專利名稱：一種微生態(tài)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，更具體地指涉及一種益生素飼料添加劑。它能夠在數(shù)量或種類上補(bǔ)充動(dòng)物腸道內(nèi)減少或缺乏的有益微生物，調(diào)整或維持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能和抗應(yīng)激能力，提高養(yǎng)殖效益。
背景技術(shù)：
通常單一微生物經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生微生物代謝物，利用該代謝物產(chǎn)物作為抗菌治病，飼料添加等等的有用物質(zhì)，例如中國(guó)專利CN 200410077706.4，該發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵，添加劑添加到飼料中或配制非抗生素類飼料，能顯著提高動(dòng)物免疫能力，促進(jìn)動(dòng)物的新陳代謝，提高動(dòng)物機(jī)體的抗病能力，改善動(dòng)物的消化機(jī)能，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，并明顯改善動(dòng)物的肉質(zhì)。在微生物制劑的應(yīng)用及發(fā)展趨勢(shì)，該文綜述了微生態(tài)制劑—益生素是種天然的生物活性制劑，無(wú)毒副作用，無(wú)耐藥性，無(wú)藥物殘留物，具有保健、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高飼料利用率等功效(出處山東家禽2001，(5)31-32頁(yè))。美國(guó)專利涉及一種檢測(cè)動(dòng)物飼料中微生態(tài)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法。該飼料中含有微生態(tài)菌與寡糖，檢測(cè)方法主要為雜交與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(TIMethods for detecting and quantifying specificprobiotic microorganisms in animal feed.Inventoramer BE.Application numberS2004000711155 Patent numberS20050048515)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用混合菌培養(yǎng)具有微生物活菌制劑和酶制劑雙重功效的微生態(tài)制劑，用以克服目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上益生素生產(chǎn)普遍存在的品種、功效單一、穩(wěn)定性差的問(wèn)題。
對(duì)于微生態(tài)制劑來(lái)講，要保證益生菌正常效力的發(fā)揮，就應(yīng)保證活菌制劑中活菌的含量和穩(wěn)定性，使其可以經(jīng)受外界因素的影響。這種新型的復(fù)合微生物菌劑參照國(guó)際研究主流方向，將單一菌株的益生菌轉(zhuǎn)化為復(fù)合菌劑，因此具有多種功效，它不僅僅可以調(diào)節(jié)機(jī)體的微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道的吸收，而且該制劑中的微生物還能分泌多種維生素和氨基酸等有益的營(yíng)養(yǎng)成分，改善機(jī)體機(jī)能，并且產(chǎn)生有機(jī)酸類抗生素，殺死病原菌，防病治病。其產(chǎn)生的氨基酸氧化酶和分制硫化物的酶類，可分解氨、硫化氫、吲哚等有害物質(zhì)，降低雞舍內(nèi)有害氣體的含量，減少臭味，改善環(huán)境，減少雞群的發(fā)病率。
另外，本發(fā)明微生態(tài)制劑的生產(chǎn)，采用了先進(jìn)的微膠囊包埋技術(shù)，使其中的微生物可以經(jīng)受溫度、濕度、酸度等外界條件的影響，保證了大多數(shù)益生菌生產(chǎn)較難解決的穩(wěn)定性問(wèn)題。
本發(fā)明成品是將從動(dòng)物體內(nèi)分離的有益微生物，經(jīng)特殊工藝發(fā)酵培殖制成的，只含活菌或包含菌體及其代謝產(chǎn)物的活菌制劑，乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌、絲狀真菌和光合菌的一種或一種以上菌組成的。工藝流程是菌種篩選→菌種培植→原料→液體發(fā)酵→后處理→成品1.菌種篩選在選擇生產(chǎn)菌株時(shí)，、除了使用傳統(tǒng)的發(fā)酵菌株外，篩選所應(yīng)用其他菌種必須符合以下條件①能夠很好地同化基質(zhì)碳源和無(wú)機(jī)氮源；②繁殖速度快，菌體蛋白含量高；③無(wú)毒性和致病性；④菌種性能穩(wěn)定；⑤最好能進(jìn)行混菌培養(yǎng)。
