專利名稱：類1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸氧化酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase)及其編碼基因與應用，特別涉及類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase)及其編碼基因在棉花纖維生產中的應用。
背景技術：
棉花是世界上最重要的經濟作物之一，是首要的纖維作物和重要的油料作物，各主要產棉國都十分重視棉花發(fā)育和遺傳的研究。棉花纖維的發(fā)育以單細胞形式出現(xiàn)，形態(tài)變化大，其長/直徑可達1000-3000；成熟的棉花纖維次生細胞壁幾乎由純的纖維素組成，因此，棉花纖維不但是研究碳參與纖維素合成也是研究細胞伸長的理想材料(因為可以排除復雜的細胞分裂及多細胞發(fā)育的干擾)。除了在研究基礎細胞生物學方面的意義外，闡明纖維發(fā)育的細胞和分子機理也能發(fā)現(xiàn)遺傳工程改良棉纖維的靶基因----棉花纖維產量和質量的根本決定因子。總之，研究棉花纖維發(fā)育的分子機理既具有重要的理論價值也具有重大經濟價值。
1984年，Basra和Malik將棉花纖維細胞發(fā)育的過程分成四個階段起始期(表皮細胞的突起，開花前1天至開花后2-3天)、伸長期(初生細胞壁的合成，從開花后2-3天至25天)、加厚期(次生細胞壁的合成，從開花后16天至45天)和成熟期(開花后45-50天)。
20世紀40年代以前研究人員就發(fā)現(xiàn)，在生理上乙烯對植物生長和發(fā)育的許多方法都有影響，它影響的過程包括種子萌發(fā)，根和莖的生長，花的發(fā)育，花、葉的衰老和脫落，果實的成熟。后來的工作還表明，乙烯也參與調節(jié)了植物一系列對應于生物和非生物脅迫的反應。早期乙烯研究的發(fā)展非常緩慢，主要的限制是技術因素。當時測定乙烯的方法繁雜而且不靈敏，況且生理濃度的乙烯濃度太低，人們不能對它進行分析。60年代后隨著商業(yè)化的氣相色譜和火焰離子化探測設備的開發(fā)，將檢測乙烯的靈敏度提高了106倍以上。
植物中乙烯氣體的合成是由前體中間產物1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)經過1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase，ACO)的催化的。而ACC則通過一個由1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(ACC synthase，ACS)催化的反應得來的。該反應稱作甲硫氨酸循環(huán)。
在1991年，Hamilton在番茄中證實了ACO基因能夠在1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸底物和其他輔助因子存在下，催化產生乙烯。1994年，Tang等證實在牽牛花花瓣衰老過程中，伴隨著ACO基因的表達升高，以及ACO酶活性的表達升高。1995年，Pogson等發(fā)現(xiàn)了在椰菜中的兩個ACO基因，ACO ox1和ACO ox2，在收割后時期的衰老中顯著升高。這是最早期關于ACO基因分子水平的研究，并且與原有的乙烯促進植物衰老相聯(lián)系。
1999年，Martinis等將反義的類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase)轉入煙草，發(fā)現(xiàn)能夠顯著抑制早期煙草胚胎的發(fā)育；這種抑制作用可以通過用過量的乙烯處理而解除。這是首次鑒定乙烯合成酶與植物發(fā)育直接有關。
2002年Weterings等發(fā)現(xiàn)，在煙草花粉管生長發(fā)育中，伴隨著ACS，ACO基因的大量表達，證實了ACO基因與花粉管伸長的相關性。同年Zanetti等發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯中的ACO基因能被逆境壓力激活表達。
關于ACO基因，全世界的科學家已經做了大量深入細致的工作，但由于乙烯激素的多功能性，棉花纖維發(fā)育和伸長調節(jié)方面的復雜性，仍有大量未知的領域有待研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase)及其編碼基因。
