專利名稱：利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法。
背景技術(shù)：
有些微生物在一定條件下能夠生產(chǎn)油脂作為細胞儲存物，少數(shù)微生物油脂含量可達菌體干重的70％以上。微生物油脂的存積發(fā)生在某些種類的酵母、霉菌、和藻類細胞中，通常稱其為產(chǎn)油微生物。已報道的產(chǎn)油微生物種類較多，酵母類的有紅酵母屬(Rhodotorha sp.)、隱球酵母屬(Crytococcus sp.)假絲酵母屬(Candida sp.)、油脂酵母屬(Lipomyces sp.)等；產(chǎn)油霉菌主要集中在接合菌亞門(Zygomycotina)，特別是被孢霉屬(Mortierella sp.)、毛霉屬(Mucor sp.)，報道較多，另外半知菌類(Fungi Imperfecti)的頭孢霉屬(Cephalosporium)等也有報道。
目前，微生物油脂在工業(yè)上的生產(chǎn)方式主要是液態(tài)發(fā)酵，由于生產(chǎn)成本高昂，而只能生產(chǎn)那些通過農(nóng)業(yè)生產(chǎn)很難得到因而能以高價出售的油脂，如富含多不飽和脂肪酸和γ-亞油酸的油脂，產(chǎn)品的范圍很窄；要提高微生物油脂在油脂市場的份額，就必須尋找新的生產(chǎn)途徑降低生產(chǎn)成本。秸稈這種可再生資源，量大、價格低廉且沒有得到通分利用，人們正在努力將它轉(zhuǎn)化為各種液態(tài)燃料，如通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)酒精或直接熱解使其轉(zhuǎn)化為生物油，微生物發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的研究目前還未見報道，本發(fā)明將豐富的秸稈資源與內(nèi)生真菌資源相結(jié)合，從油脂植物中篩選出能夠降解秸稈大量積累油脂的內(nèi)生真菌菌株，并提供這些菌株利用秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，將豐富的秸稈資源與內(nèi)生真菌資源相結(jié)合，從油脂植物中篩選出能夠降解秸稈大量積累油脂的內(nèi)生真菌菌株，再利用該內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，其步驟如下1)篩選分離高產(chǎn)油脂的內(nèi)生真菌菌株通過無菌操作，將清洗干凈并晾干的新鮮松柏綱或/和紅豆杉綱油脂植物的葉、莖和果實切成片，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于溫箱中，在25～28℃下，培養(yǎng)3～9天，待植物組織切面長出菌絲后，挑取邊緣部分移至新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后，得到內(nèi)生真菌；用插片培養(yǎng)的方法，挑取上述內(nèi)生真菌菌體點接在PDA固體平板上，生長4～7天后制作臨時裝片，鏡檢觀察菌絲內(nèi)脂肪滴，篩選出在100倍顯微鏡下能看到菌絲內(nèi)脂肪滴的內(nèi)生真菌菌株；2)利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂將篩選出的內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基試管斜面上，25-30℃下培養(yǎng)4-6天后，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5-7天后，收集菌體并用水充分洗滌后，烘干得干菌體；將所得干菌體用過量的體積比為2∶1的氯仿和甲醇混合溶劑在索氏抽提器中75-85℃回流6-8小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除溶劑，得微生物油脂，所得油脂重量與干菌體的重量之比為油脂含量，選取油脂含量在30％-40％的菌株作為種子菌株；將得到的種子菌株在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天后，按固液比為1.0-2.0的接種量再接種到固體培養(yǎng)基中，20～32℃下培養(yǎng)6～12天；在75-85℃烘箱內(nèi)烘干，再在索氏提取器中以石油醚為溶劑，75-85℃下回流6-8小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，制得微生物油脂；所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包含汽爆秸桿、麩皮和水，所述汽爆秸桿、麩皮與水的重量份配比為5∶0.2～1∶10～50。
所述的內(nèi)生真菌為Microspaeropsis，Phomopsis，Cephalosporium，Sclerocystis，或Nigrospora。
所述的汽爆秸桿為小麥、玉米和水稻秸稈。
所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入纖維素酶，纖維素酶的加入量為每克汽爆秸桿加入2～30個濾紙酶活單位的纖維素酶。
本發(fā)明的利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，與目前主要用淀粉、葡萄糖等為主要底物通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂方法相比，具有下述優(yōu)點首先，秸稈是可再生資源，取之不盡用之不竭，且價格低廉，所以用它來生產(chǎn)微生物油脂不僅能大量生產(chǎn)滿足市場需求，而且降低了生產(chǎn)成本，使其在市場上能與動、植物油脂相抗衡；其次，通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂沒有廢水排放，大大減少環(huán)境污染。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。
