專利名稱：一類在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一類在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽。
背景技術(shù)：
肝臟是人體內(nèi)最大的消化腺。也是體內(nèi)新陳代謝的中心站。據(jù)估計(jì)，在肝臟中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)有500種以上，實(shí)驗(yàn)證明，動(dòng)物在完全摘除肝臟后即使給予相應(yīng)的治療，最多也只能生存50多個(gè)小時(shí)。這說明肝臟是維持生命活動(dòng)的一個(gè)必不可少的重要器官。肝臟的血流量極為豐富，約占心輸出量的1/4。每分鐘進(jìn)入肝臟的血流量為1000-1200ml。肝臟的主要功能是進(jìn)行糖的分解、貯存糖原；參與蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、激素的代謝；解毒；分泌膽汁；吞噬、防御機(jī)能；制造凝血因子；調(diào)節(jié)血容量及水電解質(zhì)平衡；產(chǎn)生熱量等。在胚胎時(shí)期肝臟還有造血功能。
肝臟疫病分為肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，肝病病毒侵入人體后，并不直接引起肝細(xì)胞的損害，只是在肝細(xì)胞內(nèi)吸收營養(yǎng)賴以生存，并在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、繁殖。其復(fù)制病毒的“零部件”如表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)釋放在肝細(xì)胞膜上，引起人體免疫系統(tǒng)對(duì)這些抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)造成肝細(xì)胞的損傷、壞死。免疫反應(yīng)的強(qiáng)弱決定于肝臟受損程度及臨床癥狀輕重。這場(chǎng)由病毒引發(fā)的、免疫系統(tǒng)對(duì)肝細(xì)胞的戰(zhàn)爭，使大約25％的患者的肝臟成為戰(zhàn)火連綿的戰(zhàn)場(chǎng)，肝臟的損傷由此加重。肝病的危害絕不僅僅限于肝臟本身，它還可以引起其它多種疾病。常見的有(1)糖尿??；(2)胰腺炎；(3)膽道感染；(4)功能性腎衰竭；(5)膽汗性腎??；(6)腎小球腎炎；(7)腎小管酸中毒；(8)溶血性貧血；(9)再生障礙性貧血；(10)心肌炎和心包炎；(11)結(jié)節(jié)性動(dòng)脈炎；(12)消化性潰瘍；(13)自發(fā)性腹膜炎；(14)性激素代謝紊亂；(15)甲狀腺功能改變；(16)肝性骨病，等等。肝病不僅對(duì)患者的身體甚至生命造成危害，而且對(duì)患者心理上的打擊也是十分沉重的。無論是肝病患者還是病毒攜帶者，在生活、社交、求職、升學(xué)等方面都會(huì)受到嚴(yán)重影響。
生物基因組中可轉(zhuǎn)錄表達(dá)的序列(即基因)僅占總序列的3-5％，對(duì)這部分序列進(jìn)行測(cè)定，將直接導(dǎo)致新基因的發(fā)現(xiàn)，并獲取基因組中與產(chǎn)業(yè)化關(guān)系最為密切的信息。20世紀(jì)80年代，高通量的自動(dòng)測(cè)序的出現(xiàn)，使從質(zhì)?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA)文庫隨機(jī)選取許多cDNA克隆和決定來自非載體兩端的幾百個(gè)堿基的DNA序列成為可能。這些短的DNA序列叫做“表達(dá)序列標(biāo)簽”(Expressed Sequence Tags，簡稱ESTs)。表達(dá)序列標(biāo)簽的概念最早是由Adams等在1992年提出來的(Nature，355，642-644)。1992年Sikela和Matsubara(Sikela，et al.Nucleic AcidsRes.19，1837-1843；Matsubara，et al.Nature Genetics，2，173-179)針對(duì)獲得大量信使核糖核酸(mRNA)序列的迫切需要，提出大規(guī)?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)測(cè)序的研究戰(zhàn)略。隨后Venter創(chuàng)立了大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)。其基本特征就是從以質(zhì)粒為載體，構(gòu)建完成的目的組織互補(bǔ)脫氧核糖核酸(Complementary DNA，簡稱cDNA)文庫中，隨機(jī)選擇許多cDNA克隆，利用質(zhì)粒上攜帶的通用引物對(duì)cDNA兩端進(jìn)行一輪脫氧核糖核酸序列測(cè)定，所獲得的來自3’端或5’端的幾百個(gè)堿基的非載體短脫氧核糖核酸(DNA)序列。簡而言之，表達(dá)序列標(biāo)簽是來自表達(dá)基因片段3’端或5’端的短脫氧核糖核酸序列，代表一個(gè)表達(dá)基因的部分轉(zhuǎn)錄片段。
表達(dá)序列標(biāo)簽可用于新基因克隆、人類基因組圖譜繪制、基因組序列編碼區(qū)的確定等。如果一個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽在基因組中只出現(xiàn)一次，那么它可以作為序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)。由表達(dá)序列標(biāo)簽構(gòu)建的物理圖譜叫表達(dá)圖或轉(zhuǎn)錄圖(expression or transcript map)。利用表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行基因圖制作，可以加快序列標(biāo)簽位點(diǎn)的制作和新基因的染色體定位。表達(dá)序列標(biāo)簽可以作為基因特異性探針，對(duì)組織特異性基因表達(dá)的研究具有重要的作用。表達(dá)序列標(biāo)簽還可以進(jìn)行新基因的遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。表達(dá)序列標(biāo)簽可以對(duì)所有動(dòng)植物的基因作為一種數(shù)據(jù)庫，通過不同的序列比較可以獲得保守序列片段，從而獲得基因的遺傳進(jìn)化圖譜。正因?yàn)楸磉_(dá)序列標(biāo)簽具有如此的優(yōu)越性，因此表達(dá)序列標(biāo)簽測(cè)序已經(jīng)成為許多基因組研究機(jī)構(gòu)的工作重點(diǎn)。
由于本發(fā)明人類肝臟特異表達(dá)基因與一些肝臟疾病相關(guān)，因此，研究人類肝臟中特異表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽對(duì)探索肝臟疾病的發(fā)病機(jī)理及研制肝病的治療藥物具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一類在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供了一類在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其包括(a)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列；(b)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列的互補(bǔ)序列；(c)與SEQ ID No.1～SEQID No.50所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列，及(d)上述(a)～(c)中一條或數(shù)條的組合。
較佳地，所述序列包括具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列。
本發(fā)明還提供了一種探針分子，所述的探針分子含有上述序列中約8-100個(gè)連續(xù)的核苷酸。
