專利名稱：基于粒子的定向組合的生物檢測器的制作方法
聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)本申請的主題部分由能源部(DEFG02-01 ER63179)和國家科學(xué)基金(DMR-0117792)資助。政府對本發(fā)明享有一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
除了蛋白質(zhì)，最近幾年內(nèi)發(fā)現(xiàn)核酸也具有催化活性。具有催化活性的核酸可以是具有催化性的DNA/RNA，還稱為DNA-酶/RNA-酶、脫氧核糖核酸酶/核糖核酸酶、以及DNA酶/RNA酶。具有催化活性的核酸也可以包含修飾的核酸?；诤怂岬拿傅拇呋钚钥偸且蕾囉谀承┹o因子(例如金屬離子)的存在。因此，對于這些輔因子的基于核酸酶的生物檢測器(例如，對于金屬離子的生物檢測器)可以基于相應(yīng)核酸酶的活性進(jìn)行設(shè)計(jì)。另一方面，核酸可以被選擇以連接到大范圍的具有高親合力和特異性的分析物。這些連接核酸被稱為適配子(aptamer)。
適配子為識別具有高親合力和特異性靶標(biāo)的核酸(如，DNA或RNA)(Ellington and Szostak 1990，Jayasena 1999)。適配酶(aptazyme)(也稱作變構(gòu)DNA/RNA酶或變構(gòu)(脫氧)核糖核酸酶)是由效應(yīng)子(靶標(biāo)分子)調(diào)節(jié)的DNA/RNA酶。它們通常包含識別效應(yīng)子的適配域和催化域(Hesselberth et al.2000，Soukup andBreaker 2000，Tang and Breaker 1997)。效應(yīng)子可通過適配域和催化域之間的特異性相互作用降低或者提高適配酶的催化活性。因此，適配酶的活性可用來檢測效應(yīng)子的存在及數(shù)量。這種方法已用來選擇和設(shè)計(jì)用于診斷及檢測目的的適配酶檢測器(Breaker 2002，Robertson and Ellington 1999，Seetharaman et al.2001)。DNA酶和DNA適配酶是用于檢測器開發(fā)的最具吸引力的候選物，因?yàn)镈NA比RNA在合成上要低廉得多并且更穩(wěn)定。另外，可利用通過引入靠近DNA酶的催化核心的適配子基序的設(shè)計(jì)DNA適配酶的一般方法(Wang et al.2002)。高裂解活性需要效應(yīng)子分子的存在，該分子連接到適配子基序后可變構(gòu)調(diào)節(jié)適配酶的催化核心部分的活性。
體外選擇方法可用來獲取用于大范圍的具有特別高的親合力、并且具有在皮摩爾范圍內(nèi)那樣高的離解常數(shù)的靶標(biāo)分子的適配子(Brody and Gold 2000，Jayasena 1999，Wilson and Szostak 1999)。例如，已開發(fā)了適配子用來識別金屬離子，如Zn(II)(Ciesiolka et al.1995)和Ni(II)(Hofmann et al.1997)；核苷酸，如三磷酸腺苷(ATP)(Huizenga and Szostak 1995)；和鳥嘌呤(Kiga et al.1998)；輔因子，如NAD(Kiga et al.1998)和黃素(Lauhon and Szostak 1995)；抗生素，如紫霉素(Wallis et al.1997)和鏈霉素(Wallace andSchroeder 1998)；蛋白質(zhì)，如HIV反轉(zhuǎn)錄酶(Chaloin et al.2002)和丙型肝炎病毒RNA依賴性RNA聚合酶(Biroccio et al.2002)；毒素，如霍亂整體毒素(cholera whole toxin)和葡萄球菌腸毒素B(Bruno and Kiel 2002)；以及細(xì)菌芽孢，如炭疽(Bruno and Kiel1999)。與抗體相比，基于DNA/RNA的適配子更容易獲得并且生產(chǎn)成本更低，因?yàn)樗鼈兛稍隗w外短時(shí)期內(nèi)獲得(幾天到幾個(gè)月)并且成本有限。另外，DNA/RNA適配子可多次進(jìn)行變性和復(fù)性而不喪失其生物識別能力。這些獨(dú)特的性質(zhì)使得適配子成為用于設(shè)計(jì)高靈敏度和選擇性的生物檢測器的理想平臺(Hesselberth et al.2000)。
為了分析DNA/RNA酶或適配酶的活性，使用可檢測的標(biāo)記物。但是，很多的這些標(biāo)記物存在顯著的缺陷。放射性同位素招致安全和處理方面的問題，而熒光團(tuán)可能會發(fā)生光褪色并且還可能抑制想要分析的生物活性；有機(jī)著色劑，例如用在可卡因檢測適配子系統(tǒng)中的有機(jī)著色劑(Stojanovic and Landry，2002)對于視覺檢測需要高濃度并且只有經(jīng)過昂貴的反復(fù)試驗(yàn)之后才能與特定的適配子相匹配。
金屬粒子克服了所有這些難題。它們可以以很小(納摩爾)的量與適配子用作檢測劑而沒有任何有機(jī)著色劑的缺點(diǎn)。在基于利用金屬粒子用于顏色檢測的適配子的檢測器中，核酸基質(zhì)被適配酶(在效應(yīng)子的連接后)的裂解可通過顏色變化而被檢測到。
通常，基于DNA/RNA酶或適配酶的檢測器具有三個(gè)部分(1)核酸酶(在下面的描述中，核酸酶指的是DNA/RNA酶和適配酶)和輔因子，如催化基質(zhì)裂解的金屬離子；(2)用于核酸酶的核酸基質(zhì)，其中基質(zhì)序列的內(nèi)部互補(bǔ)于部分酶序列；以及(3)連接到互補(bǔ)于基質(zhì)的3’-和5’-端的多核苷酸的粒子。
為了檢測目標(biāo)輔因子或效應(yīng)子，多核苷酸的互補(bǔ)部分(多核苷酸連接到互補(bǔ)于基質(zhì)鏈的3’-和5’-端的粒子，核酸酶的3’-和5’-端互補(bǔ)于內(nèi)部基質(zhì)鏈序列)在懷疑含有靶標(biāo)輔因子或效應(yīng)子的樣品存在下進(jìn)行退火。如果不存在輔因子或效應(yīng)子，那么適配酶無活性或者表現(xiàn)出的活性大大降低，導(dǎo)致沒有或很少的基質(zhì)裂解和由此導(dǎo)致的粒子聚集。如果存在輔因子或效應(yīng)子，那么酶具有活性并裂解基質(zhì)，并阻止聚集形成，因?yàn)榱Ｗ又g的連接被酶催化的裂解所破壞。
表1舉例說明了這樣的系統(tǒng)。

*當(dāng)金粒子用于檢測時(shí)。
在金粒子的情形下，聚集態(tài)顯示為藍(lán)色，而分散態(tài)(或非聚集態(tài))為紅色。作為輔因子或效應(yīng)子的靶標(biāo)分析物的存在可基于檢測器系統(tǒng)顏色的出現(xiàn)被檢測。
由于裂解的程度反映到顏色變化的程度，所以可以量化靶標(biāo)輔因子或效應(yīng)子的濃度。例如，簡單的光譜測定法可用于靈敏度檢測。不僅顏色改變可用于檢測和量化，而且可使用其他裂解結(jié)果，如沉淀。通過用識別預(yù)選效應(yīng)子的適配酶替換適配子區(qū)，用于任何希望的效應(yīng)子的比色檢測器可容易地被制成和使用。
基于前面的工作，設(shè)計(jì)成了基于金納米粒子的DNA酶定向組合的用于Pb(II)的比色生物檢測器和基于金納米粒子的適配酶定向組合的用于腺苷的比色生物檢測器(參見，例如，系列號為09/605,558；10/144,094；10/144,679；以及10/384,497的美國專利申請)。盡管具有高度靈敏度和選擇性，但是這類分析檢測器需要加熱到高于50℃達(dá)幾分鐘并在2小時(shí)內(nèi)緩慢冷卻至室溫以用于檢測。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明涉及用于檢測效應(yīng)子或輔因子的檢測器系統(tǒng)，包括(a)核酸酶，包括輔因子的結(jié)合部位和可選地效應(yīng)子的結(jié)合部位；(b)用于核酸酶的基質(zhì)，包括第一多核苷酸；(c)第一組粒子，包括第二多核苷酸，其中該多核苷酸在3’端連接到該粒子；以及(d)第二組粒子，包括第三多核苷酸，其中該多核苷酸在5’端連接到該粒子。第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于第二多核苷酸，并且第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于第三多核苷酸。
在第二方面，本發(fā)明涉及用于檢測效應(yīng)子或輔因子的檢測器系統(tǒng)，包括(a)核酸酶，包括輔因子結(jié)合部位和可選地效應(yīng)子結(jié)合部位；(b)用于核酸酶的基質(zhì)，包括第一多核苷酸；(c)第一組粒子，包括第二多核苷酸；以及(d)第二組粒子，包括第三多核苷酸。第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于第二多核苷酸，并且第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于第三多核苷酸。第二組粒子具有至少20nm的直徑。
在第三方面，本發(fā)明涉及檢測樣品中效應(yīng)子和輔因子的方法，包括混合在一起的至少(a)核酸酶，包括輔因子結(jié)合部位和可選地效應(yīng)子結(jié)合部位；(b)用于核酸酶的基質(zhì)，包括第一多核苷酸；(c)第一組粒子，包括第二多核苷酸；(d)第二組粒子，包括第三多核苷酸；以及(e)樣品；以形成混合物。第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于第二多核苷酸，并且第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于第三多核苷酸。不用加熱，該混合物在形成混合物的10分鐘內(nèi)，產(chǎn)生顯示樣品中存在效應(yīng)子或輔因子的顏色變化。


圖1(A)包括酶鏈(17E)和基質(zhì)鏈(17DS)的“8-17”DNA酶體系的二級結(jié)構(gòu)。(B)在Pb(II)存在下，由17E對17DS的裂解。(C)金粒子的DNA酶定向組合及其用作用于諸如Pb(II)的金屬離子的生物檢測器的示意圖。
圖2(A)在“8-17”DNA酶平臺上構(gòu)建的腺苷適配酶的一級結(jié)構(gòu)和提議的二級結(jié)構(gòu)。(B)腺苷比色檢測的圖示。
圖3DNA連接的金粒子的兩種排列(alignment)方式。(A)“頭對尾”排列的粒子，其中，只需要一種硫醇修飾的DNA。(B)“尾對尾”排列的粒子。
圖4粒子排列和粒子大小對顏色變化速率的影響。
圖5一種Pb2+比色生物檢測器，其中，粒子的直徑為～35nm并且粒子以“尾對尾”的方式排列。