實施例11、將用水清洗干凈并涼干的新鮮馬尾松植物的葉、果實和切成2cm小段的莖，用70％的酒精漂洗60～90秒，無菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，無菌水清洗去除升汞；通過無菌操作，將莖的韌皮部及葉、果實切成0.1cm×0.5cm×0.5cm小片，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于25℃溫箱培養(yǎng)9天，待各植物組織切面長出菌絲后，挑取邊緣部分移至新的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后，得內(nèi)生真菌。
用插片培養(yǎng)的方法挑取菌體點接在PDA固體平板上，生長7天后制作臨時裝片，鏡檢觀察菌絲內(nèi)脂肪滴，篩選出在100倍顯微鏡下能看到菌絲內(nèi)脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂將篩選出的內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基試管斜面上，25℃下培養(yǎng)6天后，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7天后，收集菌體并用水充分洗滌后，烘干得干菌體；將所得干菌體用體積比為2∶1的氯仿和甲醇過量混合溶劑在索氏抽提器中85℃回流6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除溶劑，選取油脂含量為30％-40％的菌株作為種子菌株；將得到的種子菌株在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后，按固液比為1.5的接種量再接種到固體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)下6天；在80℃烘箱內(nèi)烘干，再在索氏提取器中以石油醚為溶劑，85℃下回流6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，即制得微生物油脂。
所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基所含組分及配比為汽爆玉米秸稈、麩皮與水的重量份配比為5∶1∶10。
實施例21、用水清洗新鮮南方紅豆杉植物的組織表面，晾干后將莖切成約2cm的小段，葉、果實不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，無菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，無菌水清洗去除升汞；通過無菌操作，將莖的韌皮部及葉、果實切成0.2cm×0.5cm×0.5cm小片，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于28℃溫箱培養(yǎng)3天，待各植物組織切面長出菌絲后，挑取邊緣菌絲移至新的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后，即得內(nèi)生真菌。
用插片培養(yǎng)的方法挑取菌體點接在PDA固體平板上，生長4天后制作臨時裝片，鏡檢觀察菌絲內(nèi)脂肪滴，篩選出在100倍顯微鏡下能看到菌絲內(nèi)脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂將篩選出的內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基試管斜面上，27℃下培養(yǎng)4天后，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6天后，收集菌體并用水充分洗滌后，烘干得干菌體；
將所得干菌體用體積比為2∶1的氯仿和甲醇過量混合溶劑在索氏抽提器中80℃回流6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除溶劑，選取油脂含量為30％-40％的菌株作為種子菌株；將得到的種子菌株在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，按固液比為1.0的接種量再接種到固體培養(yǎng)基中，20℃培養(yǎng)下12天；在85℃烘箱內(nèi)烘干，再在索氏提取器中以石油醚為溶劑，75℃下回流8小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，即制得微生物油脂。
所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基所含組分及配比為汽爆玉米秸稈、麩皮與水的重量份配比為5∶0.2∶50。
實施例31、用水清洗新鮮西藏柏木植物的組織表面，晾干后將莖切成約2cm的小段，葉、果實不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，無菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，無菌水清洗去除升汞；通過無菌操作，將莖的韌皮部及葉、果實切成0.15cm×0.5cm×0.5cm小片，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于27℃溫箱培養(yǎng)6天，待各植物組織切面長出菌絲后，挑取邊緣部分移至新的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后，即得內(nèi)生真菌。
