專利名稱：與可調流式電穿孔室相關的方法和裝置的制作方法
與可調流式電穿孔室相關的方法和裝置
背景技術：
本申請要求2004年5月12日提交的美國臨時專利申請序列號60/570,317的優(yōu)
先權，該申請已完整納入本文作為參考。
I. 發(fā)明領域
本發(fā)明涉及用瞬時電場處理細胞的領域，更具體涉及細胞的電穿孔。更具體地 說，本發(fā)明涉及用于可調流式電穿孔(flow electroporation)的方法、電穿孔室及相關裝置。
II. 相關領域的描述
自從1970年代早期開始電穿孔就被用于將分子插入到動物或植物細胞內。研究 者證實，細胞暴露于短暫持續(xù)的高壓電場中可導致細胞膜上形成通道，分子，其中 包括大分子如蛋白質和DNA，可通過該通道進入細胞內。這些通道被稱為電孔洞 (electropore)，是由高壓電場造成的細胞膜局部破裂引起的通透性升高區(qū)。這些孔洞 存在的時間雖然短暫，但是足以滿足大分子如質粒DNA分子進入細胞的需要。細胞 雖然能夠耐受這些孔洞的形成，但是，如果形成的孔洞過多，其產生的過程以及由 此導入的分子也可能會殺死細胞。由于這種電穿孔過程會導致電流(雖然短暫)通過傳 導性的細胞懸液，因此，根據(jù)焦耳定律電極會產生熱量。這種熱量可使細胞懸液的 溫度升高，如果熱量過多，會使細胞的溫度升高到足以導致細胞死亡的程度。初期 進行電穿孔時用的是特殊的容器，其中有彼此相對的電極，二者之間可產生基本均 勻的電場。最方便的是用兩個平板電極，分別固定在矩形容器或矩形室相對的兩個 壁上。將準備進行電穿孔的細胞懸液與操作者希望將其導入到細胞內的分子混合， 加入到容器或室內，然后將其置于兩個電極之間，這樣細胞懸液就會混入到與電極 接觸的液體中。為了影響分子通過電穿孔導入到細胞內的效果，在電極上通以一次 或多次短時間的高壓電場脈沖，從而對電極之間的細胞懸液施以高壓電場脈沖。目 甜市場上最常見的電穿孔容器的容積都有限，每次處理的細胞懸液量很小(通常低于 1 ml)。如果每次加入到容器內進行電穿孔的細胞量很小，那么對大體積的細胞懸液進行電穿孔就是不切實際的。
一般來說，對大體積的細胞進行電穿孔必須保持無菌。重復在容器內加樣以及 混合集中電穿孔的細胞是不可能保持無菌的。雖然這種電穿孔法方便而簡單，能夠 滿足許多研究者進行小規(guī)模細胞電穿孔的要求，但是，還需要尋找其他的方法，特 別是能夠方便地對大體積的細胞進行電穿孔，同時又能保持無菌環(huán)境的方法。在封 閉的無菌環(huán)境內對大體積的細胞進行電穿孔可使電穿孔用于人類的細胞治療。因此， 在整個操作過程中能形成并保持封閉的無菌流動通路的方法和裝置是我們最需要 的。
在20世紀80年代，有一些研究者開始研究用于處理大體積細胞的流式電穿孔 法(美國專利4,752,586， 5,612,207， 6,074,605， 6,090,617，本文都已完整納入作為參 考)。 一般來說，用于電穿孔的流動裝置包含兩個平行電極，要進行電穿孔的細胞懸 液持續(xù)而穩(wěn)定地流過兩個電極之間，直到整個細胞懸液都進行了電穿孔。在細胞懸 液穩(wěn)定地流過兩個電極之間時，高壓脈沖被施加到細胞上。在電極上重復施加高壓 脈沖會導致熱量的產生，因此必須通過冷卻裝置將熱量帶走，防止電極和細胞懸液 的溫度過高。流式電穿孔裝置包含帶電極和接口的電穿孔室，細胞懸液可通過接口 注入。電極與能給電極提供高壓脈沖的電路相連。高壓脈沖由程序控制計算機控制。 現(xiàn)在已開發(fā)出了流式電穿孔系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠對較大體積的細胞進行電穿孔，能夠 制備出已導入目的分子的活細胞。
電穿孔的條件因細胞類型的不同而不同，還因期望導入到細胞內的分子的類型 不同而不同。對于任何一個特定類型的細胞來說，都存在一個最佳的處理條件，其 中包括最佳電壓的最佳脈沖次數(shù)以及以最佳間隔時間進行脈沖的持續(xù)時間。為了使 施加到細胞上的電脈沖次數(shù)達到最佳，在使用本領域所描述的流式電穿孔裝置吋， 細胞懸液通過電穿孔室、在電極之間的流速以及脈沖的速率都是可以選擇的，從而 對一定體積的細胞懸液進行最佳次數(shù)的脈沖。例如，對于一個特定細胞來說，如果 已知每個細胞上施加的最佳脈沖數(shù)是2，通過電穿孔室的體積是1 ml，那么，流速 就設定為每一單位時間1 ml，每一單位時間內施加的脈沖次數(shù)為2。如果以這種方 式進行電穿孔，在這個例子中每個細胞就會受到2次脈沖。但是，細胞懸液通過電 穿孔室的水動力學流動不會導致細胞以相同的速率通過室以及在電極之間流動。由 于離室壁遠的地方比靠近室壁的地方流速高，因此，在電極之間向液流中心流動的 細胞通過電極之間的區(qū)域所需要的時間會低于單位時間，其受到的脈沖次數(shù)可能會 少于2次，而靠近室壁流動的細胞通過電極之間的區(qū)域所需要的時間會高于單位時間，其受到的脈沖次數(shù)可能高于2次。由于在這個例子中每個細胞受到的最佳脈沖 次數(shù)為2次，但是，很明顯并不是每個細胞都受到了最佳次數(shù)的脈沖，因此，細胞 懸液的整體電穿孔效果就不是最佳的。
如上所述，按照焦耳定律，電穿孔必然會在細胞懸液內產生熱量。由于在流式 電穿孔法中液流是穩(wěn)定而持續(xù)的，其產生的熱量也是持續(xù)的，因此，從電穿孔室中 帶走熱量的裝置必須能夠平衡產生的熱量從而避免電穿孔室的溫度上升到不可接受 的程度。在兩次電穿孔之間進行冷卻吋這個過程可以不保持連續(xù)性。
如上文所討論的，電穿孔的最佳條件根據(jù)電穿孔的特定細胞類型以及想要通過 電穿孔導入到細胞內的分子類型的不同而不同。利用試驗的方法解決這個問題是可 能的，利用靜態(tài)的室有組織地改變電穿孔的條件，然后將確定于這些試驗的最佳條 件應用到流式電穿孔系統(tǒng)中。這個方法有兩個缺點。第一，由于進行大量樣品的靜 態(tài)室電穿孔需要耗費大量的時間，因此，用于每次靜態(tài)電穿孔的細胞在試驗中也會 發(fā)生改變。第二，使用這種方法只是因為人們認為靜態(tài)室電穿孔的最佳條件與流式 電穿孔是一樣的，但是并不知道這是否真實。我們期望的是利用一個細胞樣品就能 夠確定使用同一個裝置進行所有電穿孔試驗的最佳條件，這個條件可用于治療或其 他目的所需的細胞大規(guī)模電穿孔。
某些分子，其中最明顯的是mRNA，在人們期望通過電穿孔將分子導入其內的 細胞內是不穩(wěn)定的。對于mRNA來說，這可能是由細胞培養(yǎng)基內或細胞表面上存在 的核酶造成的。在這種情況下，我們希望分子在被導入到細胞內前處于此不穩(wěn)定條 件下的時間縮短到最短。在利用靜態(tài)室進行電穿孔時，分子(如，mRNA)與細胞混合， 然后手工加到室內，液體一旦注入到電穿孔裝置內就馬上進行電穿孔。在進行這些 手工操作步驟期間，粘附到細胞上的某些分子可能被破壞。在電穿孔前立刻使被導 入分子與細胞在封閉的無菌環(huán)境中自動混合的方法是我們所期望的。
在本領域所描述的持續(xù)流動系統(tǒng)中，除了在電極上施加脈沖的時間與細胞在電 極之間開始流動的吋間需要協(xié)調之外，脈沖與細胞流動之間不需要"期間處理"的 協(xié)調。
既有持續(xù)流式電穿孔的優(yōu)點，特別是能在無菌封閉系統(tǒng)內對大體積的細胞進行 電穿孔，又能保證每個細胞都受到最佳次數(shù)的脈沖的方法和裝置是我們所期望的。
發(fā)明概述
本發(fā)明的實施方式包括電穿孔法以及能進行大體積電穿孔的相關電穿孔裝置和設備。在某些方面，本發(fā)明能平衡熱量的產生以避免室的溫度升高到不可接受的程 度。另外，電脈沖可以被優(yōu)化以處理單位體積的目的樣品和/或處理全部或部分目的 樣品。本文所用的術語"單位體積"或"單位"是指灌滿或部分灌滿電穿孔室所需 的樣品或液體的體積。 一個單位一般是指暴露于一個特定電脈沖或一系列電脈沖的 一部分樣品。每一個單位都可以被稱為樣品的一個部分。單位可由操作者確定，并 且可以通過注入或排出電穿孔室或者通過改變液體流過室的速率來調整單位的大 小。每個單位都可以是樣品的不連續(xù)部分，通過在兩個或多個樣品單位之間加入非 樣品氣體或液體。在許多實施方式中，樣品的處理可在閉合系統(tǒng)內進行，即，限制 外部環(huán)境接觸裝置或設備容器的內部、流動通路和電穿孔裝置的室的系統(tǒng)。這種封 閉系統(tǒng)可用于保持無菌和樣品的完整性。
