專利名稱：Spg3a基因突變、其編碼產(chǎn)物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及SPG3A突變基因及其編碼產(chǎn)物和檢測SPG3A基因突變的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
遺傳性痙攣性截癱是單個(gè)基因的病理性突變而引起的疾病。這是一組遺傳異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，即本病可由不同基因的不同突變引起。因此，找尋及鑒定本病的致病基因及其突變類型不僅是了解、闡明本病發(fā)病機(jī)理的必須途徑，同時(shí)也是建立本病的基因診斷和產(chǎn)前/種植前診斷的先決條件。在已了解本病的致病基因及其突變類型之后，我們可以建立起基于這一基因及其突變類型的診斷技術(shù)，以期對臨床上可疑的患者進(jìn)行確鑿的基因水平的診斷，還可以通過羊水及臍血的檢測，判斷胎兒是否攜帶有這一基因的突變，從而預(yù)測胎兒出生后是否會(huì)患有這一疾病，并將這一信息提供給孕婦及其家人，從而決定繼續(xù)或終止妊娠。由于基因的突變是本病發(fā)生的原因，從長遠(yuǎn)看，對突變的鑒定使我們有可能使用糾正突變的基因療法或其它針對這一突變的生物學(xué)效應(yīng)的方法(如蛋白質(zhì)拮抗劑)去治療本病。因此，從長遠(yuǎn)看，本突變的發(fā)現(xiàn)有治療方面的應(yīng)用前景。
由于對本病的臨床診斷現(xiàn)無特殊方法，因而基因水平的診斷不僅明確了突變的具體部位及種類，還具有準(zhǔn)確，快速，低消耗的特點(diǎn)。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的早期診斷、鑒定與遺傳性痙攣性截癱相關(guān)的基因突變及其檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供與遺傳性痙攣性截癱的發(fā)病或發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的多核苷酸和蛋白。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是用這些蛋白和多核苷酸篩選調(diào)節(jié)這些蛋白或多核苷酸表達(dá)或功能的化合物。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是用這些化合物調(diào)節(jié)或與所述遺傳性痙攣性截癱相關(guān)的蛋白及多核苷酸相互作用，以治療和診斷這種疾病。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供檢測SPG3A基因突變的方法和試劑盒。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種SPG3A基因突變蛋白，其特征在于，SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中第189位組氨酸突變?yōu)樘於彼幔蛘逽EQ ID NO2所示的氨基酸序列中第410位甘氨酸突變?yōu)榫彼帷?br> 本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的SPG3A突變基因，其特征在于，它編碼上述SPG3A基因突變蛋白。
在優(yōu)選例中，所述的SPG3A突變基因的突變選自SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位C發(fā)生突變；SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位G發(fā)生突變。
在一實(shí)施例中，SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位由C突變?yōu)镚；在另一實(shí)施例中，SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位由G突變?yōu)锳。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測SPG3A基因突變的方法，它包括步驟提取DNA樣本；PCR擴(kuò)增；測序；與正常SPG3A核苷酸序列(SEQ ID NO1)比較是否存在突變；其特征在于，所述突變選自SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位C發(fā)生突變；SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位G發(fā)生突變。
在一實(shí)施例中，SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位由C突變?yōu)镚；在另一實(shí)施例中，SEQID NO1所示核苷酸序列第1228位由G突變?yōu)锳。
優(yōu)選的，上述PCR擴(kuò)增的引物選自(1)SEQID NO3和SEQ ID NO4；(2)SEQID NO5和SEQ ID NO6。
較佳的，所述DNA樣本取自血液(包括臍血)、羊水或組織。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，所述載體包含上述SPG3A突變基因。
本發(fā)明的第五方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是被上述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測SPG3A基因突變的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增SPG3A基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述PCR擴(kuò)增的引物選自(1)SEQ ID NO3和SEQ ID NO4；(2)SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
優(yōu)選的，上述基因突變選自SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位發(fā)生C突變；SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位發(fā)生G突變。