2.菌種培殖采用多菌種混菌培養(yǎng)要求菌株間存在同住或偏利生或共生關(guān)系，我們采用優(yōu)良的細(xì)菌通過(guò)固體發(fā)酵粗淀粉原料及渣柏類原料。
3.原料根據(jù)菌種的生長(zhǎng)要求，從國(guó)內(nèi)十幾種主要農(nóng)副產(chǎn)品中經(jīng)發(fā)酵比較培養(yǎng)基由黃豆粉、玉米、米糠、豆粕為主原料加上少量輔劑及微量元素組成。
4.發(fā)酵及處理在生產(chǎn)工藝方面，為保證產(chǎn)品質(zhì)量，采用液體發(fā)酵工藝，從而提高生產(chǎn)的可控性和生產(chǎn)規(guī)模，降低生產(chǎn)成本。本微生態(tài)制劑的制備技術(shù)由絲狀真菌，酵母菌，芽孢桿菌，乳酸菌，光合菌等組成。前四種菌分別在28-32℃溫度環(huán)境下，固體或液體發(fā)酵40-50小時(shí)；其中乳酸菌按1∶1加入填充料；在35-50℃環(huán)境中烘干，粉碎，經(jīng)40-60目過(guò)篩；光合菌在見(jiàn)光20℃環(huán)境下進(jìn)行；加入礦物質(zhì)和維生素、混合均勻制成。
5.成品分類要求表1產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)

表2成品無(wú)害化指標(biāo)

有益效果禾維益生素是一種功能強(qiáng)大的微生物菌群，養(yǎng)殖場(chǎng)使用它后，可使養(yǎng)殖場(chǎng)臭味大幅減少或消失，飼料利用率大幅度提高，家禽產(chǎn)蛋量增加，動(dòng)物的抗病力增強(qiáng)、繁殖率提高，能夠代替以促生長(zhǎng)、預(yù)疾病為目的藥物添加劑、酶制劑等，從而生產(chǎn)無(wú)藥物殘留的綠色飼料和降低飼料的制作成本。且生產(chǎn)出的動(dòng)物產(chǎn)品為綠色食品。
禾維益生素其具有微生物活菌制劑和酶制劑的雙重功效；(1)調(diào)節(jié)腸道菌系平衡有益菌進(jìn)入腸道內(nèi)大量繁殖，拮抗有害菌，最終定植在腸壁上形成菌系平衡，抑制有害菌侵入，同時(shí)產(chǎn)生大量有助于消化、促進(jìn)生長(zhǎng)的物質(zhì)。
(2)消化酶的作用制劑中各類消化酶及有益菌在代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的各類消化酶含量達(dá)到或超過(guò)普通飼用復(fù)合酶的外源添加水平。因此，飼料得到充分消化吸收。
一、試驗(yàn)證明，在肉雞日糧中加入100mg/kg禾維益生素，可使增重率提高5％-9％；在蛋雞日糧中加入100mg/kg益生素，蛋雞的產(chǎn)蛋量可提高5％；用于防治雛雞白痢，發(fā)病率明顯低于27.5％。30日齡的雛雞平均日增重提高12.26％，蛋雞所產(chǎn)的雞蛋其蛋白質(zhì)質(zhì)量明顯提高，蛋黃的膽固醇含量明顯降低。
二、禾維益生素中的微生物能合成B族維生素、賴氨酸、蛋氨酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)，還可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、植酸酶等多種消化酶來(lái)促進(jìn)飼料的消化，從而提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和飼料報(bào)酬。
三、禾維益生素還可以產(chǎn)生有機(jī)酸類抗生素，殺死病原菌，起到防病治病的作用。其產(chǎn)生的氨基酸氧化酶和分制硫化物的酶類，可分解氨、硫化氫、吲哚等有害物質(zhì)，降低雞舍內(nèi)有害氣體的含量，減少臭味，改善環(huán)境，減少雞群的發(fā)病率。養(yǎng)殖業(yè)使用禾維益生素，不僅僅可以調(diào)節(jié)機(jī)體的微生態(tài)平衡，促進(jìn)機(jī)體對(duì)養(yǎng)分的吸收，而且不會(huì)造成藥物殘留和抗藥性等問(wèn)題，是很有希望代替抗生素的飼料添加劑。