本發(fā)明的實施方式包括流式電穿孔處理方法，該方法包括調節(jié)樣品流過電穿孔 室的速率。 一般來說，樣品以單位的形式處理，該單位是由重復循環(huán)注滿或排出電 穿孔室而產生的。循環(huán)通過電穿孔室的每一個樣品單位都暴露在相同或不同的電脈 沖或條件下。在某些方面，樣品的單位是通過在未處理和已處理的樣品體積之間設 置一個邊界而形成的。邊界可將非樣品氣體或液體循環(huán)到兩個或多個樣品單位或部 分之間的室內而提供。非樣品氣體或液體一般由一定體積的未處理樣品置換出室。 可通過從電穿孔室中排出已處理的樣品、將樣品主動泵入電穿孔室、將非樣品液體 或氣體主動泵入電穿孔室或上述過程的組合使非樣品液體或氣體流入電穿孔室。
"泵送"是指提供一個壓力梯度從而給液體或氣體施加一個運動力。例如，這 種運動力可由重力或被泵入液體的表面張力所產生的力來提供。給氣體或液體施加 運動力的裝置，特別是給細胞懸液施加運動力的裝置，被稱為泵裝置。泵裝置包括 在系統(tǒng)內產生壓力差以調節(jié)液體或氣體在流動通路內流動速度的各種機器。己知的 各種泵裝置包括而不限于旋轉泵、擺動泵、離心泵、空運泵或噴射泵。泵裝置可包 括活塞、蠕動裝置、橫隔膜、體積可變的容器、壓縮氣體、螺旋輥、渦輪、螺絲、 齒輪傳動型機械以產生可調節(jié)的液體或氣體流。
在某些特殊的方面，循環(huán)是通過改變樣品流過電穿孔室的1、 2、 3、 4或更多接
口的速度來產生的。"接口"是指液體流入或流出電穿孔室所通過的開口。應當考慮 的是，電穿孔室可以作為歧管(manifold)來引導液體的流動，但是其他實施方式可以 使用，可以使用或不使用不作為電穿孔室一部分的歧管。樣品或非樣品液體或氣體 的循環(huán)一般由l、 2、 3、 4、 5、 6或更多個泵裝置、閥門或其他液體調節(jié)裝置的不同 組合來調節(jié)。在一個實施例中，邊界可通過將樣品滴過室來提供，其中樣品滴在通過兩個電極之間時暴露于一個或多個電脈沖之下。
本發(fā)明的其他實施方式包括流式電穿孔室，該電穿孔室包含帶至少兩個電極和
至少3個接口的室，其中，(i)第一接口用于樣品流入室；(ii)第二接口用于已處理樣 品流出室；和(iii滯三接口用于非樣品液體或氣體流入或流出室，其中，在樣品流入 室時非樣品液體或氣體流出室，在樣品流出室時非樣品液體或氣體流入室。第一接 口與一個或多個樣品容器形成流體連通。第二接口與一個或多個已處理樣品容器形 成流體連通。第三接口與一個儲存容器形成流體連通，其中當室注滿或部分注滿樣 品時儲存容器內盛有全部或部分非樣品液體或氣體。在某些實施方式中，室至少有 四個接口。第四接口與樣品容器、已處理樣品容器、非樣品氣體或液體儲器、試劑 容器(如洗滌緩沖液、清洗溶液、冷卻溶液等)或上述容器的組合形成流體連通。
在其他實施方式中，流式電穿孔裝置包含通過第一室接口與電穿孔室發(fā)生流體 連通從而形成第一流動通路的至少1、 2、 3、 4或更多個樣品容器；通過第二室接口 與電穿孔室發(fā)生流體連通從而形成第二流動通路的至少1、 2、 3、 4或更多個已處理 樣品容器；以及通過第三室接口與電穿孔室發(fā)生流體連通從而形成第三流動通路的 至少一個非樣品液體或氣體儲器。非樣品氣體或液體儲器可以是非樣品氣體或液體 容器、樣品容器的一部分、已處理樣品容器的一部分、電穿孔室的'部分、或其不 同組合。第二流動通路可以和第一流動通路的一個或多個樣品容器及第三流動通路 的非樣品儲存容器形成流體連通，后者相對于第二流動通路的已處理樣品容器來說 處于電穿孔室的遠處。在某些方面，裝置還包含可操控地連接到至少1、 2、 3、 4或 更多個流動通路上的至少1、 2、 3、 4或更多個泵。樣品容器、已處理樣品容器、非 樣品液體或氣體儲器或上述容器的不同組合可以是可折疊的、可擴張的或固定體積 的容器。在本發(fā)明的其他方面，裝置內的液流可由裝置的1、 2、 3、 4、 5、 6或更多 流動通路的開放或閉合來控制。不同流動通路可交替開放和閉合，優(yōu)選的是從樣品 容器到電穿孔室的流動通路和從已處理容器到電穿孔室的流動通路交替開放和閉 合，其中，在電穿孔循環(huán)期間二者不會同時開放。液流可由1、 2、 3、 4、 5、 6或更 多個閥門，1、 2、 3、 4、 5、 6或更多個泵裝置，或者上述裝置的不同組合來控制。 在一個優(yōu)選實施方式中，泵是蠕動泵，更優(yōu)選的是，蠕動泵是全壓縮蠕動泵。
在其他的實施方式中，流式電穿孔裝置可包含通過第一室接口與電穿孔室形成 流體連通的至少l、 2、 3、 4或更多個樣品容器和通過第二室接口與樣品容器形成流 體連通的電穿孔室，形成第一流動通路；至少l、 2、 3、 4或更多個已處理樣品容器 通過第三室接口與電穿孔室形成流體連通，電穿孔室通過第四室接口與已處理樣品
10容器形成流體連通，形成第二流動通路。1、 2、 3、 4或更多個已處理樣品容器還可 作為非樣品氣體或液體儲存容器。在某些方面，非樣品氣體或液體儲存容器與樣品 容器或已處理樣品容器結合在一起，或者和二者都結合在一起。裝置還可以包含可 操控地連接到至少1、 2、 3、 4、 5、 6或更多個流動通路上的至少1、 2、 3、 4或更 多個泵裝置。樣品容器、已處理樣品容器或者二者都可以是可折疊的、可擴張的或 固定體積的容器。在許多方面，裝置內的液流是由裝置的一個或多個流動通路的開 放或閉合來控制的。在某些實施方式中，第一和第二流動通路交替開放和閉合。液 流通常由一個或多個泵裝置調節(jié)或控制，優(yōu)選的是泵，更優(yōu)選的是蠕動泵，更優(yōu)選 的是全壓縮蠕動泵。液流還可由閥門、泵裝置或其組合的不同組合來調節(jié)或控制。
應當注意的是，本文描述的所有方法或組合物的實現(xiàn)都與本文所描述的其他方 法或組合物有關。
單詞"一"或"一個"與權利要求和/或說明書中的術語"包含"連用時是指"一 個"，但是也可以指"一個或多個"、"至少一個"、以及"一個或一個以上"。
權利要求中所用的術語"或"的意思是"和/或"，除非明確地指出只表示二者 選一，或者二者是互相排斥的，盡管說明書支持只是二者選一和"和/或"的定義。
本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點通過閱讀下面的詳細說明就可以清楚。但是應 當理解的是，詳細描述和特定的實施例在用于說明本發(fā)明的特殊實施方式的同時， 只是以說明的方式提供，因為本領域的技術人員通過閱讀這個詳細說明就可以清楚 地理解本發(fā)明精神和范圍內的各種改變和修飾。
附圖簡述
下面的附圖構成了本說明書的一部分，用于進一步證明本發(fā)明的某些方面。通 過參考這些附圖中的一個或多個并結合本文所提供的特殊實施方式的詳細描述可以 更好地理解本發(fā)明。


圖1是電穿孔過程一個典型循環(huán)的示意圖。
圖2是電穿孔過程第一典型構成的示意圖。
圖3是電穿孔過程第二典型構成的示意圖。
圖4是電穿孔過程第三典型構成的示意圖。
圖5是電穿孔室的一個實施方式的圖解。
圖6是電穿孔室的一個實施方式的分解圖。
圖7是電穿孔室的另一個實施方式的分解圖。圖8是本發(fā)明電穿孔室的另一個公開實施方式的透視圖。
圖9是本發(fā)明電穿孔室的另一個公開實施方式的分解透視圖。
圖10是安裝到電穿孔裝置內的電穿孔室的示意圖。
圖11描述的是Jurkat細胞在電穿孔后24小時進行碘化丙錠(PI)和GFP熒光分
析的結果。