在一實(shí)施例中，SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位由C突變?yōu)镚；在另一實(shí)施例中，SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位由G突變?yōu)锳。
本發(fā)明的第七方面，提供了一種化合物，所述化合物抑制上述SPG3A基因突變蛋白的激活或抑制上述SPG3A突變基因的表達(dá)。較佳的，所述化合物是SPG3A突變基因的反義核苷酸。
本發(fā)明的第八方面，提供了一種SPG3A基因突變蛋白的用途，所述SPG3A基因突變蛋白用于制備治療或診斷遺傳性痙攣性截癱的組合物。
本發(fā)明的第九方面，提供了一種SPG3A突變基因的用途，所述SPG3突變基因用于制備治療或診斷遺傳性痙攣性截癱的組合物。
本發(fā)明也包括了應(yīng)用所述蛋白和多核苷酸篩選治療和/或診斷遺傳性痙攣性截癱的化合物，這些化合物可以作為SPG3A基因表達(dá)或功能的激活劑或拮抗劑。這些蛋白和多核苷酸既作為篩選化合物的靶子，同時(shí)為合成衍生化合物提供了原料，后者能作為SPG3A基因表達(dá)或功能的激活劑或拮抗劑。
特別地，本發(fā)明還包括針對SPG3A基因或基因產(chǎn)物的異常表達(dá)水平、基因的突變、甚至異?；蚧蚧虍a(chǎn)物的檢測方法。上述異常出現(xiàn)于具有遺傳性痙攣性截癱或有遺傳性痙攣性截癱發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的人的細(xì)胞、血液或組織中，或者在患有這種疾病的細(xì)胞或動(dòng)物模型中。
因而，本發(fā)明用于通過檢測SPG3A基因或基因產(chǎn)物來指導(dǎo)篩選遺傳性痙攣性截癱患者或遺傳性痙攣性截癱的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。對異常表達(dá)水平、基因突變或其他的異?，F(xiàn)象的檢測容許對遺傳性痙攣性截癱患者或遺傳性痙攣性截癱發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行診斷，還可以作為孕婦產(chǎn)前篩查的手段，必要的時(shí)候可以終止妊娠。在實(shí)施例中，這項(xiàng)發(fā)明指示了檢測SPG3A基因的異常水平或基因突變的方法。
因此，本發(fā)明還包括對患有遺傳性痙攣性截癱，或有遺傳性痙攣性截癱發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的人的治療方法，本方法用SPG3A基因或基因產(chǎn)物的異常表達(dá)水平、突變或其他的異常現(xiàn)象作為治療的指標(biāo)或靶子。
本發(fā)明也包括了用SPG3A基因或基因產(chǎn)物作為指標(biāo)或靶子篩選調(diào)節(jié)表達(dá)水平的因子或有效逆轉(zhuǎn)在SPG3A基因或基因產(chǎn)物中的突變或其他異常特征的方法。因此，本發(fā)明包括篩選SPG3A基因或基因產(chǎn)物的激活劑和拮抗劑的方法。這些因子可以根據(jù)它們對SPG3A基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或功能的影響用于制備診斷或治療遺傳性痙攣性截癱的組合物。通過鑒別能調(diào)節(jié)SPG3A基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能的因子，就獲得了通過調(diào)節(jié)SPG3A基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或功能而影響一個(gè)人的遺傳性痙攣性截癱發(fā)病過程或發(fā)病程度的方法。進(jìn)一步，通過獲得這些基因表達(dá)調(diào)節(jié)的因子，就形成了評估對細(xì)胞和動(dòng)物模型的治療效果的方法。
通過篩選能夠相互作用，或者容許對SPG3A基因或基因產(chǎn)物的異常表達(dá)或功能進(jìn)行檢測的因子，這樣就形成了診斷遺傳性痙攣性截癱的發(fā)病或發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步還包括了在SPG3A基因或基因產(chǎn)物基礎(chǔ)上得到的組合物，它們對于檢測或調(diào)節(jié)SPG3A基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能都十分有用。所以，這些組合物對于制備診斷和/或治療遺傳性痙攣性截癱的組合物十分有用。
本發(fā)明也包括了根據(jù)模型中的SPG3A基因或基因產(chǎn)物研究遺傳性痙攣性截癱的載體、細(xì)胞和動(dòng)物模型。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1伴有c.565C＞G(p.H189D)突變的蜆二家系系譜圖。
圖2伴有c.1228G＞A(p.G410R)突變的西藏家系系譜圖。
圖3伴有c.715C＞T(p.R239C)突變的山東家系系譜圖。
圖4包含突變點(diǎn)的人類SPG3A cDNA與各物種同源序列比對結(jié)果，圖中的方框表示c.565C和c.1228G位點(diǎn)。
圖5.包含突變點(diǎn)的人類SPG3A基因編碼的蛋白質(zhì)與各物種同源序列比對結(jié)果，圖中的方框表示p.H189和p.G410位點(diǎn)。
圖6A野生型(A1、A2)與突變型(B1、B2)(p.H189D突變)的atlastin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測。
cartoons(A1，B1)(比Ribbons選項(xiàng)(用光滑的條帶表示a-和β-片段)厚，并且β鏈有箭頭標(biāo)注)與spacefill(A2，B2)(用范德華半徑來顯示所表示的原子)模式。突變位點(diǎn)用桿線表示。GB鳥苷酸結(jié)合蛋白域；TM跨膜螺旋區(qū)。突變后的p.G410R沒有在圖中顯示，是由于模型模板的結(jié)構(gòu)從104-436轉(zhuǎn)換到104-378，除去了突變位點(diǎn)。
圖6B野生型(A1、A2)與突變型(B1、B2)(p.G410R突變)的atlastin蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測。