四、禾維益生素該飼料添加劑可直接飼喂反芻動(dòng)物，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵，改善營(yíng)養(yǎng)成分在瘤胃中的消化與再合成，有效提高飼料的利用率和動(dòng)物的抗病力，對(duì)于奶牛來(lái)說(shuō)，可明顯提高其產(chǎn)奶量。該產(chǎn)品具備安全、高效的特點(diǎn)，符合現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)調(diào)控型添加劑發(fā)展的趨勢(shì)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)后，預(yù)計(jì)將對(duì)我國(guó)奶牛養(yǎng)殖水平的提高做出重要貢獻(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
絲狀真菌(菌種選育和菌種培植)--28～32℃菌種 接種---原料(玉米、米糠、豆、黃粉)----發(fā)酵罐---發(fā)酵----40～50h--菌體富集(離心機(jī))-真空冷凍干燥機(jī)-低溫干燥----包裝機(jī)---成品乳酸菌(菌體選育和菌體培植)28～35℃---菌種-----接種------原料(玉米、米糠、黃粉、豆)--發(fā)酵罐---發(fā)酵---40～50℃---加填充料(1∶1)---35～50℃-----烘干粉碎----40～60目過(guò)篩---成品。
試驗(yàn)方法采樣方法產(chǎn)品每批抽樣5箱，每箱抽1瓶，無(wú)菌操作，每瓶吸取5毫升一同放入無(wú)菌的三角瓶中，搖均勻，瓶上粘貼標(biāo)簽，表明產(chǎn)品名稱、取樣日期、批號(hào)、取樣人，供檢驗(yàn)用。
感觀指標(biāo)的測(cè)定目測(cè)鼻嗅，無(wú)異臭味、黃褐色液體有效活細(xì)胞數(shù)和雜菌率的測(cè)定枯草芽孢桿菌活細(xì)胞數(shù)的測(cè)定枯草芽孢桿菌細(xì)胞測(cè)定用瓊脂培養(yǎng)基的制備葡萄糖0.5g(NH4)SO4 0.2g檸檬酸鈉 0.1gK2HPO4 1.4gKH2PO4 0.6gMgSO40.02g蒸餾水100ml純化瓊脂 2gpH 7.0確證實(shí)驗(yàn)枯草芽孢桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征，菌落較大，直徑3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃狀，邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)睢?br> 用無(wú)菌吸管吸取5ml1號(hào)產(chǎn)品加入帶玻璃珠的45ml無(wú)菌水中，靜置20min后，充分震蕩30min，混勻成1∶10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等濃度(每個(gè)稀釋度必須更換無(wú)菌吸管)。
用1ml無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度均懸液0.1ml，加至直徑為9cm平皿的枯草芽孢桿菌細(xì)胞測(cè)定用瓊脂培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)加無(wú)菌水的空白對(duì)照，好氧培養(yǎng)2-4天，培養(yǎng)溫度為28℃-30℃，每個(gè)稀釋度取5-10個(gè)菌落的菌體，涂片染色，顯微鏡觀察識(shí)別后計(jì)數(shù)菌落。
嗜酸乳桿菌活細(xì)胞數(shù)測(cè)定嗜酸乳桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長(zhǎng)成菌落，計(jì)數(shù)。其菌落的形態(tài)特征為平皿底為黃色，菌落中等大小，呈棉團(tuán)狀，微白色，濕潤(rùn)，邊緣不整齊，直徑3±1mm。計(jì)數(shù)步驟如下(1)用無(wú)菌吸管吸取5ml2號(hào)產(chǎn)品加入帶玻璃珠的45ml無(wú)菌水中，靜置20min后，充分震蕩30min，混勻成1∶10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等濃度(每個(gè)稀釋度必須更換無(wú)菌吸管)。
(2)用1ml無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1ml加至直徑為9cm平皿的嗜酸乳桿菌細(xì)胞測(cè)定用瓊脂培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)加無(wú)菌水的做空白對(duì)照，厭氧培養(yǎng)2～4天，培養(yǎng)溫度為28℃～30℃，每個(gè)稀釋度取5～10個(gè)菌落的菌體，涂片染色，顯微鏡觀察識(shí)別后計(jì)數(shù)菌落。