圖12A-12C描述的是Jurkat細胞在電穿孔后24小時通過FACS分析得到的熒光 強度直方圖。圖12A是對照轉染。圖12B是400 pL靜態(tài)轉染。圖12C是100 mL可 變流式轉染(flow transfection)。
圖13描述的是連續(xù)循環(huán)的電穿孔所收集的各個組分的分析結果。 圖14描述的是包含活塞型泵裝置的本發(fā)明的另一個實施方式。 圖15描述的是一個封閉的一次性單沖程泵送系統(tǒng)。
說明性實施方式的描述
本發(fā)明的實施方式包括用于電穿孔的各種新型設備和方法。更具體地說，某些 實施方式提供了用于將分子、化合物或組合物導入到細胞或細胞組分內的流式電穿 孔裝置和方法，其中的細胞或細胞組分包括而不限于細菌、真菌、植物細胞、動物 細胞、培養(yǎng)的細胞、原代細胞、紅細胞、白細胞、血小板、干細胞、基因改造的干 細胞或干細胞的擴增群。在某些方面，瞬時高壓電場如果使用太高的電壓或持續(xù)時 間過長會打亂細胞的代謝及殺死某些細胞。由于不同類型的細胞在用瞬時電場處理 時所受到的瞬吋電場的影響是不同的，例如通過電穿孔將分子加載或導入到細胞內 的那些電場，因此，不同的細胞所受到的殺傷是不同的，因而某些細胞可能被從細 胞群中清除。在另外一些方面，分子不需要被導入，但是樣品通過暴露到電場中進 行處理。在另外的實施方式中，目的不是將外源分子導入到細胞內，而是修飾被處 理的細胞，即，在暴露到電場中之前、期間或之后使細胞接觸某些其他的藥理試劑 或條件一殺死是修飾的極端例子。在另一個實施方式中，本發(fā)明的裝置將進行細胞 電穿孔的電穿孔室與裝置內細胞懸液的可調流動或可變流動組合在一起，這種裝置 P了使電穿孔室的重復注入和排空與電脈沖互相協(xié)調。優(yōu)選的是，室與其相關的流動 通路和容器形成一個閉合無菌環(huán)境。本發(fā)明的其他優(yōu)點包括裝置能夠提供更均勻的 細胞脈沖。這種新型可調流式電穿孔室以單位體積的形式對細胞懸液進行電穿孔。 各個組分或單位體積由流過電穿孔室的樣品體積決定，其間由非樣品氣體或液體物 理分隔，或者由其他方式如閥門的開放和閉合將其彼此分隔。樣品體積之間的分隔有利于分別收集每一獨立的體積，其中連續(xù)體積的樣品可能不會經(jīng)歷相同的電穿孔 條件，或者其中連續(xù)體積的樣品可能會包含細胞和分子的不同組合來進行電穿孔加
載。應當注意的是，本發(fā)明的方法和裝置，其中包括電穿孔室，可用于包裹各種細 胞群內的各種物質，也可用于使細胞暴露于已包含、正包含或將包含藥理試劑或條 件的電場中。暴露于電場本身就是對細胞進行處理。
木發(fā)明的某些實施方式包括處理方法，其中有可調液流或氣流通過室。因此， 這個處理方法被稱為連續(xù)流。但是，在某些實施方式中，樣品流或已處理樣品流在 處理過程中流速可以減緩或停止，這樣，液流或氣流作為一個整體而不是作為特定 的樣品、液體或氣體流過室被描述為連續(xù)流。電穿孔過程一般包含流過室的樣品流， 其中的樣品以固定體積的部分或單位體積的形式被處理。在細胞懸液的兩個部分進 行電穿孔的間歇期由流入電穿孔室的非樣品液體或氣體將樣品分隔成獨立的不同組 分。
在某些實施方式中，樣品可被分成多個組分。另外，每個被處理的樣品組分可 以被分別分類、收集和/或儲存或分成特定的組。產物或已處理樣品組分可以是幾個 已處理樣品的混合物或者一次一個。在本發(fā)明中沒有任何事情可干擾本技術的使用 者用一個樣品部分填滿室，然后加入其他溶液，進行電穿孔，并收集得到的產物。
在本發(fā)明的某些方面，不同樣品組分可暴露于不同的脈沖或試劑中。例如，開 始時全部或部分樣品或同一組合物的一個樣品用一個范圍的條件處理以便于快速地 確定最佳的電穿孔條件。另外，使用者可以希望得到細胞群或細胞的不同組分，其 中包含已暴露于各種電穿孔條件下的細胞。
在某些實施方式中，"在線混合"樣品組分也是可以考慮的。例如，某些試劑可 能對電穿孔混合物中的細胞或其他電穿孔靶標或試劑不穩(wěn)定或有害。因此，我們希 望在進行電脈沖前臨時加入這些組分，即，不要提前混合，或者不要只在電穿孔前 的短時間內混合電穿孔樣品的一個或多個組分。
本發(fā)明的其他實施方式包括新型可調流式電穿孔室，該電穿孔室可使細胞可調 節(jié)地流入和流出電穿孔室，這樣，細胞在接受高壓脈沖時流入或流出室的速率要低 于脈沖間隙或系列脈沖時。細胞的流速不需要降低到0以體現(xiàn)可調流的優(yōu)勢，但是 在電穿孔期間降低流速是我們所期望的。本發(fā)明的實施方式還可以暫時協(xié)調為電極 提供高壓脈沖的電子元件和使細胞懸液在電極之間流動的裝置。使細胞懸液流動的 裝置(給液體氣體提供運動力)是指泵裝置。泵裝置包括在系統(tǒng)內產生壓力差以調節(jié)液 體或氣體在流動通路內的流速的各種機器。已知的泵裝置包括而不限于重力泵、旋
13轉泵、擺動泵、離心泵、空運泵或噴射泵，泵還可以包括活塞、蠕動裝置、橫隔膜、 體積可變的容器、壓縮氣體、螺旋輥、渦輪、螺絲或齒輪傳動型機械以產生可調節(jié) 的液體或氣體流。
本發(fā)明還提供了可方便地在細胞懸液進行電穿孔的間歇期內冷卻電穿孔室的裝 置。向電穿孔室內注入細胞懸液與從電穿孔室中排出細胞懸液之間的時間間隔是可 以調節(jié)的，以確保在對細胞懸液進行電穿孔前電穿孔室的溫度不耍高于某個特定溫度。
與本文所描述的主要原則一致的對基本設計的其他修改也包括在本發(fā)明之內。 在各種實施方式中，樣品和產物管道或流動通路只與室的空腔匹配，即，室可作為 樣品流動的歧管存在，在新的樣品組分達到前室可完全或部分排空。本文所用的術 語"流動通路"是指組件或部件的集成，通過隧道、管道、導管或通路的形式進行 流體連通，流體如液體或氣體可通過該通路。本文所用的術語"流體連通"是指流 動通路的兩個或多個部件之間直接或間接的功能性連接，該聯(lián)通可使液體在部件之 間及流動通路內流動。例如，如果液體能從樣品容器流到室內，那么就可以說樣品 容器與室有"流體連通"。
一個可產生流體連通的流動通路的例子是包括一個容器和-個室的通路，二者 之間由帶一個裝置的管道相連，該裝置用于調節(jié)液體或氣體流過通路的速率，這種 裝置包括一個全壓縮蠕動泵或者一個位于容器和室之間的閥門。調節(jié)裝置可操控地 連接到容器和室之間的任何位置上。術語"可操控地連接"與流速調節(jié)裝置連用時 是指調節(jié)裝置與液體或氣體之間的直接或間接聯(lián)通，這樣可以某種方式調節(jié)液體或 氣體的流速，如允許流動或禁止流動。調節(jié)裝置不一定和液體或氣體直接接觸，如， 可彎曲管上的夾子(例如，參見圖15)。
在某些實施方式中，裝置的一個或多個流動通路可以是無菌通路。就是說，從 樣品源中流出的樣品和從室流向已處理樣品容器的已處理樣品可以處于閉合系統(tǒng) 內。封閉系統(tǒng)可在適當?shù)臒o菌條件下準備，這樣在處理過程中可以使樣品保持無菌。 另外，容器、管道、電穿孔室都是一次性的。本文所用的術語"一次性"是指所設 計和組裝的部件足夠便宜，即使不是大多數(shù)使用者，也是很多使用者都認為在經(jīng)濟 上沒有重復使用該部件的必要，在使用一次后就可以將其丟棄。
本發(fā)明的裝置和方法還可以包含其他各種處理組分。例如，在循環(huán)中間或一定 次數(shù)的循環(huán)之后用于洗滌、清潔或冷卻室的溶液，如洗滌緩沖液。在裝置停止使用 時也可用洗滌緩沖液冷卻電極和室。I.流式電穿孔法的描述
圖l是一個示意圖，代表了本文所描述的可調或斷續(xù)流式電穿孔法的一個典型 電穿孔循環(huán)?？?panel)l描述的是非樣品液體或氣體從室中的排出，框2描述的是在 非樣品液體或氣體從室中排出的同時將待電穿孔樣品注入室。框3和4描述的是在 樣品從流入到流出的流動過程中對樣品進行電穿孔?？?和6描述的是在已處理樣 品從室中排出的同時注入非樣品液體或氣體。本發(fā)明的方面包括通過電穿孔室的1、 2、 3、 4、 5、 6或更多個接口所發(fā)生的流入、流出或者流入及流出。流入和流出可通 過同一接口，也可以通過不同的接口。室本身可作為歧管使用，或者在室外樣品源 與室之間、收集點與室之間、或者兩個樣品源與收集點之間的位置上設置獨立的歧 管。本發(fā)明的實施方式并不要求都使用歧管。