cartoons(A1，B1)與spacefill(A2，B2)模式。突變位點(diǎn)用桿線表示。GB鳥苷酸結(jié)合蛋白域；TM跨膜螺旋區(qū)。
圖7蜆二家系的測序結(jié)果圖上部分為患者的正向測序結(jié)果，中部為患者的反向測序結(jié)果，圖下部為正常人的正向測序結(jié)果。(箭頭所示為突變位點(diǎn))。
圖8西藏家系的測序結(jié)果圖上部分為患者的正向測序結(jié)果，中部為患者的反向測序結(jié)果，圖下部為正常人的正向測序結(jié)果。(箭頭所示為突變位點(diǎn))。
圖9山東家系的測序結(jié)果圖上部分為患者的正向測序結(jié)果，中部為患者的反向測序結(jié)果，圖下部為正常人的正向測序結(jié)果。(箭頭所示為突變位點(diǎn))。
圖10負(fù)重狀態(tài)下蜆二家系和山東家系患者足部前后位和側(cè)位的影像圖。
TC的角度變大(前后位圖中TC＝34°，側(cè)位圖中TC＝55°)，TMT角度偏離(在側(cè)位圖中TMT＝162°)。
圖11負(fù)重狀態(tài)下蜆二家系和山東家系患者足部前后位和側(cè)位的影像圖。
TC的角度變大(前后位圖中TC＝34°，側(cè)位圖中TC＝55°)，TMT角度偏離(在側(cè)位圖重TMT＝162°)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的SPG3A突變蛋白是指SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的第189位氨基酸突變?yōu)榫彼岬牡鞍谆虻?10位氨基酸突變?yōu)樘於彼?。本發(fā)明的SPG3A突變基因編碼SPG3A突變蛋白。其核苷酸序列是指SEQIDNO1的第565位發(fā)生突變。較佳的，上述突變?yōu)镃→G?；蛘咂渫蛔儼l(fā)生在SEQ ID NO1的核苷酸序列第1228位。較佳的，上述突變?yōu)镚→A。
本發(fā)明的人SPG3A核苷酸全長序列(SPG3A突變基因)或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)SPG3A的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆人載體；再轉(zhuǎn)入細(xì)胞；然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
將本發(fā)明SPG3A編碼序列插入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，就可以分離出SPG3A突變蛋白。
本發(fā)明的核苷酸序列可優(yōu)選地插入到載體，例如表達(dá)載體中。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于表達(dá)載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細(xì)菌)、低等真核細(xì)胞(如酵母)、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達(dá)載體中，除了含有復(fù)制起點(diǎn)外，還可含有標(biāo)記基因和其他翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含SPG3A突變基因的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
上述載體，可以用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)外源蛋白質(zhì)或功能性核酸。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。一些采用的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可生產(chǎn)本發(fā)明突變蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明所述多核苷酸，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)液中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基、培養(yǎng)液或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
SPG3A突變蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明還包括對本發(fā)明SPG3A突變基因或是其片段編碼的蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人SPG3突變基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人SPG3A突變基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。
此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人SPG3A突變蛋白功能的抗體以及不影響人SPG3A蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人SPG3A突變基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用蛋白合成儀合成。
本發(fā)明包括SPG3A突變蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑等。當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、或局部給藥(包括病灶處)。較佳地是局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明SPG3A突變蛋白的拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的SPG3突變蛋白的拮抗劑拮抗劑施用于哺乳動(dòng)物，其中本安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地本劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人SPG3A突變蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。
