專利名稱：由HLA－A2402－限制的Ep－CAM－特異的CTL識(shí)別的表位/肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別的表位肽，抗原呈遞細(xì)胞和主要組織相容性抗原復(fù)合體；含有這些物質(zhì)作為活性成分的癌癥疫苗或胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑；含有此種胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑作為活性成分的表皮癌的被動(dòng)免疫治療藥物；利用上述物質(zhì)的癌癥治療或改善方法；以及特異于癌癥的HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞的定量方法。
背景技術(shù)：
胞毒T淋巴細(xì)胞(下文稱為“CTL”)被認(rèn)為是抵抗癌癥的重要因子。
在癌癥患者的腫瘤部位可觀察到針對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示胞毒性的CTL滲入。腫瘤抗原為被這種腫瘤特異的CTL靶向的分子，在細(xì)胞中分解成含有8-11個(gè)氨基酸的肽(腫瘤表位肽)，結(jié)合到人白細(xì)胞抗原(下文稱為“HLA”，為一種主要組織相容性抗原)，然后呈遞在腫瘤細(xì)胞表面。CTL識(shí)別含有HLA和腫瘤抗原肽的復(fù)合體，并攻擊腫瘤細(xì)胞。由此，CTL通過(guò)腫瘤抗原的HLA限制識(shí)別腫瘤細(xì)胞。
HLA為在幾乎所有細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞膜抗原，并被主要分成I型抗原和II型抗原。與表位肽一起被CTL識(shí)別的HLA劃分為I型抗原。HLAI型抗原進(jìn)一步被分成HLA-A，HLA-B，HLA-C等，而且它們的基因還具有亞型。例如，HLA-A是多態(tài)性的，并具有A1，A2，A24，A26等亞型。因此，各個(gè)人個(gè)體的HLA不總是相同，CTL在識(shí)別HLAI型抗原和腫瘤表位肽的復(fù)合體時(shí)甚至可識(shí)別這些HLA亞型。進(jìn)一步，能夠結(jié)合到HLA的表位肽已知具有能夠結(jié)合到各型HLA之一的肽序列基元(模式序列)。因此，對(duì)誘導(dǎo)和/活化CTL而言，選擇含有能夠結(jié)合到每個(gè)患者不同型HLA的基元的肽是必要的。
Ep-CAM是在上皮起源的癌細(xì)胞表面上廣泛表達(dá)的分子，并擔(dān)當(dāng)非鈣依賴性細(xì)胞—細(xì)胞附著的中間物。Ep-CAM也稱作EGP-2，17-1A，GA733-2或KSA。Ep-CAM在衍生自諸如大腸，肺，頭和頸，乳腺等不同組織起源的許多腫瘤中是高度表達(dá)的，而其表達(dá)在正常上皮細(xì)胞中是區(qū)域性的。進(jìn)一步，由于腫瘤發(fā)展和Ep-CAM表達(dá)水平相關(guān)，因此Ep-CAM表達(dá)的檢測(cè)作為標(biāo)記診斷最低存在的腫瘤轉(zhuǎn)移和在預(yù)測(cè)患者預(yù)后中是有用的。
Ep-CAM在源自上皮細(xì)胞的癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但在正常細(xì)胞中局部表達(dá)。鑒于此，Ep-CAM是利用單克隆抗體進(jìn)行免疫治療和基因治療中的重要靶。
例如，有報(bào)道，給其腫瘤已通過(guò)手術(shù)摘除的患者施用Ep-CAM-特異的鼠單克隆抗體(命名為17-1A)可有效預(yù)防遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移，以及連續(xù)7年給藥對(duì)提高生存率是有效的。還有報(bào)道，命名為17-1A的Ep-CAM-特異的單克隆抗體在用于治療大腸癌患者時(shí)對(duì)減少死亡率和腫瘤復(fù)發(fā)是有效的。
此外，最近的一些報(bào)道公開的事實(shí)顯示利用CTL靶向HLA-限制的Ep-CAM治療癌癥的可能性。
例如，專利文獻(xiàn)1報(bào)道，HLA-A0201-限制的Ep-CAM-特異性CTL破壞上皮腫瘤細(xì)胞，但不影響正常細(xì)胞。專利文獻(xiàn)1中公開的肽由SEQID NO12所示的序列YQLDPKFITSI組成，作為被HLA-A0201-限制的CTL識(shí)別的Ep-CAM 174-184表位肽。
T-細(xì)胞對(duì)Ep-CAM的反應(yīng)還在沒(méi)有接受免疫治療的結(jié)腸和大腸癌患者中觀察到。另外，在大腸癌患者免疫以Ep-CAM表達(dá)的重組金絲雀痘病毒時(shí)，抗Ep-CAM-特異性CTL反應(yīng)的獲得不會(huì)引起自身免疫反應(yīng)。
在HLA I型抗原的HLA-A型中，日本人的HLA-A24表達(dá)最多。結(jié)果，HLA-A24-限制的Ep-CAM表位肽推測(cè)是理想的癌癥疫苗。有關(guān)這種表位肽的報(bào)道例子如下。
專利文獻(xiàn)2公開5種表位肽，由含有9個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成，來(lái)自SART-2腫瘤抗原蛋白，作為HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻(xiàn)3公開6種表位肽，由含有8-11個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成，來(lái)自ART-4腫瘤抗原蛋白，作為HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻(xiàn)4公開7種表位肽，由含有8-11個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成，來(lái)自在大腸癌細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中異常表達(dá)的p56luk蛋白(由luk基因編碼的腫瘤抗原蛋白)，作為獲自從食道癌患者建立的細(xì)胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻(xiàn)5公開4種PI-9-衍生的表位肽，由含有9-10個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成，獲自KE4腫瘤細(xì)胞系—衍生的cDNA文庫(kù)，作為獲自從食道癌患者建立的細(xì)胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻(xiàn)6公開17種PI-9-衍生的表位肽，由含有9-10個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列組成，獲自11-18肺腺癌細(xì)胞系cDNA文庫(kù)，作為獲自從肺癌患者建立的細(xì)胞系的HLA-A2402-限制的CTL表位肽。
專利文獻(xiàn)7公開由9-10個(gè)氨基酸殘基組成的表位肽，具有能夠結(jié)合到HLA-A24.1的基元(HLA-A2402)，并在N-端具有第一保守殘基Y，F(xiàn)或W，以及在C-端具有第二保守殘基F，I，W或M，其中第一和第二保守殘基由6-7個(gè)殘基分開。
如上所例證，腫瘤相關(guān)抗原中的不同HLA-A2402-限制的CTL表位已被鑒定；然而腫瘤抗原的表達(dá)依據(jù)組織起源，個(gè)體癌癥患者和各患者損傷而變化，因此其他新表位預(yù)計(jì)被指定。
此外，由于通過(guò)能夠結(jié)合到HLA-A2402分子的Ep-CAM表位肽衍生CTL尚未確認(rèn)，因此對(duì)開發(fā)能夠結(jié)合到HLA-A2402分子及能夠誘導(dǎo)CTL的新型癌細(xì)胞-特異的Ep-CAM表位肽存在需求。
專利文獻(xiàn)1國(guó)際專利公布No.WO 97/15597專利文獻(xiàn)2未審日本專利申請(qǐng)公布No.1999-318455專利文獻(xiàn)3未審日本專利申請(qǐng)公布No.2000-116383專利文獻(xiàn)4國(guó)際專利公布No.WO2000-06595專利文獻(xiàn)5未審日本專利申請(qǐng)公布No.2001-245675專利文獻(xiàn)6未審日本專利申請(qǐng)公布No.2003-270專利文獻(xiàn)7未審日本專利申請(qǐng)公布No.1996-500103(權(quán)利要求11等)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明解決的問(wèn)題本發(fā)明目的是提供能夠誘導(dǎo)HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞的Ep-CAM表位肽，抗原呈遞細(xì)胞和主要組織相容性抗原復(fù)合體；含有這些物質(zhì)作為活性成分的癌癥疫苗或胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑；Ep-CAM-特異性HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞；含有此種淋巴細(xì)胞的被動(dòng)免疫治療藥物；利用上述物質(zhì)的癌癥治療或改善方法；以及上皮癌特異的HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞的定量方法。
解決問(wèn)題的方法為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人通過(guò)生物信息學(xué)途徑在Ep-CAM蛋白中預(yù)測(cè)和合成了7種肽序列，找到了具有結(jié)合到HLA-A2402分子能力的表位肽序列，HLA-A2402分子在日本人中是最常見的HLA-A類型(60％以上)，以及在歐洲人中約20％。
當(dāng)通過(guò)生物學(xué)信息途徑預(yù)測(cè)能夠結(jié)合到特異性HLA分子的肽時(shí)，由這種預(yù)測(cè)的肽誘導(dǎo)的胞毒T淋巴細(xì)胞實(shí)際上通常不識(shí)別含有這種肽的抗原。
在此情形下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，特異于7種預(yù)測(cè)的表位肽中的2種的CTL克隆真正對(duì)HLA-A2402陽(yáng)性Ep-CAM表達(dá)癌細(xì)胞顯示胞毒性，但對(duì)HLA-A2402陰性癌細(xì)胞不顯示胞毒性。
而且，冷靶抑制分析證明，這些表位肽被加工，并作為抗原呈遞在HLA-A2402陽(yáng)性Ep-CAM陽(yáng)性癌細(xì)胞上。
結(jié)果，這兩種肽可用作具有HLA-A2402人的癌癥疫苗。
本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而完成，并提供下列表位肽等。
第1項(xiàng).下列(1)-(4)任一項(xiàng)的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的肽；
(3)基本上由通過(guò)添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO1所示氨基酸序列的氨基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞；(4)基本上由通過(guò)添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞。
第2項(xiàng).下列(1)或(2)的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示氨基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的肽。
第3項(xiàng).包含第1或2項(xiàng)的肽作為活性成分的癌癥疫苗。
第4項(xiàng).第3項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
第5項(xiàng).第3或4項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第6項(xiàng).第3-5任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第7項(xiàng).包含第1或2項(xiàng)的肽作為活性成分的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑。
第8項(xiàng).第7項(xiàng)的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第9項(xiàng).下列(5)-(8)任一項(xiàng)的多核苷酸(5)基本上由SEQ ID NO10所示堿基序列組成的多核苷酸；(6)基本上由SEQ ID NO11所示堿基序列組成的多核苷酸；(7)在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO10所示堿基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞；(8)在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO11所示堿基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞。
第10項(xiàng).上皮癌的基因治療藥物，包含第9項(xiàng)的多核苷酸作為活性成分。
