專(zhuān)利名稱：培養(yǎng)豬苓菌絲體形成豬苓菌核的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體說(shuō)涉及一種在固體培養(yǎng)基中添加特殊物質(zhì)誘導(dǎo)豬苓菌絲體快速形成豬苓菌核的實(shí)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
豬苓Polyporus umbellatus(Pers.)Fries隸屬于真菌門(mén)(Eumycophyta)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)。豬苓菌核生于地下，其干燥品入藥，又稱豕苓、豬茯苓、野豬屎、地烏桃。豬苓子實(shí)體從地下的菌核上長(zhǎng)出，俗稱“豬苓花”、“千層蘑菇”，味美質(zhì)軟，可以食用。豬苓始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，在我國(guó)已經(jīng)有2000多年的藥用歷史，臨床主要用于治療急性腎炎，淋病，糖尿病，全身浮腫，小便不暢，尿急尿頻，尿道疼痛，受暑水瀉以及急性肝炎，急性胃炎等疾病。從豬苓菌核中提取的豬苓多糖能顯著降低肝臟中氧化脂質(zhì)的含量，有清除自由基損傷作用，能提高細(xì)胞中超氧化物歧化酶和肝臟過(guò)氧化氫酶的活力，對(duì)于延緩組織細(xì)胞老化、保護(hù)機(jī)體、抗老防衰十分有益。
近年來(lái)由于環(huán)境污染，人口增加，社會(huì)老齡化加快，使腫瘤及各種老年性疾病的發(fā)生率提高，導(dǎo)致豬苓在中藥中用量大增。豬苓多糖是從豬苓菌核中提取的主要有效成分，主要用于腫瘤治療，療效可靠、穩(wěn)定。由于腫瘤發(fā)病率提高，豬苓多糖的需求量和生產(chǎn)量顯著提高，加之近年的研究發(fā)現(xiàn)豬苓多糖還具有抗老防衰的新療效，使得豬苓菌核原料的年消耗量猛增。而野生豬苓一方面由于人類(lèi)過(guò)度活動(dòng)，大量的毀林造田，使其生境被破壞，另一方面由于價(jià)格因素的刺激，導(dǎo)致無(wú)序采挖，使近年來(lái)其產(chǎn)量銳減。以上因素造成豬苓菌核的貨源緊缺，價(jià)格持續(xù)升高。
人工栽培豬苓，雖然早已實(shí)驗(yàn)成功，但由于栽培技術(shù)要求高，工序繁雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，需要3-4年方能采收，且單產(chǎn)低、收益少，因此發(fā)展緩慢。由于現(xiàn)有的豬苓人工栽培技術(shù)中的種苓問(wèn)題始終沒(méi)有根本解決，目前大規(guī)模的豬苓栽培還只限于半野生栽培，這是限制豬苓貨源的瓶頸問(wèn)題。如果能研究出由豬苓菌絲體大面積工業(yè)化生產(chǎn)豬苓菌核的新技術(shù)，每年將可以節(jié)約大量的種苓用豬苓菌核，使商品菌核的產(chǎn)量大幅度增加。
近20多年來(lái)，中國(guó)以及日本、韓國(guó)的科技工作者先后對(duì)豬苓菌絲體形成菌核的機(jī)理進(jìn)行了長(zhǎng)期研究，均未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。由于豬苓菌核的形成機(jī)制研究一直沒(méi)有突破性進(jìn)展，對(duì)菌核形成的機(jī)理尚不明確，一直難以實(shí)現(xiàn)由菌絲體到菌核的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化，因而也就不能實(shí)現(xiàn)用豬苓菌種大量地生產(chǎn)豬苓菌核作為種苓或藥材，也無(wú)法象人工培養(yǎng)許多食用菌那樣全人工栽培豬苓菌核。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供固體培養(yǎng)誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成菌核的方法，該方法豬苓菌絲體發(fā)生菌核率高、菌核生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)豬苓菌核。
本發(fā)明的另一目的是用固體培養(yǎng)的人工豬苓菌核替代野生豬苓菌核藥材，解決豬苓菌核藥用資源緊缺的問(wèn)題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)是先液體發(fā)酵培養(yǎng)豬苓種子菌種，再將種子菌種接種到添加了特殊物質(zhì)的固體培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成豬苓菌核。本發(fā)明采用的真菌為分離自野生豬苓并經(jīng)過(guò)人工馴化和選育的豬苓菌株GZ-06，經(jīng)培養(yǎng)鑒定為豬苓(Polyporusumbellatus)，該菌種于2005年7月20日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No.1418。保藏和存活證明見(jiàn)附件。
具體地說(shuō)，本發(fā)明所述的技術(shù)步驟方法如下1.豬苓種子菌種的液體培養(yǎng)將豬苓菌株GZ-06自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于24-26℃恒溫培養(yǎng)30-50天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；豬苓菌株GZ-06液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基玉米面1-5％，酵母膏1-5％，KH2PO40.05-0.2％，MgSO40.05-0.2％，CaCO30.05-0.1％，VB10.008-0.03％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 5.0-6.5，三角瓶或其他容器振蕩，暗培養(yǎng)真菌。容器裝量30-60％，滅菌后接入上述豬苓菌株。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速100-150轉(zhuǎn)/分鐘；22-25℃暗培養(yǎng)；12-20天收獲。