用插片培養(yǎng)的方法挑取菌體點接在PDA固體平板上，生長5天后制作臨時裝片，鏡檢觀察菌絲內(nèi)脂肪滴，篩選出在100倍顯微鏡下能看到菌絲內(nèi)脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂將篩選出的內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基試管斜面上，30℃下培養(yǎng)5天后，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5天后，收集菌體并用水充分洗滌后，烘干得干菌體；將所得干菌體用體積比為2∶1的氯仿和甲醇過量混合溶劑在索氏抽提器中75℃回流8小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除溶劑，選取油脂含量在30％-40％的菌株作為種子菌株；將得到的種子菌株在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，按固液比為2.0的接種量再接種到固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)下9天；在75℃烘箱內(nèi)烘干，再在索氏提取器中以石油醚為溶劑；80℃下回流7小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，即制得微生物油脂。
所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基所含組分及配比為汽爆小麥桿、麩皮與水的重量份配比為5∶0.2～1∶10～50。
實施例51、用水清洗新鮮檜柏植物的組織表面，晾干后將莖切成約2cm的小段，葉、果實不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，無菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，無菌水清洗去除升汞；通過無菌操作，將莖的韌皮部及葉、果實切成0.1cm×0.5cm×0.5cm小片，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于25℃(當然也可以是26℃、27℃或28℃)溫箱培養(yǎng)3～9天，待各植物組織切面長出菌絲后，挑取邊緣部分移至新的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后，即得內(nèi)生真菌。
用插片培養(yǎng)的方法挑取菌體點接在PDA固體平板上，生長4～7天后制作臨時裝片，鏡檢觀察菌絲內(nèi)脂肪滴，篩選出在100倍顯微鏡下能看到菌絲內(nèi)脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂將篩選出的內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基試管斜面上，26℃下培養(yǎng)4天后，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6天后，收集菌體并用水充分洗滌后，烘干得干菌體；將所得干菌體用體積比為2∶1的氯仿和甲醇過量混合溶劑在索氏抽提器中80℃回流6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除溶劑，選取油脂含量為30％-40％的菌株作為種子菌株；將得到的種子菌株在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，按固液比為1.0的接種量再接種到固體培養(yǎng)基中，20～32℃培養(yǎng)下6～12天；在80℃烘箱內(nèi)烘干，再在索氏提取器中以石油醚為溶劑；80℃下回流6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，即制得微生物油脂。
所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基所含組分及配比為汽爆小麥桿、麩皮與水的重量份配比為5∶0.2～1∶10～50。
實施例6
1、用水清洗新鮮龍柏植物的組織表面，晾干后將莖切成約2cm的小段，葉、果實不切，用70％的酒精漂洗60～90秒，無菌水清洗去除表面酒精，再用0.1％升汞浸泡30～60秒，無菌水清洗去除升汞；通過無菌操作，將莖的韌皮部及葉、果實切成0.2cm×0.5cm×0.5cm小片，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于25℃(當然也可以是26℃、27℃或28℃)溫箱培養(yǎng)3～9天，待各植物組織切面長出菌絲后，挑取邊緣部分移至新的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后，即得內(nèi)生真菌。
用插片培養(yǎng)的方法挑取菌體點接在PDA固體平板上，生長4～7天后制作臨時裝片，鏡檢觀察菌絲內(nèi)脂肪滴，篩選出在100倍顯微鏡下能看到菌絲內(nèi)脂肪滴的菌株。
