專利名稱：一種固體培養(yǎng)獲得針葉樹種胚狀體的方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物外植體的培養(yǎng)方法，特別是涉及一種固體培養(yǎng)獲得針葉樹種胚狀體的方法及其培養(yǎng)基。
背景技術：
植物體細胞胚胎發(fā)生(somatic embryogenesis)是指二倍體或單倍體的體細胞在特定條件下，未經(jīng)性細胞融合而通過與合子胚胎發(fā)生類似的途徑發(fā)育出新個體的形態(tài)發(fā)生過程；經(jīng)體細胞胚胎發(fā)生形成類似合子胚的結構稱為體細胞胚(somaticembryo)；體細胞胚胎發(fā)生是由一類稱為胚性細胞(embryogenic cell)的組織發(fā)育而來，這是體細胞胚胎發(fā)生技術體系能否建立的關鍵。隨著現(xiàn)代生物技術的飛速發(fā)展，體細胞胚胎發(fā)生已經(jīng)成為針葉樹細胞工程中植株再生的重要途徑，可以用來研究無性系細胞起源、調(diào)控和發(fā)育，利于闡明植物有性胚與無性胚發(fā)生機理，還是植物細胞全能性、分化及其形態(tài)建成研究的理想實驗體系，也是進行基因轉導、種質保存、微體快繁、人工種子研制的重要手段。它還是基因工程的橋梁，可大幅度縮短林木育種與繁殖周期，尤其是用于針葉樹育種與繁殖工程，理論價值與經(jīng)濟意義重大。
目前，植物體細胞胚胎發(fā)生的方式分直接發(fā)生、間接發(fā)生和混合發(fā)生三種直接發(fā)生即體細胞胚直接從原外植體不經(jīng)愈傷組織階段發(fā)育而成，其來源細胞可以是外植體表皮、亞表皮、合子胚等，約20多種外植體可按直接方式產(chǎn)生體細胞胚；但有相當部分植物，尤其是木本植物的體細胞胚發(fā)生是間接方式，即體細胞胚是從愈傷組織，有時也從已形成體細胞胚的一組細胞中發(fā)育而成；此外，某些植物既可按直接方式又可按間接方式進行體細胞胚發(fā)生，叫混合發(fā)生方式，如取自鴨茅葉基的外植體，先形成愈傷組織，再進行體細胞胚發(fā)生；若取其葉尖則體細胞胚直接從外植體上產(chǎn)生。對于針葉樹種來說，常用的離體培養(yǎng)基有MS、DCR、SH、LP、GD等，存在的問題主要有早期原胚形成的狀態(tài)不好、胚性愈傷組織質量不高、早期原胚發(fā)育不完全與子葉發(fā)育不正常、玻璃化問題、下胚軸不伸長、體細胞胚不生根等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種固體培養(yǎng)獲得針葉樹種胚狀體的方法及其培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的針葉樹種胚狀體固體培養(yǎng)基，包括誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基，所述成熟培養(yǎng)基分為成熟培養(yǎng)基1或成熟培養(yǎng)基2；其中，所述誘導培養(yǎng)基含有下述組分，pH為5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl201-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，激動素0.05-2.6mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；所述增殖培養(yǎng)基含有下述組分，pH為5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，
CoCl20.01-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；所述成熟培養(yǎng)基1含有下述組分，pH為5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸 0.05-1.5mg/L，維生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脫落酸 7-150mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；
所述成熟培養(yǎng)基2含有下述組分，pH為5.6-5.9KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脫落酸 7-150mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；其中，誘導培養(yǎng)基組分優(yōu)選為KNO32102mg/L，NH4NO3248mg/L，KH2PO477mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 155mg/L，H3BO33.1mg/L，ZnSO4.7H2O 3.9mg/L，MnSO4.H2O 7.6mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.113mg/L，KI 0.38mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，激動素 0.05-2.6mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；增殖培養(yǎng)基組分優(yōu)選為KNO32803mg/L，NH4NO3331mg/L，KH2PO4103mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 206mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 5.2mg/L，MnSO4.H2O 10.2mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.15mg/L，KI0.51mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；成熟培養(yǎng)基1組分優(yōu)選為KNO32336mg/L，NH4NO3276mg/L，
KH2PO486mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 172mg/L，H3BO33.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.3mg/L，MnSO4.H2O 8.45mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.125mg/L，KI 0.42mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸 0.05-1.5mg/L，維生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脫落酸 7-150mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；成熟培養(yǎng)基2組分優(yōu)選為KNO32453mg/L，NH4NO3290mg/L，KH2PO490mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 181mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.52mg/L，MnSO4.H2O 8.87mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.131mg/L，KI 0.44mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，