在樣品注入室的過程中，液體可以是噴出并滲到室的空腔內。這種噴射可能會 對細胞產生水動力學壓力，或者會在細胞懸液內產生泡沫或氣泡。在處理活細胞時 最好要避免產生水動力學壓力和泡沫或氣泡。當我們希望提高電穿孔處理過程的通 量時，液體噴射、水動力學壓力和氣泡形成就會成為問題。如果使用者想盡量縮短 用細胞懸液注滿和排空室所需的時間，可以選擇會導致液體噴射的流速，但其負面 效果比更快流速獲得的優(yōu)點更加顯著。如下文所示，在某些條件下，液體可能會從 入口噴入室內，并且可能會滲透到其本不應當存在的系統(tǒng)空腔內。避免出現(xiàn)這種問 題的一個方法是根據(jù)水動力學領域的成熟原理設置一個筆直通道，或者制作一個測 試室，可以從中觀察注入的細胞懸液流，例如用透明材料制作室的表面。利用這種 測試室可以觀察液體噴射狀況或者氣泡或泡沫的產生情況，從而有可能避免產生噴 射或形成氣泡或泡沫。
在一種解決噴射問題的方法中，考慮使少量體積(一滴)的液體離開垂直放置的圓 管上的開口。當液體處于管中時由泵或其他方式所產生的跨圓管兩端的壓力差推動。 當液體從圓管中流出時繼續(xù)延慣性方向流動。如果流動的方向是朝上，那么肯定對 游離的液滴不會施加力，發(fā)明者能夠根據(jù)能量守恒原理估算出其在空氣中運行的距 離，該原理認為液滴的動能與勢能之和為常數(shù)(公式l)-
公式l: ，f + ，^^常數(shù)
其中
附是液滴的質量， F^是其速度，g是重力加速度，以及 AW是液滴位于圓管開口上方的高度。
由于液滴在離開圓管的那一刻所具有的全部機械能基本都是動能，因此常數(shù)等 于'/2ltlV。2，其中V。是液流的平均線性速率，它等于體積流率與管道截面積之比。當 液滴到達其最高點時，其速度為0，利用關系式(公式2)可計算出其高度。在設計系 統(tǒng)時可以將這些力考慮進去，通過改變流動通路的形狀、電穿孔室的幾何構型以及 調節(jié)系統(tǒng)內液流所使用的壓力就可以使系統(tǒng)的設計達到最優(yōu)化。
例如，以5 mL/s的速度泵送細胞懸液通過內徑(ID)為1/8英寸的圓管。其平均 線性速率就是 63cm/s，根據(jù)層流原理，圓管中心的最大線性速率將達到平均速率的 兩倍，因此K。值可達126 cm/s。假設g等于980 cm/s2，那么可以得到hmax = 8 cm。 這個例子可比擬處理室的特征形狀，因此，在指定的條件下噴射是可能的。
解決噴射問題的方法包括而不限于下列例子流速增加兩倍h,皿就會增加4倍， 在流速為10 mL/s時噴射高度將達到30 cm以上，這就意味著細胞懸液絕對是通過噴 射進入室內而不是緩慢流進室內的。另一方面，管道的截面積增加2倍噴射高度將 會下降4倍，因此，如果流速確定，我們所選擇的供應管道和入口的直徑應盡可能 地大以使噴射和對懸液內細胞的干擾降低到最小。根據(jù)解決問題的這個原理，可以 通過試驗流速、接口直徑、流動通路等的不同組合來確定更有效的解決方法。
本發(fā)明的方法可利用具有不同構型的裝置來實現(xiàn)。在第-一個實施例中，裝置的 構型包括圖5或圖8所示的電穿孔室或其修改構型。參照圖2，樣品源30通過第一 流動通路31與室11形成流體連通，31通過室接口 17與室相連。從樣品源30向室 11的流動通過閥門32調節(jié)。室11與已處理樣品儲存罐36之間由第二流動通路37 通過第二接口 18相連。流動通路37內的流動由第二閥門38調節(jié)。非樣品液體或氣 體源35通過第三流動通路33與室11形成流體連通。流動通路33提供了非樣品氣 體或液體儲存罐35與室11之間的流體連通。第三流動通路33包含驅動液體流入流 動通路并與之連接的泵34或其他裝置。第三流動通路33通過第三接口 19連接到室 11上。
圖2所示的是一個典型的系統(tǒng)初始構型，其中的室11含有非樣品液體或氣體， 樣品源30包含靶細胞、靶物質、試劑或其不同組合的溶液。當閥門32開放而閥門 38關閉時，泵34可將室11內的非樣品液體或氣體排空。另外，也可以將樣品泵入室內以替換或壓縮非樣品液體或氣體。當非樣品氣體離開室11或在室內被壓縮時， 來自樣品源30的樣品流入室11內。 一旦室ll注滿了樣品，就利用電極向室內發(fā)送
電脈沖。暴露于電流之中的樣品被認為是己處理樣品。當閥門32關閉而閥門38開
放時，非樣品液體或氣體被泵入室ll內。通過排空已處理樣品可將非樣品液體或氣
體主動泵入或吸入室內。已處理樣品通過流動通路37流到標記為收集袋36的儲存 罐或收集點內。這個過程可循環(huán)數(shù)次，其間可以改變電脈沖，也可以不改變，直到 全部或部分起始體積的樣品被處理完。
參照圖3，本發(fā)明的另一個實施方式包括通過第一流動通路31與室11形成流體 連通的樣品源30， 31通過室接口 17與室11相連。從樣品源30向室11的流動由標 記為32的閥門調節(jié)。非樣品液體或氣體源與已處理樣品儲存罐或收集點結合形成非 樣品液體或氣體/己處理樣品儲存罐39。室11由第二流動通路37通過第二接口 18 與非樣品液體或氣體/已處理樣品儲存罐39相連。第二閥門38可調節(jié)流動通路37 內的液流。非樣品液體或氣體/已處理樣品儲存罐39通過第三流動通路41與室11 形成流體連通。流動通路41在非樣品液體或氣體Z己處理樣品儲存罐39與泵34之間 分叉形成第四流動通路42。第三流動通路41可操控地與泵34或驅動液體在流動通 路內流動的其他方式相連。第三通路41通過第三接口 19與室11相連。
圖3所示的是一個典型的系統(tǒng)初始構型，其中的室11和非樣品液體或氣體/已 處理樣品儲存罐39含有非樣品液體或氣體，樣品源30包含靶細胞、試劑、靶物質 或其不同組合的溶液。當閥門32開放而閥門38關閉時，泵34可驅動室11內的非 樣品液體或氣體流過流動通路42進入樣品源30。當非樣品氣體離開室11時，來自 于樣品源30的樣品流入室11。 一旦室注滿了樣品，就利用電極向室內發(fā)送電脈沖。 暴露于電流之中的樣品被認為是已處理樣品。當閥門32關閉而閥門38開放時，非 樣品液體或氣體從非樣品液體或氣體/已處理樣品儲存罐39通過流動通路41被泵入 室11內。已處理樣品流過流動通路37進入非樣品液體或氣體/已處理樣品儲存罐39。 這個過程可循環(huán)數(shù)次，直到全部或部分起始體積的樣品被處理完。
在其他的實施方式中，電穿孔室10具有圖4所示的構型。參照圖4，樣品源30 通過流動通路31與室11形成流體連通，后者通過室接口 17與室相連。從樣品源30 向室11的流動由閥門32或泵43調節(jié)，閥門32是可選的。室11由第二流動通路37 通過第二接口 18與非樣品液體或氣體/己處理樣品儲存罐39相連。流動通路37內的 流動由第二閥門38(可選的)或第一泵34調節(jié)。非樣品液體或氣體源與已處理樣品儲 存罐或收集點結合形成非樣品液體或氣體/已處理樣品儲存罐39。非樣品液體或氣體
17/已處理樣品儲存罐39通過第三流動通路44與室11形成流體連通。第三流動通路 44可操控地與第一泵34或驅動液體在流動通路內流動的其他方式相連。第三流動通 路44通過第四接口 20與室11相連。室11通過接口 19和第四流動通路45與樣品 源30相連。第二泵43可操控地與第四流動通路45相連。