圖6一種新的Pb2+檢測器系統(tǒng)。(A)35nm的金粒子在不同時(shí)間的消光(extinction)光譜。(B)基質(zhì)濃度對聚集速率的影響。(C)NaCl濃度對聚集速率的影響。(D)17E濃度對聚集速率的影響。(E)粒子在不同pH值緩沖液中的聚集。(F)聚集10分鐘后的消光比率。
圖7新Pb2+檢測器的靈敏度和選擇性。(A)在不同Pb2+濃度下的金粒子聚集的動力學(xué)。(B)在開始后10分鐘的消光比率。
圖8一種新設(shè)計(jì)的基于適配酶的腺苷檢測器。反應(yīng)A不存在腺苷下的藍(lán)色聚集的形成。反應(yīng)B基質(zhì)在存在腺苷下的裂解。反應(yīng)C裂解的基質(zhì)不能組合金粒子，而產(chǎn)生紅色、分開的粒子。
圖9(A)粒子的基質(zhì)濃度依賴性聚集。(B)基質(zhì)被適配酶裂解的動力學(xué)。(C)基于適配酶的檢測器對腺苷的靈敏度和選擇性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明避免了現(xiàn)有DNA酶-和適配酶-金屬粒子檢測器系統(tǒng)需要的加熱，使得這些檢測器不僅可在實(shí)驗(yàn)室使用，而且可由用戶在其家中使用，或者由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用。本發(fā)明利用下面的影響基于粒子的比色生物檢測器性能的發(fā)現(xiàn)(1)將粒子的排列(alignment)從頭對尾改變?yōu)槲矊ξ玻?2)利用更大的粒子；以及(3)控制離子強(qiáng)度、適配子濃度和pH。
粒子的聚集受其相互之間的排列的影響。粒子可用兩種方式進(jìn)行排列，即“頭對尾”或“尾對尾”(圖3)。在早期的基于DNA酶的Pb2+檢測器中，例如，粒子以“頭對尾”方式排列。如果粒子以“頭對尾”方式排列，只需要一種硫醇修飾的DNA將DNA連接至粒子。在這種構(gòu)型中，粒子很難聚集，可能是由于空間位阻效應(yīng)。因此需要加熱和冷卻來促進(jìn)粒子的組合。但是，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用“尾對尾”排列時(shí)，粒子可在環(huán)境溫度下聚集(圖5)。對于“尾對尾”排列的粒子，3’-和5’-硫醇修飾的多核苷酸都需要。
粒子聚集物的顏色主要由聚集物的大小所控制。因此，聚集速率相等，則利用較大粒子的顏色變化速率增加。如在下面的實(shí)施例中所描述的，當(dāng)使用13nm和35nm直徑的粒子的混合物時(shí)，顏色變化的速率比僅用13nm直徑的粒子的顏色變化速率更快。如果僅用35nm直徑的粒子，顏色變化速率進(jìn)一步增大。
溶液的離子強(qiáng)度也影響系統(tǒng)的性能。較高的鹽濃度有利于聚集，可能是由于鹽減少帶負(fù)電的多核苷酸鏈之間的靜電排斥。盡管只需要基質(zhì)鏈來連接兩個(gè)粒子，但是，在沒有酶鏈存在下，基質(zhì)由于太“松軟”而不能組裝粒子。因此，酶濃度是很重要的參數(shù)。
pH也影響聚集。pH的影響可能是由于多核苷酸堿基的質(zhì)子化作用，其影響堿基配對并由此影響聚集的速率。
定義“輔因子”是在核酸酶催化反應(yīng)的催化過程中涉及的離子或分子并且為催化活性所需。
“效應(yīng)子”是當(dāng)其結(jié)合到具有效應(yīng)子結(jié)合部位的酶時(shí)，能夠增強(qiáng)或抑制酶催化作用的分子。“效應(yīng)子結(jié)合部位”可以是“特異的”，即，在其他效應(yīng)子分子存在的情況下，只結(jié)合一種效應(yīng)子分子。效應(yīng)子結(jié)合部位特異性的實(shí)例是當(dāng)許多其他類似分子，如胞苷、鳥苷和尿苷存在時(shí)，只結(jié)合腺苷分子?？蛇x地，效應(yīng)子結(jié)合部位可以是“部分”特異的(只結(jié)合一類分子)、或“非特異的”(具有分子混雜性)。效應(yīng)子的實(shí)例包括環(huán)境污染物，如氮肥、農(nóng)藥、二氧芑、酚類、或2，4-二氯苯氧基乙酸；重金屬離子，如Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、或Co(II)；生物分子，如葡萄糖、胰島素、hCG-激素、HIV或HIV蛋白質(zhì)；化學(xué)和生物恐怖劑，如炭疽、天花、或神經(jīng)毒氣；爆炸物，如TNT或DNT；藥物，如可卡因或抗生素。
“核酸酶”是指主要包含核酸的酶，如核糖核酸酶(RNA酶)、脫氧核糖核酸酶(DNA酶)、以及適配酶。核酸可以是天然的、非天然的或修飾的核酸。也包括肽核酸(PNA)。核酸酶需要“輔因子”用于有效的基質(zhì)裂解和/或特異性效應(yīng)子結(jié)合。通常的輔因子包括Mg(II)、Ca(II)、Zn(II)、Mn(II)、Co(II)和Pb(II)。
“多核苷酸”指的是具有至少兩個(gè)或多個(gè)核苷酸的核酸序列。多核苷酸可包含天然存在的核苷酸和合成的核苷酸。該術(shù)語也包括PNA分子。
“靈敏度”指的是能被檢測器檢測的輔因子或效應(yīng)子濃度的最小增加。
“檢測限”指的是分析裝置的檢測限。在本發(fā)明基于DNA酶和適配酶的檢測器上下文中，檢測限指的是檢測器能從背景中區(qū)分的輔因子或效應(yīng)子的最低濃度。
“堿基配對”指的是在較低嚴(yán)格性條件下，多核苷酸與核苷酸形成至少一個(gè)氫鍵的能力。該核苷酸可以是第二多核苷酸的部分或在第一多核苷酸內(nèi)存在的核苷酸。當(dāng)?shù)谝欢嗪塑账崮軌蚺c第二多核苷酸形成至少一個(gè)氫鍵時(shí)，多核苷酸部分地互補(bǔ)于第二多核苷酸。為了成為部分互補(bǔ)，多核苷酸可具有這樣的區(qū)其中堿基對不可以被形成環(huán)、莖-環(huán)、以及其他二級結(jié)構(gòu)的這些區(qū)形成環(huán)繞。
“適配子”指含有效應(yīng)子結(jié)合部位的多核苷酸。“效應(yīng)子結(jié)合部位”可以是“特異性的”，即，在其他效應(yīng)子分子存在下，只結(jié)合一種效應(yīng)子分子。效應(yīng)子結(jié)合部位特異性的實(shí)例為，當(dāng)在許多其他類似分子，如胞苷、鳥苷和尿苷存在時(shí)，只結(jié)合腺苷分子。可選地，效應(yīng)子結(jié)合部位可以是“部分”特異的(只結(jié)合一類分子)、或“非特異的”(具有分子混雜性)。
“適配酶”指的是包括結(jié)合效應(yīng)子的適配子區(qū)的核酸酶。效應(yīng)子的結(jié)合可增強(qiáng)或抑制催化作用。
具有效應(yīng)子(或效應(yīng)物)結(jié)合部位的核酸酶發(fā)現(xiàn)或開發(fā)了大量具有不同催化活性的核酸酶(表1和表2)。對于催化功能，該酶通常依賴于一種或多種輔因子。體外選擇可用來“增強(qiáng)”對特殊離子的選擇性和靈敏度。催化分子締合(連接(ligation)、磷酸化作用、以及形成酰胺結(jié)合)或分解(裂解或轉(zhuǎn)移)的核酸酶在本發(fā)明中尤其有用。
使用在效應(yīng)子存在下催化核酸裂解的核酸酶。該核酸酶可以是RNA(核糖核酸酶)、DNA(脫氧核糖核酸酶)、DNA/RNA雜化酶、或肽核酸(PNA)酶。PNA包含聚酰胺骨架(主鏈)和核苷堿基(可從例如Biosearch公司(Bedford，MA)獲得)?？墒褂玫暮颂呛怂崦赴ǖ贗組和第II組內(nèi)含子、細(xì)菌核糖核酸酶P的RNA組分、錘頭結(jié)構(gòu)、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、肝炎δ病毒和脈孢菌屬VS(Neurospora VS)核糖核酸酶。還包括體外選擇的核糖核酸酶，如以前分離出的那些核糖核酸酶(Tang and Breaker 2000)。核糖核酸酶趨于沒有脫氧核糖核酸酶穩(wěn)定，因此，優(yōu)選脫氧核糖核酸酶。具有擴(kuò)大的化學(xué)官能度的脫氧核糖核酸酶也是理想的(Santoro et al.，2000)。
表1由從體外選擇實(shí)驗(yàn)分離的核糖核酸酶催化的反應(yīng)。

a從體外選擇實(shí)驗(yàn)分離的核糖核酸酶催化的反應(yīng)。
Kcat/kuncat為對未催化反應(yīng)的速率提高。
表2通過體外選擇分離出的脫氧核糖核酸酶

bKmax是在優(yōu)化條件下獲得的最大速率常數(shù)。
制造核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的方法包括化學(xué)寡核苷酸合成、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、DNA克隆和復(fù)制。優(yōu)選地，核酸酶為DNA/RNA雜交體和PNA。還可使用含有修飾的堿基、磷酸酯(鹽)、或糖的核苷；在一些實(shí)例中，這些修飾的核苷酸更有利于穩(wěn)定性或提供效應(yīng)子特異性。修飾的堿基的實(shí)例包括次黃嘌呤核苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤核苷、N7-脫氮腺苷、以及O6-甲基鳥苷(Earnshaw and Gait 1998)。修飾的糖和磷酸酯(鹽)包括2’-脫氧核苷、脫堿基、丙基、硫代磷酸酯(鹽)、以及2’-O-烯丙基核苷(Earnshaw and Gait 1998)。
將核酸鏈從包括酶的鏈裂解開的核酸酶為反式作用酶。利用反式作用酶允許多輪(multiple rounds)基質(zhì)裂解，因?yàn)橐谱吡嗣复呋a(chǎn)物。這樣的核酸酶的實(shí)例是17E(SEQ ID NO1)；對應(yīng)的基質(zhì)是17DS(SEQ ID NO2，r表示單個(gè)核糖核苷酸)；兩者都表示在表3A中并在圖1中描述。包括酶鏈(17E)和基質(zhì)鏈(17DS)的“8-17”DNA酶系統(tǒng)的二級結(jié)構(gòu)在圖1a中進(jìn)行描述。裂解部位用箭頭指示。除了在裂解部位(rA)的核糖核苷腺苷外，所有其他核苷為脫氧核糖核苷。在存在Pb(II)的情況下，酶鏈裂解基質(zhì)鏈(圖1b)。因此，如圖1c所示的，該酶鏈和基質(zhì)鏈可用于DNA酶定向的金粒子的組合和用在作為對諸如Pb(II)的金屬離子的生物檢測器中。在這個(gè)系統(tǒng)中，17DS在3’和5’端都延長了12個(gè)堿基，其互補(bǔ)于連接到13nm金粒子的12-merDNA(DNAAu)。還在表3B中給出了其他實(shí)例。
表3A DNA酶和基質(zhì)