肌醇50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺400-700mg/L，蔗糖20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白350-1050mg/L，脫落酸 7-150mg/L，瓊脂2,500-7,000mg/L；應用上述固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)獲得針葉樹種胚狀體的方法，包括如下步驟1)誘導培養(yǎng)將針葉樹種未成熟胚消毒后接種于誘導培養(yǎng)基中，在18-28℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；2)增殖培養(yǎng)將胚性愈傷組織接種于權利要求1所述固體培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基中，在18-28℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)；3)成熟培養(yǎng)將經(jīng)過增殖培養(yǎng)的胚性愈傷組織接種于權利要求1所述固體培養(yǎng)基的成熟培養(yǎng)基1或成熟培養(yǎng)基2中，在18-28℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到所述胚狀體。
經(jīng)過上述暗培養(yǎng)的胚性愈傷組織出現(xiàn)可見小胚后，還在22-28℃、1600～2000lx的光照條件下進行光培養(yǎng)。
本發(fā)明通過對培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，提高了胚性愈傷組織質量，早期原胚質量大大改善，胚頭與胚柄正常率達到95％以上，原胚的愈傷化和畸形胚減少35％，高質量子葉胚達90％以上，每克胚性愈傷組織上可發(fā)生210～360個子葉胚，畸形胚近于零，且可見的子葉胚基本為同步化、標準化，其生根、伸長率達到95％；與現(xiàn)有技術(子葉胚發(fā)生頻率低，每克胚性愈傷組織上只發(fā)生5～25個子葉胚，畸形胚占到70％以上，且體細胞胚生根率0～7％等)相比，體細胞胚發(fā)生狀況取得了重大突破。


圖1為培養(yǎng)獲得的胚狀體照片。
具體實施例方式
實施例1、一、實驗材料與方法1、實驗材料華北落葉松、日本落葉松、長白落葉松、日本×華北雜種落葉松、日本×長白雜種落葉松等的未成熟合子胚。
日本落葉松選自遼寧省清源縣大孤家林場30年生種子園中的日永8、日永85、日撫27、日草103等無性系；長白落葉松采自遼寧省撫順市哈達林場30年生長白落葉松種子園中的長3、長14、長11、長4C、長33等無性系；華北落葉松采自山西省管埁林局秋千溝林場華北落葉松母樹林中華3、華6、華7等無性系。日本、長白、華北落葉松各組合雜交技術采用開放式控制授粉方法進行。
2、實驗方法1)接種、誘導培養(yǎng)用鑷子從球果中取出種子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞溶液浸泡6min，無菌水沖洗5次后，接種備用，在超凈臺中剝?nèi)》N胚，從側部劃開種殼，取出種仁，劃破內(nèi)種皮，挑開胚乳，將嫩胚同胚柄一起接種于誘導培養(yǎng)基上，每皿接種25個，重復4次，在溫度21～27℃下暗培養(yǎng)，20～30天根據(jù)顏色、形態(tài)、結構等特征，初步確定胚性愈傷組織；2)增殖培養(yǎng)針葉樹胚性愈傷組織在誘導培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)兩次后，轉接于增殖培養(yǎng)基中進行增殖、繼代培養(yǎng)，每20～35天繼代一次，每次轉接時均選取新分化的胚性愈傷組織，在23±5℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。
3)成熟培養(yǎng)針葉樹胚性愈傷組織在增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)到一定數(shù)量后，轉接于成熟培養(yǎng)基中進行成熟培養(yǎng)。
將增殖后的接種于成熟培養(yǎng)基1中，在20-26℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。在成熟培養(yǎng)基上約20～65天時間段內(nèi)，不同胚性細胞系的成熟時間差異較大，有可見的小胚發(fā)生后，移到25±3℃、1600～2000lx的光照條件下進行光培養(yǎng)，即可得到體細胞胚。
所用的培養(yǎng)基組分如表1所示。
表1培養(yǎng)基組分 (mg/L)


二、實驗結果采用上述培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件得到的體細胞胚照片如圖1，體細胞胚發(fā)生數(shù)量如表表2. 落葉松不同胚性細胞系體細胞胚發(fā)生數(shù)量

結果表明，本方法提高了胚性愈傷組織質量，早期原胚質量大大改善，胚頭與胚柄正常率達到95％以上，原胚的愈傷化和畸形胚減少35％，高質量子葉胚達90％以上，每克胚性愈傷組織上可發(fā)生210～360個子葉胚，畸形胚近于零，且可見的子葉胚基本為同步化、標準化，其生根、伸長率達到95％；與現(xiàn)有技術(子葉胚發(fā)生頻率低，每克胚性愈傷組織上只發(fā)生5～25個子葉胚，畸形胚占到70％以上，且體細胞胚生根率0～7％等)相比，體細胞胚發(fā)生狀況取得了重大突破。
實施例2、選擇與實施例1相同的方法，所用的培養(yǎng)基如表3，進行針葉樹種的體細胞胚培養(yǎng)，可得到與實施例1相同的結果。
表3培養(yǎng)基配方(mg/L)


權利要求
1.一種針葉樹種胚狀體固體培養(yǎng)基，包括誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基，所述成熟培養(yǎng)基分為成熟培養(yǎng)基1或成熟培養(yǎng)基2；其中，所述誘導培養(yǎng)基含有下述組分，pH為5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，激動素0.05-2.6mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；所述增殖培養(yǎng)基含有下述組分，pH為5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；所述成熟培養(yǎng)基1含有下述組分，pH為5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸 0.05-1.5mg/L，維生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脫落酸7-150mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L；所述成熟培養(yǎng)基2含有下述組分，pH為5.6-5.9KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脫落酸7-150mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L。