一種檢測樣品中是否存在SPG3A突變蛋白的方法是利用SPG3A蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與SPG3A蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在SPG3A突變蛋白。
SPG3A蛋白的多聚核苷酸可用于SPG3A蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，SPG3A蛋白的多聚核苷酸可用于檢測SPG3A蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下SPG3A蛋白的異常表達(dá)。如SPG3A DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷SPG3A蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用SPG3A蛋白特異的引物進(jìn)行RNA一聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測SPG3A蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
本發(fā)明提供了一種檢測人SPG3A基因表達(dá)是否異常的方法；它包括步驟(a)確定在人SPG3A基因的SEQ ID NO1所示序列的第565或1228位的核苷酸；和b)檢測在所述位置是否存在堿基C或G的錯(cuò)義突變。
檢測SPG3A基因的突變也可用于診斷遺傳性痙攣性截癱。檢測可以針對DNA，也可針對基因組DNA。SPG3A蛋白突變的形式包括與正常野生型SPG3A DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析，PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，對來自21個(gè)遺傳性痙攣性截癱的家系(20個(gè)漢族家系和1個(gè)藏族家系)的84位患者和23個(gè)散發(fā)病例進(jìn)行SPG3A基因的突變篩查。Zhao X等在2001年克隆了SPG3A基因(Zhao X，et al.Mutations in a newly identified GTPase genecause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia.Nat Genet 29326-331，2001)。目前全世界已報(bào)導(dǎo)了19個(gè)SPG3A基因的突變位點(diǎn)，但從未見中國人的報(bào)道。發(fā)明人通過測序的方法，在3個(gè)中國人的家系中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)，其中2個(gè)突變位點(diǎn)為國際上從未報(bào)道的新的突變位點(diǎn)，1個(gè)突變位點(diǎn)為已知突變(但在中國人群為首次報(bào)道)。1個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生在SPG3A基因的第5外顯子c.565C＞G(SEQ ID NO1中第565位由C變?yōu)镚)，導(dǎo)致p.H189D氨基酸(SEQ ID NO2中第189位氨基酸由組氨酸變?yōu)樘於彼?的改變；發(fā)生在SPG3A基因的第12外顯子c.1228G＞A(SEQ ID NO1中第1228位由G變?yōu)锳)，導(dǎo)致p.G410R氨基酸(SEQ ID NO2中第410位氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?的改變。
由于突變氨基酸位于編碼肽鏈跨膜區(qū)的功能基團(tuán)中，這一改變使得SPG3A基因所編碼肽鏈的功能發(fā)生異常，從而引發(fā)本病。突變堿基C和G在脊椎動(dòng)物中的保守性，也證明了這二個(gè)堿基在功能上的重要性。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SPG3A基因的2個(gè)新突變。這一發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于制備診斷、治療遺傳性痙攣性截癱的藥物，檢測SPG3A基因的突變；并進(jìn)一步證實(shí)了SPG3A基因是引起遺傳性痙攣性截癱的疾病基因。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)疾病的表型和基因型存在著一定相關(guān)性。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 家系收集發(fā)明人收集了來自21個(gè)遺傳性痙攣性截癱的家系(20個(gè)漢族家系和1個(gè)藏族家系)的84位患者和23個(gè)散發(fā)病例。黑色圖案符號(hào)表示患者。方框表示男性，圓圈表示女性。斜條表示個(gè)體死亡，黑色箭頭指示的患者表示先證者(即家系中第一個(gè)得到確診的患者)。在上述所有家系成員知情同意后，取外周血于EDTA管中備用。用Qiagen公司生產(chǎn)的QIAampDNA Blood Maxi Kits從抗凝外周血中提取DNA，TE溶解，-70℃保存，備用。
實(shí)施例2 SPG3A基因突變檢測SPG3A基因其mRNA序列來自Genebank(NM_181598.1)。Genomic DNA序列來自http//genome.ucsc.edu。
主要步驟1.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體積為50μl，內(nèi)含50mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，16.6mmol/L(NH4)2SO4，0.10mg/mlBSA，3.0mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，引物P1、P2(檢測外顯子5即蜆二家系突變位點(diǎn)所在的引物)、P3、P4(檢測外顯子12即西藏家系突變位點(diǎn)所在的引物)各0.2μmol/L，Taq酶2U(MBI公司)，人基因組DNA約0.1～0.7μg。PCR反應(yīng)條件94℃3min；94℃45s，60℃1min，72℃1min，35循環(huán)；最后72℃延伸10min。引物P1(SEQID NO3)的序列為5’-TCCATCTCCAGAGCAGGTGA-3’，P2(SEQ ID NO4)的序列為5’-AGGCAGCTAATTGGGCCAA-3’；引物P3(SEQID NO5)的序列為5’-TATAGTCATGCCTCGTGGAT-3’；引物P4(SEQ ID NO6)的序列為5’-GCTTGTATCTGGGCAGGTCA-3’2.測序反應(yīng)方案(1)預(yù)反應(yīng)反應(yīng)體積共3μl，內(nèi)含PCR產(chǎn)物5-10ng(約0.5-1.0μl)，蝦堿性磷酸酶(SAP)、外切酶I(Exo I)各0.25μl(USB公司)，補(bǔ)超純水至3μl。反應(yīng)混合物在PCR儀上反應(yīng)，37℃溫浴15min，然后85℃15min滅活酶。反應(yīng)完畢后反應(yīng)混合物直接作為測序反應(yīng)的模板用。