本發(fā)明提供的類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase)的名稱為Gh-ACO1，是具有下列氨基酸序列之一的蛋白質1)序列表中序列2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與乙烯合成相關的蛋白質。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
序列表中的序列2的蛋白質Gh-ACO1由319個氨基酸殘基組成。
上述類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
上述類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶Gh-ACO1的編碼基因可具有下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID No2蛋白質序列的DNA；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID No1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
序列1的基因由1283個堿基組成，該基因的讀碼框為自5’端第57位堿基到第1016位共960個堿基。
含有上述類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的編碼基因的表達載體、細胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
該基因編碼一個類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶Gh-ACO1，和棉花纖維伸長密切相關，該基因具有乙烯合成酶(ACC oxidase)的功能，在棉花纖維發(fā)育的起始期開始轉錄，并在伸長期大量轉錄，在開花后15天到達最高。在棉花纖維組織中大量表達，而在胚珠中表達水平不到纖維的1/40；在其他營養(yǎng)組織中，除了根部有少量表達(纖維中表達水平的1/12)，莖、葉中幾乎不表達(圖1、圖2)。
棉花纖維的發(fā)育和伸長是一個復雜的代謝調控過程，本發(fā)明通過前期的陸地棉纖維cDNA文庫及測序，獲得了11692個纖維獨立基因。經過cDNA芯片雜交發(fā)現(xiàn)，有超過700基因可能參與了纖維細胞的發(fā)育。通過生化通路分析軟件KOBAS計算發(fā)現(xiàn)，乙烯合成途徑是纖維發(fā)育中上調最明顯的(表1)。本發(fā)明所提供的Gh-ACO1催化ACC生成乙烯，是乙烯信號途徑中的關鍵酶(表1)。
本發(fā)明運用體外棉花纖維培養(yǎng)技術，將開花后1天的野生陸地棉胚珠、開花后1天的無毛突變體棉花胚珠移入裝有MS培養(yǎng)基的三角瓶培養(yǎng)。氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)野生陸地棉胚珠釋放的乙烯數(shù)量超過突變體的20倍，而后者的含量已接近檢測儀器的低限。如果在培養(yǎng)基中加入乙烯合成抑制劑AVG，野生胚珠釋放的乙烯也會顯著降低到1/4以下(圖3)。本實驗充分說明了乙烯合成數(shù)量與纖維長度的正相關性。
本發(fā)明采用酵母表達系統(tǒng)來研究Gh-ACO1基因編碼的類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的酶活性。結果表明在用2％半乳糖誘導4小時后，轉pYTV-Gh-ACO1的PEP4-PYTV-ACO1表達的Gh-ACO1可催化ACC產生乙烯的量為4.0nL×h-1/106細胞，與未用半乳糖誘導的對照組相比要高出很多(對照組產生的乙烯只有0.2nL(納升)×h-1/106細胞左右，在室溫20度，1nL(納升)＝0.416nM(納摩爾))。該實施例充分說明了本發(fā)明中的Gh-ACO1具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的酶活性。
根據(jù)植物激素乙烯的正常功能推斷，乙烯一般在植物受到傷害、或者是進入衰老時大量合成，從而啟動植物抗逆或者程序性死亡的過程。人們在棉花中從未研究過類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase)的功能，也未發(fā)現(xiàn)ACO基因與細胞伸長之間的直接聯(lián)系。本發(fā)明直接證實了棉花纖維的發(fā)育過程中乙烯合成酶基因(Gh-ACO1)大量表達，并伴隨有明顯的乙烯氣體的增加；Gh-ACO1具有類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的酶活性。