第11項(xiàng).重組載體，包含第9項(xiàng)的多核苷酸。
第12項(xiàng).轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入第11項(xiàng)的重組載體。
第13項(xiàng).第1或2項(xiàng)的肽的制備方法，包括培育第12項(xiàng)的轉(zhuǎn)化體，以及從培養(yǎng)物中收集第1或2項(xiàng)的肽的步驟。
第14項(xiàng).抗原呈遞細(xì)胞，其脈沖以第1或2項(xiàng)的肽。
第15項(xiàng).癌癥疫苗，包含第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞作為活性成分。
第16項(xiàng).第15項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
第17項(xiàng).第15或16項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第18項(xiàng).第15-17任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第19項(xiàng).胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞作為活性成分。
第20項(xiàng).第19項(xiàng)的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第21項(xiàng).主要組織相容性抗原復(fù)合體，包含主要組織相容性抗原，和第1或2項(xiàng)的肽，或者存在于第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽。
第22項(xiàng).第21項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體，包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和第1或2項(xiàng)的肽，或者存在于第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽。
第23項(xiàng).癌癥疫苗，包括第21或22項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體作為活性成分。
第24項(xiàng).第23項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
第25項(xiàng).第23或24項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第26項(xiàng).第23-25任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第27項(xiàng).胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括第21或22項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體作為活性成分。
第28項(xiàng).第27項(xiàng)的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第29項(xiàng).主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，包括主要組織相容性抗原，和第1或2項(xiàng)的肽，或者存在于第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽。
第30項(xiàng).利用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)，通過(guò)刺激外周血淋巴細(xì)胞獲得的胞毒T淋巴細(xì)胞(a)第1或2項(xiàng)的肽；(b)第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞；(c)第21或22項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)第29項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
第31項(xiàng).第30項(xiàng)的胞毒T淋巴細(xì)胞，其是通過(guò)下列步驟獲得的利用第30項(xiàng)限定的一種或多種(a)-(d)物質(zhì)，通過(guò)刺激外周血淋巴細(xì)胞，在主要組織相容性抗原復(fù)合體和/或其四聚體與胞毒T淋巴細(xì)胞之間形成復(fù)合體，并從復(fù)合體中分離胞毒T淋巴細(xì)胞。
第32項(xiàng).被動(dòng)免疫治療藥物，包括第30或31項(xiàng)的胞毒T淋巴細(xì)胞作為活性成分。
第33項(xiàng).第32項(xiàng)的被動(dòng)免疫治療藥物，其中癌癥為上皮癌。
第34項(xiàng).第32或33項(xiàng)的被動(dòng)免疫治療藥物，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第35項(xiàng).第32-34任一項(xiàng)的被動(dòng)免疫治療藥物，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第36項(xiàng).定量外周血中HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞的方法，其包括下列步驟
使一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)作用于外周血(a)第1或2項(xiàng)的肽；(b)第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞；(c)第21或22項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)第29項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，以及定量外周血中的胞毒T淋巴細(xì)胞或者由這樣的胞毒淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
第37項(xiàng).癌癥治療和/或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)(a)第1或2項(xiàng)的肽；(b)第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞；(c)第21或22項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)第29項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
第38項(xiàng).癌癥治療和/或改善方法，包括下列步驟從具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人患者的外周血中收集單核細(xì)胞部分，采用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)培養(yǎng)單核細(xì)胞部分(a)第1或2項(xiàng)的肽；(b)第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞；(c)第21或22項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)第29項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，以及將其中胞毒T淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)和/或激活的單核細(xì)胞部分返回至患者血液。
第39項(xiàng).誘導(dǎo)胞毒T淋巴細(xì)胞的方法，包括給具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)(a)第1或2項(xiàng)的肽；(b)第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞；(c)第21或22項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)第29項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
第40項(xiàng).癌癥治療或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人施用第30或31項(xiàng)的胞毒T淋巴細(xì)胞。
第41項(xiàng).第21項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，其中四聚體為包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和第1或2項(xiàng)的肽，或者存在于第14項(xiàng)的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽的復(fù)合體。
第42項(xiàng).癌癥疫苗，包括第41項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體作為活性成分。
第43項(xiàng).第42項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
第44項(xiàng).第42或43項(xiàng)的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
第45項(xiàng).第42-44任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
第46項(xiàng).胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括第41項(xiàng)的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
第47項(xiàng).第46項(xiàng)的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
發(fā)明效果本發(fā)明提供的表位肽衍生自在上皮癌細(xì)胞上廣泛表達(dá)的Ep-CAM分子，并可被限制至HLA-A2402的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別，HLA-A2402為日本人中最常見的人白細(xì)胞抗原類型。結(jié)果，這種表位肽可用作癌癥疫苗來(lái)治療分布廣泛的HLA-A2402-陽(yáng)性人上皮癌。
附圖簡(jiǎn)述

圖1示出多克隆肽激活的CTL細(xì)胞系的ELISOT分析評(píng)估結(jié)果。
圖2示出Ep-CAM肽特異的多克隆(A)和單克隆(B)CTL的四聚體染色結(jié)果。
圖3示出Ep173-特異性-CTL-克隆特征。
圖3A示出51Cr釋放分析，表明在肽Ep173或?qū)φ针腅BV-LMP419存在下C27(Ep173-特異的CTL克隆)針對(duì)T2-A24的胞毒性。
圖3B示出抗-HLA-A24單克隆抗體對(duì)Ep173-特異的CTL克隆(C27)針對(duì)HLA-A2402陽(yáng)性細(xì)胞系(PC9)的胞毒性的抑制作用。
圖3C示出在Ep173存在下，基于冷靶抑制分析，C27的胞毒性。
圖4示出基于PCR的Ep-CAM分析。
圖5示出Ep173-特異性CTL克隆(C27)針對(duì)多種不同的癌細(xì)胞系的胞毒性。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明詳細(xì)描述如下。
(I)表位/肽結(jié)構(gòu)參照HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)(HLA Peptide Binding Predictions)，BioInformatics & Molecular Analysis Section(BIMAS)，(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla bind/index.html)，這是檢索組成為9-10個(gè)氨基酸、在氨基酸序列中具有HLA-A2402-結(jié)合基元的表位肽的參考位點(diǎn)，所述序列衍生自在起源于上皮細(xì)胞的癌細(xì)胞上廣泛表達(dá)的Ep-CAM蛋白，作為篩選潛在的肽為表位肽的結(jié)果，本發(fā)明的肽經(jīng)確認(rèn)是被胞毒T淋巴細(xì)胞(下文稱為“CTL”)識(shí)別的表位肽。
更具體而言，本發(fā)明的肽為下列(1)-(4)任一種(1)基本上由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的肽；(3)基本上由通過(guò)添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO1所示氨基酸序列的氨基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞；(4)基本上由通過(guò)添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞。