由本發(fā)明的在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽，可以方便的尋找出在人類肝臟中特異表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽，從而尋找出人類肝臟疾病相關(guān)基因，從而在研究肝臟疾病的致病機(jī)理以及開發(fā)治療肝臟疾病的藥物中發(fā)揮重要作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人肝臟組織的mRNA的分離組織分離(Tissue isolation)肝臟來源于5個(gè)成年男性，在肝臟切除手術(shù)后，將肝臟組織立即置于液氮中冷凍保存。
mRNA的分離(mRNA isolation)取出肝臟組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)，勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
實(shí)施例2cDNA文庫的構(gòu)建(Constuct ion of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時(shí)，再進(jìn)行片斷分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Strategene，CA9203，USA)，以ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Strategene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1 Blue MRF’(Strategene，CA9203，USA)細(xì)菌。涂板并測(cè)定滴度。
實(shí)施例3測(cè)序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(QiagenGermany)，用T3和T7作為3’和5’端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。
實(shí)施例4基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(Consensus Sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行連接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open ReadingFrame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列的核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通?？色@取人肝臟相關(guān)基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNAEnds，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列5’或3’端設(shè)計(jì)引物，在人類肝臟Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長距離PCR反應(yīng)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復(fù)上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對(duì)于5’和3’端的已知的序列，如果中間有一段間隙(gap)無法從已有的公共數(shù)據(jù)庫或自身數(shù)據(jù)庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5’端設(shè)計(jì)引物，3’端引物采用Oligo-dT，在肝臟總RNA庫中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。最后拼接便獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，可獲得人肝臟相關(guān)蛋白的全長編碼序列。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽<130>NP-10157<160>50<210>1<211>467<212>DNA<213>Homo sapiens<400>11 gctctatttt caggaaaatt tctatcatat aaaagcttat ttcagttatt ataaaagtgc61 ttattctctg gttatttctt ctttttatat aatcttgtca tgtttcatag tagcagtatc121 ttctgctatc tctctgagta tattaattat actttatttc tacttcagct actgttttct181 acaggacata ctgcctctaa ttcttaaaca ggttctggag tatgaactgt cttgtttctc241 attgacacaa cactctccag tcacatgtat tcggctttcc catttctgcc agttcctcct301 ttacatcttc caaaagttgt gtctctttaa tatgttgctt cctcttcctt atgcctgtgg361 atttatatat tttttagtct tttgctcaaa atttttagtc ccttactagg aaggaacatg421 gaaaaacatg tgttcaatca cgaagtttaa ctggaagtct gctgtta<210>2<211>461<212>DNA<213>Homo sapiens<400>21 aaaaaataaa aatcatttat ttaaacaaaa atatacacac agtgtacaat gaatatggtt61 tacacagaac aataaaacaa aaatgatatc tcttaaatgc caacataaaa tgatctattt121 atgcctagaa aaaatttcta ggaatacaca ttattgattc atctaaaata catatataac181 ataaaaagaa aacaaatgcc aacctttcag atgagtacca caaaaaccta aaagttaaat241 gttagattaa ataaaattat aaaatatcca cacgagaagt atgtgtatac aaagtattgt301 atgtatgcag tgaaatgaga gtgcccatac agttatatgc aaacttttga aagtttcata
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權(quán)利要求
1.一類分離出的在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于，包括(a)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列；(b)SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列的互補(bǔ)序列；(c)與SEQ ID No.1～SEQ ID No.50所示的序列中每條序列有至少70％同源性的序列，及(d)上述(a)～(c)中一條或數(shù)條的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類分離出的在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽的序列，其特征在于所述序列包括具有SEQ ID No.1～SEQ IDNo.50所示的序列。
3.一種探針分子，其特征在于所述的探針分子含有權(quán)利要求1中所述的序列中約8-100個(gè)連續(xù)的核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽的序列。利用本發(fā)明的在人類肝臟中表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽，可以方便的尋找出在人類肝臟中特異表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)簽，從而尋找出人類肝臟疾病相關(guān)基因，從而在研究肝臟疾病的致病機(jī)理以及開發(fā)治療肝臟疾病的藥物中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1970757SQ20051011059
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月22日
發(fā)明者韓澤廣, 黃健 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心