑量的樣品，在加入水性鹽溶液之前，將面粉與已測數(shù)量的成份進行徹底混合。將易碎的生面團以中速進一步混合4分鐘，并壓片8次。用鋼制壓實機開始壓片，隨后通過兩個塑料槽紋輥，以及最后通過五個不銹鋼光面輥，每次滾軋之間30％減低(reduction)比。最終的面片厚度是1.35mm。在切割之前，將面片再一次壓片。在切割輥和傳送帶之間的速度差異，導致形成緊密卷曲物。將緊密卷曲的面條鏈蒸兩分鐘，并在棕櫚油中于180℃進行兩面油炸1分鐘。冷卻面條塊并裝進箝緊封口的袋中，以備進一步分析。在生產(chǎn)的幾個階段收集樣品以備分析。使用MinoltaChromameter和游標卡尺，分別測定面包屑的色澤和粒徑。用MinoltaChromameter記錄面片和成品的色澤，并拍攝兩者的數(shù)碼照片(未顯示)。對蒸過的面條進行水活度測量。通過測定蒸過的面條的重量測量水活度，面條重量的測定在蒸過之后立刻進行，或在烤箱中于900℃干燥而完全除去水分之后進行，然后用干燥前和干燥后的重量差來除以干燥后的重量來測定水分含量。使用對本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的標準農(nóng)業(yè)食品技術(shù)步驟，測量最適烹飪時間、烹飪產(chǎn)量、烹飪損耗(重量分析法)、煮熟的面條的色澤和質(zhì)地(硬度)。也可對煮熟的面條的質(zhì)地進行質(zhì)地剖面(profile)分析(TPA)，以便測量粘結(jié)性、彈性和咀嚼性。粘結(jié)性定義為相對于產(chǎn)品在第一次變形中的表現(xiàn)其抵抗第二次變形的能力。用第二次壓縮中的工作面積除以第一次壓縮中的工作面積對其加以測量，因此沒有測量單位。在這種情況下，粘結(jié)性涉及“咬起來硬的”產(chǎn)品，這對于IN不是所期望的性質(zhì)。彈性定義為在第一次壓縮中產(chǎn)品已變形之后，產(chǎn)品能物理回彈的多少程度。以幾種方式測量彈性，但最典型通過產(chǎn)品的檢測高度對第二次壓縮的距離進行。咀嚼性僅僅適用于固體產(chǎn)品，并以膠粘性乘以彈性進行計算。咀嚼性是與膠粘性互相排斥的。代表每個劑量等級的一個面條塊在咖啡磨碎機中研碎，并通過酸水解法(或者可使用適于測定脂肪含量的其它標準方法)將同質(zhì)的子樣品用于脂肪分析。結(jié)果與討論面粉的蛋白含量和色澤(涉及亮度、L*)落在用于生產(chǎn)方便面的可接受范圍內(nèi)。對于IN生產(chǎn)而言，水吸收稍微有點高；然而，由于面條生面團是相當易碎的，因此它不影響機械加工性。面粉具有良好的單(拉伸曲線圖)和雙(面團吹泡張力曲線圖)軸伸展性，這對面條的食用品質(zhì)具有正面影響。淀粉粘焙力測量法的最大粘度是870BU，這對于IN是合意的。含有第二高劑量的脂肪分解酶的IN的烹飪損耗，高于對照和含有最小量的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的IN。具有最大量脂肪分解酶的IN的脂肪含量明顯低于對照和具有最小量脂肪分解酶的試驗性IN。一些試驗性IN的彈性和咀嚼性優(yōu)于對照。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，在不同劑量下進一步研究脂肪分解酶。結(jié)論從這些研究中，可得到的一些突出點是將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶加入IN中，并不顯著地影響面包屑大小、生面團粘性、可機械加工性或加工性能。重要的是，提高脂肪分解酶劑量，引起IN脂肪含量的減少。與對照相比，當劑量增加時，脂肪分解酶可提高面條硬度，而不影響粘結(jié)性。脂肪分解酶對烹飪過的面條的黃色具有積極效果。因此在IN中，脂肪分解酶可減少脂肪含量、改善烹飪過的面條的質(zhì)地以及增強其黃色。所有在上述說明書中提到的出版物在此處引用作為參考。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，不脫離本發(fā)明的范圍和精神下，可對本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)進行各種修飾和改變。盡管通過具體優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，應當理解的是所要求保護的發(fā)明不應該不正當?shù)乇幌拗朴谒龅木唧w實施方案。事實上，用于實施本發(fā)明所述方式的各種修飾(對于生物化學和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的)，意味著落入下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種真菌野生型脂肪分解酶，相對于甘油三酯而言，其對于極性脂質(zhì)具有更高活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的真菌脂肪分解酶，其中所述的酶具有至少為4的磷脂∶甘油三酯水解活性比。3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的真菌脂肪分解酶，其中所述的酶具有至少為1.5的糖脂∶甘油三酯水解活性比。