c“r”表示單個(gè)核糖核苷酸圖3B 基于RNA/DNA的適配子和RNA/DNA酶

定向誘發(fā)突變可用來改變核酸酶或其基質(zhì)的一種或多種性質(zhì)。利用17E和17DS作為實(shí)例，可能希望改變雜交酶和基質(zhì)的兩臂的親合力?！氨邸笔侵笀D1中顯示W(wǎng)atson-Crick堿基配對的那些區(qū)域。為了改變親合力，可以改變臂的長度。增加臂長度就增加了Watson-Crick堿基配對的數(shù)量，從而增大親合力；減小臂長度就降低了親合力。降低臂的親合力有利于將基質(zhì)從酶除去，由此可以進(jìn)行更快的酶促周轉(zhuǎn)。
另一種降低親合力的方法包括在酶和基質(zhì)之間產(chǎn)生錯(cuò)配。可選地，可改變臂的G-C含量。應(yīng)監(jiān)控任何定向變化的影響以便確保酶保持希望的活性，包括離子靈敏度和選擇性。例如，為了確保突變的酶保持對腺苷的靈敏度和選擇性，要進(jìn)行試驗(yàn)以確定突變的酶在腺苷存在下是否保留反應(yīng)活性(靈敏度)并在其他效應(yīng)子存在下是否保持其較低水平的活性(選擇性)。
適配子的體外選擇結(jié)合希望效應(yīng)子的適配子和適配酶可通過體外選擇進(jìn)行分離。體外選擇是通過多次循環(huán)的選擇和放大從大量序列變異體中分離出具有某些功能的RNA或DNA分子的方法(Chapman and Szostak1994，Joyce 1994)。具有最大化活性或新的催化能力的DNA酶和RNA酶、以及適配子可利用例如通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化方法(SELEX)獲得(Tuerk and Gold 1990)。
體外選擇一般用通常含有1013-1016個(gè)序列變異體的隨機(jī)序列的大量收集(池)進(jìn)行啟動。一組利用標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)的退化多核苷酸的化學(xué)合成可用來產(chǎn)生這樣的隨機(jī)池。將4種核苷(腺苷、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶)的3’-亞磷酰胺化合物預(yù)先混合并用來合成多核苷酸；隨機(jī)性通過控制這4種亞磷酸酰胺的比率產(chǎn)生。當(dāng)將亞磷酰胺常數(shù)控制在特定點(diǎn)時(shí)，還可實(shí)現(xiàn)偏向性。其他用于形成隨機(jī)DNA庫的方法包括誘變的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和模板定向的誘變(Cadwell and Joyce 1992，Cadwell and Joyce 1994，Tsang andJoyce 1996)。如果希望進(jìn)行RNA分子的體外選擇，那么首先通過體外轉(zhuǎn)錄將隨機(jī)DNA庫轉(zhuǎn)變?yōu)镽NA庫。
然后對隨機(jī)庫進(jìn)行篩選，選出具有希望的諸如結(jié)合靶標(biāo)效應(yīng)子功能的分子并分離出來?？衫糜H合柱層析(例如，利用靶標(biāo)效應(yīng)子)、凝膠電泳、或標(biāo)記的反應(yīng)中間體的選擇性放大來實(shí)現(xiàn)分離。將所選的分子利用例如對DNA的PCR、或?qū)NA的等溫放大反應(yīng)進(jìn)行放大。然后將這些所選的、放大的分子利用例如誘變PCR進(jìn)行突變(重新引入多樣性)，以選擇具有可能更高活性的分子。重復(fù)進(jìn)行選擇、放大和突變這3個(gè)步驟，經(jīng)常增加選擇的嚴(yán)格性，直至具有希望活性的序列在池中占優(yōu)勢。
從體外從隨機(jī)序列分離的新核酸酶具有擴(kuò)大的RNA和DNA的全部催化性能(表1)。相比于核糖核酸酶，脫氧核糖核酸酶催化較少類型的反應(yīng)(表2)。大多數(shù)脫氧核糖核酸酶的催化速率(Kcat)比得上核糖核酸酶催化相同反應(yīng)的催化速率。在某些情形下，核酸酶的催化效率(Kcat/Km)甚至超過蛋白酶的催化效率(Santoro andJoyce 1997)。
體外選擇可用來改變現(xiàn)有核酸酶的離子特異性或結(jié)合親合力或用來獲得對希望基質(zhì)具有特異性的核酸酶。例如，用于優(yōu)化錘頭狀核糖核酸酶活性所需的Mg2+濃度已經(jīng)利用體外選擇降低了，以便在生理?xiàng)l件下提高酶性能(Conaty et al.1999，Zillmann et al.1997)。
通常通過體外選擇開發(fā)的用于特定輔因子核酸酶在其他分子存在下具有活性。例如，通過體外選擇開發(fā)的17E脫氧核糖核酸酶具有在Zn2+存在下的活性。但是，該酶在存在Pb2+的情況下比存在Zn2+的情況下表現(xiàn)出更大的活性。盡管是在尋找Zn2+相關(guān)活性的過程中產(chǎn)生的，但是17E可用作用于Pb2+的靈敏度和選擇性的檢測器。為了產(chǎn)生具有更大選擇性的核酸酶，可引入陰性(negative)選擇步驟(Peter J.Bruesehoff，Jing Li，Anthony J.Augustine III，And Yi Lu，“Improving Metal Ion Specificity During In Vitro Selection of CatalyticDNA”Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening 5，327-355(2002))。
其他的多核苷酸序列也是有用的，包括于2000年6月27日提交的系列號為09/605,558的美國專利申請中所述的那些多核甘酸序列，其內(nèi)容以引用方式結(jié)合于此作為參考(Lu and Li)。
腺苷檢測器圖2A中所示的適配酶對腺苷是特異性的。適配酶的催化核心由“8-17”DNA酶修改而得并優(yōu)化為在Pb2+存在的情況下具有高活性。DNA酶的3’-端連接到腺苷適配子基序。因此，腺苷的存在可以促進(jìn)形成活性三級DNA酶結(jié)構(gòu)。在基于適配酶的檢測器中，這種復(fù)合體促進(jìn)基質(zhì)鏈在單個(gè)核糖-腺苷(ribo-adenosine)位置的裂解。在沒有腺苷的情況下，即使這三個(gè)組分仍能通過Watson-Crick堿基配對聚集在一起，但是裂解活性顯著降低。還示出了雜合到適配酶兩端的兩個(gè)DNA功能化的13nm直徑的金粒子。
如圖2B所圖解描述的，基質(zhì)鏈(自由基質(zhì)和雜化有酶以及調(diào)節(jié)子鏈的基質(zhì))可用作DNA功能化的金粒子的連接子，以形成具有藍(lán)顏色的聚集(反應(yīng)A)。在腺苷和金屬離子存在下，該基質(zhì)可被裂解(反應(yīng)B)。裂解的基質(zhì)可不再用作粒子的連接子并且顏色保持為紅色(反應(yīng)C)。
在這類檢測器中，基質(zhì)、酶和調(diào)節(jié)子鏈的存在還不足以在室溫下形成聚集。在不加熱情況下，很難雜合所有這三種鏈并用作連接子。為了解決這個(gè)問題，引入另一個(gè)DNA鏈(“腺苷-連接子”(Ade-linker))(圖8)。腺苷-連接子的作用是高效率地雜合基質(zhì)鏈并促進(jìn)粒子在室溫下的聚集。雜合后，腺苷-連接子形成具有10個(gè)核苷酸的凸起二級結(jié)構(gòu)。該凸起阻止腺苷-連接子利用裂解的基質(zhì)作為連接子而組合粒子。具有該凸起，即使部分腺苷-連接子雜合到裂解的基質(zhì)，但是整個(gè)結(jié)構(gòu)仍是松軟的，而不能組合粒子。
如果不存在腺苷，那么適配酶的基質(zhì)雜合腺苷-連接子，并且雜合的產(chǎn)物可組合(assemble)粒子而形成藍(lán)色聚集(反應(yīng)A)。在腺苷存在下，基質(zhì)鏈被裂解(反應(yīng)B)，而裂解的基質(zhì)不能組合金粒子，產(chǎn)生紅色的、分離的粒子(反應(yīng)C)。
用互補(bǔ)于核酸酶基質(zhì)3’和5’端的多核苷酸標(biāo)記的粒子對于用來記錄酶活性的檢測器，可檢測的變化必須基于在多核苷酸連接的粒子的聚集中發(fā)生的變化。另外，粒子的組成必須是不干擾基質(zhì)裂解。粒子可由例如金屬、半導(dǎo)體和磁性材料；ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnSe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs(例如，(Mirkin et al.2002))構(gòu)成；并且優(yōu)選由金粒子(可商業(yè)獲得；例如，Amersham Biosciences；Piscataway，NJ and Nanoprobes，Inc；Yaphank，NY)所構(gòu)成。還可使用非金屬粒子，包括陶瓷和聚合物，如聚苯乙烯膠乳粒子或含有著色劑的膠乳粒子。優(yōu)選粒子具有至少20nm，更優(yōu)選至少30nm，甚至更優(yōu)選至少35nm，包括15-500nm、20-200nm以及35-100nm的平均粒徑。
優(yōu)選具有至少35nm直徑的金膠粒。金膠粒對引起其強(qiáng)烈顏色的波段具有高的消光系數(shù)。這些顏色隨粒子大小、濃度、粒子間間距、聚集程度以及聚集形狀而變化。例如，由連接至粒子的多核苷酸的雜合促進(jìn)的金粒子的聚集導(dǎo)致產(chǎn)生肉眼可見的直接的顏色變化(參見，例如，(Mirkin et al.2002)。
粒子、多核苷酸或這兩者衍生(derivatized)用于連接。例如，用烷基硫醇在其3’-或5’-端衍生出來的多核苷酸容易連接到金粒子(Whitesides 1995)。將3’硫醇DNA連接至平整金表面的方法還可用來將多核苷酸連接至粒子(Mucic et al.1996)。烷基硫醇衍生的粒子可用來連接多核苷酸。其他用于將多核苷酸連接至固體表面的功能團(tuán)包括將多核苷酸連接至金表面的硫代磷酸酯(Beebe andRabke-Clemmer 1995)、用于將多核苷酸連接到硅石和玻璃表面的取代的烷基硅氧烷、氨基烷基硅氧烷以及巰基烷基硅氧烷(Grabar et al.1995)。在5’-硫代核苷或3’-硫代核苷終止的多核苷酸還可用于將多核苷酸連接至固體表面。連接多核苷酸的一些方法在表4中示出。
表4 用于將多核苷酸連接至粒子的系統(tǒng)