在本發(fā)明中，肽表示生物活性氨基酸分子鏈，其中相鄰氨基酸殘基的α-氨基和羧基通過(guò)肽鍵連接。
除上述肽之外，肽還包括其鹽和衍生物，這是因?yàn)樗鼈兊纳锘钚詻](méi)被破壞。這些衍生物的例子包括那些糖基化、酰胺化、磷酸化、羧化、膦酸化、甲?；Ⅴ；妊苌?。優(yōu)選的鹽為酸加成鹽。這種鹽的例子包括鹽酸、磷酸、硫酸等無(wú)機(jī)酸加成鹽；以及甲酸、乙酸、丙酸、酒石酸等有機(jī)酸加成鹽。
(1)-(4)中限定的肽分別衍生自在起源于上皮細(xì)胞的癌細(xì)胞上廣泛表達(dá)的Ep-CAM，并被HLA-A2402-限制的CTL識(shí)別，或誘導(dǎo)或進(jìn)一步激活這種CTL。因此，這些肽可合適地用作CTL-誘導(dǎo)或激活腫瘤抗原，即癌癥疫苗，來(lái)治療或改善具有HLA-A2402的人癌癥。而且，這些肽可用于制備各種不同的腫瘤抗原表位特異的肽。本發(fā)明肽的應(yīng)用如下所述。
(3)和(4)中限定的突變肽的氨基酸最小數(shù)通常約為5，優(yōu)選約為7。氨基酸的最大數(shù)不受限制，只要肽可被HLA-A2402-限制的CTL識(shí)別，并通常約為12，含有約9至約11個(gè)氨基酸的突變肽是優(yōu)選的。
通過(guò)參照上述HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)(HLA Peptide Binding Predictions)，設(shè)計(jì)HLA-A2402-結(jié)合基元的序列，并且從中選擇那些真正被HLA-A2402-限制的CTL識(shí)別或誘導(dǎo)這種CTL的序列，可獲得這種突變肽。
HLA-A2402陽(yáng)性Ep-CAM表位肽例如通過(guò)下列方法鑒定。
淋巴細(xì)胞分離自HLA-A2402-陽(yáng)性成人，并以細(xì)胞濃度2×106/ml懸浮于含有10％人血清的RPMI1640培養(yǎng)基。向各細(xì)胞懸浮液以濃度1μg/ml加入其中一種表位候選肽。將懸浮液在CO2培養(yǎng)箱中37℃下溫育7天，并在第7天加入IL-2。其后，每周1次重復(fù)由候選肽刺激和IL-2刺激的循環(huán)，以誘導(dǎo)Ep-CAM-特異的CTL。
通過(guò)ELISPOT分析(Kuzushima K.等，The Journal of ClinicalInvestigation，(1999)，Vol.104，p.163-171)確定如此誘導(dǎo)的上皮癌-特異的CTL是否被表位候選肽刺激。
利用上述候選肽，合成含有約20個(gè)氨基酸的肽的肽文庫(kù)，覆蓋整個(gè)Ep-CAM蛋白，對(duì)合成的肽進(jìn)行ELISPOT分析，CTL對(duì)其反應(yīng)的肽逐漸縮短，以致最終包含約9至約10個(gè)氨基酸，從而用作本發(fā)明的表位肽。
此外，關(guān)于氨基酸替換，具有等同活性的突變肽極可能獲得，如果氨基酸的電荷，可溶性，親水性/疏水性，極性等性質(zhì)類似于那些替換前的氨基酸，則替換后的蛋白結(jié)構(gòu)予以保存。
導(dǎo)入缺失，添加(包括插入)和替換的方法是眾所周知的，例子包括Wurmer氏技術(shù)(Science，219，666(1983))。
本發(fā)明的肽可以與糖類，聚乙二醇，脂質(zhì)等加成的復(fù)合體，放射性同位素衍生物和聚合物等的形式使用。
(II)多核苷酸本發(fā)明的多核苷酸編碼上述本發(fā)明肽，并具體由下列(5)-(8)任一項(xiàng)限定(5)基本上由SEQ ID NO10所示堿基序列組成的多核苷酸；(6)基本上由SEQ ID NO11所示堿基序列組成的多核苷酸；(7)在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO10所示堿基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞；(8)在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO11所示堿基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的多核苷酸包括DNA和RNA。DNA包括cDNA，基因組DNA和合成DNA。RNA包括mRNA，rRNA和合成RNA。除具有這種堿基序列的多核苷酸之外，那些互補(bǔ)于這種多核苷酸的多核苷酸以及雙鏈多核苷酸也包括在內(nèi)。
SEQ ID NO10所示堿基序列的多核苷酸(編碼SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多核苷酸之一)，和SEQ ID NO11所示堿基序列的多核苷酸(編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸之一)是獲自人腫瘤相關(guān)抗原GA733-2的Ep-CAM基因的部分序列(Szala，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1990)87(9)，3542-3546)。
(7)和(8)中限定的突變多核苷酸為任一那些在編碼本發(fā)明表位肽的區(qū)域中通常含有15或更多，優(yōu)選21或更多，但通常45或更少核苷酸的多核苷酸。其中，含有約27至約33個(gè)核苷酸的多核苷酸是優(yōu)選的。
以DNA分子為多核苷酸分子的代表性例子，“在嚴(yán)格條件下可與DNA分子雜交的DNA分子”可通過(guò)例如下列文獻(xiàn)所述的方法獲得《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Sambrook等編，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)等。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指，例如，在6×SSC，0.5％SDS，和50％甲酰胺的溶液中42℃下加熱，并且在0.1×SSC和0.5％SDS的溶液中68℃下洗滌時(shí)，觀察到陽(yáng)性雜交信號(hào)的條件。
采用下述方法，利用公知的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)確認(rèn)在具有HLA-A2402的細(xì)胞上表達(dá)的肽被CTL識(shí)別或具有誘導(dǎo)CTL的能力，而選擇(7)和(8)的突變多核苷酸。
突變多核苷酸具有3’poly A結(jié)構(gòu)，多核苷酸中poly A的核苷酸數(shù)沒(méi)有限制，因?yàn)椴挥绊憮?dān)當(dāng)腫瘤抗原的氨基酸編碼區(qū)。
當(dāng)利用重組技術(shù)來(lái)制備本發(fā)明的表位肽時(shí)，本發(fā)明多核苷酸可提供有益的基因信息。這種多核苷酸可用作核酸試劑或標(biāo)準(zhǔn)多核苷酸。
(III)重組載體通過(guò)導(dǎo)入本發(fā)明多核苷酸至合適的載體DNA，獲得本發(fā)明的重組載體。
根據(jù)宿主細(xì)胞種類和用途目的，可合適地選擇載體DNA。載體DNA可以為那些天然存在的載體DNA，或者那些天然存在但有部分DNA從對(duì)增殖不必需的區(qū)域中丟失的載體DNA。載體DNA的例子包括那些起源于染色體，附加體和病毒的載體DNA。更具體而言，載體DNA包括那些衍生自細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體，轉(zhuǎn)位子，酵母附加體，插入元件，酵母染色體元件，病毒(例如，baculoviruses，乳頭狀多瘤空泡病毒，SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，偽狂犬病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒等)等的載體DNA，及其組合，以及那些衍生自質(zhì)粒和噬菌體(例如，粘粒，噬粒等)的基因元件的載體DNA。
而且，表達(dá)載體和克隆載體可用于生物合成本發(fā)明肽。
重組載體具有目標(biāo)多核苷酸的基因序列及編碼復(fù)制和控制信息的基因序列(例如，啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，終止子，信號(hào)序列，增強(qiáng)子等)的組成元件，并可通過(guò)公知方法組合這些序列而制備。
本發(fā)明多核苷酸通過(guò)公知方法可插入載體DNA。例如，利用合適的限制性酶，DNA和載體DNA可在特異位點(diǎn)連接，并利用連接酶為重組而混合?；蛘?，通過(guò)連接合適的接頭至本發(fā)明多核苷酸，并插入多核苷酸至滿足用途目的的載體DNA的多克隆位點(diǎn)可獲得載體DNA。
(IV)轉(zhuǎn)化體利用公知的方法，通過(guò)導(dǎo)入含有多核苷酸的上述重組載體至公知的宿主細(xì)胞，諸如，大腸桿菌(Escherichia coli)(例如，K12)，屬于桿菌屬的細(xì)菌(例如，MI114)，酵母(例如，AH22)，昆蟲細(xì)胞(例如，Sf細(xì)胞)，動(dòng)物細(xì)胞(例如，COS-7細(xì)胞，Vero細(xì)胞，CHO細(xì)胞等)等，可獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。
鑒于良好的基因穩(wěn)定性，基因整合至染色體的方法是優(yōu)選的基因轉(zhuǎn)移法。利用核外基因自動(dòng)復(fù)制系統(tǒng)為簡(jiǎn)單可用的方法。載體DNA轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞可通過(guò)公開在例如下列文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)等。更具體的例子包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，微注射，陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，刮載(scrape loading)，彈道導(dǎo)入和感染等。
(V)表位肽的制備方法本發(fā)明的肽可通過(guò)公知的肽合成法，諸如固相肽合成法等加以合成。這種肽合成法包括那些公開在“肽合成(Peptide Synthesis)”(Maruzen，1975)和“肽合成(Peptide Synthesis)”(Interscience，New York，1996)中的方法?；蛘?，本發(fā)明的表位肽可利用公知的化學(xué)合成設(shè)備，諸如Applied Biosystems生產(chǎn)的肽合成儀制備。
此外，本發(fā)明肽的制備方法包括下列步驟培養(yǎng)上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，以及從該培養(yǎng)物中收集本發(fā)明的肽。
利用對(duì)宿主細(xì)胞適合的培養(yǎng)基，通過(guò)次培養(yǎng)或分批培養(yǎng)，進(jìn)行這種培養(yǎng)。持續(xù)培養(yǎng)直到本發(fā)明肽以所需的量生產(chǎn)，這基于轉(zhuǎn)化體內(nèi)外生產(chǎn)的肽量，和/或CTL誘導(dǎo)能力，所述能力是由轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)的本發(fā)明肽顯示的作用之一。
在從培養(yǎng)基中收集之后，優(yōu)選的是進(jìn)一步純化本發(fā)明肽。純化可通過(guò)公知的方法進(jìn)行，諸如分子篩層析，離子交換層析，親和層析等層析技術(shù)；利用硫酸銨和/或醇等，基于溶解性差異的分級(jí)方式的組合。這種純化的進(jìn)行可基于通過(guò)CTL的肽識(shí)別或通過(guò)肽的CTL誘導(dǎo)，更具體例如，通過(guò)CTL的IFN-γ產(chǎn)量。
或者，培養(yǎng)基中的本發(fā)明肽利用多克隆或單克隆抗體可被特異性吸附回收，所述抗體的生產(chǎn)是基于本發(fā)明肽的氨基酸序列，并且特異于該氨基酸序列。
(VI)抗原呈遞細(xì)胞本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)用本發(fā)明肽脈沖樹突細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞而獲得。本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞能夠表達(dá)在其表面與本發(fā)明肽結(jié)合的HLA，并具有刺激CTL的能力。
“脈沖”不受限制，并可通過(guò)例如在含有約1-10μg/ml的本發(fā)明肽的培養(yǎng)基中，約20-約30℃下溫育這種抗原呈遞細(xì)胞約30分鐘至約1小時(shí)而進(jìn)行。由HLA-A2402-限制的CTL識(shí)別的腫瘤抗原肽由此呈遞在抗原呈遞細(xì)胞表面。
腫瘤抗原是指存在于腫瘤細(xì)胞中被腫瘤-特異的CTL識(shí)別，或進(jìn)一步誘導(dǎo)CTL或/和激活CTL的蛋白，多肽或肽。而且，腫瘤抗原肽是指通過(guò)分解腫瘤細(xì)胞中的腫瘤抗原而產(chǎn)生的肽，作為結(jié)合到HLA分子的結(jié)果，當(dāng)呈遞在細(xì)胞表面上時(shí)，這種肽被CTL識(shí)別，誘導(dǎo)CTL，或/和激活CTL。
表位序列衍生自腫瘤抗原中的氨基酸序列，并被腫瘤特異的CTL識(shí)別，或進(jìn)一步誘導(dǎo)或激活CTL，稱為腫瘤抗原表位(腫瘤抗原決定簇)。