2.豬苓菌絲體的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)上述菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后，種子菌種接入誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成豬苓菌核的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件18-25℃靜置，暗培養(yǎng)；25-50天收獲。固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為(1)培養(yǎng)基1甘油0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米漿0.5-2％，瓊脂0.8-2.0％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 4.5-6.5，試管或罐頭瓶等玻璃器皿，容器裝量20-50％，靜置，暗培養(yǎng)，25-50天收獲；(2)培養(yǎng)基2甘露醇0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米漿0.5-2％，瓊脂0.8-2.0％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 4.5-6.5，試管或罐頭瓶等玻璃器皿，容器裝量20-50％，靜置，暗培養(yǎng)，25-50天收獲；(3)培養(yǎng)基3鋸末(或小麥秸、或玉米秸、或玉米芯)20-25％，豆餅粉0.5-2％，甘油1.0-7.0％，玉米漿0.2-1.0％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，罐頭瓶、花盆等器皿，容器裝量50-80％，靜置，暗培養(yǎng)，.30-120天收獲。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.豬苓種子菌種的液體培養(yǎng)將豬苓菌株GZ-06自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于24-26℃恒溫培養(yǎng)40天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；豬苓菌株GZ-06液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO40.1％，CaCO30.05％，VB10.01％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，三角瓶振蕩，暗培養(yǎng)真菌。容器裝量40％，滅菌后接入上述豬苓菌株。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘；22-25℃暗培養(yǎng)，15天收獲。
2.豬苓菌絲體的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)上述菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后，種子菌種接種到誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成豬苓菌核的固體培養(yǎng)基1上，培養(yǎng)基組成甘油2％，蛋白胨0.6％，玉米漿1％，瓊脂2％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，試管靜置，暗培養(yǎng)，容器裝量30％；培養(yǎng)條件18-25℃靜置暗培養(yǎng)；35天收獲。
比較例1.固體培養(yǎng)基1對(duì)豬苓菌核的誘導(dǎo)將豬苓菌株GZ-06自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，在24-26℃下于PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)40天，接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO40.1％，CaCO30.05％，VB10.01％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，三角瓶振蕩，暗培養(yǎng)真菌。容器裝量40％，滅菌后接入上述豬苓菌株。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘；22-25℃暗培養(yǎng)；18天收獲。收獲的種子菌種接種到固體培養(yǎng)基1上，培養(yǎng)基組成甘油2％，蛋白胨0.6％，玉米漿1％，瓊脂2％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，用250ml輸液瓶裝培養(yǎng)基，容器裝量40％；培養(yǎng)條件18-25℃靜置，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至32天時(shí)，每10瓶培養(yǎng)物中有3瓶生長(zhǎng)形成了豬苓菌核；培養(yǎng)到50天時(shí)，每10瓶培養(yǎng)物有8瓶形成了豬苓菌核。這一結(jié)果說(shuō)明固體培養(yǎng)基1對(duì)豬苓菌核的誘導(dǎo)率能達(dá)到80％。