嗜酸乳桿菌細(xì)胞測(cè)定用瓊脂培養(yǎng)基的制備番茄汁50ml酵母提取液5g肉膏10g乳糖20g葡萄糖2g磷酸氫二鉀2g吐溫80 1g乙酸鈉5g瓊脂15g水加至1000ml PH 6.8±0.2嗜酸乳桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征，平皿底為黃色，菌落中等大小，微白色，濕潤(rùn)，邊緣不整齊，直徑3±1mm，如棉團(tuán)狀菌落。
糞鏈球菌活細(xì)胞數(shù)測(cè)定糞鏈球菌在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長(zhǎng)成菌落，計(jì)數(shù)。其菌落的形態(tài)特征為菌落呈紅色或粉紅色，邊緣整齊，表面以下常呈橢圓或晶狀體。其計(jì)數(shù)步驟如下(1)用無(wú)菌吸管吸取5ml2號(hào)產(chǎn)品加入帶玻璃珠的45ml無(wú)菌水中，靜置20min后，充分震蕩30min，混勻成1∶10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等濃度(每個(gè)稀釋度必須更換無(wú)菌吸管)。
(2)用1ml無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度均懸液0.1ml加至直徑為9cm平皿的糞鏈球菌細(xì)胞測(cè)定用瓊脂培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)加無(wú)菌水的空白對(duì)照，厭氧培養(yǎng)2～4天，培養(yǎng)溫度為28℃～30℃，每個(gè)稀釋度取5～10個(gè)菌落的菌體，涂片染色，顯微鏡觀察識(shí)別后計(jì)數(shù)菌落。
糞鏈球菌細(xì)胞測(cè)定用瓊脂培養(yǎng)基的制備蛋白胨10.0g酵母浸膏10.0g氯化鈉5.0g甘油磷酸鈉10.0g麥芽糖20.0g乳糖1.0g疊氮化鈉0.4g瓊脂20.0g蒸餾水1000ml糞鏈球菌在瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征，瓊脂平板上生長(zhǎng)的紅色或粉紅色菌落，邊緣整齊，表面以下常呈橢圓或晶狀體，都是糞鏈球菌。
雜菌率的測(cè)定用無(wú)菌吸管吸取5ml產(chǎn)品加入帶玻璃珠的45ml無(wú)菌水中，靜置20min后，充分震蕩30min，混勻成1∶10稀釋的菌懸液，這樣依次稀釋，分別得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等濃度(每個(gè)稀釋度必須更換無(wú)菌吸管)。
4.3.4.2用1ml無(wú)菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1ml加至直徑為9cm平皿的瓊脂培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌玻璃刮刀將菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)加無(wú)菌水的空白對(duì)照，好氧培養(yǎng)2～4天，培養(yǎng)溫度為30～33 & ordm；C，每個(gè)稀釋度取5～10個(gè)菌落的菌體，涂片染色，顯微鏡觀察識(shí)別后計(jì)數(shù)菌落。
計(jì)算公式每一種活細(xì)胞數(shù)的計(jì)算都按下述方法進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)算出同一稀釋度3個(gè)平皿上菌落平均數(shù)。
產(chǎn)品活細(xì)胞數(shù)＝菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10雜菌率(％)＝[雜菌數(shù)÷(有效菌數(shù)+雜菌數(shù))]×100根據(jù)菌落特征判定，分別計(jì)算出產(chǎn)品中的特定微生物細(xì)胞數(shù)(以億/ml表示)。
PH值測(cè)定儀器燒杯、酸度計(jì)。
測(cè)定方法隨機(jī)取10ml樣品置于干凈燒杯內(nèi)，預(yù)熱PH計(jì)用標(biāo)準(zhǔn)溶液(PH 6.86)校正儀器后，測(cè)定樣品的PH，邊測(cè)邊攪拌，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄。每個(gè)樣品重復(fù)三次。