在本說(shuō)明書中，“識(shí)別”表示認(rèn)識(shí)和區(qū)分靶和其他物質(zhì)，以及例如，結(jié)合到被認(rèn)識(shí)的靶。在本說(shuō)明書中，“CTL識(shí)別腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原表位肽”表示通過(guò)T淋巴細(xì)胞受體，CTL結(jié)合到人白細(xì)胞抗原(HLA)或腫瘤抗原肽。
“激活”表示進(jìn)一步增強(qiáng)或刺激具有某種活性或作用的物質(zhì)或狀態(tài)。具體而言，“CTL被激活”表示CTL產(chǎn)生效應(yīng)子，諸如，INF-γ，或顯示針對(duì)靶細(xì)胞的胞毒性，當(dāng)CTL識(shí)別被HLA呈遞的表位肽時(shí)，識(shí)別這些靶細(xì)胞。
“誘導(dǎo)”表示從基本沒(méi)有某種活性或作用的物質(zhì)或狀態(tài)引起這種活性或作用。具體而言，“誘導(dǎo)抗原特異的CTL”表示分化和/或增殖體外或體內(nèi)特異性識(shí)別某種抗原的CTL。
以其脈沖本發(fā)明表位肽的抗原呈遞細(xì)胞可用作癌癥疫苗?？乖蔬f細(xì)胞可進(jìn)一步用于生產(chǎn)特異于上皮衍生的癌癥的CTL，定量人外周血中的這種CTL等。
(VII)主要組織相容性抗原復(fù)合體本發(fā)明的主要組織相容性抗原復(fù)合體是主要組織相容性抗原和本發(fā)明肽或呈遞在脈沖以本發(fā)明肽的抗原呈遞細(xì)胞表面上的腫瘤抗原表位肽之間的復(fù)合體。
本發(fā)明中，主要組織相容性抗原是將被T淋巴細(xì)胞識(shí)別的肽呈遞至T淋巴細(xì)胞抗原受體的分子，并且是與表位肽一起被CTL識(shí)別的人白細(xì)胞抗原(HLA)。
更具體而言，本發(fā)明的主要組織相容性抗原復(fù)合體(下文簡(jiǎn)稱“MHC”)是MHC I型人白細(xì)胞抗原(HLA)和被CTL識(shí)別或能夠誘導(dǎo)CTL的表位肽之間的復(fù)合體，所述HLA表達(dá)在與表位肽一起被CTL識(shí)別的靶細(xì)胞表面。這種復(fù)合體包括那些被β2微球蛋白結(jié)合的復(fù)合體。
Ep-CAM-特異的CTL表位肽是特異位點(diǎn)在Ep-CAM蛋白中的肽，并且是被CTL識(shí)別的抗原決定簇，免疫性結(jié)合到CTL的抗原受體。進(jìn)一步，CTL表位肽通過(guò)直接進(jìn)攻表達(dá)Ep-CAM分子的細(xì)胞能夠消除癌細(xì)胞。
尤其是，本發(fā)明MHC是指表達(dá)在靶細(xì)胞上的HLA-A2402分子和Ep-CAM蛋白中被CTL識(shí)別的特定表位肽之間的復(fù)合體，并且還可以是指與β2微球蛋白形成的這種復(fù)合體。
本發(fā)明中的HLA-A2402是指人白細(xì)胞抗原中的I型抗原的亞型，A-24多態(tài)性，而HLA-2402分子表示抗原呈遞細(xì)胞表面上的HLA-A2402基因表達(dá)產(chǎn)物。
可用的HLA-A2402分子為純化自HLA-A2402表達(dá)用E.coli培養(yǎng)物的任一HLA-A2402分子，通過(guò)轉(zhuǎn)移基因至靶細(xì)胞強(qiáng)制表達(dá)的HLA-A2402分子，以及天然存在于靶細(xì)胞上的HLA-A2402分子。而且，本發(fā)明的HLA-A2402分子包括HLA-A2402分子的片段和重鏈。
本發(fā)明的MHC取決于其組成元件可通過(guò)多種不同的方法制備，并且通過(guò)例如將本發(fā)明肽、HLA-A2402分子和β2微球蛋白懸浮于諸如Tris等緩沖液，并在約4-約10℃下溫育該懸浮液約24-約72小時(shí)而形成。
MHC可以四聚體。MHC四聚體為四個(gè)亞復(fù)合體的多聚復(fù)合體，各亞復(fù)合體包括被CTL識(shí)別的Ep-CAM表位肽和HLA-A2402分子(通常β2微球蛋白結(jié)合的HLA-A2402分子)。
MHC四聚體通過(guò)生物素?；疢HC，并以1∶4之比混合鏈親和素和生物素?；腗HC而獲得?；蛘撸琈HC四聚體通過(guò)添加生物素結(jié)合位點(diǎn)至HLA分子的C端，在形成MHC后使生物素結(jié)合至這樣的位點(diǎn)，然后以1∶4之比混合鏈親和素和生物素?；腗HC而獲得。
更具體而言，MHC四聚體可以例如如下方式制備。為制備MHC，HLA-A2402分子重鏈和β2微球蛋白利用MHC表達(dá)的E.coli重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)大量生產(chǎn)，并且純化。在HLA-A2402重鏈C端事先添加識(shí)別生物素連接酶的氨基酸序列。純化的HLA-A2402重鏈和β2微球蛋白分別溶解于8M尿素。向200ml重折疊緩沖液(pH 8.0，100mMTris-HCl，400mM L-精氨酸-HCl，2mM EDTA，0.5mM氧化型谷胱苷肽，5mM還原型谷胱苷肽)，分別利用27號(hào)針的注射器，加入12mg具有SEQ ID NO1(RYQLDPKFI)所示氨基酸序列的本發(fā)明肽，18.6mgHLA-A2402重鏈，和13.2mgβ2微球蛋白?；旌衔镉跍囟染S持在10℃的浴中攪拌48-72小時(shí)，以促進(jìn)MHC形成。含有MHC的重折疊緩沖液隨后于溫度維持在4℃的浴中對(duì)1.8L蒸餾水透析24小時(shí)，以及透析的重折疊緩沖液利用Centriprep 10(Millipore Corporation，Bedford MA)濃縮至2ml。在分子量約45kD處被洗脫的MHC通過(guò)凝膠過(guò)濾層析，利用Superdex 200HR(Amersham Pharmacia Biotech AB，UppsalaSweden)而分離，從而得到所需的MHC四聚體。
為隨后制備生物素?；腗HC，利用生物素連接酶(AVIDITY，LLC，Denver CO)，將生物素結(jié)合至HLA-A2402重鏈C端的特異位點(diǎn)。生物素結(jié)合的MHC通過(guò)凝膠過(guò)濾層析，利用Superdex 200HR而純化。
然后，PE-標(biāo)記的鏈親和素(Molecular Probe，Eugene OR)和純化的生物素?；腗HC以1∶4之摩爾比混合，以及在分子量約480kD處被洗脫的含有SEQ ID NO1(RYQLDPKFI)所示氨基酸序列的MHC四聚體通過(guò)凝膠過(guò)濾層析利用Superdex 200HR分離，通過(guò)Centricon10(Millipore Corporation)濃縮至約3mg/ml，并維持在4℃。諸如疊氮鈉，EDTA，亮抑酶肽，和抑肽素等防腐劑可加入其中。
在上述各制備步驟中，理想的是通過(guò)諸如凝膠過(guò)濾層析等公知的方法純化備用蛋白和肽。
本發(fā)明MHC可用作癌癥疫苗。而且，其可用于制備上皮癌特異的CTL，以及用于定量人外周血中的這種CTL。
(VIII)癌癥疫苗，CTL誘導(dǎo)劑和基因治療藥物癌癥疫苗和CTL誘導(dǎo)劑本發(fā)明肽可有利地用作癌癥疫苗的活性成分，以疫苗被動(dòng)免疫治療。該癌癥疫苗可用于具有HLA-A2402的人中。
即，給具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的癌癥患者施用本發(fā)明肽誘導(dǎo)或激活特異性識(shí)別Ep-CAM的HLA-A2402-限制的CTL，由此使得治療或改善上皮癌等疾病成為可能。
由于癌癥患者的CTL為一組識(shí)別兩種或更多種腫瘤抗原的細(xì)胞，因此利用多種表位肽作為癌癥疫苗有時(shí)比利用單種表位肽具有更好效果。本發(fā)明肽可單獨(dú)或組合多種(兩種或更多種)利用。
含有本發(fā)明肽的Ep-CAM的mRNA表達(dá)在肺癌細(xì)胞系(QG56，LU99，LC99A，LC1-sq，LC65A和PC-9)，大腸癌細(xì)胞系，胃癌細(xì)胞系(MKN28，MKN45)，口腔癌細(xì)胞系(HSC-2)，乳腺癌細(xì)胞系，白血病細(xì)胞系(K562)等。Ep-CAM的表達(dá)也在來(lái)自肺癌，大腸癌，胃癌，乳腺癌或口腔癌患者的組織中觀察到。因此，本發(fā)明肽對(duì)治療或改善這種癌癥是有益的。
本發(fā)明的肽，無(wú)論單獨(dú)還是與多種不同載體組合，可制成制劑。制劑可采用口服或腸胃外的形式。通常，腸胃外的形式是優(yōu)選的。腸胃外制劑的例子包括皮下注射劑，肌內(nèi)注射劑，靜脈內(nèi)注射劑，栓劑等。
利用不會(huì)抑制本發(fā)明表位肽活性的可藥用賦形劑，可制備口服制劑。這種賦形劑的例子包括淀粉，甘露醇，乳糖，硬脂酸鎂，纖維素，聚合氨基酸，白蛋白等。
利用不會(huì)抑制本發(fā)明表位肽活性的可藥用載體，可制備腸胃外制劑。這種載體的例子包括水，氯化鈉，右旋葡萄糖，乙醇，甘油，DMSO等。如需要，腸胃外制劑可進(jìn)一步含有白蛋白，潤(rùn)濕劑，乳化劑等。為了刺激細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，表位肽優(yōu)選與合適的佐劑組合使用。本發(fā)明肽可以天然或鹽形式使用?？伤幱名}的例子包括諸如鹽酸，磷酸等無(wú)機(jī)酸的鹽，以及諸如乙酸，酒石酸等有機(jī)酸的鹽。
通過(guò)與化合物、免疫識(shí)別肽的抗體等一起配制肽，可調(diào)節(jié)本發(fā)明肽的活性，所述化合物自身或與HLA-A2402相互作用增強(qiáng)肽被CTL的識(shí)別。
脈沖以本發(fā)明肽的抗原呈遞細(xì)胞和主要組織相容性抗原復(fù)合體，也可有利地用作癌癥疫苗。這種疫苗的制劑形式，靶患者，靶癌癥，效果等與含有本發(fā)明肽的癌癥疫苗一樣。
治療方法本發(fā)明的肽，抗原呈遞細(xì)胞和主要組織相容性抗原復(fù)合體，當(dāng)給藥于具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人時(shí)，誘導(dǎo)或激活Ep-CAM-特異的HLA-A2402-限制的CTL，從而治療或改善上皮癌。
本發(fā)明肽的劑量隨肽被CTL識(shí)別程度而變化，并基于活性表位肽，成人每天可以例如，約0.01mg-約100mg，以及優(yōu)選約0.1mg-約30mg。取決于給藥目的，劑量間隔可為患者個(gè)體合適地加以選擇。
或者，向患者血液循環(huán)導(dǎo)入單核細(xì)胞部分，可實(shí)現(xiàn)有效的癌癥免疫接種，所述部分已分離自患者外周血，并與本發(fā)明肽一起培養(yǎng)以誘導(dǎo)和/或激活CTL。對(duì)培養(yǎng)條件，諸如單核細(xì)胞和本發(fā)明肽的濃度，加以選擇，使得成人給藥108-1010CTL/天。這種條件可由簡(jiǎn)單測(cè)試方便確定。具有淋巴增殖能力的物質(zhì)，諸如白介素-2，可在培養(yǎng)過(guò)程中加入。
抗原呈遞細(xì)胞的劑量對(duì)成人為例如，約106-109細(xì)胞/天，優(yōu)選107-108細(xì)胞/天。而且，通過(guò)向患者血液循環(huán)導(dǎo)入分離自患者外周血的單核細(xì)胞部分與本發(fā)明抗原呈遞細(xì)胞的共培養(yǎng)物，可實(shí)現(xiàn)有效的癌癥免疫接種。
主要組織相容性抗原復(fù)合體對(duì)成人為例如1-100mg/天，優(yōu)選5-50mg/天。而且通過(guò)向患者血液循環(huán)導(dǎo)入分離自患者外周血的單核細(xì)胞部分與本發(fā)明主要組織相容性抗原復(fù)合體的共培養(yǎng)物，可實(shí)現(xiàn)有效的癌癥免疫接種。
癌癥的基因治療藥物本發(fā)明的多核苷酸(包括互補(bǔ)鏈)，作為例如肺癌，大腸癌，胃癌，乳腺癌，口腔癌等的基因治療藥物是有益的。
對(duì)癌癥治療而言，含有本發(fā)明多核苷酸的載體可直接導(dǎo)入體內(nèi)，或?qū)胧占匀说募?xì)胞，所述細(xì)胞再返回至體內(nèi)。載體不受限制，并可選自那些已知用于基因治療的載體，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，牛痘病毒等，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是優(yōu)選的。這種病毒是復(fù)制缺陷的。
本發(fā)明多核苷酸通過(guò)微注射技術(shù)可導(dǎo)入細(xì)胞，在所述技術(shù)中多核苷酸被封裝在脂質(zhì)體中并轉(zhuǎn)移。
因此，本發(fā)明癌癥基因治療藥物可為任何形式單獨(dú)的本發(fā)明多核苷酸，含有本發(fā)明多核苷酸的重組載體，使本發(fā)明多核苷酸封裝的脂質(zhì)體等。
本發(fā)明多核苷酸的劑量隨由多核苷酸編碼的肽被CTL識(shí)別的程度而變化。例如，成人的合適劑量，基于編碼本發(fā)明表位肽的部分多核苷酸的量，約0.1μg-約100mg/天，優(yōu)選約1μg-約50mg/天。這種劑量的給藥可每幾天一次至每數(shù)月一次。
本發(fā)明的多核苷酸可與細(xì)胞因子，諸如IL-2，或與本發(fā)明多核苷酸相互作用的物質(zhì)組合使用，從而增強(qiáng)多核苷酸的表達(dá)。
(IX)胞毒T淋巴細(xì)胞利用下列(a)-(d)中的至少一種物質(zhì)，通過(guò)刺激外周血淋巴細(xì)胞，可獲得本發(fā)明的胞毒T淋巴細(xì)胞(a)本發(fā)明的肽，(b)本發(fā)明的抗原呈遞細(xì)胞；(c)本發(fā)明的主要組織相容性抗原復(fù)合體，和(d)本發(fā)明的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