2.固體培養(yǎng)基2對(duì)豬苓菌核的誘導(dǎo)將豬苓菌株GZ-06自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，在24-26℃下于PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)40天，接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO40.1％，CaCO30.05％，VB10.01％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，三角瓶振蕩，暗培養(yǎng)真菌。容器裝量40％，滅菌后接入上述豬苓菌株。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘；22-25℃暗培養(yǎng)；18天收獲。收獲的種子菌種接種到固體培養(yǎng)基2上，培養(yǎng)基組成甘露醇2％，蛋白胨0.6％，玉米漿1％，瓊脂2％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，用250ml輸液瓶裝培養(yǎng)基，容器裝量40％；培養(yǎng)條件18-25℃靜置，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至25天時(shí)，每10瓶培養(yǎng)物中有8瓶形成了豬苓菌核；培養(yǎng)至35天，每瓶中都形成了數(shù)量不等的黃豆粒大小的豬苓菌核。這一結(jié)果說(shuō)明固體培養(yǎng)基2對(duì)豬苓菌核的誘導(dǎo)率能達(dá)到100％。
3.固體培養(yǎng)基3對(duì)豬苓菌核的誘導(dǎo)將豬苓菌株GZ-06自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，在24-26℃下于PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)40天，接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO40.1％，CaCO30.05％，VB10.01％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，三角瓶振蕩，暗培養(yǎng)真菌。容器裝量40％，滅菌后接入上述豬苓菌株。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘；22-25℃暗培養(yǎng)；18天收獲。收獲的種子菌種接種到固體培養(yǎng)基3上，培養(yǎng)基組成鋸末20％，豆餅粉1％，甘油2.5％，玉米漿0.5％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，用250ml輸液瓶裝培養(yǎng)基，容器裝量70％；培養(yǎng)條件18-25℃靜置，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至30天時(shí)，10瓶培養(yǎng)物中都形成了白色的豬苓菌核，并且產(chǎn)生的豬苓菌核逐漸生長(zhǎng)，體積增大，直徑可以達(dá)到5cm以上。這一結(jié)果說(shuō)明固體培養(yǎng)基3對(duì)豬苓菌核的誘導(dǎo)率能達(dá)到100％。
4.固體培養(yǎng)豬苓菌核與豬苓藥材的質(zhì)量比較將豬苓菌株GZ-06自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，在24-26℃下于PDA培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)40天，接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基玉米面3％，酵母膏3％，KH2PO40.1％，MgSO40.1％，CaCO30.05％，VB10.01％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，三角瓶振蕩暗培養(yǎng)真菌。容器裝量40％，滅菌后接入上述豬苓菌株。培養(yǎng)條件振蕩轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘；22-25℃暗培養(yǎng)；18天收獲。收獲的種子菌種分別接種到固體培養(yǎng)基1，2和3上。培養(yǎng)基1組成甘油2％，蛋白胨0.6％，玉米漿1％，瓊脂2％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，用250ml輸液瓶裝培養(yǎng)基，容器裝量40％；培養(yǎng)基2組成甘露醇2％，蛋白胨0.6％，玉米漿1％，瓊脂2％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，pH 6.0，用250ml輸液瓶裝培養(yǎng)基，容器裝量40％；培養(yǎng)基3組成鋸末20％，豆餅粉1％，甘油2.5％，玉米漿0.5％，以上組分均按重量百分含量計(jì)算，其余成分為水，用250ml輸液瓶裝培養(yǎng)基，容器裝量70％。培養(yǎng)條件18-25℃靜置，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)至40天時(shí)，分別收獲3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的豬苓菌核，55℃干燥。干燥的菌核粉碎后分別以甲醇提取，定容。各樣品溶液經(jīng)HPLC分析，并與用相同方法提取的豬苓藥材溶液對(duì)照，結(jié)果表明3種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)生產(chǎn)的人工豬苓菌核均與豬苓藥材的特征性化學(xué)成分的指紋圖譜基本一致，3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的豬苓菌核的化學(xué)成分基本一致。