圖4所示的是一個典型的系統(tǒng)初始構型，其中的室11和非樣品液體或氣體/已 處理樣品儲存罐39含有非樣品液體或氣體，樣品源30包含靶細胞、試劑、靶物質 或其不同組合的溶液。當閥門32開放而閥門38關閉時，或者第一泵34抑制第二通 路37和第三流動通路44內的液流時，第二泵43可驅動室11內的非樣品液體或氣 體流過流動通路45進入樣品源30。當非樣品氣體離開室11時，來自于樣品源30 的樣品通過流動通路31流入室11。 一旦室注滿了預定體積的樣品，就利用電極向室 內發(fā)送電脈沖。暴露于電流之中的樣品被認為是已處理樣品。當閥門32關閉或者第 二泵43抑制第一流動通路31和第四流動通路45內的液流且閥門38開放時，非樣 品液體或氣體由第一泵34從非樣品液體或氣體/已處理樣品儲存罐39通過流動通路 44泵入室11內。這個過程可循環(huán)數(shù)次，直到全部或部分起始體積的樣品被處理完。
II.流式電穿孔裝置的描述
電穿孔室組件可用于選擇性地區(qū)隔生物單位，如細胞，這些生物單位由外部源 進入電穿孔室組件內。然后在生物或化學物質存在的情況下對生物單位進行電穿孔， 使物質進入生物單位膜上瞬時開放的孔道內。生物單位被電穿孔后移出電穿孔室， 進行下一步的處理，然后再對另一部分或單位體積的細胞懸液進行電穿孔。下面根 據(jù)木發(fā)明的典型實施方式對電穿孔室的結構和構造進行詳細描述。
本發(fā)明的某些實施方式包括用于對粒子，尤其是活細胞的懸液進行電處理的電 穿孔室，其中包含帶有一個或多個流入口和一個或多個流出口的電穿孔室。電穿孔 室包括兩個或多個壁，其構型可接受并儲存由一個或多個流入口流入的樣品，如， 懸液中的細胞，或非樣品液體或氣體。室還包括一對電極， 一個電極至少形成室的 一個壁。每個電極都與一個電源形成電子聯(lián)通，從而使流過室的細胞懸液暴露于兩 個電極之間形成的電場中。
圖5所示的是本發(fā)明的一個典型電穿孔室。參照圖5，電穿孔室10包含室11。 壁12確定了室的形狀，墊圈13位于壁12中間。壁12可以是電極板。墊圈13在壁 12中間提供了一個空間形成室11。壁12和墊圈13由固定裝置14固定，14有相連 的電極間隔15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖5所示的實施方式中，電穿孔室10有4個接口第一接口 17、第二接口 18、 第三接口 19和第四接口20，在某些實施方式中第四接口20是可選的。每個接口都
與樣品源、非樣品液體或氣體、試劑源、已處理樣品儲存罐或儲存各種溶液和試劑 的各種容器形成流體連通。
圖5所示的電穿孔室10的分解圖顯示在圖6中。參照圖6，電穿孔室10包含 室ll。室11的形狀由壁/電極12及位于壁之間的墊圈13確定。墊圈13在壁12之 間提供一個空間形成室11。壁12和墊圏13由固定裝置14固定，14有相連的間隔 15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖6所 示的實施方式中，室有4個接口第一接口 17、第二接口 18、第三接口 19和第四 接口 20，在某些實施方式中第四接口 20是可選的。每個接口都與樣品源、非樣品液 體或氣體、試劑源、已處理樣品儲存罐或各種容器形成流體連通。
電穿孔室10的另一個實施方式的分解圖顯示于圖7中。參照圖7，電穿孔室10 包含室ll。室11的形狀由室的壁/電極12及位于壁之間的墊圈13確定。墊圈13在 壁12之間提供一個空間形成室11。壁12和墊圈13由固定裝置14固定，14有相連 的間隔裝置15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。 在圖5所示的實施方式中，室有4個接口第一接口 17、第二接口 18、第三接口 19 和第四接口20，在某些實施方式中第四接口 20是可選的。在這個實施方式中，接口 (17、 18、 19、 20)孔所處的平面和室11的壁12所處的平面是同一個平面。每個接口 都與樣品源、非樣品液體或氣體、試劑源、已處理樣品儲存罐或各種容器形成流體 連通。
電穿孔室的另一個實施方式顯示于圖8中。參照圖8，電穿孔室21包含三個接 口(17、 18和19)。室的形狀由壁12確定，墊圈13位于壁12之間。壁12可以是電 極，或者其上連接電極。墊圈13在壁12之間提供一個空間形成室11。壁12和墊圈 13由固定裝置14固定，14有相連的間隔15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、 拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖8所示的實施方式中，室有3個接口第一接口 17、第二接口 18和第三接口 19。每個接口都與下述的樣品源、非樣品液體或氣體、 試劑源、已處理樣品儲存罐或各種容器形成流體連通。
參照圖9所示的圖8的分解圖，電穿孔室21包含室11和三個接口(17、 18和 19)。室的形狀由壁12確定，墊圈13位于壁12之間。壁12可以是電極，或者其上 連接電極。墊圈13在壁12之間提供一個空間形成室11。壁12和墊圈13由固定裝 置14固定，14有相連的間隔15。固定裝置14包括而不限于螺釘、夾子、拴、鑄模材料如鑄模塑料等。在圖5所示的實施方式中，室有3個接口第一接口17、第二 接口 18和第三接口 19。每個接口都與樣品源、非樣品液體或氣體、試劑源、已處理 樣品儲存罐或各種容器形成流體連通。
在圖5-9所示的本發(fā)明的實施方式中，包含室11的墊圈13位于電極板12之間， 墊圈13的厚度與電極間隔15的厚度相同。墊圈13通常和相對的電極板12 —起形 成密封。墊圈13可由硅膠、其他合成或天然橡膠或其他聚合物、或者其他非導電性 材料制成。墊圈13內的空間形成一個或多個室11。墊圈13內的正方形、矩形或其 他切割空間定義了室11的構型。室11的大小和形狀與電極板12的大小和形狀是成 比例的。
再參照圖5-9，電穿孔室10或21可由兩個相對的電極板12構建。 一般來說， 電極板可由鐵、鋼、銅、鋁或其他導電性金屬或金屬合金制成。電極板12還可以包 被金、鉑、鋅、碳或其他電鍍材料以增強其導電性。每個電極板12都有一個或多個 電子終端22與流式電穿孔系統(tǒng)的電源線路聯(lián)通。
電極板12通常由一個或多個電極間隔15隔離。電極間隔15的厚度決定和固定 了電極12之間的間隙。只需改變電極間隙15就可以將電極12之間的間隙調整到期 望的數(shù)值。這種間隙的寬度可根據(jù)液體體積和電場強度來調整，但是一般都要大于3 mm，優(yōu)選的是約0.01 mm到2 cm，更優(yōu)選的是約0.1 mm到1 cm。在其他實施方式 中，間隙的寬度大于3mm，優(yōu)選的是約4mm到約2cm，更優(yōu)選的是約5mm到約 lcm。圖14描述的是本發(fā)明另一個實施方式的實施例，其中至少帶一個接口的活塞 裝置用作本文所描述的電穿孔室。在這個特殊類型的裝置中，活塞用于置換樣品體 積。根據(jù)該圖所描述的基本原理產生的裝置或方法不需要加入非樣品氣體或液體。
電極間隔15通常由電絕緣材料制成，如塑料、陶瓷、橡膠或其他非傳導性聚合 材料或其他材料。
在一個實施方式中，電穿孔室組件包括帶有一個或多個孔洞的電極板12。每個 孔洞還可以是流入口、流出口、或者非樣品液體或氣體入口/出口，分別作為連接流 式電穿孔裝置的流入/流出流動通路的接口。
電穿孔室還可以包含一個或多個附件以便于使組件緊密組裝。在本發(fā)明的不同 實施方式中，附件14包括緊固件如螺絲、螺栓、鉚釘、螺桿或夾子，用于將電極板 12插到墊圈13和室11的預期位置上。在本發(fā)明的電穿孔室11的其他實施方式中， 附件14可通過粘附、其他接合技術或封裝裝置固定。
附件可以是附孔，其大小和位置可容納螺桿。這種螺桿可直接插到附孔內或者插到電極板的套管內，螺桿可被固定以固定電穿孔室。在使用傳導性電極間隔的實 施方式中，相對的電極板之間的絕緣可通過絕緣的電極板套管來實現(xiàn)。
在其他實施方式中， 一個或兩個相對的電極板12還可以包含帶有冷卻元件的界 面。冷卻元件可以是熱電冷卻元件，或者通過與水或其他冷卻劑直接接觸、通過散 熱裝置通風來冷卻，或者通過其他冷卻裝置驅散電穿孔過程中產生的熱量，電穿孔 過程通常都是產熱過程。