鑒于棉花在國計民生中的重要地位，本發(fā)明具有重大經濟價值和應用前景。例如，用乙烯氣體或乙烯利處理棉花、苧麻等纖維植物，將能大大增加纖維的生長速度和最終產量，顯著提高其經濟價值。將本發(fā)明的Gh-ACO1全長基因或其功能性融合基因按照正向模式連接到如纖維特異性表達啟動子、酵母/大腸桿菌的穿梭質粒pREP5N的nmt1啟動子或35S啟動子那樣能在各種植物組織和器官中高效表達的啟動子的下游，構建成植物轉化中間載體，然后用農桿菌法、基因槍法或花粉管通道法將該基因導入棉花、苧麻等纖維植物基因組中，Gh-ACO1所介導的持續(xù)而旺盛的細胞伸長會大幅度提高轉基因植物的纖維生長速度和長度，顯著提高棉花、苧麻等纖維植物的經濟價值和效益。本發(fā)明的Gh-ACO1及其編碼基因具有重要的學術和經濟價值，為實現(xiàn)人為控制植物細胞伸長奠定了堅實的基礎。


圖1為Gh-ACO1 mRNA在棉花纖維不同發(fā)育時期的表達水平分析圖2為Gh-ACO1 mRNA在不同組織中的表達水平分析圖3為不同處理條件下棉花纖維細胞釋放乙烯的測定圖4為Gh-ACO1的酶活性鑒定具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、棉花基因組cDNA芯片雜交結果分析以及乙烯合成酶基因Gh-ACO1及其編碼基因的獲得選取發(fā)育不同時期的野生型和突變型棉花材料，利用在北京博奧生物芯片公司點制的含有11,692個棉花獨立基因的cDNA芯片(貨號CAP-F0003)，篩選在纖維發(fā)育時期高表達基因。
本實驗的具體操作步驟為1.RNA的提取、反轉錄、標記和雜交實驗。從野生型陸地棉(wt)開花前3天，開花當天(0天)以及開花后3天的胚珠、開花后5天、10天、15天和20天的胚珠和纖維的混合材料，以及無毛突變體(fl mutant)(無毛突變體購自中國科學院植物研究所)開花后3天和10天的胚珠中分別提取總RNA，經1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-ReverseTranscriptase的方法，合成單鏈(ss)cDNA。芯片雜交方法見Shi et al(2005)中“Fiber cDNA Microarray Construction and Hybridizations”部分所述。分別比較開花前3天和開花后3天(-3wt/+3wt)，開花當天和開花后3天(0wt/+3wt)，開花后3天和開花后3天(+3wt/+3wt)，開花后5天和開花后3天(+5wt/+3wt)，開花后10天和開花后3天(+10wt/+3wt)，開花后15天和開花后3天(+15wt/+3wt)，開花后20天和開花后3天(+20wt/+3wt)的野生陸地棉的芯片雜交結果，并比較野生陸地棉開花后3天和無毛突變體開花后3天(+3wt/+3fl)，野生陸地棉開花后10天和無毛突變體開花后10天(+10wt/+10fl)的芯片雜交結果。采用ScanArray2.0(Packard Bioscience，Meriden，CT，USA)和GenePix Pro 4.0(AxonInstruments，USA)軟件獲得芯片雜交數(shù)據(jù)。采用Treeview軟件(Eisen et al.，1998)進行聚類分析，尋找表達模式接近的基因群。結果表明有1877個棉花基因至少在開花后3天，開花后5天，開花后10天，開花后15天，開花后20天某個時期表達升高，其中有709個棉花基因在野生陸地棉比在無毛突變體表達高1倍以上。
經過cDNA芯片雜交發(fā)現(xiàn)，有超過700基因可能參與了纖維細胞的發(fā)育。采用Mao等開發(fā)的KOBAS軟件(KEGGOrthologyBasedAnnotationSystem)將11,692個棉花基因和536個纖維特異基因分別進行定位，然后通過概率計算得出棉花纖維中高表達的生化途徑。KOBAS計算結果如表1所示，表明乙烯信號途徑是纖維特異性最高的生化途徑，是纖維發(fā)育中上調最明顯的。
表1.用KOBAS分析鑒定的棉花纖維特異表達的生化途徑

注a為把某些植物特有的生化途徑從KEGG數(shù)據(jù)庫中”Enzyme(酶類)”目錄下分離出來，補足了某些KEGG沒有加以注釋的植物生化途徑。
b為只列出P值小于0.05的生化途徑。