2、利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂將篩選出的內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基試管斜面上，28℃下培養(yǎng)5天后，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6天后，收集菌體并用水充分洗滌后，烘干得干菌體；將所得干菌體用體積比為2∶1的氯仿和甲醇過量混合溶劑在索氏抽提器中83℃回流6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除溶劑，選取油脂含量為30％-40％的菌株作為種子菌株；將得到的種子菌株在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天后，按固液比為1.6的接種量再接種到固體培養(yǎng)基中，20～32℃培養(yǎng)下6～12天；在80℃烘箱內(nèi)烘干，再在索氏提取器中以石油醚為溶劑；80℃下回流6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，即制得微生物油脂。
所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基所含組分及配比為汽爆水稻桿、麩皮與水的重量份配比為5∶0.2～1∶10～50。
本實施例在種子液接入的同時在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一定量的纖維素酶，纖維素酶的加入量為每克秸稈2～30個濾紙酶活單位。
權(quán)利要求
1.一種利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，其步驟如下1)篩選分離高產(chǎn)油脂的內(nèi)生真菌菌株通過無菌操作，將清洗干凈并晾干的新鮮松柏綱或/和紅豆杉綱油脂植物的葉、莖和果實切成片，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，置于溫箱中，在25～28℃下，培養(yǎng)3～9天，待植物組織切面長出菌絲后，挑取邊緣部分移至新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后，得到內(nèi)生真菌；用插片培養(yǎng)的方法，挑取上述內(nèi)生真菌菌體點接在PDA固體平板上，生長4～7天后制作臨時裝片，，鏡檢觀察菌絲內(nèi)脂肪滴，篩選出在100倍顯微鏡下能看到菌絲內(nèi)脂肪滴的內(nèi)生真菌菌株；2)利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂將篩選出的內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基試管斜面上，25-30℃下培養(yǎng)4-6天后，轉(zhuǎn)接到PDA液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5-7天后，收集菌體并用水充分洗滌后，烘干得干菌體；將所得干菌體用過量的體積比為2∶1的氯仿和甲醇混合溶劑在索氏抽提器中75-85℃回流6-8小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓去除溶劑，得微生物油脂，所得油脂重量與干菌體的重量之比為油脂含量，選取油脂含量為30％-40％的菌株作為種子菌株；將得到的種子菌株在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天后，按固液比為1.0-2.0的接種量再接種到固體培養(yǎng)基中，20～32℃下培養(yǎng)6～12天；在75-85℃烘箱內(nèi)烘干，再在索氏提取器中以石油醚為溶劑，75-85℃下回流6-8小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑后，制得微生物油脂；所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包含汽爆秸桿、麩皮和水，所述汽爆秸桿、麩皮與水的重量份配比為5∶0.2～1∶10～50。
2.按權(quán)利要求1所述的利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于，所述的內(nèi)生真菌為Microspaeropsis，Phomopsis，Cephalosporium，Sclerocystis，或Nigrospora。
3.按權(quán)利要求1所述的利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于，所述的汽爆秸桿為小麥、玉米和水稻秸稈。
4.按權(quán)利要求1所述的利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，其特征在于，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入纖維素酶，纖維素酶的加入量為每克汽爆秸桿加入2～30個濾紙酶活單位的纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用油脂植物內(nèi)生真菌發(fā)酵秸稈生產(chǎn)微生物油脂的方法，首先從植物中分離得到內(nèi)生真菌，用鏡檢法觀察菌絲內(nèi)油滴初步篩選出產(chǎn)油菌株，通過液態(tài)發(fā)酵測定其菌體油脂含量篩選出油脂高產(chǎn)內(nèi)生真菌菌株；再使用所得油脂高產(chǎn)菌株以汽爆秸稈為主要底物通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂，其油脂產(chǎn)率為4～12％；本發(fā)明的優(yōu)點在于使用取之不盡的可再生植物秸稈資源，價格低廉，可降低生產(chǎn)成本；而且固態(tài)發(fā)酵無廢水排放，可減少環(huán)境污染。
文檔編號C12R1/645GK1955302SQ20051011675
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者陳洪章, 彭小偉 申請人:中國科學院過程工程研究所