在本發(fā)明的另外一個方面，電穿孔室與一個封閉的一次性單沖程泵送系統(tǒng)可操 控地連接在一起，這種泵送系統(tǒng)不需要止回閥，如圖15所示。許多氣泵都使用擺動 的彈性膜，需要止回閥使空氣定向流動。由于變速流系統(tǒng)的許多實施方式都有止回 閥作為系統(tǒng)的一部分，因此電穿孔室的注入/排出過程可在帶彈性膜的活塞的一個沖 程中完成。
因此，具有這個特征的處理室是很便宜的，并且是一個完全密封的單位，在變 速流處理過程中可達到十分精確的樣品運送。參照圖15，處理室的組件包括而不限 于硅膠墊圈13、電極12、塑料體50和彈性膜52。電穿孔室11的壁和非樣品液體或 氣體容器35(見圖2)可由墊圈形成。墊圈13可以是單片結構的。在這種實施方式中， 有活塞54;由步進電機和裝置表面上的計算機控制的壓縮線性執(zhí)行機構56。帶有這 種單沖程活塞機器的本發(fā)明的實施方式包含兩個擠壓閥門，如上面的圖2所描述(閥 門32和38)。接口 17、 18和19的典型位置也顯示在圖15中。
本文所描述的特殊實施方式是以舉例說明的方式描述本發(fā)明，不能解釋為將本 發(fā)明限制在特殊實施例上。
本發(fā)明的某些方面包括在電穿孔裝置(圖IO)中插入本發(fā)明的電穿孔室和各種處 理構件。在本發(fā)明的某些實施方式中，本發(fā)明的流式電穿孔裝置包含如下構件包 含電穿孔室的組件；容納樣品、已處理樣品和非樣品液體或氣體以及可用于本發(fā)明 的其他試劑的各種容器；提供高壓脈沖的電子元件和電路；控制電路和液流的計算 機；以及與計算機連接的監(jiān)視器，監(jiān)視器可使操作者評估數(shù)據(jù)、向計算機輸入數(shù)值 或程序。
本發(fā)明利用可調流式電穿孔開發(fā)出新的電穿孔法和電穿孔裝置。本文所舉例說 明的及描述的方法包括細胞懸液的可調流動和電穿孔。本發(fā)明的室可以組裝，因此 其價值很低，可以一次性使用。不同構型的電穿孔室都可用于本發(fā)明中，如本文所 描述的實施例。當細胞懸液處于電極之間時，細胞懸液接受預先確定電參數(shù)的一次 或多次電脈沖，電參數(shù)包括電壓、持續(xù)時間和脈沖之間的短暫間隙(如果有多次脈沖)。
21根據(jù)細胞類型的不同以及人們想通過電穿孔導入到細胞內的可能分子的不同，所選 擇的最佳電參數(shù)也是不同的。適宜的電參數(shù)是本領域所熟知的，利用試驗確定適于 新類型細胞的最佳電參數(shù)的方法也是大家所熟知的。適于多種類型的哺乳動物細胞 的一個典型參數(shù)是l kV/cm， 1 ms的脈沖寬度。目的分子、化合物或組合物隨著濃 度梯度和/或電梯度彌散到細胞內。本發(fā)明還能夠給細胞施加一定強度范圍內的電場。 一般來說，用于本發(fā)明的電場強度要高于約0.5 kV/cm;優(yōu)選約1 kV/cm到3.5 kV/cm。 處理過程開始于在電穿孔室上連接管道，管道與容器內的溶液和細胞懸液相通， 這個過程應該在無菌環(huán)境中進行。電穿孔室可卡到裝置的受位上，通過閉合可折面 板將其固定。細胞懸液和/或其他試劑的注入可通過給一個或多個泵、闊門或其組合 下達指令使細胞懸液在適當?shù)臅r間、以適當?shù)乃俣攘魅腚姶┛资叶瓿伞．斠徊糠?細胞懸液位于電極之間的電穿孔室中時，給電極提供進而也給懸液中的細胞施加設 定電壓、持續(xù)吋間和間歇時間的電脈沖。在施加所需的電脈沖后，給一個或多個泵、 閥門或其組合下達指令，從電穿孔室中排出細胞懸液。另外也可以下達指令將一部 分新的細胞懸液注入到電穿孔室內。已進行電穿孔的細胞懸液與未進行電穿孔的細 胞分開收集。上述一系列事件可由計算機控制使其在時間上協(xié)調進行，計算機與提 供電脈沖的電路以及影響和控制細胞懸液流入和流出電穿孔室的泵、閥門或其組合 可操控地連接。操作者通過可操控地連接到計算機上的監(jiān)視器的圖形界面和鍵盤向 計算機內輸入給細胞懸液施加的電脈沖以及流入和流出電穿孔室的細胞懸液的流速 和持續(xù)時間。下面將詳細描述本發(fā)明的流式電穿孔系統(tǒng)的實施例。
A. —次性電穿孔室及其相關組件(一次性裝置)
一次性裝置包括本文所描述的各種容器(如PVC袋)、PVC管、接頭、硅膠泵管
以及電穿孔室。與血液或其他細胞材料接觸的所有塑料組件都可以用醫(yī)用級iv類材
料D
電穿孔室(見圖5)包括兩個電鍍有約100微英寸純金(99.9%)的低碳鋼(99+°/。鐵) 電極。電極通常為20mm長、整體寬度為77pm。當電極平行放置時，棒狀電極之 間的最大距離為154 pm。在組裝過程中， 一般將電極插到電極墊圈內，然后將其夾 到隔板和平板之間。平行棒狀電極之間的正常間隙為3mm。電穿孔室的內容積約為 1.6mL。
電極可用包被金屬層或其他電傳導性化合物的任何非傳導性材料制備。 在某些實施方式中，可有l(wèi)、 2、 3、 4、 5、 6或更多個容器或源連接到一次性裝置上。容器包括而不限于可折疊的、可擴張的或固定體積的容器。第一容器被稱為 樣品源或樣品容器，可容納細胞懸液，可以包含，也可以不包含通過電穿孔過程插 入到細胞內的物質D如果不包含插入到細胞內的物質，那么就需要有第二容器來容 納這些物質，這些物質在進入電穿孔室前或者在電穿孔室內在線混合。第一容器(也 可以是第二容器)與PVC或其他適宜的管線相連，如果其構型中包含閥門，那么液體 可通過任何指定的閥門流入電穿孔室的第一接口(流入口)。在某些實施方式中，可以 考慮使用帶一個接口的電穿孔室來實現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明的其他實施方式包含其他容 器，這些容器與來自樣品容器的管線相連，可向室內提供試劑或其他樣品。匯聚的 溶液可在到達電穿孔室之前、期間或之后混合。
在其他的實施方式中，電穿孔室的第二接口(流出口)至少與1、 2、 3、 4或更多
個容器相通，可以有一個或多個介入裝置引導溶液從電穿孔室流到適當?shù)娜萜鲀取?在其他的構型中，可以連接一個容納廢物的容器，該容器可容納使用者希望丟棄的 任何液體。第二或第三容器或袋被稱為已處理樣品容器或產物容器。已處理樣品容 器或產物容器可容納經(jīng)過電穿孔的細胞或經(jīng)電穿孔處理的其他產物。
第三或第四容器可容納各種非樣品液體或氣休，非樣品液體或氣體用于將樣品 分隔成不連續(xù)的體積或單位體積。非樣品液體或氣體容器可與已處理樣品容器或樣 品容器合并，這樣可以將非樣品液體或氣體從己處理樣品容器轉移到另一個容器內， 后者在樣品處理過程中可以是樣品源容器。在某些方面，容納非樣品液體或氣體的 儲存罐可與室合并，只要非樣品液體或氣體可以被壓縮以使電極處于正確的位置上 進行電穿孔就可以。
如較早前所提及的，其他各種容器都可以合并到本文所舉例說明的構型內。這 些其他的容器可供應其他的試劑、細胞等。其他的容器也可以用作廢物容器或用作
分隔已處理樣品的容器。在各種實施方式中，本發(fā)明的電穿孔室可包含1、 2、 3或 更多對電極。在室包含一對以上電極的情況下，當施加脈沖時只有處于電極對之間 的細胞懸液能被有效電穿孔或完全電穿孔。如果需要，可以設置多個電穿孔室以便 于更快速地進行更大體積的電穿孔。本文所用的術語電穿孔區(qū)是指室內的一個區(qū)域， 流過該區(qū)域的材料被暴露于強度足以影響電穿孔的電場中。根據(jù)本發(fā)明，我們希望 確定電穿孔室電穿孔區(qū)相對壁至少一部分的兩個成對電極形成了電穿孔區(qū)內那些相 對壁的基本部分。如本文所述，如果電極所處的位置使在電極對上施加電壓差時在 它們之間存在基本均勻的電場，那么我們就說電極是一對。本文所用的術語基本部 分是指大于約50%，優(yōu)選的是大于約60%，更優(yōu)選的是大于約70%、 80%、 90%，最優(yōu)選的是約100%。
優(yōu)選的是，電穿孔室作為無菌單位供一次性使用。因此，電穿孔室的組件優(yōu)選 用能抵抗滅菌過程如高壓滅菌、輻射滅菌或化學滅菌的材料制備。