粒子排列為了使粒子以“尾對尾”方式進(jìn)行排列，將粒子以下面的方式進(jìn)行功能化。在基質(zhì)5’部位結(jié)合到基質(zhì)的粒子用在其3’端連接至粒子的互補(bǔ)多核苷酸鏈進(jìn)行功能化，而在基質(zhì)3’部位結(jié)合到基質(zhì)的粒子用在其5’端連接至粒子的互補(bǔ)多核苷酸鏈進(jìn)行功能化?；|(zhì)-粒子復(fù)合體具有圖3B中所示的結(jié)構(gòu)，而不是圖3A中所示的結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選地，將基質(zhì)進(jìn)行修飾，例如通過用大量用作“粘性末端”的堿基延長3’-和5’-端，以有利于對連接至粒子的互補(bǔ)多核苷酸鏈進(jìn)行退火?；|(zhì)修飾使得無需抑制核酸酶/基質(zhì)相互作用下形成包括基質(zhì)連接的粒子的復(fù)合體。但是，對含有對與核酸酶的相互作用不重要的區(qū)的基質(zhì)，修飾不是必須的。
粒子還可能直接連接到基質(zhì)，或可選地，基質(zhì)一端連接至粒子，而另一端互補(bǔ)于連接粒子的多核苷酸。因此，互補(bǔ)多核苷酸是任選的。
為了檢測目標(biāo)輔因子或效應(yīng)子，核酸酶、基質(zhì)以及標(biāo)記的粒子在懷疑含有酶對其敏感的靶標(biāo)輔因子或效應(yīng)子如腺苷的樣品存在下進(jìn)行組合(圖3)。在輔因子或效應(yīng)子存在下，酶裂解基質(zhì)而阻止聚集形成。
粒子的不同聚集狀態(tài)導(dǎo)致產(chǎn)生不同顏色。例如，較大程度的金粒子聚集顯示出藍(lán)色而較小程度的粒子聚集顯示出紅色。而且，基質(zhì)裂解的量和由此聚集的程度依賴于輔因子或效應(yīng)子的濃度。較低輔因子或效應(yīng)子的濃度導(dǎo)致只有部分產(chǎn)生單個(gè)粒子和聚集體的混合物的基質(zhì)裂解，使得可以進(jìn)行半定量或定量化驗(yàn)分析。可將顏色差異放大以提高靈敏度。對于量化檢測，分析混合物的光譜是確定的。除了顏色變化，粒子聚集的形成、或聚集粒子的沉淀也可被檢測。顏色變化可用肉眼或光譜法進(jìn)行觀察。聚集的形成可通過電子顯微鏡或通過比濁法進(jìn)行觀察；聚集粒子的沉淀可用肉眼或顯微鏡進(jìn)行觀察。
為了方便顏色變化的觀察，可在對比色背景下觀察顏色。當(dāng)使用金粒子時(shí)，通過將雜合溶液的樣品點(diǎn)在固體白色表面(如硅或鋁TLC平板、濾紙、硝酸纖維素膜、以及尼龍膜)上并使斑點(diǎn)干燥有利于顏色變化的觀察。最初，斑點(diǎn)保持雜化體溶液的顏色(其范圍為在沒有聚集存在下的粉紅色/紅色；至有金粒子聚集時(shí)的紫紅色/紫色)。通過干燥，如果在打點(diǎn)之前存在聚集，則顯現(xiàn)出藍(lán)色斑點(diǎn)；如果發(fā)生分散，則顯現(xiàn)出粉紅色斑點(diǎn)。藍(lán)色和粉紅色斑點(diǎn)穩(wěn)定并且在隨后的冷卻或加熱或經(jīng)過一段時(shí)間也不會變化。這提供了方便的、永久的試驗(yàn)記錄。觀察顏色變化無需其他步驟。
可選地，可對通過將使用35nm的金粒子的樣品在玻璃纖維過濾器上打點(diǎn)而將分析結(jié)果直觀化。在用水沖洗后，觀察到包括聚集的斑點(diǎn)。用于直觀化分析結(jié)果的其他方法也是可以利用的(Mirkin etal.2002)。
靶標(biāo)輔因子或效應(yīng)子可在各種樣品，包括生物樣品中進(jìn)行檢測。含有已知量的輔因子或效應(yīng)子的標(biāo)準(zhǔn)物可與未知樣品一起進(jìn)行分析，并將顏色變化進(jìn)行對比?？蛇x地，類似于使用pH試紙的那些方法，可提供標(biāo)準(zhǔn)比色圖表。
試劑盒本發(fā)明還提供用于檢測如輔因子或效應(yīng)子的分析物的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括至少一個(gè)容器，容器裝有至少兩類具有連接至其的多核苷酸的粒子；基質(zhì)，其具有至少三個(gè)部分，第一部分為第二部分的5’端，第二部分在分析物存在下由核酸酶所裂解，和第三部分為第二部分的3’端；以及核酸酶。連接至第一粒子的多核苷酸具有互補(bǔ)于至少基質(zhì)第一部分的序列的序列并在其5’端連接至粒子。連接第二粒子的多核苷酸具有互補(bǔ)于至少基質(zhì)第三部分的序列的序列并在其3’端連接至粒子。
當(dāng)提供試劑盒后，組合物的不同組分可在分開的容器中進(jìn)行包裝并在使用之前直接進(jìn)行混合。這種組分分別包裝使得活性組分可長期保存。例如，多種具有連接至其上的多核苷酸的粒子的一種、基質(zhì)、以及核酸酶用獨(dú)立的容器提供。
包括在試劑盒中的試劑可以用任何類型的容器提供，該容器可以保持不同組分的有效期并且不會被容器的材料所吸收或改變。例如，密封的玻璃安瓿瓶可容納多種試劑中的一種、或封裝在中性、非反應(yīng)性氣體如氮?dú)庀碌木彌_劑。安瓿瓶可由任何合適的材料如玻璃；諸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等的有機(jī)聚合物；陶瓷、金屬或任何其他通常用來盛裝類似試劑的材料所構(gòu)成。合適容器的其他實(shí)例包括可用與安瓿瓶類似的物質(zhì)制成的簡易瓶；和可包含金屬薄片狀內(nèi)部結(jié)構(gòu)，如鋁或合金的包裝物。其他容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶、注射器等等。容器可具有消毒通道口，如具有能用皮下注射器針頭刺穿的塞子的小瓶。其他容器可具有用可易于移走的隔膜分隔開并通過移走該隔膜而將組分進(jìn)行混合的兩個(gè)隔間。可移走的隔膜可以是玻璃、塑料、橡膠等。
試劑盒還可包含其他試劑和對檢測靶標(biāo)標(biāo)輔因子或效應(yīng)子有用的物品。試劑可包括含有已知量輔因子或效應(yīng)子的標(biāo)準(zhǔn)溶液、稀釋劑和其他緩沖劑、預(yù)處理試劑等。可作為部件提供的其他物品包括墊片(backing)(用于直觀化聚集坍塌(break down))，如TLC硅石板；微孔材料，注射器、吸液管、比色杯以及容器?？商峁┲甘靖鞣N聚集態(tài)的粒子出現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)圖表，其對應(yīng)所檢測的不同量的輔因子或效應(yīng)子的存在。
提供的試劑盒還可具有說明材料。說明書可以是印刷在紙或其他基材上，和/或可以以電子可讀介質(zhì)，如軟盤、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盤、錄像帶、錄音磁帶等。詳細(xì)說明可以不與試劑盒實(shí)體結(jié)合；替代地，用戶可從試劑盒的生產(chǎn)商或銷售商指定的因特網(wǎng)站得到指導(dǎo)或以電子郵件提供。
實(shí)施例實(shí)施例1 比色Pb2+生物檢測器多核苷酸和試劑所有多核苷酸從聯(lián)合(Integrated)DNA技術(shù)公司(Coralville，IA)購買。腺苷和其他核苷從Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)公司購買。制備35nm直徑的金粒子并連接3’-和5’-硫醇修飾的12-merDNA(Storhoff et al.1998)。基質(zhì)和酶用HPLC進(jìn)行提純。
金粒子的制備和功能化35nm直徑的金粒子通過用檸檬酸鈉還原HAuCl4而制備。制備過程使用的玻璃器皿浸泡在王水中并用微孔過濾水徹底沖洗。在250mL的兩頸燒瓶中，在攪拌下將200mL 0.3mM的HAuCl4加熱至回流。然后加入2mL 38.8mM的檸檬酸鈉。在幾分鐘內(nèi)，顏色從淺黃色變?yōu)樯罴t色。在顏色變化后，使系統(tǒng)再回流半個(gè)小時(shí)以使還原反應(yīng)完成。接著將系統(tǒng)緩慢冷卻至室溫，并用派熱克斯玻璃漏斗(Pyrex funnel)過濾粒子。將粒子利用透射電子顯微鏡法(TEM)在JEOL 2010電子顯微鏡上進(jìn)行表征，并確定大小為35±6nm。大多數(shù)粒子呈球形，少部分粒子呈縱橫比小于2的棒狀。金膠體在532nm具有～1的消光峰(extinction peak)，并且在假設(shè)所有粒子為具有35nm半徑的球體、所有HAuCl4都發(fā)生反應(yīng)以及粒子的密度與塊狀金的密度一樣下，計(jì)算的濃度為約0.23nM。這給出在532nm處的消光系數(shù)為4.4×109M-1cm-1。
具有3’-和5’-硫醇修飾的DNA的粒子的功能化硫醇修飾的DNA通過與50mM二硫蘇糖醇(DTT)孵育而活化。通常，60μL的1mM DNA與60μL的100mM DTT在室溫(20-22℃)下孵育2小時(shí)。然后將混合物置于Sep-Pak C18柱上以除去DTT。用10mL 95％的CH3CN；10mL的CH3CN、甲醇和水以1∶1∶1體積比的混合物；20mL的水和10mL的2M NH4OAc處理該柱。然后將DNA和DTT的混合物裝入柱中。用20mL的去離子水沖走DTT，而用1mL 95％的CH3CN；10mL的CH3CN、甲醇和水以1∶1∶1體積的混合物洗提DNA。將洗提后的DNA加入到12mL的金粒子(0.23nM)中。在孵育1天后，加入1.4mL含有1M NaCl和0.1MTris-乙酸酯(TA)的緩沖溶液。再次培養(yǎng)2天后，通過在8000rpm下離心10分鐘收集粒子。除去上清液，并將DNA-功能化的粒子再分散到25mM的TA緩沖液，pH值7.2，100mM的NaCl中。該過程重復(fù)三次，以確保除去游離DNA；最后，將粒子分散在同樣的緩沖液中并將532nm處的消光系數(shù)調(diào)整為～2.2(對應(yīng)于～0.5nM的濃度)。
粒子通過DNA酶的聚集在典型的實(shí)驗(yàn)中，將濃度都在～0.5nM的20μL的3’-硫醇修飾的和20μL的5’-硫醇修飾的DNA功能化的金粒子進(jìn)行混合。加入NaCl、酶(17E)和Pb2+，并加入基質(zhì)后將最終體積調(diào)整為100μL。通過加入基質(zhì)鏈引發(fā)聚集，并在Hewlett-Packard 8453分光光度計(jì)上檢測消光。除了pH依賴性研究外，緩沖液對所有的實(shí)驗(yàn)為pH值7.2的TA。對所有樣品，控制在基質(zhì)加入至第一光譜檢測之間的時(shí)間為15秒鐘。
在圖4所示的實(shí)驗(yàn)中，將消光率標(biāo)準(zhǔn)化以便更好地進(jìn)行比較。這些實(shí)驗(yàn)使用2μM的酶，基質(zhì)濃度對13nm的粒子為160nM、對13nm-35nm的混合粒子為120nM以及對35nm-35nm的粒子為3nM。緩沖液為pH7.2、25mM的TA。
新Pb2+檢測系統(tǒng)的優(yōu)化(f)聚集10分鐘后的消光率。