本發(fā)明CTL的誘導(dǎo)方法是將外周血淋巴細(xì)胞與(a)-(d)中的至少一種物質(zhì)一起在優(yōu)選含有人血清的RPMI1640培養(yǎng)基中約37℃下培養(yǎng)約7-約14天。當(dāng)外周血淋巴細(xì)胞被主要組織相容性抗原復(fù)合體(下文稱為“MHC”)或其四聚體刺激時(shí)，CTL被誘導(dǎo)并與MHC或四聚體組合。因此，通過(guò)合適的方法，CTL從MHC或四聚體中分離。
具體地，CTL可通過(guò)例如下列制備方法獲得。
當(dāng)以表位肽或抗原呈遞細(xì)胞刺激時(shí)將分離自外周血的淋巴細(xì)胞與本發(fā)明肽或脈沖以該肽的抗原呈遞細(xì)胞一起在二氧化碳培養(yǎng)箱中約37℃下培養(yǎng)約7-約10天。然后，優(yōu)選在加入IL-2，PHA，抗-CD3抗體等后，溫育約7-約14天，從而刺激和增殖CTL。
以所述肽或抗原呈遞細(xì)胞刺激，任選接著以IL-2等刺激，實(shí)施約3次，從而獲得所需數(shù)目的CTL。
如此獲得的上皮癌特異的CTL例如可以在含有人血清的PBS等中的懸浮液形式，作為上皮癌等的被動(dòng)免疫治療藥物使用。被動(dòng)免疫治療藥物的形式通常為注射劑，諸如肌內(nèi)注射劑，皮下注射劑，靜脈內(nèi)灌輸液等。
當(dāng)以MHC或其四聚體刺激時(shí)染色分離將淋巴細(xì)胞從外周血等中分離，并與合適濃度的MHC或MHC四聚體在例如PBS中約4-約25℃下反應(yīng)約30-約60分鐘。標(biāo)記染料，諸如FITC或PE，加入反應(yīng)混合物中，以使結(jié)合到MHC或MHC四聚體的CTL染色。隨后，染色的CTL利用流式細(xì)胞儀或顯微鏡分離。
通過(guò)MHC固定分離利用其表面固定有MHC或MHC四聚體的無(wú)菌板，將分離自外周血的淋巴細(xì)胞與板中固定的MHC或MHC四聚體在約4-約25℃下反應(yīng)約30-約60分鐘。清洗掉其他未結(jié)合和漂浮的細(xì)胞后，板上遺留的上皮癌特異的CTL懸浮在新培養(yǎng)基中。如此分離的上皮癌特異的CTL可以T細(xì)胞刺激劑，諸如抗-CD3抗體，PHA，IL-2等刺激，從而使CTL增殖至被動(dòng)免疫治療藥物應(yīng)用所需的數(shù)目。
磁珠的使用如上所述制備的生物素?；腗HC結(jié)合至鏈親和素標(biāo)記的磁珠，以制備結(jié)合物(下文稱為“MHC-磁珠”)。隨后，淋巴細(xì)胞從外周血等中分離，并以合適的濃度添加MHC-磁珠，使得淋巴細(xì)胞∶珠之比成1∶5-20，接著反應(yīng)。
當(dāng)含有結(jié)合至MHC-磁珠的上皮癌特異的CTL的測(cè)試管置于磁場(chǎng)中時(shí)，與珠結(jié)合的CTL被吸附至測(cè)試管內(nèi)壁的磁力一側(cè)。
由于與所述珠結(jié)合的CTL被附著至測(cè)試管內(nèi)壁，其他細(xì)胞被沖洗掉。其后，測(cè)試管從磁場(chǎng)移出，測(cè)試管中剩余的抗原特異的CTL懸浮在新培養(yǎng)基中。
如此分離的上皮癌特異的CTL可以T淋巴細(xì)胞刺激劑，諸如抗-CD3抗體，PHA，IL-2等刺激，從而使CTL增殖至被動(dòng)免疫治療藥物應(yīng)用所需的數(shù)目。
治療或改善癌癥的方法本發(fā)明的CTL，當(dāng)其作為被動(dòng)免疫治療藥物給藥至上皮癌患者時(shí)，可治療或改善癌癥。
劑量取決于給藥目的隨患者而變化。例如，成人的合適劑量約107-約1011細(xì)胞/天，優(yōu)選約108-約1010細(xì)胞/天。這種劑量的給藥可每幾天一次至每數(shù)月一次。
(X)定量CTL的方法在癌癥治療管理中，包括適當(dāng)使用抗癌藥和化療藥，重要的是知曉，上皮癌特異的CTL是否存在于高風(fēng)險(xiǎn)癌癥患者(由癌細(xì)胞或癌組織引起的免疫性降低的患者，并發(fā)癥患者，老年患者，嬰兒患者，孕婦患者)的外周血中。上皮癌特異的HLA-A2402-限制的CTL可通過(guò)下列方法定量。
方法包括使下列(a)-(d)中任一物質(zhì)作用于外周血樣品，以及定量樣品中的CTL或由此產(chǎn)生的細(xì)胞因子的步驟(a)本發(fā)明肽，(b)本發(fā)明抗原呈遞細(xì)胞，(c)本發(fā)明MHC，和(d)本發(fā)明MHC四聚體。
將所得值與通過(guò)相同方法(除使用含有已知濃度的HLA-A2402-限制的CTL的溶液以外)定量的值進(jìn)行比較，從而計(jì)算外周血樣品中HLA-A2402-限制的CTL濃度。
由一種或多種(a)-(d)物質(zhì)誘導(dǎo)的HLA-A2402-限制的CTL，或由此CTL生產(chǎn)的細(xì)胞因子，例如可定量測(cè)定如下。
當(dāng)使用表位肽時(shí)將分離自外周血的淋巴細(xì)胞以本發(fā)明肽刺激，并測(cè)量誘導(dǎo)的CTL的數(shù)或由此CTL產(chǎn)生的諸如干擾素-γ(IFN-γ)，白介素等細(xì)胞因子(包括趨化因子)的量。具體方法描述如下，以IFN-γ的情形為例。
胞內(nèi)IFN-γ生產(chǎn)細(xì)胞的定量將分離自外周血的淋巴細(xì)胞以細(xì)胞濃度2×106/ml懸浮在含有10％人血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并以濃度1mg/ml加入本發(fā)明的CTL表位肽。此外，加入胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，諸如布雷菲爾德菌素A，接著在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)5-6小時(shí)。培養(yǎng)后，細(xì)胞固定，進(jìn)行膜滲透處理，并與熒光標(biāo)記的抗-IFN-γ抗體反應(yīng)。利用流式細(xì)胞儀等對(duì)CD8陽(yáng)性淋巴細(xì)胞中的IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行定量測(cè)定。
CD8陽(yáng)性細(xì)胞的定量標(biāo)記的CD8陽(yáng)性細(xì)胞可按照上述定量胞內(nèi)IFN-γ生產(chǎn)細(xì)胞的方法(除利用抗-CD8抗體代替熒光-標(biāo)記的抗IFN-γ抗體之外)定量。
細(xì)胞因子的定量(ELISPOT分析)96孔MultiScreen-HA板(Millipore)在4℃下以抗-IFN-γ單克隆抗體包被過(guò)夜。以PBS洗滌孔之后，將分離自外周血的淋巴細(xì)胞接種至孔中。表位肽置于孔內(nèi)，并在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)20小時(shí)。次日，板以含有0.05％Tween-20的PBS洗滌，并在室溫下與抗-IFN-γ兔血清反應(yīng)90分鐘，然后與過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗兔IgG山羊血清反應(yīng)90分鐘。此外，將含有3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)和0.015％過(guò)氧化氫溶液的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)置于孔中，并在室溫下反應(yīng)40分鐘。IFN-γ點(diǎn)可視化并以立體顯微鏡計(jì)數(shù)。
定量分泌在培養(yǎng)物上清液中的細(xì)胞因子的方法將分離自外周血的淋巴細(xì)胞以細(xì)胞濃度2×106個(gè)細(xì)胞/ml懸浮在含有10％人血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并以濃度1μg/ml加入本發(fā)明的CTL表位肽。在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24-48小時(shí)。培養(yǎng)后，收集上清液，并利用可商購(gòu)的ELISA試劑盒(例如，ENDOGEN的人IFN-γELISA)測(cè)量上清液中IFN-γ的濃度。
當(dāng)使用MHC四聚體時(shí)淋巴細(xì)胞從外周血等中分離，并與濃度為1-100μg/ml的MHC四聚體(熒光標(biāo)記有鏈親和素)在37℃下反應(yīng)15分鐘。與MHC結(jié)合的CTL通過(guò)添加抗體而染色，所述抗體結(jié)合至與MHC結(jié)合的CTL，并標(biāo)記有另一熒光染料。利用流式細(xì)胞儀或顯微鏡，對(duì)染色的CTL計(jì)數(shù)。
實(shí)施例下文，參照實(shí)施例，將更詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于實(shí)施例1
1)捐贈(zèng)者和細(xì)胞系所有捐贈(zèng)者完全知曉由Aichi癌癥中心道德委員會(huì)批準(zhǔn)的研究計(jì)劃及其目的。測(cè)試用的外周血樣品獲自5位知情同意后的HLA-A2402陽(yáng)性健康捐贈(zèng)者。從獲自各捐贈(zèng)者的外周血樣品，通過(guò)Ficoll密度梯度離心，分離出外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
大細(xì)胞癌細(xì)胞系LU99(JCRB0080)作為人肺癌細(xì)胞系；人表皮狀癌細(xì)胞系HSC-2(JCRB0622)；表皮狀癌細(xì)胞系MKN28(JCRB0253)和MKN45(JCRB0254)作為人胃癌細(xì)胞系；以及表皮狀癌細(xì)胞系COLO320DM(JCRB0225或ATCCCCL-220)作為人直腸癌細(xì)胞系購(gòu)自JCRB細(xì)胞庫(kù)(Ministry of Health，Labour and Welfarehttp//Cellbank.nihs.go.jp)。表皮狀癌細(xì)胞系LC-1/sq(RCB0455)作為人肺癌細(xì)胞系購(gòu)自Riken細(xì)胞庫(kù)。
LC/sq細(xì)胞維持在45％RPMI1640培養(yǎng)基和45％Ham氏F12培養(yǎng)基(Sigma產(chǎn)品)中，所述培養(yǎng)基通過(guò)加入液體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物而制備，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物包括10％FCS，L-谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素，和卡那霉素。COLO320DM細(xì)胞和MKN28維持在DMEM培養(yǎng)基(Sigma產(chǎn)品)中。K562細(xì)胞維持在IMDM培養(yǎng)基(Sigma產(chǎn)品)中，所述培養(yǎng)基通過(guò)添加液體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物而制備，所述補(bǔ)充物包括10％FCS(胎牛血清，LifeTechnology產(chǎn)品)，L-谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素和卡那霉素。
將其他癌細(xì)胞系培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基通過(guò)添加液體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物而制備，所述補(bǔ)充物包括10％FCS，2×10-3M L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，100μg/ml卡那霉素，和5×10-5Mβ-巰基乙醇(作為完全培養(yǎng)基)。
HLA-A2402基因?qū)?74CEM.T2(下文稱作“T2細(xì)胞”)，給出呈遞HLA-A2402結(jié)合肽的細(xì)胞(下文稱作“T2-24細(xì)胞”)作為肽呈遞細(xì)胞。T2-24細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素，鏈霉素和G418(Gibco產(chǎn)品)的IMDM培養(yǎng)基(Iscove氏修改的Dulbecco氏培養(yǎng)基Gibco產(chǎn)品)中。
依據(jù)“組織抗原”(Tissue Antigens，59502-511，(2002))中所述的方法，HLA-A2402-陰性QG56細(xì)胞系和HLA-A2402-陰性A549(JCRB0076)細(xì)胞系以編碼HLA-A2402的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。為了檢測(cè)感染的細(xì)胞，將感染的QG56細(xì)胞維持在含有終濃度為0.6μg/ml的嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中，并命名為QG56-A24。同樣，感染的A549細(xì)胞維持在含有終濃度為0.9μg/ml的嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中，并命名為A549-A24。
2)肽合成在Ep-CAM(登錄號(hào)M33011)內(nèi)潛在的HLA-A2402-結(jié)合的肽通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，基于從環(huán)球網(wǎng)生物信息學(xué)&分子分析部分(BIMASBioInformatics and Molecular AnalysisSection)(htt://bimas.dcrt.gov/molbio/hla_bind)可獲得的HLA肽復(fù)合體預(yù)計(jì)的半數(shù)時(shí)間解離，根據(jù)HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)計(jì)劃(HLA Peptide BindingPrediction Program)，而得以鑒定。