結果表明乙烯合成途徑中有3個基因(Gh-ACO1，Gh-ACO2，Gh-ACO3)在芯片數(shù)據(jù)+3wt/0wt和+3wt/+3fl比值都＞2.0；或者是+10wt/+10fl比值＞2.0，且+5wt/+3wt，+10wt/+3wt，+15wt/+3wt，+20wt/+3wt四對比值中至少有一對＞2.0(其中Gh-ACO1基因在所有樣品中比值都＞2.0，在+10wt/+3wt和+15wt/+3wt中比值＞10.0)。Gh-ACO1基因在上述含有11,692個棉花獨立基因的cDNA芯片的編號為CM027E10，該基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的Gh-ACO1。其編碼信息如表2。cDNA芯片雜交實驗表明Gh-ACO1、Gh-ACO2、Gh-ACO3都在纖維快速伸長期(+5wt，+10wt，+15wt)大量表達。
表2.類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC oxidase)的編碼基因信息

a列出了每個棉花ACO基因與其相應的NCBI中匹配度最高的基因的讀碼框長度。
b匹配度最高的基因指的是與棉花ACO基因進行BLASTX比對后，E值最低的NCBI數(shù)據(jù)庫中的那條基因序列。
c保守結構域是將棉花ACO基因的讀碼框翻譯為蛋白質序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP搜索而得到。
dCOG3491，Isopenicillin N synthase and related dioxygenases(異青霉素-N-合酶以及相關的雙加氧酶)。
實施例2.Gh-ACO1 mRNA表達水平與棉花纖維伸長的關系選取發(fā)育不同時期的野生型陸地棉(wt)和無毛突變體(fl mutant)棉花材料，利用實時定量PCR(quantitation PCR)分析這些材料中Gh-ACO1的表達水平，從而獲得Gh-ACO1表達水平與纖維伸長的關系。
本實驗的具體操作步驟為1.RNA的提取。根據(jù)操作手冊Micro-TO-Midi Total RNA PurificationSystem(Invitrogen，USA)從野生型棉花開花當天以及開花后3天的胚珠、開花后5天的胚珠和纖維的混合物、開花后10天、15天和20天的纖維，以及突變體開花后10天的胚珠中分別提取總RNA。
2.cDNA模板的制備。以5μg的總RNA為模板，以DNA酶I(Invitrogen，USA)消化，防止基因組DNA的污染，然后根據(jù)操作手冊用SUPERSCRIpTTM第一條鏈合成系統(tǒng)合成cDNA第一條鏈。
3.實時定量PCR。分別設計Ubiquitin 7、Gh-ACO1基因特異性引物，選取看家基因棉花泛素(Ubiquitin)作為內標，根據(jù)DyNAmoTMSYBR Green qPCRKit(Finnzymes，USA)操作手冊進行實時定量PCR(quantitation PCR)分析Gh-ACO1在不同發(fā)育時期組織中的表達情況。
其中，Ubiquitin 7的NP1的序列為5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC，Ubiquitin 7的NP2R的序列為5’CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG；Gh-ACO1的NP1的序列為5’-CACCACAAAATGGAGCTCACTTTCCCTGTAATC-3’(正向引物)，Gh-ACO1的NP2R的序列為5’-AACAGTTGCAATAGGACCCAAGTT-3’(反向引物)。
反應體系如下

實時定量PCR(quantitationPCR)反應條件Gh-ACO195℃5分鐘；95℃10秒，56℃20秒，72℃14秒，74℃讀板(讀取雙鏈PCR產物的熒光強度值)，42個循環(huán)；72℃5分鐘；從65℃到95℃進行溶解曲線分析。
Ubiquitin 795℃5分鐘；95℃10秒，57.2℃20秒，72℃15秒，77℃讀板，42個循環(huán)；72℃5分鐘；從65℃到95℃進行溶解曲線分析。
結果如圖1所示，Gh-ACO1在纖維發(fā)育的起始階段的豐度很低，隨著纖維的伸長，它的表達豐度有顯著的增加，并且Gh-ACO1在開花后15天的纖維中表達達到峰值，開花后10-15天是纖維伸長最快的時候。當進入次生壁合成時期，纖維伸長速度減慢，該基因的表達豐度有不同程度的下降，實驗表明，該基因在纖維細胞的伸長期大量表達，可能發(fā)揮重要作用。圖1中，ACO1表示Gh-ACO1；Owt、+3wt分別表示野生型棉花開花當天、開花后3天的胚珠；+5wt表示野生型棉花開花后5天的胚珠和纖維的混合物；+10wt、+15wt、+20wt分別表示野生型棉花開花后10天、15天和20天的纖維；+10f1表示突變體開化后10天的胚珠。