35nm的金粒子聚集后可觀察到明顯的紅色到藍(lán)色的顏色變化，因此，聚集過程可方便地通過紫外-可見光譜進(jìn)行檢測。圖6A示出了具有3nM的連接基質(zhì)、250mM的NaCl、以及1μM的酶(17E)的新檢測系統(tǒng)在加入基質(zhì)鏈后的不同時(shí)間點(diǎn)的幾個(gè)光譜。在加入基質(zhì)鏈之前，該系統(tǒng)顯示出在532nm處具有消光峰的紅色，相比于13nm直徑的粒子，其有10nm的紅色移動。在開始的3分鐘內(nèi)，顏色變化非常小。在這期間，認(rèn)為基質(zhì)鏈與酶鏈進(jìn)行堿基配對，并且雜合的DNA酶連接到金粒子。在接下來的幾分鐘內(nèi)，顏色變化的速率非常塊，表明粒子發(fā)生交聯(lián)而形成較大的聚集。隨著聚集的形成，在532nm處的消光峰降低，同時(shí)在700nm區(qū)內(nèi)增加，形成紅色到藍(lán)色的顏色過渡。經(jīng)過10分鐘后，聚集開始沉淀，導(dǎo)致在所有波長觀察到的消光降低。為了使樣品制備和粒子的濃度之間差異的影響減到最小，利用532nm和700nm處的消光率來檢測顏色變化的速率，具有與紅色有關(guān)的比率更高，而與藍(lán)色有關(guān)的比率更低。
圖6B示出了在存在不同濃度的基質(zhì)下顏色變化的速率。基質(zhì)濃度越高產(chǎn)生的顏色變化速率越高。因此，基質(zhì)濃度降低導(dǎo)致在設(shè)定時(shí)間的“更少的藍(lán)色”或“更多的紅色”。不同Pb2+濃度以不同速率裂解基質(zhì)，因此，通過觀察由檢測器顯示的顏色，就可以檢測Pb2+并進(jìn)行量化。利用3nM的基質(zhì)、250mM的NaCl和1μM的17E進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
影響聚集的其他因素如上所述，可找到影響粒子聚集速率的其他因素，如酶濃度、鹽濃度以及pH值。圖6C中所示的實(shí)驗(yàn)都是用3nM的基質(zhì)濃度和1μM的17E酶濃度以及變化的NaCl濃度進(jìn)行的。越高的NaCl濃度有利于聚集，可能因?yàn)镹aCl降低帶負(fù)電的DNA的負(fù)電荷之間的靜電排斥作用。
酶濃度也對粒子聚集有顯著的影響。圖6D中所示的實(shí)驗(yàn)都是用0.3nM的基質(zhì)濃度和250mM的NaCl濃度以及變化的17E酶濃度進(jìn)行的。越高的酶鏈濃度產(chǎn)生更快的聚集速率。在沒有酶存在或當(dāng)酶濃度非常低的情形下(圖6D，最上端的曲線)，聚集被抑制。盡管實(shí)體地只有基質(zhì)鏈用作連接子以組合粒子，但是酶鏈的存在表現(xiàn)出是任意的。根據(jù)這些觀察，假設(shè)聚集的第一步是基質(zhì)鏈雜合到酶鏈。接著雜合的DNA酶可組合金粒子。在不存在酶鏈的情形下，基質(zhì)通過其本身可能是太松軟而不能組合金粒子。
不同pH值也影響聚集。如圖6E所示，從pH 5.2到pH 10.2(pH5.2的乙酸酯(鹽)緩沖液，pH 6.2的MES緩沖液，pH 7.2-10.2的TA緩沖液)，所有樣品得到S形曲線，其為室溫(20-22℃)下金粒子的DNA酶定向組合的特性。對于pH 5.2的樣品，粒子的聚集表現(xiàn)為被抑制。聚集10分鐘后對消光率進(jìn)行繪圖并表示在圖6F中。從pH 7.2到9.2，觀察到了類似的消光性，表明了聚集的相似速率，但聚集速率對越高和越低的pH值都降低。因此檢測器可在從約6.2到約10.2的pH值范圍內(nèi)使用，在從約pH7.2到約9.2的pH值范圍內(nèi)具有最佳性能。粒子聚集速率的變化可能是由于DNA堿基在較低或較高pH值處的質(zhì)子化和去質(zhì)子化作用，這影響堿基配對，因此導(dǎo)致聚集速率的變化。
室溫下的聚集對具有不同Pb2+濃度的新檢測器在室溫(20-22℃)下的聚集動力學(xué)用紫外-可見光譜法進(jìn)行檢測。假設(shè)在存在Pb2+下，在基質(zhì)雜合到酶鏈之后，基質(zhì)鏈可以由酶鏈裂解或者成為組合粒子的連接子。兩個(gè)過程的相對速率依賴于Pb2+的濃度。如圖7A所示，當(dāng)Pb2+濃度增大時(shí)，聚集的速率被抑制。對于沒有加入Pb2+的樣品，聚集在10分鐘后幾乎完成。將在10分鐘的消光率用來量化Pb2+的濃度(圖7B)。
實(shí)施例2 比色腺苷生物檢測器粒子通過適配酶的聚集為了確定基質(zhì)鏈對基于適配酶的檢測器的最佳濃度，將20μL的每種粒子溶液(E532＝2.2)進(jìn)行混合，并加入腺苷-連接子直至最終濃度為5μM、最終濃度為250mM的NaCl，并在加入基質(zhì)后將體積調(diào)整為100μL。溶液在25mM、pH7.2的TA緩沖液中。
使用該溶液制備第二溶液，其具有最終濃度為0.15μM的基質(zhì)鏈、3μM的酶和調(diào)節(jié)子鏈、5mM的腺苷、250mM的NaCl以及25mMpH7.2的TA緩沖液。將98μL的第二溶液轉(zhuǎn)移到反應(yīng)管中并將此時(shí)設(shè)為O點(diǎn)。將2μL的金屬離子儲備溶液加入到反應(yīng)管中，以引發(fā)裂解反應(yīng)，并且在不同時(shí)間點(diǎn)將2μL的等分溶液轉(zhuǎn)入檢測管。一旦每個(gè)等分溶液從反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到檢測管，則通過在檢測管中加入EDTA淬滅裂解反應(yīng)。取自反應(yīng)管的2μL的等分溶液含有0.3pmol基質(zhì)，并且如果不發(fā)生裂解，則將在檢測管中給出3nM的基質(zhì)濃度。在反應(yīng)管中的每個(gè)樣品的消光光譜在將等分溶液從反應(yīng)管轉(zhuǎn)移后20分鐘進(jìn)行檢測。
為了檢測檢測器的靈敏度和選擇性，預(yù)備具有不同腺苷或其他核苷濃度的不同反應(yīng)管。在孵育30分鐘后，將2μL的等分溶液轉(zhuǎn)移到檢測管，并在孵育20分鐘后測量檢測管的消光光譜。
圖9A示出了基質(zhì)濃度依賴性的粒子聚集，其通過聚集20分鐘后消光光譜進(jìn)行檢測。圖9B示出了基質(zhì)被適配酶裂解的動力學(xué)。圖9C示出了用于腺苷的新設(shè)計(jì)的基于適配酶的檢測器的靈敏度和選擇性。粉紅、紅色以及藍(lán)色圓點(diǎn)分別為5mM胞苷、鳥苷和尿苷的消光率。
參考文獻(xiàn)(表3B的參考文獻(xiàn)獨(dú)立地在下面列出)Allara D，Nuzzo R.(1985)Spontaneously organized molecular assemblies.1.Formation，dynamics and physical properties of n-alkanoic acids adsorbedfrom solution on an oxidized aluminum surface.Langmuir 145-52.
Beebe T，Rabke-Clemmer C，(1995)Thiol labeling of DNA for attachment to goldsurfaces.Patent No.5,472,881 USA.
Biroccio A，Hamm J，Incitti I，De Francesco R，Tomei L.(2002)Selection of RNAaptamers that are specific and high-affinity ligands of the hepatitis C virusRNA-dependent RNA polymerase.J Virol 763688-3696.
Breaker RR，Joyce GF，Breaker RR，Joyce GF.(1995)A DNA enzyme withMg(2+)-dependent RNA phosphoesterase activity.；A DNA enzyme thatcleaves RNA.Chem Biol；Chem Biol 2；1223-229.
Breaker RR，Joyce GF.(1994)A DNA enzyme that cleaves RNA.Chem Biol 1223-229.
Breaker RR.(2002)Engineered allosteric ribozymes as biosensor components.Curr Opin Biotechnol 1331-39.
Brody EN，Gold L.(2000)Aptamers as therapeutic and diagnostic agents.JBiotechnol 745-13.
Brown A，Pavot C，Li J，Lu Y.A lead-dependent DNAzyme with a two-stepmechanism.submitted.
Bruno JG，Kiel JL.(1999)In vitro selection of DNA aptamers to anthrax sporeswith electrochemilumirescence detection.Biosens Bioelectron 14457-464.
Bruno JG，Kiel JL.(2002)Use of magnetic beads in selection and detection ofbiotoxin aptamers by electrochemiluminescence and enzymatic methods.Biotechniques 32178-80，182-3.
Cadwell RC，Joyce GF.(1992)Randomization of genes by PCR mutagenesis.PCR Methods Appl 228-33.
Cadwell RC，Joyce GF.(1994)Mutagenic PCR.PCR Methods Appl 3S136-40.Cao Y，Jin R，Mirkin CA.(2001)DNA-modified core-shell Ag/Au particles.J AmChem Soc 1237961-7962.
Carmi N，Shultz LA，Breaker RR.(1996)In vitro selection of self-cleaving DNAs.Chem Biol31039-1046.
Chaloin L，Lehmann MJ，Sczakiel G，Restle T.(2002)Endogenous expression ofa high-affinity pseudoknot RNA aptamer suppresses replication of HIV-1.Nucleic Acids Res304001-4008.