基于Ep-CAM表位肽預(yù)測(cè)結(jié)果選擇的7種肽由PepSet(Mimotope產(chǎn)品)合成。如果需要，將所得肽溶解于100μl二甲基亞砜中，并進(jìn)一步以40％乙腈稀釋至0.1M(pH 7.4)。
各肽的生產(chǎn)量預(yù)估為1μmol。
7種合成肽分別命名為Ep31，Ep173，Ep185，Ep250，Ep225，Ep296，和Ep304。表1示出Ep-CAM的合成肽序列。
表1

備注a從HLA-A24分子解離的預(yù)計(jì)半數(shù)時(shí)間(分鐘)，通過(guò)訪問(wèn)環(huán)球網(wǎng)生物信息學(xué)&分子分析部分(BIMAS)HLA肽結(jié)合預(yù)測(cè)而獲得。
b基于MHC穩(wěn)定性分析，評(píng)估合成肽對(duì)HLA-A24分子的結(jié)合活性。％MFI表示平均熒光強(qiáng)度。
另外，人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜肽RYLRDQQLL(命名為ENV584，J.Immunol，1596242-6252，1997殘基584-592)和EBV潛在膜蛋白2肽(EBV潛在膜)(命名為EBV-LMP419，J.Immunol，1583325-3334，1997殘基419-427)合成用作對(duì)照(Toray Industriesresearch center company)。
3)細(xì)胞染色和流式細(xì)胞儀分析利用表達(dá)在細(xì)胞表面上的抗HLA-A2402單克隆抗體(One Lambda公司產(chǎn)品)和FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG(ab’)2片段(Immunotech產(chǎn)品)，通過(guò)間接免疫熒光抗體分析進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)“Blood，981872-1881，2001，Science，27494-96，1996”中所述步驟，制備MHC/肽四聚體。
CD8陽(yáng)性T細(xì)胞系或其克隆以含有Ep-CAM肽和Ep173的藻紅蛋白(PE)-標(biāo)記的HLA-A2402四聚體(稱作HLA-A2402/Ep173四聚體)，或含有HIV-1肽和ENV584的PE標(biāo)記的HLA-A2402四聚體(稱作HLA-A2402/ENV584四聚體)染色。
利用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company產(chǎn)品)對(duì)染色的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，并通過(guò)CellQuest軟件(Becton，Dickinson andCompany產(chǎn)品)分析數(shù)據(jù)。
MHC穩(wěn)定性分析為評(píng)估合成肽的HLA-A2402結(jié)合效率，根據(jù)Kuzushima等的步驟(Blood，981872-1881，2001)，利用T2-A24細(xì)胞(其為表達(dá)HLA-A2402分子的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染至T2[174×CEM.T2ATCC登錄號(hào)CRL-1992]的細(xì)胞系)進(jìn)行MHC穩(wěn)定性分析。
具體而言，將濃度為10μM的各個(gè)肽在200μl含有T2-A24細(xì)胞(2×105個(gè)細(xì)胞)、0.1％FCS和5×10-5Mβ-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基中26℃下溫育16小時(shí)，接著在37℃下繼續(xù)溫育3小時(shí)。溫育后，細(xì)胞表面HLA-A2402分子以上述3)中的抗HLA-A2402單克隆抗體和FITC標(biāo)記的抗體染色。通過(guò)FACSCalibur確定表達(dá)水平，并記錄平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
％MFI增加由下列公式計(jì)算％MFI增加＝100×(以肽給藥的組的MFI-未以肽給藥的組的MFI)/(未以肽給藥的組的MFI)表1示出有關(guān)％MFI水平增加的結(jié)果。如表1所示，細(xì)胞表面上的HLA-A2402表達(dá)水平對(duì)大多數(shù)肽是增加的，表明這些肽結(jié)合至細(xì)胞表面，由此使MHC穩(wěn)定。
特別是，在上述肽中，Ep173(RYQLDPKFI)對(duì)HLA-A2402顯示最高的親合力。Ep304(EMGEMHREL)由于顯示最低的親合力不繼續(xù)其他試驗(yàn)。
5)Ep-CAM肽特異的CTL及其克隆的生產(chǎn)根據(jù)Dauer等的步驟(J.Immunol，1704069-4076)生產(chǎn)外周血單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞(DC)。
更具體而言，附著至塑料的細(xì)胞從HLA-A2402陽(yáng)性健康志愿者的外周血單核細(xì)胞中分離出來(lái)，并培養(yǎng)于含有5％熱滅活人血血清，10μg/ml重組人白介素-4(hIL-4，R&D systems Company產(chǎn)品)和50ng/ml重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF，R&D systemsCompany產(chǎn)品)的RPMI1640培養(yǎng)基。溫育1天之后，為了細(xì)胞生長(zhǎng)，加入50ng/ml IL-1β(PeproTech，Inc產(chǎn)品)，50ng/ml重組人腫瘤壞死因子-α(hTNF-αPeproTech Inc產(chǎn)品)和1μM前列腺素E2(CaymanChemical Company產(chǎn)品)。2或3天過(guò)后，收集細(xì)胞用于呈遞抗原的單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞。
生產(chǎn)的細(xì)胞明顯表達(dá)樹突細(xì)胞介導(dǎo)的抗原，諸如CD1a，CD80，CD83，CD86，和HLA II型分子。
此外，利用CD8微珠(Milteny Biotec產(chǎn)品)，從相同捐獻(xiàn)者中分離出CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞。
隨后，自衍生的樹突細(xì)胞室溫下脈沖以各個(gè)Ep-CAM合成肽2-4小時(shí)，該肽在含有5×10-5M β-巰基乙醇的AIM-V培養(yǎng)基(Gibco產(chǎn)品)中濃度為10μM，接著輻射(33Gy)。
然后，樹突細(xì)胞(1×105細(xì)胞)與CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞(1×106淋巴細(xì)胞)共培育在含有10％人血血清，25ng/ml重組人IL-7(R&D systemscomapany產(chǎn)品)，和5ng/ml重組人IL-12(R&D systems company產(chǎn)品)的RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中。
培育7天之后，加入1×105個(gè)上述制備的肽脈沖的自衍生的樹突細(xì)胞，來(lái)刺激細(xì)胞。繼續(xù)培育7天之后，以相同步驟刺激細(xì)胞3次。每次再刺激后，加入人重組IL-2(Takeda Pharmaceutical Company，Ltd.產(chǎn)品)給出終濃度20u/ml。如需要，活性增殖細(xì)胞分成2或3個(gè)管，并培養(yǎng)在含有20u/ml IL-2的新鮮培養(yǎng)基中。
T-細(xì)胞特異性通過(guò)ELISPOT分析進(jìn)行檢查。
為建立T-細(xì)胞克隆，根據(jù)Blood，981872-1881，2001中所述的方法，對(duì)多克隆CTL進(jìn)行有限稀釋。更具體而言，將多克隆CD8陽(yáng)性T-細(xì)胞接種在96孔環(huán)形板(1，3，10個(gè)細(xì)胞/孔)，板中含有培養(yǎng)基(0.2ml)以及抗-CD3單克隆抗體(30ng/ml)(Orth Diagnostic Inc.產(chǎn)品)，IL-2(50u/ml)，1×105個(gè)γ-輻射(33Gy)的PBMC細(xì)胞，和2×104個(gè)被EBV轉(zhuǎn)化的γ-輻射(55Gy)的B淋巴母細(xì)胞(以95.8-細(xì)胞(JCRB9123)上清液轉(zhuǎn)化志愿者的外周血B淋巴細(xì)胞而獲得的細(xì)胞)。
溫育兩周之后，增殖的細(xì)胞的特異性以與Lee等方法(J.Immunol，1583325-3334，1997)的同樣方式，通過(guò)CTL-CTL-殺傷分析確定。
CTL克隆僅在以終濃度為2μM含有同樣起源衍生自Ep-CAM的肽或?qū)φ针腅NV584的100μl完全培養(yǎng)基或96孔環(huán)形板(300細(xì)胞/孔)中溫育過(guò)夜。
CTL細(xì)胞的細(xì)胞殺傷能力利用倒置顯微鏡在次日確定。將這些僅在脈沖以Ep-CAM時(shí)顯示細(xì)胞-殺傷能力的克隆移至燒瓶，并如上所述增殖。
6)IFN-γ的ELISPOT分析具有硝酸纖維素膜的平底96孔MultiScreen-HA板(Millipore Corp.產(chǎn)品)包被以10μg/ml抗-IFN-γ單克隆抗體(R&D systems company產(chǎn)品)，并在4℃下溫育過(guò)夜。以PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌后，該板以培養(yǎng)基在37℃下封閉1小時(shí)。在各個(gè)板孔中，T2-A24細(xì)胞(5×104細(xì)胞)在100μl含有0.1％FCS和5×105Mβ-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基中室溫下脈沖以各個(gè)表位候選合成肽30分鐘。將1×105個(gè)懸浮在含有20％FCS的培養(yǎng)基中的CD8-陽(yáng)性T細(xì)胞接種至各孔中。
當(dāng)有太多點(diǎn)計(jì)數(shù)時(shí)，1×104CD8陽(yáng)性T細(xì)胞用于對(duì)細(xì)胞作出反應(yīng)。整個(gè)測(cè)量方法一式兩份進(jìn)行。
板在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃下溫育20小時(shí)，并充分洗滌以含有0.05％Tween 20的PBS。隨后，向各個(gè)孔中加入多克隆兔抗-IFN-γ抗體(Genzyme產(chǎn)品)，室溫下放置90分鐘，然后繼續(xù)暴露于過(guò)氧化酶-結(jié)合的山羊抗兔抗免疫球蛋白G(Genzyme產(chǎn)品)90分鐘。為了顯色I(xiàn)FN-γ特異點(diǎn)，向各孔中加入含有3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma產(chǎn)品)和0.015％過(guò)氧化氫溶液的0.1M乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)。40分鐘后，以水洗滌終止反應(yīng)，并使板干燥。擴(kuò)散的大點(diǎn)數(shù)在顯微鏡下計(jì)數(shù)。
結(jié)果示于圖1和2。
圖1顯示當(dāng)5位HLA-A2402陽(yáng)性健康捐贈(zèng)者的CD8陽(yáng)性T-細(xì)胞由被6種肽中的一種脈沖的自-衍生的樹突細(xì)胞刺激時(shí)多克隆肽-激活的胞毒淋巴細(xì)胞系的ELISOT分析評(píng)價(jià)結(jié)果。
正如圖1所見，當(dāng)5位HLA-A2402陽(yáng)性健康捐贈(zèng)者的CD8陽(yáng)性T-細(xì)胞由被6種肽中的一種脈沖的自-衍生的樹突細(xì)胞刺激時(shí)，從4位捐贈(zèng)者獲得的T-細(xì)胞系通過(guò)與被Ep173脈沖的T2-A24細(xì)胞溫育顯示主要產(chǎn)生IFN-γ點(diǎn)。
CTL系經(jīng)歷獲自3號(hào)捐贈(zèng)者的Ep250刺激，通過(guò)與Ep250溫育，特異性生產(chǎn)IFN-γ點(diǎn)。
圖2顯示Ep-CAM肽特異的多克隆和單克隆CTL的四聚體染色結(jié)果。
圖2A顯示，以Ep173刺激四次的多克隆CD8陽(yáng)性T細(xì)胞用FITC-標(biāo)記的抗-CD8抗體，含有Ep173的PE-標(biāo)記的HLA-A24四聚體，或?qū)φ针腅NV584染色，并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析。四聚體陽(yáng)性細(xì)胞在總CD8陽(yáng)性T-細(xì)胞中的比例以右上部的百分比顯示。
如圖2A所示，在大多數(shù)對(duì)照肽ENV584中，沒(méi)有觀察到IFN-γ點(diǎn)形成。四次刺激后，從4號(hào)捐贈(zèng)者建立的CTL系以HLA-A24/Ep173四聚體而非以HLA-A24/ENV584四聚體特異性染色(相對(duì)總CD8陽(yáng)性T-細(xì)胞，37.2％∶0.06％，圖2A)。