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)豬苓(Polyporus umbellatus)菌株GZ-06的菌絲體形成豬苓菌核的方法，包括步驟(1)豬苓種子菌種的液體培養(yǎng)將豬苓菌株GZ-06自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉(zhuǎn)接于含PDA培養(yǎng)基的平皿中，于24-26℃恒溫培養(yǎng)30-50天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；豬苓菌株GZ-06的液體培養(yǎng)培養(yǎng)基組成為玉米面、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、VB1，水；三角瓶或其他容器振蕩暗培養(yǎng)真菌，制得豬苓種子菌種；(2)豬苓菌絲體形成菌核的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)上述菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)后，種子菌種接種到誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成豬苓菌核的固體培養(yǎng)基上，于黑暗中靜置培養(yǎng)，形成菌核；固體培養(yǎng)基組成為甘油、甘露醇、蛋白胨、玉米漿、鋸末(或小麥秸、或玉米秸、或玉米芯)、豆餅粉、瓊脂、水。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其中所述的豬苓菌株為豬苓(Polyporus umbellatus)菌株GZ-06，保藏編號(hào)CGMCC No.1418。
3.如權(quán)利要求1和2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于豬苓種子菌種液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組分按重量計(jì)為玉米面1-5％，酵母膏1-5％，KH2PO40.05-0.2％，MgSO40.05-0.2％，CaCO30.05-0.1％，VB10.008-0.03％，其余成分為水，pH 5.0-6.5。
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于豬苓種子菌種液體培養(yǎng)條件為三角瓶或其他容器，培養(yǎng)基裝量30-60％，滅菌后接入上述豬苓菌株，振蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速100-150轉(zhuǎn)/分鐘；22-25℃暗培養(yǎng)，12-20天收獲。
5.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成豬苓菌核的固體培養(yǎng)基及其組分分別為(1)培養(yǎng)基1的組分按重量計(jì)為甘油0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米漿0.5-2％，瓊脂0.8-2.0％，其余成分為水，pH 4.5-6.5；(2)培養(yǎng)基2的組分按重量計(jì)為甘露醇0.5-6％，蛋白胨0.6-1％，玉米漿0.5-2％，瓊脂0.8-2.0％，其余成分為水，pH 4.5-6.5；(3)培養(yǎng)基3的組分按重量計(jì)為鋸末(或小麥秸、或玉米秸、或玉米芯)20-25％，豆餅粉0.5-2％，甘油1.0-7.0％，玉米漿0.2-1.0％，其余成分為水。
6.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于豬苓菌絲體在培養(yǎng)基1和2上誘導(dǎo)形成豬苓菌核的培養(yǎng)條件為試管或罐頭瓶等玻璃器皿靜置，暗培養(yǎng)，容器裝量20-50％；滅菌后接入液體培養(yǎng)的豬苓種子菌種，18-25℃暗培養(yǎng)；25-50天收獲。
7.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于豬苓菌絲體在培養(yǎng)基3上誘導(dǎo)形成豬苓菌核的培養(yǎng)條件為罐頭瓶、花盆等器皿靜置，暗培養(yǎng)，容器裝量50-80％；滅菌后接入液體培養(yǎng)的豬苓種子菌種，18-25℃暗培養(yǎng)；30-120天收獲。
8.如權(quán)利要求5中所述，其特征在于，誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成豬苓菌核的培養(yǎng)基3也可用于大田或山區(qū)的豬苓菌絲體形成豬苓菌核的坑栽培。
9.用于任一權(quán)利要求1-8所述方法的菌株為分離自野生豬苓并經(jīng)過(guò)人工馴化和選育的豬苓(Polyporus umbellatus)菌株GZ-06，保藏編號(hào)CGMCC No.1418。
全文摘要
一種培養(yǎng)豬苓菌絲體形成豬苓菌核的方法，所用的真菌為分離自野生豬苓(Polyporus umbellatus)并經(jīng)過(guò)人工馴化和選育的豬苓菌種GZ－06；通過(guò)在培養(yǎng)基中添加特殊的物質(zhì)，高效誘導(dǎo)豬苓菌絲體形成菌核。該技術(shù)豬苓菌絲體發(fā)生菌核率高、菌核生長(zhǎng)周期短、培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；應(yīng)用該技術(shù)培養(yǎng)生產(chǎn)的人工豬苓菌核和天然豬苓菌核特征性化學(xué)成分的指紋圖譜基本一致，可以成為豬苓的替代藥材使用。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1900267SQ20051008549
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者郭順星, 程顯好, 王春蘭, 陳曉梅, 邢曉科 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所