Chapman KB，Szostak JW.(1994)In vitro selection of catalytic RNAs.Curr OpinStruct Biol 4618-622.
Ciesiolka J，Gorski J，Yarus M.(1995)Selection of an RNA domain that bindsZn2+.RNA 1538-550.
Conaty J，Hendry P，Lockett T.(1999)Selected classes of minimisedhammerhead ribozyme have very high cleavage rates at low Mg2+concentration.Nucleic Acids Res272400-2407.
Conn M，Prudent J，Schultz P.(1996)Porphyrin Metallation Catalyzed by a SmallRNA Molecule.J Am Chem Soc 1187012-7013.
Cuenoud B，Szostak JW.(1995)A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity.Nature 375611-614.
Dai X，De Mesmaeker A，Joyce G F.(1995)Cleavage of an amide bond by aribozyme.Science 267237-240.
Earnshaw，Gait.(1998)Modified oligoribonucleotides as site-specific probes ofRNA structure and function.Biopolymers 4839-55.
Ekland EH，Bartel DP.(1996)RNA-catalysed RNA polymerization usingnucleoside triphosphates.Nature 382373-376.
Ekland EH，Szostak JW，Bartel DP.(1995)Structurally complex and highly activeRNA ligases derived from random RNA sequences.Science 269364-370.
Ellington AD，Szostak JW.(1990)In vitro selection of RNA molecules that bindspecific ligands.Nature 346818-822.
Faulhammer D，F(xiàn)amulok M.(1997)Angew Chem Int Ed Engl 352837-2841.
Geyer CR，Sen D.(1997)Evidence for the metal-cofactor independence of anRNA phosphodiester-cleaving DNA enzyme.Chem Biol 4579-593.
Grabar K，F(xiàn)reeman R，Hommer M，Natan M.(1995)Preparation andcharacterization of Au colloid Monolayers.Anal.Chem.67735-743.
Hesselberth J，Robertson MP，Jhaveri S，Ellington AD.(2000)In vitro selection ofnucleic acids for diagnostic applications.J Biotechnol 7415-25.
Hofmann HP，Limmer S，Hornung V，Sprinzl M.(1997)Ni2+-binding RNA motifswith an asymmetric purine-rich internal loop and a G-A base pair.RNA 31289-1300.
Huizenga DE，Szostak JW.(1995)A DNA aptamer that binds adenosine andATP.Biochemistry 34656-665.
Iler R.(1979)Chapter 6.Inanonymous(eds)The chemistry of silica.Wiley，NewYork.
Illangasekare M，Yarus M.(1997)Small-molecule-substrate interactions with aself-aminoacylating ribozyme.J Mol Biol 268631-639.
Jayasena SD.(1999)Aptamersan emerging class of molecules that rivalantibodies in diagnostics.Clin Chem 451628-1650.
Jhave ri S，Kirby R，Conrad R，Maglott E，Bowser M，Kennedy R，Glick G，Ellington A.(2000)Designed signaling aptamers that transduce molecularrecognition to changes in fluorescence intensity.J.Am.Chem.Soc.1222469-2473.
Jhaveri S，Rajendran M，Ellington AD.(2000)In vitro selection of signalingaptamers.Nat Biotechnol 181293-1297.
Joyce GF.(1994)In vitro evolution of nucleic acids.Curr Opin Struct Biol 4331-336.
Kiga D，F(xiàn)utamura Y，Sakamoto K，Yokoyama S.(1998)An RNA aptamer to thexanthine/guanine base with a distinctive mode of purine recognition.NucleicAcids Res 261755-1760.
Lauhon CT，Szostak JW.(1995)RNA aptamers that bind flavin and nicotinamideredox cofactors.J Am Chem Soc 1171246-1257.
Li J，Lu Y.(2000)A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor forlead ions.J Am Chem Soc 12210466-10467.
Li J，Zheng W，Kwon AH，Lu Y.(2000)In vitro selection and characterization of ahighly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleaving deoxyribozyme.NucleicAcids Res 28481-488.
Li Y，Breaker RR.(1999)Phosphorylating DNA with DNA.Proc Natl Acad Sci US A 962746-2751.
Li Y，Sen D.(1996)A catalytic DNA for porphyrin metallation.Nat Struct Biol 3743-7.
Link S，Wang Z，EI-Sayed M.(1999)Alloy formation of gold-silver particles andthe dependence of the plasmon absorption on their compositions.J PhysChem B 1033529-3533.
Lohse PA，Szostak JW.(1996)Ribozyme-catalysed amino-acid transferreactions.Nature 381442-444.
Lorsch JR，Szostak JW.(1994)In vitro evolution of new ribozymes withpolynucleotide kinase activity.Nature 37131-36.
Lu Y.(2002)New transition-metal-dependent DNAzymes as efficientendonucleases and as selectiye metal biosensors.Chemistry 84589-4596
Lu Y，Liu J，SIMPLECATALYTICDNABIOSENSORS FOR IONS BASED ONCOLOR CHANGES，Application Serial No.09/605,558，USA.
Maoz R，Sagiv J.(1987)Penetration-controlled reactions in organized monolayerassemblies.1.Aqueous permanganate interaction with monolayer andmultilayer films of long-chain surfactants.Langmuir 31034-1044.
Mirkin CA，Letsinger RL，Mucic RC，Storhoff JJ.(1996)A DNA-based method forrationally assembling particles into macroscopic materials.Nature 382607-609.
Mirkin，C.A.，Letsinger，L.R，Mucic，C.R，Storhoff，J.J，Elghanian R，(2002)Particles having polynucleotides attached thereto and uses therefor.PatentNo.6,361,944 USA.
Mucic R，Herrlein M，Mirkin，C.A.，Letsinger R.(1996)Synthesis andcharacterization of DNA with ferrocenyl groups attached to their 5’-terminiElectrochemical characterization of a redox-active nucleotide monolayer.Chem.Commun.555.
Nuzzo R，F(xiàn)usco F，Allara D.(1987)Spontaneously organized molecularassemblies，3.Preparation and properties of solution adsorbed monolayersof organic disulfides on gold surfaces.J Am Chem Soc 1092358.
Piccirilli JA，McConnell TS，Zaug AJ，Noller HF，Cech TR.(1992)Aminoacylesterase activity of the Tetrahymena ribozyme.Science 2561420-1424.
Prudent JR，Uno T，Schultz PG.(1994)Expanding the scope of RNA catalysis.Science 2641924-1927.
Rakow NA，Suslick KS.(2000)A colorimetric sensor array for odour visualization.Nature 406710-713.
Robertson MP，Ellington AD.(1999)In vitro selection of an allosteric ribozymethat transduces analytes to amplicons.Nat Biotechnol 1762-66.
Roth A，Breaker RR.(1998)An amino acid as a cofactor for a catalyticpolynucleotide.Proc Natl Acad Sci USA 956027-6031.
Rusconi CP，Scardino E，Layzer J，Pitoc GA，Ortel TL，Monroe D，Sullenger BA.(2002)RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa.Nature 41990-94.
Santoro SW，Joyce GF.(1997)A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme.Proc Natl Acad Sci U S A 944262-4266.
Seetharaman S，Zivarts M，Sudarsan N，Breaker RR.(2001)Immobilized RNAswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures.NatBiotechnol 19336-341.
Shaiu WL，Larson DD，Vesenka J，Henderson E.(1993)Atomic force microscopyof oriented linear DNA molecules labeled with 5nm gold spheres.NucleicAcids Res 2199-103.
Sillén LG，(1964)Stability constants of metal-ion complexes.Edition2d ed.Smith J，Olson D，Armitage B.(1999)Molecular recognition of PNA-containinghybridsSpontaneous assembly of helical cyanine dye aggregates on PNAtemplates.J.Am.Cham.Soc.1212686-2695.
Soriaga M，Hubbard A.(1982)Determination of the orientation of aromaticmolecules adsorbed on platinum electrodesThe influence of soluteconcentration.J Am Chem Soc 104.
Soukup GA，Breaker RR.(2000)Allosteric nucleic acid catalysts.Curr OpinStruct Biol 10318-325.
Stojanovic MN，Landry DW.(2002)Aptamer-based colorimetric probe forcocaine.J Am Chem Soc 1249678-9679.
Storhoff J，Elghanian R，Mucic R，Mirkin C，Letsinger RL.(1998)One-potcolorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfectionsusing gold particle probes.J Am Chem Soc 1201959-1964.
Tang J，Breaker RR.(1997)Rational design of allosteric ribozymes.Chem Biol 4453-459.
Tang J，Breaker RR.(2000)Structural diversity of self-cleaving ribozymes.ProcNatl Acad Sci U S A 975784-5789.
Tarasow TM，Tarasow SL，Eaton BE.(1g97)RNA-catalysed carbon-carbon bondformation.Nature 38954-57.
Timmons，Zisman.(1965)J.Phys.Chem.69984-990.
Tompkins H，Allara D.(1974)The study of the gas-solid interaction of acetic acidwith a cuprous oxide surface using reflection-absorption spectroscopy.J.Colloid and Interface Sci.49410.
Tsang J，Joyce GF.(1996)In vitro evolution of randomized ribozymes.MethodsEnzymol 267410-426.
Tuerk C，Gold L.(1990)Systematic evolution of ligands by exponentialenrichmentRNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science249505-510.
Vaish NK，Heaton PA，F(xiàn)edorova O，Eckstein F.(1998)In vitro selection of apurine nucleotide-specific hammerheadlike ribozyme.Proc Natl Acad Sci US A 952158-2162.
Wallace ST，Schroeder R.(1998)In vitro selection and characterization ofstreptomycin-binding RNAsrecognition discrimination between antibiotics.RNA 4112-123.
Wallis MG，Streicher B，Wank H，von Ahsen U，Clodi E，Wallace ST，F(xiàn)amulok M，Schroeder R.(1997)In vitro selection of a viomycin-binding RNApseudoknot.Chem Biol 4357-366.
Wang DY，Lai BH，Sen D.(2002)A general strategy for effector-mediated controlof RNA-cleaving ribozymes and DNA enzymes.J Mol Biol 31833-43.
Wecker M，Smith D，Gold L.(1996)In vitro selection of a novel catalytic RNAcharacterization of a sulfur alkylation reaction and interaction with a smallpeptide.RNA 2982-994.
Whitesides，(1995)Proceedings of the Robert A.Welch Foundation 39thConference On Chemical Research Nanophase Chemistry.，Houston，TX.
Wiegand TW，Janssen RC，Eaton BE.(1997)Selection of RNA amide synthases.Chem Biol 4675-683.
Wilson C，Szostak JW.(1995)In vitro evolution of a self-alkylating ribozyme.Nature 374777-782.
Wilson DS，Szostak JW.(1999)In vitro selection of functional nucleic acids.Annu Rev Biochem 68611-647.
Zhang B，Cech TR.(1997)Peptide bond formation by in vitro selectedribozymes.Nature 39096-100.