圖2B顯示，Ep173-特異的CTL克隆(C27)，以上述同樣方式染色。四聚體陽(yáng)性細(xì)胞在CD8陽(yáng)性T-細(xì)胞中的比例以右上部的百分比顯示。
如圖2B所示，四聚體陽(yáng)性細(xì)胞的強(qiáng)度在對(duì)數(shù)上等同于或高于四聚體陰性細(xì)胞2-至3-倍。本發(fā)明人從4號(hào)捐贈(zèng)者的Ep173特異性多克隆CTL系的有限稀釋培養(yǎng)基中建立T細(xì)胞克隆C27。
利用四聚體的該研究顯示，多克隆和單克隆Ep173-特異的CD8陽(yáng)性T細(xì)胞皆具有特異于HLA-A2402/Ep173復(fù)合體的高親和性細(xì)胞受體。
因此，Ep173-特異的CTL克隆從該CTL系中建立。
實(shí)施例2肽Ep173特異的CTL克隆的性質(zhì)，部分17)CTL分析本發(fā)明人進(jìn)一步檢查在HLA-A24情形下，C27是否識(shí)別自發(fā)呈遞在腫瘤細(xì)胞表面上的肽。
Cr-標(biāo)記的細(xì)胞在加入C27之前與特異于總HLA I型，HLA-A24或HLA-A2中的任一種的單克隆抗體溫育，并以效應(yīng)子與靶之比為10進(jìn)行CTL分析。
靶細(xì)胞(PC9細(xì)胞)在100μl培養(yǎng)基中37℃下以鎘(51Cr)標(biāo)記1小時(shí)。在有些實(shí)驗(yàn)中，為了指定HLA限制，在加入效應(yīng)細(xì)胞之前30分鐘，向各孔加入預(yù)定量的封閉抗體W6/32(抗-HLA I型)，MA2.1(抗-HLA-A2)，和A11.1(抗-HLA-A24)。
板在37℃下溫育4小時(shí)，并利用γ-計(jì)數(shù)儀對(duì)上清液計(jì)數(shù)。
51Cr釋放％的計(jì)算公式為100×(實(shí)驗(yàn)釋放—自發(fā)釋放)/(最大釋放—自發(fā)釋放)結(jié)果示于圖3和5。
圖3A顯示，在效應(yīng)子與靶之比為1時(shí)，通過(guò)51Cr釋放分析確定的C27(Ep173-特異性CTL克隆)抗T2-A24在各指定濃度的肽Ep173和對(duì)照肽EBV-LMP419處的胞毒性。
結(jié)果，Ep173-特異的CTL克隆(C27)證實(shí)針對(duì)脈沖以低肽濃度100pM的Ep173的T2-A24細(xì)胞的胞毒性，而這種胞毒性利用EBV-LMP419(對(duì)照肽)并未被觀察到。
圖5和表2顯示C27針對(duì)多種不同癌細(xì)胞系的胞毒性的評(píng)價(jià)結(jié)果。
表2

備注a利用HLA-A24mAb和FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體F(ab’)2片段，通過(guò)免疫熒光，評(píng)價(jià)平均熒光強(qiáng)度。
b未做圖2顯示C27(Ep173-特異的CTL克隆)對(duì)8種HLA-A24陽(yáng)性癌細(xì)胞系和HLA-A24陰性細(xì)胞系作為靶細(xì)胞的胞毒性的評(píng)價(jià)結(jié)果。
所有細(xì)胞系表達(dá)Ep-CAM，除肺腺癌細(xì)胞系11-18，COLO320DM和A549以外。HLA-A2402基因如逆轉(zhuǎn)錄病毒被轉(zhuǎn)化至A549和QG56，命名為A549-A24和QG56-A24的轉(zhuǎn)化體也用作靶細(xì)胞。通過(guò)51Cr釋放分析，在各效應(yīng)子∶靶之比(40∶1，20∶1，10∶1，5∶1)處，詳細(xì)說(shuō)明胞毒性。K562為敏感于天然殺傷細(xì)胞的典型細(xì)胞系。
如圖5和表2所示，C27有效地施加毒性至肺癌細(xì)胞系PC9，LU99，LC-1/sq和LC99A；口腔鱗狀癌細(xì)胞系HSC-2；和既表達(dá)HLA-A24又表達(dá)Ep-CAM的胃癌細(xì)胞系MKN45。然而，C27未表明針對(duì)HLA-A24陽(yáng)性Ep-CAM陰性細(xì)胞系(A549-A24和COLO320DM)，或HLA-A24陰性和Ep-CAM陽(yáng)性細(xì)胞系，或Ep-CAM陰性細(xì)胞系(OG56，A549，MKN28)的毒性。當(dāng)HLA-A2402基因?qū)際LA-A24陰性QG56細(xì)胞系(QG56-A24)時(shí)，C27殺傷靶細(xì)胞。對(duì)K562的細(xì)胞毒性是低的。
這些數(shù)據(jù)表明，Ep173-特異的CTL殺傷既表達(dá)HLA-A24又表達(dá)Ep-CAM的腫瘤細(xì)胞。
圖3B顯示抗-HLA-A24單克隆抗體對(duì)Ep173-特異的CTL克隆(C27)抗HLA-A2402陽(yáng)性細(xì)胞系(PC9)的胞毒性的抑制作用。
C27對(duì)肺癌細(xì)胞系(HLA-A24陽(yáng)性Ep-CAM陽(yáng)性肺癌細(xì)胞系)PC9的胞毒性被特異于HLA-A24或I型分子(W6/32)的單克隆抗體封閉，但不被抗-HLA-A2單克隆抗體封閉。
8)冷靶抑制分析根據(jù)Arai等方法(Blood，972903-2907，2001)進(jìn)行冷靶抑制分析。
T2-A24細(xì)胞與終濃度為1×105M的表位肽Ep173或EBV-LMP419溫育1小時(shí)。
數(shù)次洗滌后，所得物與2×104效應(yīng)細(xì)胞溫育1小時(shí)，以生成肽脈沖的T2-A24細(xì)胞與靶細(xì)胞之比為40∶1，20∶1，10∶1，和5∶1。2×103個(gè)51Cr-標(biāo)記的PC9細(xì)胞系添加至各孔中。
胞毒性的確定如上述第7項(xiàng)有關(guān)CTL分析中所述。
圖3C顯示冷靶抑制分析結(jié)果。
在圖3C中，橫坐標(biāo)表示脈沖以Ep173(●)或?qū)φ誆BV-LMP419(■)肽的T2-A24細(xì)胞(冷)與鎘標(biāo)記的PC9細(xì)胞(熱)之?dāng)?shù)目比?？v坐標(biāo)以百分比表示C27針對(duì)PC9的胞毒性。空心圓顯示沒(méi)有冷靶的胞毒性。
結(jié)果，針對(duì)PC9的C27-介導(dǎo)的胞毒性受到Ep173-脈沖的T2-A24細(xì)胞的特異性抑制，但未受到非相關(guān)肽的抑制。
因此，針對(duì)PC9的C27-介導(dǎo)的胞毒性被抗-HLA-A24單克隆抗體或Ep173-脈沖的冷靶細(xì)胞封閉。于是表明，CTL克隆對(duì)自發(fā)呈遞在腫瘤細(xì)胞表面上的Ep173具有優(yōu)良的特異性。
實(shí)施例3肽Ep173特異的CTL克隆的性質(zhì)，部分29)RT-PCR利用GenElute mRNA Miniprep試劑盒(Sigma產(chǎn)品)，從培育的細(xì)胞系中抽提全部RNA?；蛱禺惖墓押塑账嵋锿ㄟ^(guò)Proligo(ProligoJapan產(chǎn)品)合成，用于Ep-CAM mRNA表達(dá)的評(píng)價(jià)。RT-PCR所用引物如下正向引物ATGGCGCCCCCGCAGGTCCT(SEQ ID NO8)反向引物TTATGCATTGAGTTCCCTATGCATCTCACC(SEQ IDNO9)
利用熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer產(chǎn)品)，進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物通過(guò)1.5％凝膠電泳和溴化乙錠顯色而分析。
PCR采用1次循環(huán)的94℃、5分鐘，30次循環(huán)的94℃、30秒，58℃、30秒和72℃、1分鐘，以及1次循環(huán)的72℃、7分鐘。
10)蛋白質(zhì)印跡分析根據(jù)稍有修改的Schwartz等(J.Immunol，165768-778，2000)的步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。更具體而言，細(xì)胞溶解于緩沖液(50mM Tris/鹽酸，pH 7.5，5mM氯化鎂，1mM EDTA，0.5％triton X-100，10μM亮抑酶肽，2.8μM抑胃酶肽，和0.85mM苯甲磺酰氟)中4℃下30分鐘。為了確定蛋白濃度，溶解的細(xì)胞上清液在280/260nm波長(zhǎng)處定量測(cè)定。130μg的蛋白進(jìn)一步添加至12％SDS-PAGE。蛋白被印跡在Immobilon-P膜(Millipore產(chǎn)品)上，并在4℃與含有100％低脂肪干奶粉和0.1％Tween 20的PBS封閉過(guò)夜。
利用Ep-CAM特異的單克隆抗體(LabVision產(chǎn)品)進(jìn)行檢索，并利用過(guò)氧化物酶-結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(Zymed產(chǎn)品)進(jìn)行檢測(cè)。
利用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham bio-science company產(chǎn)品)使蛋白顯色。
圖4顯示通過(guò)RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析，癌細(xì)胞系表達(dá)Ep-CAM的檢查結(jié)果。
15種癌細(xì)胞系中有12種(80％)明顯表達(dá)Ep-CAM。HLA-A24的表達(dá)利用抗-HLA-A24單克隆抗體通過(guò)間接免疫熒光測(cè)試而檢查。在檢查的15種癌細(xì)胞系中有10種細(xì)胞系顯示陽(yáng)性HLA-A24表達(dá)。
正如上述實(shí)施例所示，本發(fā)明人已獲得了衍生自Ep-CAM的新型HLA-A2402-限制的表位。至少表位肽Ep173(RYQLDPKFI；SEQ IDNO1)能夠誘導(dǎo)CTL(包括特異于HLA-A2402/肽復(fù)合體的高親和性T-細(xì)胞受體)，由此，利用該肽免疫治療是可預(yù)期的。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的肽可合適的用作寬范圍的含有HLA-A2402的人癌的癌癥疫苗。
序列表<110>大塚制藥株式會(huì)社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)愛知縣(Aichi Prefecture)<120>由HLA-A2402-限制的Ep-CAM-特異的CTL識(shí)別的表位/肽及其應(yīng)用(epitope peptidewhich is recognized by HLA-A2402-restricted and Ep-CAM-specific CTL)<130>SCT063152-47<150>JP 2004-11752<151>2004-01-20<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL<400>1Arg Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL<400>2Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe1 5 10<210>3
<211>9<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL<400>3Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL<400>4Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL<400>5Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu1 5<210>6<211>10<212>PRT
<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL<400>6Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu Met1 5 10<210>7<211>9<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A2402-restricted CTL<400>7Glu Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu1 5<210>8<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide used as PCR primer<400>8atggcgcccc cgcaggtcct 20<210>9<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide used as PCR primer<400>9
ttatgcattg agttccctat gcatctcacc 30<210>10<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide used as PCR primer<400>10cgttatcaac tggatccaaa atttatc 27<210>11<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>oligonucleotide used as PCR primer<400>11tattatgttg atgaaaaagc acctgaattc 30<210>12<211>11<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>Ep-CAM epitope peptide candidate being capable of inducingHLA-A0201-restricted CTL<400>12Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile1 5 10