實施例3.Gh-ACO1 mRNA在不同組織中的表達水平分析選取發(fā)育不同時期的野生型陸地棉(wt)和無毛突變體(fl mutant)棉花材料，利用實時定量PCR(quantitation PCR)分析這些材料中Gh-ACO1的表達情況，從而獲得Gh-ACO1表達水平與纖維伸長的關系。
本實驗的具體操作步驟為1.RNA的提取。采集棉花材料，包括根據(jù)操作手冊Micro-TO-Midi Total RNAPurification System(Invitrogen，USA)從野生型棉花的根、莖、葉，開花后10天的纖維和胚珠，突變體開花后10天的胚珠中分別提取總RNA。
2.cDNA模板的制備。以5ug的總RNA為模板，以DNA酶I(Invitrogen，USA)消化，防止基因組DNA的污染，然后根據(jù)操作手冊用SUPERSCRIPTTM第一條鏈合成系統(tǒng)合成cDNA第一條鏈。
3.實時定量PCR。分別設計Ubiquitin 7、Gh-ACO1基因特異性引物(同實施例2)，選取看家基因棉花泛素(Ubiquitin)作為內標，根據(jù)DyNAmoTMSYBR Green qPCRKit((Finnzymes，USA))操作手冊進行實時定量PCR(quantitation PCR)分析Gh-ACO1的表達情況。
反應體系如下

實時定量PCR(quantitationPCR)反應條件Gh-ACO195℃5分鐘；95℃10秒，56℃20秒，72℃14秒，74℃讀板，42個循環(huán)；72℃5分鐘；從65℃到95℃進行溶解曲線分析。
Ubiquitin 795℃5分鐘；95℃10秒，57.2℃20秒，72℃15秒，77℃讀板，42個循環(huán)；72℃5分鐘；從65℃到95℃進行溶解曲線分析。
結果如圖2所示，Gh-ACO1表達具有組織特異性，它在野生型的根、莖、葉、開花后10天的胚珠和突變體開花后10天的胚珠中豐度很低，但是在開花后10天的野生型纖維中豐度顯著上升，這說明Gh-ACO1只在纖維細胞中特異表達，對纖維的發(fā)育可能具有重要作用。圖2中，F(xiàn)表示野生型的纖維；F+O表示野生型的纖維和胚珠；O(wt)表示野生型胚珠；O(fl)表示無毛突變體胚珠。
實施例4.不同處理條件下棉花纖維細胞釋放乙烯的測定棉花胚珠組織營養(yǎng)液的成分見表3。乙烯合成酶抑制劑氨基乙氧基乙烯甘氨酸(AVG)購買自sigma公司(St.Louis，USA)。用于測定乙烯含量的是日本島津公司的GC-14C氣相色譜儀和美國安捷倫HP-PLOTQ型氣相色譜柱。氣體發(fā)生器北京中興匯利GX300A。氣相色譜儀的工作條件為進樣口溫度100℃，柱溫60℃，檢測器150℃，空氣50kPa，氮氣75kPa，氫氣50kPa。
表3.棉花胚珠組織培養(yǎng)液成分(MS培養(yǎng)基)

按照表3中各物質成分配制棉花胚珠組織培養(yǎng)液，在定容前將其pH值調節(jié)到6.0，分裝滅菌制成MS培養(yǎng)液。
本實驗具體操作步驟為1.分別將開花后1天的野生型陸地棉(WT)和無毛突變體(fl)胚珠從子房壁上小心剝離，放入棉花胚珠組織營養(yǎng)液中(不加任何其他物質)培養(yǎng)；再準備一份含有5.0μM AVG的胚珠營養(yǎng)液，將開花后1天的野生陸地棉胚珠放入培養(yǎng)。培養(yǎng)1天以后用塑料膜將三角瓶完全密封。與此同時，將野生陸地棉和突變體種子在含有0.6％瓊脂的MS培養(yǎng)基(見后面說明)的廣口瓶中播種，3天后種子發(fā)芽將廣口瓶完全密封，將該棉花幼苗處理作為負對照。培養(yǎng)將持續(xù)12天。每個樣品都做3個獨立的重復試驗，確保其結果的可統(tǒng)計性。
2.培養(yǎng)12天時，采用氣體進樣針分別從步驟1的5個獨立培養(yǎng)樣品瓶中取出100μL頂端空氣，進行氣相色譜分析。
結果如圖3所示，加入5.0μM AVG培養(yǎng)的陸地棉胚珠產生的乙烯濃度只有3.2nM(納摩爾)，只有不加AVG的對照組的1/6左右(19.3nM)。無毛突變體棉花胚珠產生的乙烯僅為0.9nM。而作為負對照的12天的陸地棉和無毛突變體棉花幼苗只能檢測到痕量的乙烯。本實驗表明，棉花胚珠中產生乙烯的含量與纖維的長度呈正相關，還說明，AVG抑制了棉花纖維中乙烯的合成，能夠導致纖維的敗育(結合實施例5中的AVG處理實驗)。圖3中，AVG表示開花后1天的野生陸地棉胚珠在含AVG的胚珠營養(yǎng)液中的乙烯釋放情況。