Zillmann M，Limauro SE，Goodchild J.(1997)In vitro optimization of truncatedstem-loop II variants of the hammerhead ribozyme for cleavage in lowconcentrations of magnesium under non-turnover conditions.RNA 3734-747.
表3B的參考文獻(xiàn)1.Ellington，A.D.& Conrad，R.(1995).Aptamers as potential nucleicacid pharmaceuticals.Biotechnol.Annu.Rev.1185-214.
2.Jayasena，S.D.(1999).Aptamers；an emerging class of moleculesthat rival antibodies in diagnostics.Clin.Chem.(Washington，D.C.)451628-50.
3.Sun，L.Q.，Cairns，M.J.，Saravolac，E.G.，Baker，A.& Gerlach，W.L.(2000).Catalytic nucleic acidsFrom lab to applications.Pharmacol.Rev.52325-47.
4.Hesselberth，J.，Robertson，M.P.，Jhaveri，S.& Ellington，A.D.(2000).In vitro selection of nucleic acids for diagnostic applications.Rev.Mol.Biotechnol.7415-25.
5.Joyce，G.F.(1999).Reactions Catalyzed by RNA and DNAEnzymes.In The RNA World，vol.37(Gesteland，R.F.，Cech，T.R.&Atkins，J.F.，ed.)，pp.687-9，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York.
6.Breaker，R.R.(1997).DNA enzymes.Nat.Biotechnol.15427-31.
7.Sen，D.& Geyer，C.R.(1998).DNA enzymes.Curr.Opin.Chem.Biol.2680-7.
8.Breaker，R.R.(1999).Catalytic DNAin training and seekingemployment.Nat.Biotechnol.17422-3.
9.Breaker，R.R.(2000).Making catalytic DNAs.Science(Washington，D.C.)2902095-6.
10.Derose，V.J.(2002).Two Decades of RNA Catalysis.Chemisty &Biology 9961-9.
11.Ellington，A.D.& Szostak，J.W.(1990).In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands.Nature(London)346818-22.
12.Ellington，A.D.& Szostak，J.W.(1992).Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures.Nature(London)355850-2.
13.Santoro，S.W.& Joyce，G.F.(1997).A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.944262-6.
14.Faulhammer，D.& Famulok，M.(1996).The Ca2+ion as a cofactorfor a novel RNA-cleaving deoxyribozyme.Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.352837-41.
15.Li，J.，Zheng，W.，Kwon，A.H.& Lu，Y.(2000).In vitro selection andcharacterization of a highly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleavingdeoxyribozyme.Nucleic Acids Res.28481-8.
16.Jenison，R.D.，Gill，S.C.，Pardi，A.& Polisky，B.(1994).High-resolution molecular discrimination by RNA.Science(Washington，DC，United States)2631425-9.
17.Santoro，S.W.& Joyce，G.F.(1998).Mechanism and utility of anRNA-cleaving DNA enzyme.Biochemistry 3713330-42.
18.Mannironi，C.，Di Nardo，A.，F(xiàn)ruscoloni，P.& Tocchini-Valentini，G.P.(1997).In vitro selection of dopamine RNA ligands.Biochemistry 369726-34.
19.Sigurdsson，S.T.，Thomson，J.B.& Eckstein，F(xiàn).(1998).Smallribozymes.Cold Spring Harbor Monogr.Ser.35339-76.
20.Stage-Zimmermann，T.K.& Uhlenbeck，O.C.(1998).Hammerheadribozyme kinetics.RNA 4875-89.
21.Werstuck，G.& Green，M.R.(1998).Controlling gene expression inliving cells through small molecule-RNA interactions.Science(Washington，D.C.)282296-8.
22.Walter，N.G.& Burke，J.M.(1998).The hairpin ribozymestructure，assembly and catalysis.Curr.Opin.Chem.Biol.224-30.
23.Holeman，L.A.，Robinson，S.L.，Szostak，J.W.& Wilson，C.(1998).Isolation and characterization of fluorophore-binding RNA aptamers.Folding Des.3423-31.
24.Wilson，C.& Szostak，J.W.(1998).Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.Chem.Biol.5609-17.
25.Pan，T.& Uhlenbeck，O.C.(1992).A small metalloribozyme with atwo-step mechanism.Nature 358560-3.
26.Yang，Q.，Goldstein，I.J.，Mei，H.-Y.& Engelke，D.R.(1998).DNAligands that bind tightly and selectively to cellobiose.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.955462-7.
27.Been，M.D.& Wickham，G.S.(1997).Self-cleaving ribozymes ofhepatitis delta virus RNA.Eur.J.Biochem.247741-53.
28.Tanner，N.K.(1998).Biochemistry of hepatitis delta virus catalyticRNAs.Ribozymes Gene Ther.Cancer.23-38.
29.Famulok，M.& Szostak，J.W.(1992).Stereospecific recognition oftryptophan agarose by in vitro selected RNA.J.Am.Chem.Soc.1143990-1.
30.Cech，T.R.(1993).Structure and mechanism of the large catalyticRNAsgroup I and group II introns and ribonuclease P.In The RNA World(Gesteland，R.F.& Atkins，J.F.，ed.)，pp.239-70，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.
31.Cech，T.R.& Herschlag，D.(1996).Group I ribozymessubstraterecognition，catalytic strategies，and comparative mechanistic analysis.Nucleic Acids Mol.Biol.101-17.
32.Famulok，M.(1994).Molecular Recognition of Amino Acids byRNA-AptamersAn L-Citrulline Binding RNA Motif and Its Evolution into anL-Arginine Binder.J.Am.Chem.Soc.1161698-706.
33.Geiger，A.，Burgstaller，P.，Von Der Eltz，H.，Roeder，A.& Famulok，M.(1996).RNA aptamers that bind L-arginine with sub-micromolardissociation constants and high enantioselectivity.Nucleic Acids Res.241029-36.
34.Tao，J.& Frankel，A.D.(1996).Arginine-Binding RNAs ResemblingTAR Identified by in Vitro Selection.Biochemistry 352229-38.
35.Connell，G.J.，Illangesekare，M.& Yarus，M.(1993).Three smallribooligonucleotides with specific arginine sites.Biochemistry 325497-502.
36.Burgstaller，P.，Kochoyan，M.& Famulok，M.(1995).Structuralprobing and damage selection of citrulline-and arginine-specific RNAaptamers identify base positions required for binding.Nucleic Acids Res.234769-76.
37.Nolte，A.，Klussmann，S.，Bald，R.，Erdmann，V.A.& Fuerste，J.P.(1996).Mirror-design of L-oligonucleotide ligands binding to L-arginine.Nature Biotechnology 141116-9.
38.Valadkhan，S.& Manley，J.L.(2001).Splicing-related catalysis byprotein-free snRNAs.Nature(London，United Kingdom)413701-7.
39.Nissen，P.，Hansen，J.，Ban，N.，Moore，P.B.& Steitz，T.A.(2000).The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis.Science(Washington，D.C.)289920-30.
40.Harada，K.& Frankel，A.D.(1995).Identification of two novelarginine binding DNAs.EMBO J.145798-811.
41.Carmi，N.，Balkhi，H.R.& Breaker，R.R.(1998).Cleaving DNA withDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.952233-7.
42.Majerfeld，I.& Yarus，M.(1994).An RNA pocket for an aliphatichydrophobe.Nat.Struct.Biol.1287-g2.
43.Cuenoud，B.& Szostak，J.W.(1995).A DNA metalloenzyme withDNA ligase activity.Nature 375611-4.
44.Majerfeld，I.& Yarus，M.(1998).IsoleucineRNA sites withassociated coding sequences.Rna 4471-8.
45.Li，Y.& Breaker，R.R.(1999).Phosphorylating DNA with DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962746-51.
46.Sassanfar，M.& Szostak，J.W.(1993).An RNA motif that bindsATP.Narure(London)364550-3.
47.Burgstaller，P.& Famulok，M.(1994).Isolation of RNA aptamers forbiological cofactors by in vitro selection.Angew.Chem.1061163-6(Seealso Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，994，33(10)，084-7).
48.Burke，D.H.& Gold，L.(1997).RNA aptamers to the adenosinemoiety of S-adenosyl methioninestructural inferences from variations ona theme and the reproducibility of SELEX.Nucleic Acids Res.252020-4.
49.Huizenga，D.E.& Szostak，J.W.(1995).A DNA Aptamer That BindsAdenosine and ATP.Biochemistry 34656-65.
50.Klussmann，S.，Nolte，A.，Bald，R.，Erdmann，V.A.& Fuerste，J.P.(1996).Mirror-image RNA that binds D-adenosine.Nat.Biotechnol.141112-5.
51.Burmeister，J.，Von Kiedrowski，G.& Ellington，A.D.(1997).Cofactor-assisted self-cleavage in DNA libraries with a 3’-’5’-phosphoramidate bond.Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.361321-4.
52.Connell，G.J.& Yarus，M.(1994).RNAs with dual specificity anddual RNAs with similar specificity.Science(Washington，D.C.)2641137-41.
53.Li，Y.& Sen，D.(1996).A catalytic DNA for porphyrin metallation.Nat.Struct.Biol.3743-7.
54.Lauhon，C.T.& Szostak，J.W.(1995).RNA aptamers that bindflavin and nicotinamide redox cofactors.J.Am.Chem.Soc.1171246-57.
55.Travascio，P.，Bennet，A.J.，Wang，D.Y.& Sen，D.(1999).Aribozyme and a catalytic DNA with peroxidase activityactive sites versuscofactor-binding sites.Chemistry & Biology 6779-87.
56.Lorsch，J.R.& Szostak，J.W.(1994).In vitro selection of RNAaptamers specific for cyanocobalamin.Biochemistry 33973-82.
57.Rink，S.M.，Shen，J.-C.& Loeb，L.A.(1998).Creation of RNAmolecules that recognize the oxidative lesion 7，8-dihydro-8-hydroxy-2’-deoxyguanosine(8-oxodG)in DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9511619-24.
58.Haller，A.A.& Sarnow，P.(1997).In vitro selection of a 7-methyl-guanosine binding RNA that inhibits translation of capped mRNAmolecules.Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.948521-6.
59.Kiga，D.，F(xiàn)utamura，Y.，Sakamoto，K.& Yokoyama，S.(1998).AnRNA aptamer to the xanthine/guanine base with a distinctive mode ofpurine recognition.Nucleic Acids Res.261755-60.
60.Lato，S.M.，Boles，A.R.& Ellington，A.D.(1995).In vitro selection ofRNA lectinsUsing combinatorial chemistry to interpret ribozymeevolution.Chem.Biol.2291-303.
61.Wang，Y.，Killian，J.，Hamasa ki，K.& Rando，R.R.(1996).RNAMolecules That Specifically and Stoichiometrically Bind AminoglycosideAntibiotics with High Affinities.Biochemistry 3512338-46.
62.Wallis，M.G.，Von Ahsen，U.，Schroeder，R.& Famulok，M.(1995).A novel RNA motif for neomycin recognition.Chem.Biol.2543-52.