權(quán)利要求
1.下列(1)-(4)任一項(xiàng)的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的肽；(3)基本上由通過(guò)添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO1所示氨基酸序列的氨基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞；(4)基本上由通過(guò)添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO2所示氨基酸序列的氨基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞。
2.下列(1)或(2)的肽(1)基本上由SEQ ID NO1所示氨基酸序列組成的肽；(2)基本上由SEQ ID NO2所示氨基酸序列組成的肽。
3.包含權(quán)利要求1或2的肽作為活性成分的癌癥疫苗。
4.權(quán)利要求3的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
5.權(quán)利要求3或4的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
6.權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
7.包含權(quán)利要求1或2的肽作為活性成分的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑。
8.權(quán)利要求7的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
9.下列(5)-(8)任一項(xiàng)的多核苷酸(5)基本上由SEQ ID NO10所示堿基序列組成的多核苷酸；(6)基本上由SEQ ID NO11所示堿基序列組成的多核苷酸；(7)在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO10所示堿基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞；(8)在嚴(yán)格條件下與由SEQ ID NO11所示堿基序列組成的多核苷酸雜交的突變多核苷酸，其編碼的肽能夠與HLA-A2402分子形成復(fù)合體而被HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞。
10.上皮癌的基因治療藥物，包含權(quán)利要求9的多核苷酸作為活性成分。
11.重組載體，包含權(quán)利要求9的多核苷酸。
12.轉(zhuǎn)化體，其中導(dǎo)入權(quán)利要求11的重組載體。
13.權(quán)利要求1或2的肽的制備方法，包括培育權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)化體，以及從培養(yǎng)物中收集權(quán)利要求1或2的肽的步驟。
14.抗原呈遞細(xì)胞，其脈沖以權(quán)利要求1或2的肽。
15.癌癥疫苗，包含權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞作為活性成分。
16.權(quán)利要求15的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
17.權(quán)利要求15或16的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
18.權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
19.胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞作為活性成分。
20.權(quán)利要求19的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
21.主要組織相容性抗原復(fù)合體，包含主要組織相容性抗原，和權(quán)利要求1或2的肽，或者存在于權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽。
22.權(quán)利要求21的主要組織相容性抗原復(fù)合體，包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和權(quán)利要求1或2的肽，或者存在于權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽。
23.癌癥疫苗，包括權(quán)利要求21或22的主要組織相容性抗原復(fù)合體作為活性成分。
24.權(quán)利要求23的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
25.權(quán)利要求23或24的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
26.權(quán)利要求23-25任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
27.胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括權(quán)利要求21或22的主要組織相容性抗原復(fù)合體作為活性成分。
28.權(quán)利要求27的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
29.主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，包括主要組織相容性抗原，和權(quán)利要求1或2的肽，或者存在于權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽。
30.利用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)，通過(guò)刺激外周血淋巴細(xì)胞獲得的胞毒T淋巴細(xì)胞(a)權(quán)利要求1或2的肽；(b)權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞；(c)權(quán)利要求21或22的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)權(quán)利要求29的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
31.權(quán)利要求30的胞毒T淋巴細(xì)胞，其是通過(guò)下列步驟獲得的利用權(quán)利要求30限定的一種或多種(a)-(d)物質(zhì)，通過(guò)刺激外周血淋巴細(xì)胞，在主要組織相容性抗原復(fù)合體和/或其四聚體與胞毒T淋巴細(xì)胞之間形成復(fù)合體，并從復(fù)合體中分離胞毒T淋巴細(xì)胞。
32.被動(dòng)免疫治療藥物，包括權(quán)利要求30或31的胞毒T淋巴細(xì)胞作為活性成分。
33.權(quán)利要求32的被動(dòng)免疫治療藥物，其中癌癥為上皮癌。
34.權(quán)利要求32或33的被動(dòng)免疫治療藥物，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
35.權(quán)利要求32-34任一項(xiàng)的被動(dòng)免疫治療藥物，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
36.定量外周血中HLA-A2402-限制的胞毒T淋巴細(xì)胞的方法，其包括下列步驟使一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)作用于外周血(a)權(quán)利要求1或2的肽；(b)權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞；(c)權(quán)利要求21或22的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)權(quán)利要求29的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，以及定量外周血中的胞毒T淋巴細(xì)胞或者由這樣的胞毒淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
37.癌癥治療和/或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)(a)權(quán)利要求1或2的肽；(b)權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞；(c)權(quán)利要求21或22的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)權(quán)利要求29的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
38.癌癥治療和/或改善方法，包括下列步驟從具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人患者的外周血中收集單核細(xì)胞部分，采用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)培養(yǎng)單核細(xì)胞部分(a)權(quán)利要求1或2的肽；(b)權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞；(c)權(quán)利要求21或22的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)權(quán)利要求29的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，以及將其中的胞毒T淋巴細(xì)胞被誘導(dǎo)和/或激活的單核細(xì)胞部分返回至患者血液。
39.誘導(dǎo)胞毒T淋巴細(xì)胞的方法，包括給具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人施用一種或多種下列(a)-(d)物質(zhì)(a)權(quán)利要求1或2的肽；(b)權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞；(c)權(quán)利要求21或22的主要組織相容性抗原復(fù)合體；(d)權(quán)利要求29的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
40.癌癥治療或改善方法，包括給具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人施用權(quán)利要求30或31的胞毒T淋巴細(xì)胞。
41.權(quán)利要求21的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體，其中四聚體為包括HLA-A2402分子，β2-微球蛋白，和權(quán)利要求1或2的肽，或者存在于權(quán)利要求14的抗原呈遞細(xì)胞上的腫瘤抗原表位肽的復(fù)合體。
42.癌癥疫苗，包括權(quán)利要求41的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體作為活性成分。
43.權(quán)利要求42的癌癥疫苗，其中癌癥為上皮癌。
44.權(quán)利要求42或43的癌癥疫苗，其中癌癥選自大腸癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，口腔癌，胰腺癌，食道癌，鼻咽癌，子宮癌，前列腺癌，和膽囊癌。
45.權(quán)利要求42-44任一項(xiàng)的癌癥疫苗，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
46.胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，包括權(quán)利要求41的主要組織相容性抗原復(fù)合體四聚體。
47.權(quán)利要求46的胞毒T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)劑，其用于治療具有HLA-A2402作為白細(xì)胞抗原的人。
全文摘要
本發(fā)明公開了基本上由SEQ ID NO1或2所示的氨基酸序列組成的肽；以及基本上由通過(guò)添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自SEQ ID NO1或2所示氨基酸序列的氨基酸序列組成的突變肽，所述肽能夠與HLA－A2402分子形成復(fù)合體而被HLA－A2402－限制的胞毒T淋巴細(xì)胞識(shí)別或誘導(dǎo)這種淋巴細(xì)胞。這樣的肽可用作具有HLA－A2402的上皮癌患者的癌癥疫苗。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1910284SQ20058000280
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月20日
發(fā)明者葛島清隆 申請(qǐng)人:愛知縣, 大塚制藥株式會(huì)社