實施例5.Gh-ACO1的酶活性鑒定1.酵母表達載體的構建。Gh-ACO1用以下引物，以野生型陸地棉(wt)的cDNA為模板進行PCR擴增。
Gh-ACO1，5’-CACCACAAAATGGAGCTCACTTTCCCTGTAATC-3’(正向引物)5’-AACAGTTGCAATAGGACCCAAGTT-3’(反向引物)PCR產物采用德國Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit進行回收。將Gh-ACO1基因PCR產物經過TOPO反應克隆入美國Invitrogen公司的pENTR/D/TOPO載體，得到含有Gh-ACO1基因的pENTR-Gh-ACO1，并通過M13引物鑒定了克隆成功。將pENTR-Gh-ACO1與pYTP載體與Invitrogen公司的Gateway LR ClonaseTMEnzymeMix進行反應，得到含有Gh-ACO1基因的酵母表達載體pYTV-Gh-ACO1。
2.Gh-ACO1的誘導表達。
將pYTV-Gh-ACO1電轉化釀酒酵母(PEP4)。將經PCR鑒定陽性的重組菌株命名為PEP4-PYTV-ACO1。將PEP4-PYTV-ACO1菌株在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基為Sc-ura，1升Sc-ura培養(yǎng)基加入6.7克的酵母氮源(YNB)、2克缺少尿嘧啶的氨基酸補充物(Sc-ura)以及20克的葡萄糖，各成分都購自美國Clontech公司)上培養(yǎng)，30度、250轉/分連續(xù)震蕩培養(yǎng)。在最初的24小時之內，培養(yǎng)基中含有2％的葡萄糖作為碳源。培養(yǎng)24小時后葡萄糖已經全部消耗，這時再加入2％的棉子糖(Raffinose)代替葡萄糖培養(yǎng)16小時。當溶液的OD600達到0.8再加入2％的半乳糖激活GAL1啟動子，誘導4小時。隨后將106CFU細胞的樣品取出(用2％半乳糖誘導4小時和未加半乳糖誘導的菌株PEP4-PYTV-ACO1都要分別取樣)加入到含有50mM的抗壞血酸(ascorbate)，200μM的FeSO4，以及不同濃度的ACC(0、0.1、0.2、0.5、1.0mM)的反應液中，隨后將各個樣品置于15×1.5cm、用塑料膜封口的試管中，于30度、250轉/分震蕩培養(yǎng)1小時以后，采用氣體進樣針分別從試管中取出100μL頂端空氣，用氣相色譜分析產生的乙烯。用于測定乙烯含量的是日本島津公司的GC-14C氣相色譜儀和美國安捷倫HP-PLOTQ型氣相色譜柱。氣體發(fā)生器北京中興匯利GX300A。氣相色譜儀的工作條件為進樣口溫度100℃，柱溫60℃，檢測器150℃，空氣50kPa，氮氣75kPa，氫氣50kPa。
結果如圖4所示，在用2％半乳糖GAL誘導4小時后，轉pYTV-Gh-ACO1的菌株PEP4-PYTV-ACO1表達的Gh-ACO1可催化ACC產生乙烯的量為4.0nL×h-1/106細胞，但與未用半乳糖GAL誘導的菌株PEP4-PYTV-ACO1相比要高出很多(對照組產生的乙烯只有0.2nL(納升)×h-1/106細胞左右)。該實施例充分說明了本發(fā)明中的Gh-ACO1具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的酶活性。(在室溫20度，1nL(納升)＝0.416nM(納摩爾))。圖4中， 表示2％半乳糖GAL誘導4小時的PEP4-PYTV-ACO1， 表示未用半乳糖誘導的菌株PEP4-PYTV-ACO1。
序列表<160>2<210>1<211>1283<212>DNA<213>棉屬陸地棉(Gossypium.hirsutum)<400>1gctaacataa cctcattgat agaaaagctt agtaaaatcc ccgggataaa caaaaaatgg60agctcacttt ccctgtaatc gacttctcca aactcaatgg tgaggagaga gcagccgcca 120tggaaatgat caaagatgcc tgtgagaatt ggggtttctt tgagttggtg aaccatggaa 180tatctcatga gctgatggac actgtggaga ggctgacaaa ggagcactac agaaagtgca 240tggagcaaag gttcaaagaa atggtggcca gtaagggtct tgaggctgtt caatctgaga 300tcaatgacat ggattgggaa