63.Famulok，M.& Huettenhofer，A.(1996).In Vitro Selection Analysisof Neomycin Binding RNAs with a Mutagenized Pool of Variants of the16S rRNA Decoding Region.Biochemistry 354265-70.
64.Wallis，M.G.，Streicher，B.，Wank，H.，Von Ahsen，U.，Clodi，E.，Wallace，S.T.，F(xiàn)amulok，M.& Schroeder，R.(1997).In vitro selection of aviomycin-binding RNA pseudoknot.Chem.Biol.4357-66.
65.Burke，D.H.，Hoffman，D.C.，Brown，A.，Hansen，M.，Pardi，A.&Gold，L.(1997).RNA aptamers to the peptidyl transferase inhibitorchloramphenicol.Chem.Biol.4833-43.
66.Wallace，S.T.& Schroeder，R.(1998).In vitro selection andcharacterization of streptomycin-binding RNAsrecognition discriminationbetween antibiotics.Rna 4112-23.
67.Giver，L.，Bartel，D.P.，Zapp，M.L.，Green，M.R.& Ellington，A.D.(1993).Selection and design of high-affinity RNA ligands for HIV-1 Rev.Gene 13719-24.
68.Giver，L.，Bartel，D.，Zapp，M.，Pawul，A.，Green，M.& Ellington，A.D.(1993).Selective optimization of the Rev-binding element of HIV-1.Nucleic Acids Res.215509-16.
69.Williams，K.P.，Liu，X.-H.，Schumacher，T.N.M.，Lin，H.Y.，Ausiello，D.A.，Kim，P.S.& Bartel，D.P.(1997).Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of vasopressin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9411285-90.
70.Zimmerman，J.M.& Maher，L.J.，lii(2002).In vivo selection ofspectinomycin-binding RNAs.Nucleic Acids Res.305425-35.
71.Vianini，E.，Palumbo，M.& Gatto，B.(2001).In vitro selection ofDNA aptamers that bind L-tyrosinamide.Bioorganic & MedicinalChemistry 92543-8.
72.Andreola，M.-L.，Pileur，F(xiàn).，Calmels，C.，Ventura，M.，Tarrago-Litvak，L.，Toulme，J.-J.& Litvak，S.(2001).DNA aptamers selectedagainst the HIV-1 RNase H display in vitro antiviral activity.Biochemistry4010087-94.
73.Fukusaki，E.-I.，Kato，T.，Maeda，H.，Kawazoe，N.，Ito，Y.，Okazawa，A.，Kajiyama，S.-I.& Kobayashi，A.(2000).DNA aptamers thatbind to chitin.Bioorg.Med.Chem.Lett.10423-5.
74.Bock，L.C.，Griffin，L.C.，Latham，J.A.，Vermaas，E.H.& Toole，J.J.(1992).Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibithuman thrombin.Nature(London)355564-6.
75.Koizumi，M.& Breaker，R.R.(2000).Molecular Recognition ofcAMP by an RNA Aptamer.Biochemistry 398983-92.
76.Kato，T.，Takemura，T.，Yano，K.，Ikebukuro，K.& Karube，I.(2000).In vitro selection of DNA aptamers Which bind to cholic acid.Biochim.Biophys.Acta 149312-8.
77.Okazawa，A.，Maeda，H.，F(xiàn)ukusaki，E.，Katakura，Y.& Kobayashi，A.(2000).In vitro selection of hematoporphyrin binding DNA aptamers.Bioorg.Med.Chem.Lett.102653-6.
78.Kawakami，J.，Imanaka，H.，Yokota，Y.& Sugimoto，N.(2000).Invitro selection of aptamers that act with Zn2+.J.Inorg.Biochem.82197-206.
79.Bruno，J.G.& Kiel，J.L.(1999).In vitro selection of DNA aptamersto anthrax spores with electrochemiluminescence detection.Biosensors &Bioelectronics 14457-64.
序列表<110>LU，YILIU，JUEWEN<120>BIOSENSORS BASED ON DIRECTED ASSEMBLY OF PARTICLES<130>ILL05-041-US<140>10/756,825<141>2004-01-13<160>16<170>patentIn Ver.3.2<210>1<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSyntheticoligonucleotide<400>1catctcttct ccgagccggt cgaaatagtg agt 33<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<220>
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<221>modified_base<222>(24)<223>Any single ribonucleotide<400>13actcatctgt gagactcact atanggaaga gatgtcaact cgtg 44<210>14<211>50<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Description of Artificial SequenceSyntheticoliqonucleotide<400>16tctcttccat tttttttaat agtgagtc28
權(quán)利要求
1.一種用于檢測效應(yīng)子或輔因子的檢測器系統(tǒng)，包括(a)核酸酶，包括輔因子結(jié)合部位和可選的效應(yīng)子結(jié)合部位；(b)用于核酸酶的基質(zhì)，包括第一多核苷酸；(c)第一組粒子，包括第二多核苷酸，其中所述多核苷酸在3’端連接到所述粒子；以及(d)第二組粒子，包括第三多核苷酸，其中所述多核苷酸在5’端連接到所述粒子；其中，所述第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于所述第二多核苷酸，并且所述第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于所述第三多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測器系統(tǒng)，其中，所述核酸酶包括DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器系統(tǒng)，其中，所述第一組粒子和所述第二組粒子包括金。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器，其中，所述第一組粒子和所述第二組粒子包括選自由金屬、半導(dǎo)體和膠乳組成的組的材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器，其中，所述效應(yīng)子或輔因子選自如下的組氮肥、農(nóng)藥、二氧芑、酚類、2，4-二氯苯氧基乙酸、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、Co(II)、葡萄糖、胰島素、hCG-激素、HIV、HIV蛋白質(zhì)、炭疽、天花、神經(jīng)毒氣、TNT、DNT、可卡因和抗生素。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器，其中所述酶包括具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO2序列的多核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO5序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO6序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO4序列的多核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO8序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO9序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO7序列的多核苷酸。
9.一種檢測效應(yīng)子或輔因子的方法，包括將權(quán)利要求1中所述的檢測器與樣品進(jìn)行混合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，進(jìn)一步包括對所述樣品顏色變化進(jìn)行分析。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述顏色變化在混合后10分鐘至少完成95％。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述混合在10-45℃的溫度下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，在所述樣品中的分析物的量與聚集的粒子的形成或沉淀成反比例。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述聚集粒子的形成或沉淀在混合后10分鐘完成至少95％。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，進(jìn)一步包括加入選自由Mg(II)、Ca(II)、Zn(II)、Mn(II)、Co(II)和Pb(II)組成的組的離子。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述樣品包括生物樣品。
17.一種用于檢測效應(yīng)子或輔因子的檢測系統(tǒng)，包括(a)核酸酶，包括輔因子結(jié)合部位和可選的效應(yīng)子結(jié)合部位；(b)用于核酸酶的基質(zhì)，包括第一多核苷酸；(c)第一組粒子，包括第二多核苷酸；以及(d)第二組粒子，包括第三多核苷酸；其中，所述第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于所述第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于所述第三多核苷酸，以及所述第二組粒子具有至少20nm的直徑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的檢測系統(tǒng)，其中，所述第二組粒子具有至少30nm的直徑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測系統(tǒng)，其中，所述核酸酶包括DNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測系統(tǒng)，其中，所述第一組粒子和所述第二組粒子包括金。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測系統(tǒng)，其中，所述第一組粒子和所述第二組粒子包括選自由金屬、半導(dǎo)體和膠乳組成的組的材料。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測系統(tǒng)，其中，所述效應(yīng)子或輔因子選自如下的組氮肥、農(nóng)藥、二氧芑、酚類、2，4-二氯苯氧基乙酸、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、Co(II)、葡萄糖、胰島素、hCG-激素、HIV、HIV蛋白質(zhì)、炭疽、天花、神經(jīng)毒氣、TNT、DNT、可卡因和抗生素。
23.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測器，其中所述酶包括具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO2序列的多核苷酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO5序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO6序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO4序列的多核苷酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求18所述的檢測器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO8序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO9序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO7序列的多核苷酸。
26.一種檢測效應(yīng)子或輔因子的方法，包括將權(quán)利要求17中所述的檢測器與樣品進(jìn)行混合。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，進(jìn)一步包括對所述樣品顏色變化進(jìn)行分析。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述顏色變化在混合后10分鐘為至少完成95％。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述混合在10-45℃的溫度下進(jìn)行。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，在所述樣品中的分析物的量與聚集的粒子的形成或沉淀成反比例。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述聚集粒子的形成或沉淀在混合后10分鐘完成95％。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，進(jìn)一步包括加入選自由Mg(II)、Ca(II)、Zn(II)、Mn(II)、Co(II)和Pb(II)組成的組的離子。
33.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述樣品包括生物樣品。
34.一種檢測樣品中效應(yīng)子或輔因子的方法，包括將至少如下物質(zhì)混合在一起(a)核酸酶，包括輔因子結(jié)合部位和可選的效應(yīng)子結(jié)合部位；(b)用于核酸酶的基質(zhì)，包括第一多核苷酸；(c)第一組粒子，包括第二多核苷酸；以及(d)第二組粒子，包括第三多核苷酸；以及(e)所述樣品；以形成混合物，其中，所述第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于所述第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包括或?yàn)橹辽俨糠只パa(bǔ)于所述第三多核苷酸，以及所述混合物在形成所述混合物10分鐘內(nèi)產(chǎn)生顯示所述樣品中存在所述效應(yīng)子或輔因子的顏色變化而無需加熱。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述核酸酶包括DNA。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述第一組粒子和所述第二組粒子包括金。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述第一組粒子和所述第二組粒子包括選自由金屬、半導(dǎo)體和膠乳組成的組的材料。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述效應(yīng)子或輔因子選自如下的組氮肥、農(nóng)藥、二氧芑、酚類、2，4-二氯苯氧基乙酸、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、Co(II)、葡萄糖、胰島素、hCG-激素、HIV、IIIV蛋白質(zhì)、炭疽、天花、神經(jīng)毒氣、TNT、DNT、可卡因和抗生素。
39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述酶包括具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO2序列的多核苷酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO5序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO6序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO4序列的多核苷酸。
41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO8序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO9序列的多核苷酸；以及所述基質(zhì)包括具有SEQ ID NO7序列的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測效應(yīng)子和輔因子的檢測系統(tǒng)，包括(a)核酸酶；(b)用于核酸酶的基質(zhì)，包括第一多核苷酸；(c)第一組粒子，包括至少部分互補(bǔ)于該基質(zhì)的第二多核苷酸，其中該多核苷酸連接于粒子；以及(d)第二組粒子，包括至少部分互補(bǔ)于該基質(zhì)的第三多核苷酸，其中該多核苷酸在其5’端連接于粒子。
文檔編號C12Q1/68GK1910282SQ200580002358
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月13日
發(fā)明者陸藝, 劉玨文 申請人:伊利諾斯大學(xué)理事會