(2)測序反應(yīng)用ABI公司的96孔板，在GeneAmp 9700PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體積共10μl，內(nèi)含3μl的預(yù)反應(yīng)產(chǎn)物，2μl的5×buffer，1μl的Big-Dye(ABI)，1μl引物(3.2pmol/μl)，3μl的超純水。反應(yīng)條件98℃2min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，30循環(huán)；最后4℃保存。
(3)測序純化直接在96孔板上進(jìn)行。
a)測序反應(yīng)完畢后，每個(gè)樣品加入90μl 75％乙醇，貼上封口鋁箔，漩渦混勻；b)室溫避光20min；c)20℃，3500rpm離心30min(5810R離心機(jī)上進(jìn)行)；d)倒去上清，倒扣在四層吸水紙上，350rpm離心30s；e)室溫避光20min，以晾干乙醇；f)樣品加10μl超純水，上ABI3100測序儀進(jìn)行測序。
3.測序結(jié)果分析用ABI序列分析軟件進(jìn)行分析發(fā)明人對來自21個(gè)遺傳性痙攣性截癱的家系(20個(gè)漢族家系和1個(gè)藏族家系)的84位患者和23個(gè)散發(fā)病例進(jìn)行SPG3A基因的突變篩查。結(jié)果如下新的突變位點(diǎn)一為發(fā)生在SPG3A基因的第5外顯子c.565C＞G，導(dǎo)致p.H189D氨基酸的改變。該家系編號(hào)蜆二家系，來自廣東肇慶蜆二。3代共8人患病。系譜見圖1。
臨床癥狀患者均在年齡6歲以前發(fā)病，表型較輕，無須輔助工具行走，病程發(fā)展緩慢，部分患者出現(xiàn)扁平足。
新的突變位點(diǎn)二為發(fā)生在SPG3A基因的第12外顯子c.1228G＞A，導(dǎo)致p.G410R氨基酸的改變。該家系來自西藏。4代共9人患病。系譜見圖2。
臨床癥狀患者均在年齡15歲以前發(fā)病。病程進(jìn)展快速而病情嚴(yán)重?；颊呔孰p下肢截癱，成痙攣狀態(tài)，肌肉萎縮。足部呈馬蹄狀內(nèi)翻，不能行走只能以手撐地移行。
已知突變位點(diǎn)(但在中國人群為首次報(bào)道)為發(fā)生在SPG3A基因的第7外顯子c.715C＞T，導(dǎo)致p.R239C氨基酸的改變。該家系來自山東。3代共5人患病。引物序列為上游SEQ ID NO75’-AGGGGAGAGACTGCCCAGA-3’；下游SEQ ID NO85’-TGCTCTAAGATTGACTCCAGGGA-3’。
臨床癥狀患者均在年齡6歲以前發(fā)病，表型較輕，無須輔助工具行走，病程發(fā)展緩慢，。部分患者出現(xiàn)扁平足。系譜見圖3。
以往的報(bào)道表明，SPG3A患者腳部的一個(gè)常見特征是弓形足。然而我們的2個(gè)漢族家系(蜆二家系和山東家系)中，11位患者有9位是扁平足。而家系中的正常人腳部都是未見異常。見圖10、11?；颊叩腡C(talocalcaneal angle，距跟骨)的角度均變大，TMT(the talarfirst metatarsal angle，距骨第一跖骨)的角度偏離。以上是根據(jù)美國的診斷標(biāo)準(zhǔn)(Lee etal.Clinical Practice Guideline Adult Flatfoot Panel.Diagnosis and treatment ofadult flatfoot.J Foot Ankle 4478-113，2005)。
發(fā)明人又檢測了100名與本家系無血緣關(guān)系的正常人，第189密碼子全為CAC，第239密碼子全為CGC，第410密碼子全為GGG。
p.H189D(CAC→GAC)、p.R239C(CGC→TGC)及p.G410R(GGG→AGG)改變及分別在我們家系中所有的病人中都存在，與疾病表型呈共分離，但在家系中所有正常人中不存在；在蜆二家系和山東家系中，其患者攜帶的致病突變導(dǎo)致SPG3A編碼的肽鏈的N端發(fā)生改變。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)家系所有的患者均有扁平足的癥狀，而其中的正常家系成員的足弓均無異常表現(xiàn)?；颊叩牟∏檫M(jìn)展緩慢，癥狀輕微，所有的患者生活都能自理。
而西藏家系的致病突變導(dǎo)致SPG3A編碼的肽鏈的C端發(fā)生改變。患者均無扁平足的癥狀，但癥狀嚴(yán)重，所有的患者均已不能行走。SPG3A編碼的肽鏈的C端發(fā)生改變，可能導(dǎo)致較嚴(yán)重的癥狀。
實(shí)施例3 跨種屬同源性比對
2個(gè)新突變發(fā)生在進(jìn)化中高度保守的序列。應(yīng)用Clustal X1.83軟件(Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin F，Higgins DG.The CLUSTAL X windows interfaceflexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res.1997；254876-4882.)比對人類SPG3A cDNA (NM 181598.1)及SPG3A基因編碼的蛋白質(zhì)(NP_853629.1)與大猩猩、牛、狗、雞、大鼠、小鼠、河豚、秀麗線蟲相應(yīng)的序列。
與10種物種比對結(jié)果顯示SPG3A基因的cDNA序列的c.565C和c.1228G位點(diǎn)，SPG3A基因編碼的蛋白的p.H189和p.G410位點(diǎn)高度保守。序列比對結(jié)果見圖4，5?？绶N屬同源性比對結(jié)果證明，突變所在位點(diǎn)堿基在脊椎動(dòng)物及非脊椎動(dòng)物10種物種中全為C和G，所在的密碼子全為His(組氨酸)及Gly(甘氨酸)。