適用于本文所述的裝置組件的材料包括被批準可用于接觸內部體液的生物相容 性醫(yī)用材料，這些材料應該符合US PV1或ISO 10993標準。另外，材料在至少使用 一次的過程中與本發(fā)明所用的溶劑接觸時應當不會發(fā)生實質性降解。材料一般都可 以通過輻射滅菌或環(huán)氧乙烷(EtO)滅菌方法滅菌。這種合適材料包括可拉伸的材料， 例如用于制備管線時，和/或可澆鑄的材料，例如用于制備硬容器時。用于制備本發(fā) 明的各種組件的材料包括而不限于尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸酯、聚砜、聚 偏(二)氟乙烯(PVDF)、氟彈性體如DuPont Dow Elastomers L.L.C.的VITON、熱塑性 的彈性體如Monsanto的SANTOPRENE、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚 苯醚(PFE)、全氟烷氧基共聚物(PFA)如E. I. du Pont de Nemours and Company的 TEFLON PFA，以及上述物質的組合。
在很多情況下，參考電穿孔處理的通量或在一定時間內處理的細胞懸液量是很 重要的。由于電穿孔單位體積的細胞懸液需要一定量的能量，因此，在一定的時間 內，電穿孔的細胞懸液體積越大，在相同的時間內所消耗的能量越多。給細胞懸液 加上電壓就會產生流經(jīng)懸液的電流，細胞懸液是有電阻的。根據(jù)焦耳定律，這個電 流會產生熱量。由于給室及其內容物提供的大多數(shù)電能都轉化成了熱能，因此，給 室及其內容物提供的電功率(P)與做功時間及室內所產生的熱之間的關系式為P = Q/t，其中Q為熱，t為時間。
電穿孔所產生的熱量可使細胞懸液的溫度升高，至少是瞬時升高。由于我們不 希望細胞的溫度超過45°C，因此最好提供一種冷卻細胞懸液和電穿孔室的方法以避 免細胞達到不可接受的溫度。暴露于這種高溫下所產生的損傷效應與暴露的時間長 短有關，因此在進行電穿孔后要盡快冷卻。由于在電穿孔過程中電穿孔室反復地接 受高壓脈沖進而產生熱量，因此，冷卻電穿孔室和已電穿孔的細胞是尤其重要的。 但是，雖然在一般情況下是通過使細胞懸液與金屬部分立刻接觸進行冷卻，金屬部 分由Peltier元件或氣流或液流依次冷卻，但是對冷卻過程也有一些原則限制。在很 多情況下，電穿孔過程的設計者忽視或忘記了這樣一個事實，即金屬的熱傳導性比 水(或生物緩沖液)的熱傳導性要高的多，這就意味著熱量從流動管道向冷卻單位的轉 移總是受到水或細胞懸液自身熱傳導性的限制。在這種情況下，選擇具有合適幾何 形狀的流動管道是十分重要的，這樣才能以最有效的途徑完成熱量轉移。B.樣品流的調節(jié)
與本發(fā)明相關的各種液體和/或氣體流可由一個或多個泵裝置、閥門或其他裝置 調節(jié)，這些裝置可促進、抑制或完全阻止流動，或者調節(jié)流動。這可通過一個或多 個將細胞懸液或其他液體泵送到電穿孔室內的泵、 一個或多個將細胞懸液或其他液 休泵出電穿孔室的泵、或其組合來完成。另外還可以通過能夠改變電穿孔室內的氣 壓或容積的泵或其他裝置使細胞懸液流入或流出電穿孔室。在某些實施方式中，重 力可用于使單位體積的樣品在一對電極之間移動?？捎玫拈y門包括擠壓閥、蝶形閥 和/或球形閥，這些閥門可使流動通路完全或部分開放或閉合。在許多實施方式中， 所使用的泵可調節(jié)和計量裝置內流動的液體。許多裝置內的液體泵送都是相似的。 根據(jù)使用目的的不同，被轉移、分散或計量的液體可以是試驗樣品，也可以是各種 試劑和洗滌溶液。在將裝置設計成可處理更小體積的液體時，就更需要-1分精確的 計量泵。
有時可用離心泵或主動置換泵來完成液體轉移。離心泵通過旋轉渦輪將能量轉 移給液體，渦輪能轉化成液壓，液壓可使液體流動。這種類型的泵是壓力和液體依 賴型的， 一般不能用于計量，因為它們在改變進入和排出條件時不能維持很精確的 液體流動。其優(yōu)點在于在低壓下就可以提供高流速。
主動置換泵通過捕獲固定體積的液體并利用齒輪、活塞、隔膜、葉片或其他裝 置移動此液體來運行。這些泵一般都以低速運行，對排出和抽吸條件的變化不敏感， 只是通過調節(jié)速度和置換來控制流動。這些特征使主動轉換泵成為計量液體的好裝 置。因此計量泵被定義為被設計成能夠在特定容積范圍內提供十分精確且可重復的 流動的主動置換裝置。主動置換計量泵通常被歸類為旋轉泵或往復泵。旋轉泵包括 齒輪泵、裂片泵、葉片泵和滾壓泵(蠕動泵)。往復泵包括隔膜泵、活塞泵和風箱泵。
C.其他組件
電穿孔裝置如本文所描述的那些電穿孔裝置包含各種其他組件，如一個或多個 電子模塊接口、計算機、監(jiān)視器以及其他電子電路和本領域技術人員很容易使用的 軟件。有關電穿孔系統(tǒng)的總體設計以及對這種系統(tǒng)的其他各種組件的描述見已公開 的美國專利申請No. 200400292240、 20030073238、 20030059945和20010001064，
木文已納入作為參考。
25實施例
下面的實施例用于證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領域的技術人員應當理解的 是，實施例中所描述的技術代表發(fā)明者所發(fā)現(xiàn)的能成功實現(xiàn)本發(fā)明的技術，因此應 當被認為構成了用于實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選模式。但是，本領域的技術人員通過閱讀本 說明書后應當理解，只要不偏離本發(fā)明的精神和范圍，對本文所描述的特殊實施方 式進行多種修改也能得到類似的或一致的結果。
實施例l可變流式電穿孔
我們利用可調或可變流式電穿孔進行了一個典型的電穿孔試驗。Jurkat細胞作為 一個模型系統(tǒng)，GFP表達載體作為轉化的模型化合物。所有的細胞密度都為4xl07 Jurkat細胞/mL,質粒濃度為每毫升100微克pTM2質粒DNA(約5 Kb)，該質?？杀?達eGFP(綠色熒光蛋fi)。試驗過程為從室中排出非樣品液體或氣體；同時向室內 注入含Jurkat細胞和GFP載體的樣品。在樣品從流入到流出的過程中對單位體積的 樣品進行電穿孔。從室內排出已處理的樣品，同時注入非樣品液體或氣體。圖U顯 示的是對照細胞、用400 (aL靜態(tài)處理方法處理的細胞以及用100 mL可變流動處理 方法處理的細胞，檢測碘化丙錠熒光或GFP熒光。圖12是用直方圖表示的對照細 胞(圖12A)、用400 靜態(tài)處理方法處理的細胞(圖12B)和用100 mL可變流式方法 處理的細胞(圖12C)的GFP熒光的FACS分析結果。圖13顯示的是利用可變流式電 穿孔法處理14個連續(xù)樣品組分所得到的單位樣品與單位樣品之間結果的一致性。通 過分析GFP轉染情況及細胞存活率將細胞分為死細胞、未轉染的活細胞和已轉染的 活細胞。參考資料
以下參考資料被納入本文作為參考，其程度為程序性地例舉或對文中提到的內容 進行補充。
美國專利4,752,586 美國專利5,612,207 美國專利6,074,605 芙國專利6,090,617 美國專利申請20010001064 美國專利申請20030059945 美國專利申請20030073238 美國專利申請200400292240
權利要求
1. 一種流式電穿孔法，該方法包括調節(jié)通過電穿孔室的樣品流，其中，所述樣品以分隔單位的形式進行處理。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品流通過至少一個閉合流動通路。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單位通過降低樣品通過電穿孔室 的流速而形成。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述單位通過在未處理的樣品體積與 已處理的樣品體積之間提供邊界而形成。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述邊界是氣體或液體。
6. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述邊界是通過將非樣品氣體或液體 循環(huán)入兩個或多個樣品組分之間的室內而提供的。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述非樣品氣體或液體被一定體積未 處理的樣品置換出室。
8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述非樣品氣體或液體通過從室中排 空巳處理樣品而流入室內。
9. 如權利耍求6所述的方法，其特征在于，通過改變通過第一接口和第二接口的 杼品流來實現(xiàn)循環(huán)。
10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，通過一個或多個閥門調節(jié)循環(huán)。
11. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，樣品在進入電穿孔室之前或期間混合。
12. —種流式電穿孔室，其包括a) 具有至少兩個電極的室；以及b) 至少三個接口，其中(i)第一接口用于樣品流入室；(ii)第二接口用于己處理 樣品流出室；禾叩ii)第三接口用于非樣品液體或氣體流入或流出室，其中，當樣品流 入室時非樣品液體或氣體流出室，當已處理樣品流出室時非樣品液體或氣體流入室。
13. 如權利要求12所述的室，其特征在于，所述第一接口與一個或多個樣品容器形 成流體連通。
14. 如權利要求12所述的室，其特征在于，所述第二接口與一個或多個已處理樣品 容器形成流體連通。
15. 如權利要求12所述的室，其特征在于，所述第三接口與儲存容器形成流體連通， 其中當室內注滿或部分注滿樣品體積時儲存容器容納全部或部分非樣品液體或氣體。
16. 如權利要求12所述的室，其特征在于，所述室具有至少4個接口。
17. 如權利要求16所述的室，其特征在于，至少第四接口與樣品容器、已處理樣品 容器、非樣品氣體或液體儲存容器或試劑容器形成流體連通。
18. —種流式電穿孔裝置，該裝置包括a) 至少一個樣品容器，該容器通過第一室接口與電穿孔室流體連通，形成第一 流動通路；以及b) 至少-一個已處理樣品容器，該容器通過第二室接口與電穿孔室流體連通，形 成第二流動通路。
19. 如權利要求18所述的裝置，該裝置還包括至少一個非樣品液體或氣體儲器，該 儲器通過第三室接口與電穿孔室流體連通，形成第三流動通路。
20. 如權利要求18所述的裝置，其特征在于，所述第一和第二接口是同一個接口。
21. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，至少一個流動通路是閉合流動通路。
22. 如權利要求21所述的裝置，其特征在于，所述第一、第二和第三流動通路是閉 合流動通路。
23. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體儲器是非樣品 氣體或液體容器。
24. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體儲器是樣品容 器、已處理樣品容器或者既是樣品容器又是已處理樣品容器。
25. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述第二流動通路與第一流動通路的 樣品容器和第三流動通路的非樣品儲器流體連通，第三流動通路的非樣品儲器相對于 第二流動通路上的已處理樣品容器來說處于電穿孔室的遠端。
26. 如權利要求19所述的裝置，該裝置還包括與至少一個流動通路可操控連接的至 少一個泵裝置。
27. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述樣品容器是可折疊的、可擴張的 或固定體積的。
28. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述已處理樣品容器是可折疊的、可 擴張的或固定體積的。
29. 如權利要求23所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體容器是可折疊 的、可擴張的或固定體積的。
30. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述裝置內的液流通過裝置一個或多 個流動通路的開放或閉合來引導。
31. 如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述第一和第二流動通路交替開放和閉合。
32.如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述液流由一個或多個閥門調節(jié)。
33.如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述液流由一個或多個泵裝置調節(jié)。
34.如權利要求33所述的裝置，其特征在于，所述泵裝置是泵。
35.如權利要求34所述的裝置，其特征在于，所述泵是蠕動泵。
36.如權利耍求35所述的裝置，其特征在于，所述蠕動泵是全壓縮蠕動泵。
37.如權利要求19所述的裝置，其特征在于，所述液流由閥門調節(jié)。
38.如權利要求37所述的裝置，其特征在于，所述液流由泵裝置調節(jié)。
39.一種流式電穿孔裝置，該裝置包括-a) 至少--個通過第一室接口與電穿孔室流體連通的樣品容器，該電穿孔室通過 第二室接口與樣品容器流體連通，形成第一流動通路；b) 至少 -個通過第二室接口與電穿孔室流體連通的已處理樣品容器，該電穿孔 室通過第四室接口與已處理樣品容器流休連通，形成第二流動通路。
40. 如權利要求39所述的裝置，其特征在于，所述已處理樣品容器也用作非樣品氣 體或液體儲器。
41. 如權利要求40所述的裝置，其特征在于，所述非樣品氣體或液體儲器是樣品容 器、已處理樣品容器或者既是樣品容器又是已處理樣品容器。
42. 如權利要求39所述的裝置，該裝置還包括與至少一個流動通路可操控連接的至 少一個泵。
43. 如權利要求39所述的裝置，其特征在于，所述樣品容器是可折疊的、oj擴張的 或固定體積的。
44. 如權利要求39所述的裝置，其特征在于，所述已處理樣品容器是可折疊的、可 擴張的或固定體積的。
45. 如權利要求39所述的裝置，其特征在于，所述裝置內的液流通過裝置一個或多 個流動通路的開放或閉合來引導。
46. 如權利要求39所述的裝置，其特征在于，所述第一和第二流動通路交替開放和 閉合。
47. 如權利要求39所述的裝置，其特征在于，所述液流由'個或多個泵裝置調節(jié)。
48. 如權利要求47所述的裝置，其特征在于，所述泵裝置是泵。
49. 如權利要求48所述的裝置，其特征在于，所述泵是蠕動泵。
50. 如權利要求49所述的裝置，其特征在于，所述蠕動泵是全壓縮蠕動泵。
51. 如權利要求39所述的裝置，其特征在于，所述液流由閥門調節(jié)。
52. 如權利要求51所述的裝置，其特征在于，所述液流由泵裝置調節(jié)。
全文摘要
電穿孔室及其相關裝置將作為歧管調節(jié)樣品流動的電穿孔室的特征與流式電穿孔裝置的特征結合在一起形成可調流式電穿孔裝置。本發(fā)明還包括一種新型可調流式電穿孔室，這種電穿孔室可改變條件使其中的樣品在一個完全密封(無菌)的系統(tǒng)內以獨立組分或獨立體積的形式受到均一的處理。
文檔編號C12M3/00GK101426929SQ200580015262
公開日2009年5月6日 申請日期2005年5月12日 優(yōu)先權日2004年5月12日
發(fā)明者L·李, N·肖帕斯, S·澤庫諾夫 申請人:麥克賽特股份有限公司