agcaccttct ttttgcgcca cttgcctgaa tctaacatgt 360ctgaaattcc tgatctcgaa gaagattaca gaaaggtgat gaaggaattt gcagtggagt 420tggagaagct tgcagagcaa cttttggacc tgttgtgtga gaatctgggg ttggagcctg 480gttacctgaa aaaagtgttt tatgggtcca aagggccaac cttcggtacc aaggttagca 540attatcctcc atgccccaaa cctgacctaa tcaagggact cagggctcac actgatgctg 600gtggaatcat cttactcttc caagatgaca aggtcagcgg ccttcagctt ctcaaggatg 660gtcagtggat tgatgttcct cctatgaaac actctattgt catcaacctt ggtgaccaac 720ttgaggtaat cacaaatggt aaatataaga gtgtgatgca ccgtgtgatt gctcaaacag 780atgggaccag aatgtccatt gcttccttct acaacccggg cagtgatgct gttatatatc 840cagcaccagc tttgctagag aaagaagctg acaaatctca agtgtacccc aaatttgtgt 900ttgaggacta catgaatctc tatgctgacc tcaagttcca agccaaggag ccaaggttcg 960aagccatgaa gaccgtggag tctgcagtta acttgggtcc tattgcaact gtttgagtcc 1020ttcagtgatt gaagagcgat gggttttaat tagcagtgtg tttctgttaa taagtttagt 1080cggctgatgg ataaattctg ttaattatag ttctggaatt agagagtgcc tgcaggtgtg 1140gagcttagta gtttaaaata agctgaaaaa gcttgtacta agaattcctc agttatatat 1200
ggtgcctggt cgccagtggc tgtgctttaa atgagatgtt ttggctgtcg gaagtgacca 1260aattatattt gataaaaaaa aaa 1283<210>2<211>319<212>PRT<213>棉屬陸地棉(Gossypium.hirsutum)<400>2Met Glu Leu Thr Phe Pro Val Ile Asp Phe Ser Lys Leu Asn Gly Glu1 5 10 15Glu Arg Ala Ala Ala Met Glu Met Ile Lys Asp Ala Cys Glu Asn Trp20 25 30Gly Phe Phe Glu Leu Val Asn His Gly Ile Ser His Glu Leu Met Asp35 40 45Thr Val Glu Arg Leu Thr Lys Glu His Tyr Arg Lys Cys Met Glu Gln50 55 60Arg Phe Lys Glu Met Val Ala Ser Lys Gly Leu Glu Ala Val Gln Ser65 70 75 80Glu Ile Asn Asp Met Asp Trp Glu Ser Thr Phe Phe Leu Arg His Leu85 90 95Pro Glu Ser Asn Met Ser Glu Ile Pro Asp Leu Glu Glu Asp Tyr Arg100 105 110Lys Val Met Lys Glu Phe Ala Val Glu Leu Glu Lys Leu Ala Glu Gln115 120 125Leu Leu Asp Leu Leu Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Pro Gly Tyr Leu130 135 140Lys Lys Val Phe Tyr Gly Ser Lys Gly Pro Thr Phe Gly Thr Lys Val145 150 155 160Ser Asn Tyr Pro Pro Cys Pro Lys Pro Asp Leu Ile Lys Gly Leu Arg165 170 175