實(shí)施例4 SPG3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法用PROSPECT(Version 2.0beta l)(Xu Y，Xu D.Protein threading using PROSPECTdesign and evaluation.Proteins.2000；40343-354.)、Pfam 14.0(Bateman A，Coin L，Durbin R，etal.The Pfam protein fami l ies database.Nucleic Acids Res.2004；32D138-141)及DAS-TMFillter軟件(The upgraded and modifed version of theDAS-prediction method)(Cserzo M，Eisenhaber F，Eisenhaber B，Simon I.TM or not TMtransmembrane protein prediction with low false positive rate using DAS-TMfilter.Bioinformatics.2004；20136-137.)預(yù)測SPG3A基因編碼的蛋白質(zhì)atlastin的結(jié)構(gòu)及功能域。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖6。PG3A基因編碼肽鏈的生物結(jié)構(gòu)學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)一個(gè)鳥苷酸結(jié)合蛋白域。該鳥苷酸結(jié)合蛋白域與包含三磷酸核苷酸水解酶的P-loop(CATH分類)(CATH isa novel hierarchical classification of protein domain structures，which clust是一種對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的新的等級(jí)分類方法，在4個(gè)主要級(jí)別上歸類蛋白質(zhì)，即門類C，體系A(chǔ)，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)T和同源超家族H)同源。H/D殘基側(cè)鏈位于結(jié)合口袋(binding pocket)的邊緣。因而蜆二家系中p.H189D氨基酸的替換預(yù)測會(huì)影響鳥苷酸的或三磷酸鳥苷酸酶的激活。而西藏家系p.G410R氨基酸的改變發(fā)生在鳥苷酸結(jié)合蛋白域(GB，球狀區(qū)域)與跨膜螺旋區(qū)(TM，桿狀區(qū)域)的聯(lián)結(jié)部位，并且這個(gè)被覆蓋在分子中間的殘基位于α-螺旋的起始點(diǎn)。因而，p.G410R氨基酸的改變很可能通過使一個(gè)小而不重要的殘基轉(zhuǎn)變成一個(gè)大而重要的殘基，破壞了α-螺旋，從而引起桿狀區(qū)域的整體結(jié)構(gòu)的變化，從而引起嚴(yán)重的臨床上的癥狀、體征。
實(shí)施例5 SPG3A基因突變檢測試劑盒1的制備制備一試劑盒，它含有
名稱序列序列(5’→3’) 編號(hào)濃度正向引物TCC ATC TCC AGA GCA GGT GA SEQ ID NO3干粉2OD反向引物AGG CAG CTA ATT GGG CCA ASEQ ID NO4干粉2ODPCR反應(yīng)液 含Taq酶、dNTP、鎂離子、PCR反應(yīng)緩沖液PCR產(chǎn)物純化盒 含小量PCR產(chǎn)物純化的溶液，DNA吸附柱Label1測序反應(yīng)液 含Big Dye抽取待檢測病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將SPG3A基因突變檢測試劑盒1中的PCR引物稀釋到0.2μmol/L，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用檢測試劑盒所提供的PRC產(chǎn)物純化盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)后直接進(jìn)行測序。觀測測序所得到的序列是否有錯(cuò)義突變，即SEQID NO1所示核苷酸序列第565位C是否突變。
實(shí)施例6 SPG3A基因突變檢測試劑盒2的制備制備一試劑盒，它含有名稱序列序列(5’→3’)編號(hào)濃度正向引物TAT AGT CAT GCC TCG TGG ATSEQ ID NO5干粉2OD反向引物GCT TGT ATC TGG GCA GGT CASEQ ID NO6干粉2ODPCR反應(yīng)液 含Taq酶、dNTP、鎂離子、PCR反應(yīng)緩沖液PCR產(chǎn)物純化盒 含小量PCR產(chǎn)物純化的溶液，DNA吸附柱Label1測序反應(yīng)液 含Big Dye抽取待檢測孕婦的羊水15ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從羊水中提取DNA。將SPG3A基因突變檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到0.2μmol/L，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用檢測試劑盒所提供的PCR產(chǎn)物純化盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化的產(chǎn)物進(jìn)行測序反應(yīng)后直接進(jìn)行測序。觀測測序所得到的序列是否有錯(cuò)義突變，即SEQID NO1所示核苷酸序列第1228位G是否突變。
實(shí)施例7 藥物組合物的制備將SPG3A突變蛋白的拮抗劑與普通的藥膏材料按特定的比例混合，制成含SPG3A突變蛋白的拮抗劑的藥膏。使用時(shí)，將藥膏施于患處，患處SPG3A突變基因所編碼的突變蛋白受到抑制，使病人由于缺乏SPG3A所編碼的正常蛋白而引起的遺傳性痙攣性截癱得以減輕，直至最后的消失?；?qū)PG3A突變基因所編碼的突變蛋白制成針劑，使用時(shí)對患處進(jìn)行皮下注射，直接抑制病灶處的SPG3A突變蛋白，使病人的遺傳性痙攣性截癱癥狀得到改善，從而達(dá)到治療的目的。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中山大學(xué)<120>SPG3A基因突變、其編碼產(chǎn)物及其應(yīng)用<130>051005<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2403<212>DNA<213>智人<220>