2.根據(jù)權利要求1所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述誘導培養(yǎng)基組分為KNO32102mg/L，NH4NO3248mg/L，KH2PO477mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 155mg/L，H3BO33.1mg/L，ZnSO4.7H2O 3.9mg/L，MnSO4.H2O 7.6mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.113mg/L，KI 0.38mg/L，CuSO4.5H2O0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺400-700mg/L，蔗糖20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L，激動素 0.05-2.6mg/L，瓊脂2,500-7,000mg/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述增殖培養(yǎng)基組分為KNO32803mg/L，NH4NO3331mg/L，KH2PO4103mg/L，CaCl2.2H2O326mg/L，MgSO4.7H2O206mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O5.2mg/L，MnSO4.H2O 10.2mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.15mg/L，KI 0.51mg/L，CuSO4.5H2O0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺400-700mg/L，蔗糖20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白350-1050mg/L，6-芐氨基嘌呤0.05-3.1mg/L，瓊脂2,500-7,000mg/L。
4.根據(jù)權利要求1所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述成熟培養(yǎng)基1組分為KNO32336mg/L，NH4NO3276mg/L，KH2PO486mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 172mg/L，H3BO33.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.3mg/L，MnSO4.H2O 8.45mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.125mg/L，KI 0.42mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸0.05-1.5mg/L，維生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脫落酸7-150mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L。
5.根據(jù)權利要求1所述的固體培養(yǎng)基，其特征在于所述成熟培養(yǎng)基2組分為KNO32453mg/L，NH4NO3290mg/L，KH2PO490mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 181mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.52mg/L，MnSO4.H2O 8.87mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.131mg/L，KI 0.44mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，維生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脫落酸7-150mg/L，瓊脂 2,500-7,000mg/L。
6.一種固體培養(yǎng)獲得針葉樹種胚狀體的方法，包括如下步驟1)誘導培養(yǎng)將針葉樹種未成熟胚消毒后接種于權利要求1所述固體培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng)基中，在18-28℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；2)增殖培養(yǎng)將胚性愈傷組織接種于權利要求1所述固體培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基中，在18-28℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)；3)成熟培養(yǎng)將經(jīng)過增殖培養(yǎng)的胚性愈傷組織接種于權利要求1所述固體培養(yǎng)基的成熟培養(yǎng)基1或成熟培養(yǎng)基2中，在18-28℃、暗培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到所述胚狀體。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于成熟培養(yǎng)還在22-28℃、1600～2000lx的光照條件下進行光培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固體培養(yǎng)獲得針葉樹種胚狀體的方法及其培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的針葉樹種胚狀體固體培養(yǎng)基，包括誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基，所述成熟培養(yǎng)基分為成熟培養(yǎng)基1或成熟培養(yǎng)基2。應用上述固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)獲得針葉樹種胚狀體的方法，包括如下步驟誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和成熟培養(yǎng)，得到所述胚狀體。本發(fā)明通過對培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，提高了胚性愈傷組織質量，早期原胚質量大大改善，與現(xiàn)有技術相比，體細胞胚培養(yǎng)發(fā)生狀況取得了重大突破。
文檔編號C12N5/04GK1733903SQ20051009028
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權日2005年8月12日
發(fā)明者韓素英, 齊力旺, 張守攻, 王建華 申請人:中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所