4.一種真菌脂肪分解酶，其中所述的酶包含如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列或與上述序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。5.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求中所述的真菌脂肪分解酶，其中可從絲狀真菌獲得該酶。6.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求中所述的真菌脂肪分解酶，其中可從鐮孢屬獲得該酶。7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的真菌脂肪分解酶，其中可從異孢鐮孢獲得該酶。8.根據(jù)權(quán)利要求7中所述的真菌脂肪分解酶，其中可從異孢鐮孢CBS782.83獲得該酶。9.編碼根據(jù)權(quán)利要求4-8中任何一項所述的真菌脂肪分解酶的核苷酸序列。10.一種編碼真菌脂肪分解酶的核酸，其中核酸選自下列中的一種或多種a)包含如SEQIDNo.3中所示的核苷酸序列的核酸；b)通過遺傳密碼子的簡并性與SEQIDNo.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；或c)包含與SEQIDNo.3中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸。11.一種制作食品的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項所述的真菌脂肪分解酶加入一種或多種食品成分中。12.一種制作烘烤食品的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項所述的真菌脂肪分解酶加入生面團中，并烘烤生面團直到制成烘烤食品。13.根據(jù)權(quán)利要求11中所述的方法，其中食品是下列中的一種或多種蛋或蛋制品；烘烤食品；糖果；冷凍產(chǎn)品；包括乳酪的乳制品；奶油凍；攪打的植物乳脂；食用油和脂肪；充氣和非充氣的攪打的產(chǎn)品；水包油乳化劑和油包水乳化劑；人造黃油；起酥油；涂抹食品，包括低脂以及極低脂涂抹食品；調(diào)味品；蛋黃醬；蘸醬；以奶油為基礎的調(diào)味汁；以奶油為基礎的湯；飲料；香料乳劑以及調(diào)味汁。14.一種制備溶血磷脂的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項所述的真菌脂肪分解酶處理磷脂來產(chǎn)生溶血磷脂。15.一種制備溶血糖脂的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項所述的真菌脂肪分解酶處理糖脂來產(chǎn)生溶血糖脂。16.一種對植物油或食用油進行酶促脫膠的方法，包括用根據(jù)權(quán)利要求1-8中任何一項所述的真菌脂肪分解酶處理食用油或植物油，來水解其中存在的大部分極性脂質(zhì)。17.通過根據(jù)權(quán)利要求11的方法所獲得的食品。18.通過權(quán)利要求12的方法所獲得的烘烤食品。19.一種真菌脂肪分解酶，如通常在上文所描述的，并參照說明書和附圖。全文摘要與對甘油三酯的活性相比，具有對極性脂質(zhì)更高活性比的真菌野生型脂肪分解酶，其中酶優(yōu)選具有至少為4的磷脂∶甘油三酯的水解活性比。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶具有至少為1.5的糖脂∶甘油三酯的水解活性比。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的真菌脂肪分解酶包含如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2或SEQIDNo.4或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列、或與其具有至少90％同一性的氨基酸序列。本發(fā)明還包括編碼真菌脂肪分解酶的核酸，其中核酸選自下列中的一種或多種a)包含如SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7中所示的核苷酸序列的核酸；b)通過遺傳密碼子的簡并性，與SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQIDNo.3、SEQIDNo.5或SEQIDNo.7中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸。文檔編號A23C19/032GK1973034SQ200580015319公開日2007年5月30日申請日期2005年3月10日優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日發(fā)明者詹妮·布倫斯特德,喬恩·D·米克凱爾森,亨里克·佩德森,喬恩·B·索申請人:丹尼斯科公司