<221>CDS<222>(1)..(1641)<223>
<400>1atg gcc aag aac cgc agg gac aga aac agt tgg ggt gga ttt tcg gaa 48Met Ala Lys Asn Arg Arg Asp Arg Asn Ser Trp Gly Gly Phe Ser Glu1 5 10 15aag aca tat gaa tgg agc tca gaa gag gag gag cca gtg aaa aag gca 96Lys Thr Tyr Glu Trp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Pro Val Lys Lys Ala20 25 30gga cca gtc caa gtc ctc att gtc aaa gat gac cat tcc ttt gag tta 144Gly Pro Val Gln Val Leu Ile Val Lys Asp Asp His Ser Phe Glu Leu35 40 45gat gaa act gca tta aat cgg atc ctt ctc tcg gag gct gtc aga gac 192Asp Glu Thr Ala Leu Asn Arg Ile Leu Leu Ser Glu Ala Val Arg Asp50 55 60aag gag gtt gtt gct gta tct gtt gct gga gca ttt aga aaa gga aaa 240Lys Glu Val Val Ala Val Ser Val Ala Gly Ala Phe Arg Lys Gly Lys65 70 75 80tca ttc ctg atg gac ttc atg ttg aga tac atg tac aac cag gaa tca 288
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260 265 270ggc tta aaa gta gct acc aat cca aac ttt gat gga aaa ttg aaa gaa 864Gly Leu Lys Val Ala Thr Asn Pro Asn Phe Asp Gly Lys Leu Lys Glu275 280 285ata gat gat gaa ttc atc aaa aac ttg aaa ata ctg att cct tgg cta 912Ile Asp Asp Glu Phe Ile Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ile Pro Trp Leu290 295 300ctt agt ccc gag agc cta gat att aaa gag atc aat ggg aat aaa atc 960Leu Ser Pro Glu Ser Leu Asp Ile Lys Glu Ile Asn Gly Asn Lys Ile305 310 315 320acc tgc cgg ggt ctg gtg gag tac ttc aag gct tat ata aag atc tat 1008Thr Cys Arg Gly Leu Val Glu Tyr Phe Lys Ala Tyr Ile Lys Ile Tyr325 330 335caa ggt gaa gaa tta cca cat ccc aaa tcc atg tta cag gcc aca gca 1056Gln Gly Glu Glu Leu Pro His Pro Lys Ser Met Leu Gln Ala Thr Ala340 345 350gaa gct aac aat tta gca gcc gtg gca act gcc aag gac aca tac aac 1104Glu Ala Asn Asn Leu Ala Ala Val Ala Thr Ala Lys Asp Thr Tyr Asn355 360 365aaa aaa atg gaa gag att tgt ggt ggt gac aaa cca ttt ctg gcc cca 1152Lys Lys Met Glu Glu Ile Cys Gly Gly Asp Lys Pro Phe Leu Ala Pro370 375 380aat gac ttg cag acc aaa cac ctg caa ctt aag gaa gaa tct gtg aag 1200Asn Asp Leu Gln Thr Lys His Leu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Val Lys385 390 395 400cta ttc cga ggg gtg aag aag atg ggt ggg gaa gaa ttt agc cgg cgt 1248Leu Phe Arg Gly Val Lys Lys Met Gly Gly Glu Glu Phe Ser Arg Arg405 410 415tac ctg cag cag ttg gag agt gaa ata gat gaa ctt tac atc caa tat 1296Tyr Leu Gln Gln Leu Glu Ser Glu Ile Asp Glu Leu Tyr Ile Gln Tyr420 425 430atc aag cac aat gat agc aaa aat atc ttc cat gca gct cgt acc cca 1344Ile Lys His Asn Asp Ser Lys Asn Ile Phe His Ala Ala Arg Thr Pro435 440 445