出廠檢驗(yàn)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)飼料級(jí)禾維益生素由公司的技術(shù)部門(mén)進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)保證所有出廠的飼料級(jí)禾維益生素都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)要求，每批出廠的飼料級(jí)微生物添加劑都應(yīng)附有一定格式的質(zhì)量合格證明，飼料級(jí)禾維益生素以每一發(fā)酵罐生產(chǎn)的產(chǎn)品為一批(3t)。
檢驗(yàn)指標(biāo)產(chǎn)品感官指標(biāo)、有效活細(xì)胞數(shù)和汞、鎘、砷、鉛、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、霉菌的測(cè)定為出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目，由質(zhì)檢科按本標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)合格并簽發(fā)合格證后方可出廠。
如果檢驗(yàn)結(jié)果不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定時(shí)，應(yīng)以加倍數(shù)量按規(guī)定選取試樣進(jìn)行檢驗(yàn)，如仍不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，該批產(chǎn)品判為不合格。
權(quán)利要求
1.一種由混合菌培養(yǎng)具有微生物活菌制劑和酶制劑的微生態(tài)制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑，其特征在于混合菌由乳酸桿菌芽孢桿菌、酵母菌、絲狀真菌和光合菌的一種或一種以上菌組成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑，其特征在于混合菌的培養(yǎng)基由黃豆粉、玉米、米糠、豆粕為主原料加上少量輔劑及微量元素組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑，其特征在于該微生態(tài)制劑只含有活菌或包含菌體及其代謝產(chǎn)物的活菌制劑。
5.如權(quán)利要求1所述的微生態(tài)制劑的制備方法包括如下步驟(1)菌種選擇選擇①能夠很好地同化基質(zhì)碳源和無(wú)機(jī)氮源；②繁殖速度快，菌體蛋白含量高；③無(wú)毒性和致病性；④菌種性能穩(wěn)定；⑤最好能進(jìn)行混菌培養(yǎng)；(2)菌種培殖采用多菌種混菌培養(yǎng)要求菌株間菌種發(fā)酵以粗淀粉及渣粕為原料，菌株間存在存在同住或偏利生或共生關(guān)系，我們采用優(yōu)良的細(xì)菌通過(guò)固體發(fā)酵粗淀粉原料及渣柏類原料；(3)培養(yǎng)基 由黃豆粉、玉米、米糠、豆粕為主原料加上少量輔劑及微量元素；(4)發(fā)酵及處理 菌種在上述培養(yǎng)基中往種子發(fā)酵，接種到發(fā)酵罐中28℃～32℃發(fā)酵；發(fā)酵40-50小時(shí)，過(guò)濾濾餅30-50℃烘干，粉碎；40-60過(guò)篩、光合菌在見(jiàn)光20℃環(huán)境下進(jìn)行；加入礦物質(zhì)和維生素、混合均勻制成。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種由混合菌培養(yǎng)具有微生物活菌制劑和酶制劑的微生態(tài)制劑。該制劑由乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌、絲狀真菌和光合菌的一種或一種以上組成的混合菌在一定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵溫度28℃－32℃，發(fā)酵40－50小時(shí)，獲及微生態(tài)制劑。該制劑具有調(diào)節(jié)機(jī)體微生態(tài)平衡，促進(jìn)腸道的吸收分泌多種維生素和氨基酸等有益營(yíng)養(yǎng)成分。改善機(jī)體機(jī)能。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1965673SQ20051011048
公開(kāi)日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月17日
發(fā)明者章定和, 沈孝煌, 張秋濤 申請(qǐng)人:上海綠其維生物科技有限公司