Ala His Thr Asp Ala Gly Gly Ile Ile Leu Leu Phe Gln Asp Asp Lys180 185 190Val Ser Gly Leu Gln Leu Leu Lys Asp Gly Gln Trp Ile Asp Val Pro195 200 205Pro Met Lys His Ser Ile Val Ile Asn Leu Gly Asp Gln Leu Glu Val210 215 220Ile Thr Asn Gly Lys Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val Ile Ala Gln225 230 235 240Thr Asp Gly Thr Arg Met Ser Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Pro Gly Ser245 250 255Asp Ala Val Ile Tyr Pro Ala Pro Ala Leu Leu Glu Lys Glu Ala Asp260 265 270Lys Ser Gln Val Tyr Pro Lys Phe Val Phe Glu Asp Tyr Met Asn Leu275 280 285Tyr Ala Asp Leu Lys Phe Gln Ala Lys Glu Pro Arg Phe Glu Ala Met290 295 300Lys Thr Val Glu Ser Ala Val Asn Leu Gly Pro Ile Ala Thr Val305 310 31權利要求
1.類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶，是具有下列氨基酸序列之一的蛋白質1)序列表中序列2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與乙烯合成相關的蛋白質。
2.根據(jù)權利要求1所述的蛋白，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質。
3.權利要求1或2所述的類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的編碼基因。
4.根據(jù)權利要求3所述的基因，其特征在于所述類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶的編碼基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的DNA；3)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.根據(jù)權利要求4所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框為自序列1的3’端第57位到第1016位堿基。
6.含有權利要求3或4或5所述基因的表達載體。
7.根據(jù)權利要求6所述的載體，其特征在于所述表達載體中含有啟動子；所述啟動子為纖維特異性表達啟動子、酵母/大腸桿菌的穿梭質粒pREP5N的nmt1啟動子或35S啟動子。
8.含有權利要求3或4或5所述基因的細胞系。
9.含有權利要求3或4或5所述基因的宿主菌。
10.權利要求1或2所述的類1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶及其編碼基因在培育纖維長度增加的植物品種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了類1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸氧化酶及其編碼基因與應用。該類1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸氧化酶，是具有下列氨基酸序列之一的蛋白質1)序列表中序列2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與乙烯合成相關的蛋白質。該類1－氨基環(huán)丙烷－1－羧酸氧化酶及其編碼基因可用于培育纖維長度增加的植物品種。
文檔編號C12N15/53GK1786160SQ20051011734
公開日2006年6月14日 申請日期2005年11月2日 優(yōu)先權日2005年11月2日
發(fā)明者朱玉賢, 施永輝, 盧迎春, 朱生偉, 姬生健 申請人:北京大學