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370 375 380Asn Asp Leu Gln Thr Lys His Leu Gln Leu Lys Glu Glu Ser Val Lys385 390 395 400Leu Phe Arg Gly Val Lys Lys Met Gly Gly Glu Glu Phe Ser Arg Arg405 410 415Tyr Leu Gln Gln Leu Glu Ser Glu Ile Asp Glu Leu Tyr Ile Gln Tyr420 425 430Ile Lys His Asn Asp Ser Lys Asn Ile Phe His Ala Ala Arg Thr Pro435 440 445Ala Thr Leu Phe Val Val Ile Phe Ile Thr Tyr Val Ile Ala Gly Val450 455 460Thr Gly Phe Ile Gly Leu Asp Ile Ile Ala Ser Leu Cys Asn Met Ile465 470 475 480Met Gly Leu Thr Leu Ile Thr Leu Cys Thr Trp Ala Tyr Ile Arg Tyr485 490 495Ser Gly Glu Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Val Ile Asp Gln Val Ala Ala500 505 510Ala Leu Trp Asp Gln Gly Arg Gly Phe Val Gln Ala Leu Gln Cys Ser515 520 525Ser Asn Pro Gln Thr Ser Val Ser Ser Ser Phe Pro Tyr Thr Lys Val530 535 540Gly Ile Tyr545<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物P1
<400>3tccatctcca gagcaggtga 20<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>引物P2<400>4aggcagctaa ttgggccaa19<210>5<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物P3<400>5tatagtcatg cctcgtggat 20
<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物P4<400>6gcttgtatct gggcaggtca 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物P5<400>7
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<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物P6<400>8gcttgtatct gggcaggtca 20
權(quán)利要求
1.一種SPG3A基因突變蛋白，其特征在于，SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中第189位組氨酸突變?yōu)樘於彼?，或者SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中第410位甘氨酸突變?yōu)榫彼帷?br> 2.一種分離的SPG3A突變基因，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的突變蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的SPG3A突變基因，其特征在于，所述突變選自SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位由C突變?yōu)镚；SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位由G突變?yōu)锳。
4.一種檢測SPG3A基因突變的方法，它包括步驟提取DNA樣本；PCR擴(kuò)增；測序；與正常SPG3A核苷酸序列(SEQ ID NO1)比較是否存在突變；其特征在于，所述突變選自SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位C發(fā)生突變；SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位G發(fā)生突變。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的引物選自(1)SEQ ID NO3和SEQ ID NO4；(2)SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述DNA樣本取自血液、羊水或組織。
7.一種載體，其特征在于，包含權(quán)利要求2或3所述的SPG3A突變基因。
8.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是被權(quán)利要求7所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
9.一種檢測SPG3A基因突變的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增SPG3A基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述PCR擴(kuò)增的引物選自(1)SEQ ID NO3和SEQ ID NO4；(2)SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，所述基因突變選自SEQ ID NO1所示核苷酸序列第565位C發(fā)生突變；SEQ ID NO1所示核苷酸序列第1228位G發(fā)生突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了SPG3A基因內(nèi)的兩個(gè)新突變，這個(gè)基因中的突變會(huì)導(dǎo)致遺傳性痙攣性截癱。同時(shí)還與小鼠、大鼠、河豚和秀麗線蟲等脊椎動(dòng)物中的SPG3A同源基因進(jìn)行同源性比對。本發(fā)明還公開了檢測上述SPG3A基因突變的方法和試劑盒以及在分離和生產(chǎn)SPG3A突變基因編碼的蛋白質(zhì)的應(yīng)用和包含此突變基因的載體和細(xì)胞株。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1958605SQ20051011006
公開日2007年5月9日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者王一鳴, 陳素琴, 李荀華, 周雁, 拉布, 宋純, 陳赟, 郭輝, 黃霜, 黃瑋俊 申請人:中山大學(xué)